KR101637517B1

KR101637517B1 - 비타민 ｕ를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101637517B1
Application number: KR1020090057931A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김영희; 고강일; 박수진; 박선희; 이수연; 송계용; 김범준; 민혜정; 이나영
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2009-06-26
Publication date: 2016-07-11
Also published as: KR20110000452A

Abstract

본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 에 관한 것으로, 본 발명에서는 비타민 U가 과잉의 지방산이 체내에서 축적되는 것을 막아주고, 간장에서 지방을 제거시키는 작용을 갖고 있음을 밝혀내었으며, 비타민 U가 유효성분으로 함유되어 있는 조성물은 비만을 예방하거나 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 비만과 관련된 각종 질병에 대한 다양한 약제로의 개발에 사용될 가능성이 높다. 따라서 본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 개선을 위한 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

비타민 U, 항비만, 지방 분해, 렙틴, 중성지방, 췌장 리파아제

Description

비타민 Ｕ를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 {Compositions for preventing or curing obesity comprising vitamin U}

본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 항비만 효과를 갖는, 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 에 관한 것이다.

1990년대 이후 국내 경제의 발전과 과학기술의 고도성장은 특히 식생활의 풍요로움을 가져왔다. 이에 따른 서구적 식생활 패턴과 생활의 편리화로 인하여, 인스턴트식품의 섭취 및 운동 부족을 야기하여 비만의 발병률은 계속해서 증가하고 있는 실정이다.

비만과 과체중은 섭취한 에너지 중 체내에서의 대사활동으로 소비하고 남은 것이 지방조직에서 중성지방으로 전환되어 축적되어 발생한다. 비만의 원인은 아직 완전히 규명된 것은 아니나 유전, 내분비 장애, 과다한 열량 섭취, 신진대사, 운동 부족, 잘못된 식습관, 스트레스 등 복합적인 요인에 의해 생기며 어떤 원인에 의한 것이든 신체에서 소모되는 에너지보다 섭취되는 에너지가 많음에 기인한다고 볼 수 있다.

비만인 사람은 자신의 체형 때문에 열등감을 느끼고, 대인관계가 원만치 못하므로 사회생활에도 지장을 초래하는 질병이기도 하지만, 최대문제는 비만에 의해 발생되는 합병증이다. 비만으로 인하여, 혈액 내의 콜레스테롤과 중성지방의 양이 증가되는 고지혈증이 발생되어 고혈압, 심혈관계 질환 및 뇌졸중의 발생이 증가하며, 말초조직과 복부지방조직에서의 중성지방 축적 또는 말초조직 중성지방의 증가로 인슐린 저항성이 유발되어 제 2형 당뇨병을 발생시킬 수 있다. 이는 비만인에서 당뇨병 발생 빈도가 정상인보다 40배 이상 높은 이유이기도 하다. 또한, 비만은 관절염, 호흡기능 장애, 불임 및 월경불순, 악성종양 등과 같은 여러 가지 합병증이 유발되기 때문에 장기적인 관리와 치료가 절대적으로 필요하다. 따라서 비만은 외형적 및 심리적인 문제 뿐 아니라 성인병 발생의 제1 위험 요소이자 심각한 사회문제로 간주되고 있다.

이러한 사회적 배경으로부터, 비만의 예방 및 치료제의 개발이 진행되고 있으며, 현재 비만을 치료하는 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물로 나누어 볼 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌(5HT) 신경계를 저해하는 펜플루라민, 덱스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 및 세로토닌과 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다.

이 외에도, 췌장 지방분해효소 저해제(pancreatic lipase inhibitor)를 이용한 비만치료법에 대한 연구가 진행 중이다. 식이로 섭취된 지방의 분해 및 흡수는 장내 낮은 pH에 의한 물리·화학적인 지방의 변화와 아울러 여러 가지 효소 작용이 동반되는 매우 복잡한 경로를 거쳐 진행된다. 이들 여러 가지 효소 중에 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase)는 트리아실글리세롤(triacylglycerol)을 2-모노아실글리세롤(2-monoacylglycerol)과 지방산(fatty acid)으로 분해하는 핵심적인 반응을 진행시키는 효소로 작용한다. 이 췌장 지방분해효소의 활성을 저해하는 대표적인 화합물로는 Streptomyces toxitricini로부터 유래된 립스타틴(lipstatin)의 유도체인 테트라하이드로립스타틴(tetrahydrolipstatin)(Orlistat, Ro 18-0647)을 들 수 있다. 테트라하이드로립스타틴은 췌장 지방분해효소의 활성부위(active site)에 위치한 세린(serine)과 공유결합을 형성하여 지방분해효소(lipase)의 활성을 억제하는 것으로 보고되고 있으며, 그 효능이 매우 우수하여 섭취된 지방의 30%까지 저해하는 것으로 제시되어, 현재 의약품(Xenical, Roche Co.)으로도 시판되고 있다.

그러나 이와 같이 뛰어난 효능에도 불구하고 펜플루라민 등 기존 약물은 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변과 같은 부작용을 일으켜 최근에 사용이 금지되었으며, 다른 약물들도 혈압감소나 유산산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전, 신질환 등의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다. 또한 테트라하이드로립스타틴은 위장장애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성 비타민 흡수억제 등의 부작용에 대한 문제가 제기되고 있다. 따라서 화학적으로 합성된 약품들의 부작용의 우려 없이 안전 하게 예방·치료제로서 사용할 수 있는 식물 소재 및 물질에 대한 개발이 계속해서 요구되어 왔다.

비만은 과잉 영양성분이 연소되지 않고 체내에 지방으로 축적되는 데서 기인하는데, 비타민, 미네랄, 효소와 같은 영양 조절 인자가 풍부하면 인체의 신진대사가 촉진되어 체내 지방 축적을 방지할 뿐 아니라 축적된 지방을 배출할 수 있게 된다.

비타민 U는 1950년대에 발견된 지용성 비타민으로, 양배추와 신선한 야채즙 따위에 들어 있으며, 위·십이지장 궤양, 대장염, 위염 치료의 보조제로 사용되어지고 있다. 또한 창자에서 산의 분비와 효소 작용을 도와주는 역할을 한다. 비타민 U는 체내에서 콜린과 같은 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 과잉의 지방산이 체내에서 축적되는 것을 막아주고, 간장에서 지방을 제거시키는 작용을 갖고 있다.

상기 언급한 바와 같이, 비만 치료와 관련된 종래 약제들과 달리 비타민 U는 세포 독성 및 부작용이 없이 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 체내 지방축적을 감소시켜 항비만 효과를 나타낼 수 있음을 새롭게 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 체내 지방축적을 감소시켜 항비만 효과를 갖는 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항비만 효과를 갖는 비타민 U를 함유하는 건강기능식품조성물을 을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 비만의 치료 또는 예방의 목적으로 대상에 투여되어, 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 체내 지방축적을 감소시켜 항비만 효과를 갖는다. 특히, 본 발명의 약학적 조성물은 인체에 무해하고 세포독성이 없어 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 1 내지 70 중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제 및 연고제로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 비타민 U를 함유하는 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 비타민 U를 함유하는 식품 조성물은, 일반 식품류에 비타민 U를 첨가하여 일반 식품류에 항비만 효과를 부여한 건강기능성 식품을 말하는 것으로, 비타민 U를 일반 식품류에 첨가하여 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 식품 조성물을 섭취할 경우 비만의 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물에서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 비타민 U를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 비타민 U를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 비타민 U를 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로 조절 할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물을 비만의 치료 목적으로 이용하는 경우는 측정된 독성 범위 내의 비타민 U를 함유되도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 식품 조성물의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 비타민 U를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 구체적으로, 비타민 U를 함유하는 건강식품으로는 비타민 U를 주성분으로 만든 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 비타민 U는 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는, 비타민 U를 이용하여 지방세포의 렙틴 분비 실험, 지방세포내 글리세롤 분비량 측정, 비만 동물 모델에서 비만 예방 및 치료 효과 실험, 췌장 리파아제 활성 저해 실험 등을 수행하여 본 발명에 따른 비타민 U를 함유하는 화장료 조성물이 비만 예방, 치료 또는 개선에 효과적임을 증명하였다.

본 발명의 조성물에서, 상기 비타민 U의 화학적 명칭은 S-메틸메티오닌(S-methylmethionine)이며, 천연 아미노산의 일종으로 양배추에 풍부하게 함유된 항위궤양성 인자로 알려져 있으며, 녹색채소류인 브로콜리, 시금치, 파슬리, 샐러리, 상추 등에서 추출하거나 화학적으로 합성할 수 있다.

식물에서 추출하는 방법은 본 명세서에 구체적으로 개시되어 있으며, 화학적 합성방법은 다음과 같다.

비타민 U(S-메틸메티오닌)는, S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine: AdoMet)과 메티오닌(methionine: Met)으로부터 S-메틸메티오닌(S-Methylmethionine : SMM)과 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine: AdoHcy)이 생성되는 과정 (Met + AdoMet → SMM + AdoHcy)에서 얻을 수 있는데, 티오글라이코레이트(thioglycolate)를 4% 부피비로 95℃에서 3시간 처리한 L-메티오닌으로부터 만들 수 있고 AG-50(NH4+)를 처리하여 이 과정에서 남아 있는 메티오닌 설폭시드(Met sulfoxide) 등 기본적인 오염물질을 제거하여 비타민 U (구조식 1)를 합성할 수 있다.

[구조식 1]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

제조예 1. 양배추로부터 비타민 U의 추출

시중에서 구입한 양배추 잎을 잘게 파쇄하여 동결건조 시킨 샘플 100 g을 1 Kg의 80% 에탄올(물:95% 에탄올=2:8(부피비))로 일주일간 숙성한 후 여과하여 원물과 액을 분리하였다. 분리한 추출액을 농축한 후 회수되어진 용매와 동량의 0.2N-구연산나트륨 용액을 가한 후 2 내지 3분간 초음파 처리하면 정제되지 아니한 비타민U를 함유한 액을 얻을 수 있다. 이 액을 역상실리카겔(C18 silica gel, Merck社, USA) 컬럼크로마토그래피를 통하여 다섯 개로 분획하였다. 용매는 메탄올:정제수 = 1:1(부피비)을 사용하였으며, 얻어진 다섯 개의 분획을 TLC(박막크로마토그래피)를 통하여 비타민 U가 다량 함유되어있는 분획을 확인한 후 농축하였다. 농축되어진 파우더를 에탄올과 물의 혼합용매를 사용하여 재결정하여 정제되어진 비타민U 0.16 g을 얻었다.

제조예 2. 다양한 채소를 이용한 비타민 U의 추출

시중에서 구입한 브로콜리, 시금치, 파슬리, 샐러리, 상추 및 배추의 잎 100 g을 이용하여 상기 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 추출, 분획, 농축 및 정제함으로써, 비타민 U는 각각 브로콜리로부터 0.07 g, 시금치로부터, 0.04 g, 파슬리로부터 0.07 g, 샐러리로부터 0.08 g, 상추로부터 0.05 g, 그리고 배추로부터 0.12 g을 얻을 수 있었다.

추출된 비타민 U는 농도별(10 mM, 50 mM, 70 mM, 90 mM 및 100 mM)로 제조한 후 이하 실험의 시료로 사용하였다.

실시예 1. 지방세포의 배양

마우스의 배아에서 유래한 세포주인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행(Korea cell line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 unit/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 3, 4일 후 세포가 컨플루언트(confluent) 상태가 되면 0.05% 트립신-EDTA(Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)로 처리하여 계대 배양하였으며 배지는 2~3일마다 교환하였다. 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포밀도가 3.3×10³ cell/cm²가 되도록 현탁액 용액을 만들어 12-웰 플레이트에 1 ml 씩 분주하여 2차 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언트 상태가 되면, 5 μg/ml 인슐린, 0.25 μM 덱사메타존(dexamethazone), 0.5 mM IBMX(isobutyl-methylxanthine)가 함유된 10% FBS-DMEM 배양액으로 교환하여 분화를 유도한 후 2일 간격으로 5 ㎍/㎖ 인슐린을 함유한 배양액으로 교환하였다. 분화배지 처리 후 약 10일이 지나면 90% 이상이 지방세포로 분화된다.

실시예 2. 오일 레드 오 염색

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별 (10 mM, 50 mM, 100 mM)로 제조한 시료를 10 ㎕씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

24시간 반응 후 배지를 걷어내고 PBS로 두 차례 세척한 뒤 미리 차갑게 만들 어 둔 10% 포름알데히드가 함유된 PBS 1 ㎖을 넣고 1시간 동안 고정시킨 후 PBS를 이용하여 세 차례 세척하였다. 0.7% 오일 레드 오 용액(Muto Chemical, Tokyo, Japan)을 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 세포를 관찰하였으며 이 때, 붉은색으로 염색된 것이 지방세포이다. 이는 도 1에 나타내었으며, 비타민 U를 처리했을 때 지방 세포가 감소하는 것을 눈으로 확인할 수 있었다.

실시예 3. 비타민 U에 의한 렙틴 분비 감소 실험

분화된 지방세포를 5×10⁴ cells/well로 12-well 플레이트에서 24시간 배양시킨 후 HBSS(Hanks Balanced Salt Solutions)로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

지방세포에서 분비된 렙틴(leptin)의 양은 수집한 배지를 이용하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosolvent Assay, R&D systems) 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저 100 μl의 항-마우스 렙틴 IgG(anti-mouse leptin IgG, 2 ㎍/ml)를 Maxisorb ELISA plate (Nunc)에 넣어 오버나이트 동안 배양시킨 후 PBS-T (0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS)로 3차례 세척한 플레이트에 수집한 배지 100 ㎕를 넣어 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBS-T로 3차례 세척한 후 100 ㎕의 비오틴 처리한 항-마우스 렙틴 IgG (biotinylated anti-mouse leptin IgG, 200 ng/㎕)을 넣고 1시간 상온에서 배양한 후 다시 PBS-T로 3번 세척하였다. 엑스트라아비딘-고추냉이 페록시다아제 (Extravidin-horse radish peroxidase, 희석율=1:200, R&D Systems)를 상온에서 1 시간 배양시킨 후 3번 세척하였다. 면역반응성(Immunoreactivity)은 각 웰에 100 ㎕의 TMB(tetramethyl benzidine dihydrochloride substrate, TMB, Amresco)를 넣고 30분간 반응시킨 후 나타났다. 이 반응은 웰 당 50 ㎕의 2M H₂SO₄를 첨가함으로 반응을 종료시켰다. 반응 종료 후, 흡광도(Optical Density)는 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

비타민 U를 3T3-L1 지방세포에 처리하여 렙틴의 분비를 살펴본 결과, 도 2에서와 같이, 대조군(비타민 U 비처리군)에 비하여 비타민 U를 처리하였을 때 렙틴의 분비가 감소하는 것으로 나타났다.

렙틴은 지방세포에서만 분비되는 단백질로서 지방세포에서 분비되어 시상하부에 있는 렙틴 수용체에 결합하여 신경계로 자극을 전달한다. 이러한 자극신호는 음식의 섭취를 억제하고, 에너지 소비를 증가시켜 비만 유도를 조절하는 역할을 한다. 지방세포에서의 렙틴 분비량의 증가는 지방세포 내의 지방이 축적되는 것을 의 미하므로, 렙틴 분비의 감소는 처리한 비타민 U가 지방세포의 분화를 억제하거나 세포의 수 및 크기를 줄이는 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다.

실시예 4. 지방세포 독성 측정

지방세포인 3T3-L1 세포를 10% 우태아혈청(bovine calf serum)이 들어있는 DMEM에서 세포배양하였다. 세포밀도가 약 85∼90% 가량 될 때 비타민 U를 처리한 24시간 후 세포활성 정도를 측정하였다. 하기 표 1에서 보듯이 비타민 U를 지방세포주에 처리하였을 때, 세포독성이 없음을 관찰할 수 있었다.

[표 1]

	대조군	비타민 U 10 mM	비타민 U 25 mM	비타민 U 50 mM	비타민 U 100 mM
세포 생존율(%)	100 ± 0.8	101 ± 0.5	99 ± 0.3	98 ± 0.7	102 ± 0.1

실시예 5. 비타민 U의 지방세포 내 중성지방(triglyceride) 생성 억제 효능 평가

분화된 지방세포를 5×10⁴ cells/well로 12-well 플레이트에서 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

지방세포로 분화시킨 3T3-L1을 PBS로 3회 세척한 후 추출완충액(extraction buffer)(20 mM Tris, 1 mM EDTA 및 1 mM 2-머캅토에탄올)으로 수확하였다. 모은 세포를 얼음 상에서 G26 needle로 6회 통과한 다음, 500×g, 4℃에서 3분간 원심분리 하고 상층액만을 취하여 실험에 사용하였다. 미국 시그마사(St. Louis, MO, U.S.A.)로부터 구입한 GPO-TRINDER kit를 사용하여 중성지방(triglyceride, TG)을 발색 반응시킨 후 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

	대조군	비타민 U 10 mM	비타민 U 25 mM	비타민 U 50 mM	비타민 U 100 mM
TG 생성량(%)	100±0.8	40±0.2	32±0.3	27±0.4	15±0.1

표 2에 나타난 바와 같이, 비타민 U를 처리한 지방세포는 대조군에 비하여 비타민 U 농도의존적으로 중성지방의 농도가 감소되었다.

실시예 6. 웨스턴 블럿팅을 통한 비타민 U의 지방세포 내 AMPK (AMP-activated protein kinase)의 활성 측정

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 용해버퍼(lysis buffer: 20 mM tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 500 μM sodium orthovanadate, 1% triton X-100, 0.1% SDS, 10 mM NaF, 10 μg/mL leupeptin and 1 mM PMSF)를 처리하여 단백질을 분리하였다. 단백질의 농도는 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 기준으로 하여 Bio-Rad DC 단백질 분석법을 이용하여 측정하였다. 전체 단백질은 SDS-PAGE (10% acrylamide gel)을 실시한 후 그 젤을 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시켰다. 그 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 처리하여 블로킹한 후 PBST (Phosphate Buffered Saline Tween)로 세척하였다. 상기 막에 PBST로 1000배 희석한 1차 항체(p-AMPKa antibody, Santa Cruz Biotechnology, California, USA)를 4℃에서 오버나이트 동안 처리한 후 PBST로 세척하였다. PBST로 1000배 희석한 2차 항체(anti-rabbit IgG, Santa Cruz, California, USA)로 막을 1시간 반응시킨 후 PBST로 다시 세척하였다. 웨스턴 블럿팅의 검출은 Amersham ECL system (Amersham-Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)을 사용하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3a와 3b에서, AMPK 인산화(p-AMPK)는 지방세포내 활성이 비타민 U의 농도의 증가에 따라 유의적으로 증가하였다. 여기서, AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사 전환의 주된 조절자이며 탄수화물과 지방 대사에 중요한 역할을 담당하는 단백질로, AMPK를 활성화시킴으로써 에너지 대사 촉진과 지방 합성 저해 작용을 통해 항당뇨/비만 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 pAMPK의 활성의 증가는 비타민 U 처리가 항비만 효과가 있음을 의미한다.

실시예 7. RT-PCR을 통한 비타민 U의 지방세포 분화 저해능 검정

7-1. 3T3-L1 세포주로부터 mRNA 획득

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 1 ml의 QIAzol (Qiagen, Germany)을 가하여 세포를 파괴시켰다. 이를 각각 1.5 ml microfuge 튜브로 옮긴 후, 클로로포름 0.2 ml을 처리하여 잘 섞어준 후 15,000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하였다. RNA를 함유한 상층액과 75% 에탄올 350 μl을 RNeasy spin column (Qiagen, Germany)에 넣고 스핀다운하고 RNA외의 요소들을 제거한 후, RNase가 없는 증류수 40 μl을 첨가하여 mRNA를 획득하였다.

7-2. 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 실시

비타민 U의 지방세포 분화와 관련하여, 마우스 지방세포 특이적 마커인 PPAR-γ, C/EBP-α, ADD-1, adipsin, FAS, LPL의 발현량을 확인하기 위해 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응을 실시하였으며 이는 올인원 RT-PCR 키트 (Rexgene, Korea) 및 상기 키트의 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였다.

구체적으로, 상기에서 얻은 mRNA 1 μg, 5X reaction buffer 5 μl, 2.5 mM dNTP 3 μl, 10 pM 프라이머 (Bioneer, Korea) 각 3 μl씩, 올인원 Enzyme mix 1 μl에 최종 부피가 25 μl이 되게 증류수를 넣어 제조하였다. 상기 마우스 지방세포 특이적 유전자의 발현량을 확인하기 위해 사용한 프라이머 쌍은 하기 표 3에 각각 기재하였다. 또한 각 유전자의 발현을 비교하기 위해 Housekeeping 유전자 중 하나인 β-actin을 사용하였다.

[표 3]

구 분		염기서열 (5' -> 3')
PPAR-γ	정방향 (Forward, 20mer)	aga cat cag cgc cta cat cg
PPAR-γ	역방향 (Reverse, 20mer)	gct ccc ggg tag tca aag tc
C/EBP-α	정방향 (Forward, 20mer)	aga cat cag cgc cta cat cg
C/EBP-α	역방향 (Reverse, 20mer)	gct ccc ggg tag tca aag tc
ADD-1	정방향 (Forward, 21mer)	agg cac act tca tca agg cag
ADD-1	역방향 (Reverse, 21mer)	ggt agc gct tct caa tgg cat
Adipsin	정방향 (Forward, 20mer)	gcc tga tgt cct gca tca ac
Adipsin	역방향 (Reverse, 20mer)	ttt tcg atc cac atc cgg ta
LPL	정방향 (Forward, 20mer)	aga aaa ccc cag caa agc at
LPL	역방향 (Reverse, 20mer)	gag aaa ttt cga agg cct gg
FAS	정방향 (Forward, 20mer)	tga agg tga aca agg caa gc
FAS	역방향 (Reverse, 20mer)	ggg tcg ata tag atg gcg gt

여기서, 상기 PPARγ는 지방 조직에서 주로 발현되는데 PPARγ target 유전자는 지방조직에 집중되어 있고 지방 조직 생성과 지질(lipid) 저장에 중요한 역할을 담당한다. 지방조직생성(adipogenesis)은 지방전구세포(preadipocyte)가 증식과 분화 과정을 거쳐 성숙한 지방세포(adipocyte)로 되는 것으로써 지방분화 유도물질로 작용하는 지방산과 프로스타글란딘과 같은 리간드가 PPARδ (proliferator activated receptor δ)에, 글루코코르티코이드(Glucocorticoids)와 같은 호르몬은 C/EBPβ (CCAAT/enhancer binding protein β)와 δ에 작용하는 것으로 분화유도가 시작되고 인슐린은 ADD-1 (adipocyte determination and differentiation factor-1)에 작용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 인자들에 의하여 분화가 유도되면서 활성을 받은 전사인자 PPARδ는 분화과정에서 PPARγ의 발현을 유도하며 C/EBPβ와 C/EBPδ는 C/EBPα와 PPARγ의 발현에 관여하고 인슐린에 의한 ADD-1의 활성은 PPARγ의 전사를 유도하는 것으로 보고 되고 있다. 이렇게 전사활성을 받은 C/EBPα와 PPARγ는 지방세포로 분화하는데 관여하는 유전자들(adipsin, LPL (Lipoprotein lipase), FAS (Fatty acid synthase) 등)의 전사활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

상기 RT-PCR을 수행한 결과, 도 4에서와 같이, 비타민U 100 mM 처리시 C/EBP-α 및 PPAR-γ, ADD-1의 발현량이 현저히 감소하였고 그에 따라 adipsin의 mRNA 발현량이 감소하였다. 또한 FAS의 발현량이 비타민U 농도 의존적으로 유의적으로 감소하였으며 지방분해효소인 LPL의 발현량은 거의 일정하게 유지되었다. 따라서 비타민 U 처리시 지방세포 분화가 감소된 것을 알 수 있다.

실시예 8. 비만 모델 동물인 Lepr ^db /Lepr ^db 마우스에서 비만 예방 및 치료효과 검정

Lepr^db/Lepr^db 마우스는 렙틴 유전자의 돌연변이에 의하여 렙틴의 분비가 저하되어 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 혈당이 상승하게 되는데 출생 후 약 10-11주 정도가 되면 체중이 대략 50 g 내외가 된다. 따라서 비만예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 체중이 50 g 정도 되는 성숙한 Lepr^db/Lepr^db 마우스를 각 군 당 10 마리씩을 대상으로 하였다. 한 개의 실험군 당 10 마리씩으로 하여 비타민 U를 50 mg/일/마우스가 되도록 30일 동안 경구 투여하였다. 대조군 10 마리의 경우에는 비타민 U 대신 증류수를 투여하였다.

도 5에서, 실험군과 대조군은 투여기간에 따른 체중의 변화를 비교하였으며, 비타민 U가 체중감소에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 9. 췌장 지방분해효소 활성 및 저해능의 측정

췌장 지방분해효소(Pancreatic lipase)의 활성 및 저해능을 측정하기 위해 0.1M NaCl이 포함된 0.1M N-tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethanesulfonic acid (pH 7.0) 9 ml에 triolein 90 μM, gum arabic 45 mg, taurocholic acid 9.45 μM을 첨가하고 sonicator로 5분 동안 처리하여 반응 기질 용액을 제조하였다. 제조된 기질 용액에 대해 효소용액(pancreatin lipase, 1,500 U/ml) 15 μl, 비타민 U 5 μl (농도별 10 mM, 25 mM, 50 mM 및 100 mM), 기질 용액 180 μl을 혼합하여 최종 부피가 200 μl이 되도록 반응용액을 제조한 뒤(pH 7.0), 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응용액 0.2 ml에 2% (v/v) 메탄올이 포함된 클로로포름/헵탄(chloroform/heptane) (1:1) 용액 3 ml을 첨가하여 10분 동안 혼합한 후, 10분 동안 원심분리(2,000×g)하여 물 층을 제거하였으며, 여기에 copper hydroxyanisole이 포함된 0.1% (w/v) bathocuprione 용액 1 ml을 첨가하여 혼합하였다. 그런 다음, 최종 반응액에 대해 480 nm에서 흡광도를 측정하여 효소반응 후 생성된 올레산(oleic acid)의 양을 측정하였다.

대조구로서는 현재 비만 치료제로 시판되고 있는 올리스타트(Orlistat)를 사용하였으며, 췌장 지방분해효소 활성에 대한 저해능은 시료를 처리하지 않았을 때의 췌장 지방분해효소 활성을 기준으로 하여 계산하여 그 결과를 하기 표 4에 나타 내었다.

[표 4]

	Orlistat	비타민 U 10 mM	비타민 U 25 mM	비타민 U 50 mM	비타민 U 100 mM
pancreatic lipase 활성 저해능(%)	88% ± 0.2	87% ± 0.1	89% ± 0.2	92% ± 0.7	93% ± 0.3

상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 올리스타트의 경우 88%의 저해활성을 나타냈으며, 이와 비교하여 비타민 U의 경우 87~93%로 올리스타트보다 높은 저해활성을 보였다.

제형예 1. 정제의 제조

비타민 U 600 g

아르기닌 240 g

결정셀룰로오스 140 g

스테아르산 마그네슘 10 g

하이드록시프로필메칠셀룰로오스 10 g

제형예 2. 분말제의 제조

비타민 U 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 젤라틴으로 이루어진 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

제형예 3. 비타민 U의 우유에의 적용

우유 99g

비타민 U 1g

제형예 4. 비타민 U의 오렌지 쥬스에의 적용

액상과당 ------------------ 5%

폴리덱스트로스 ------------ 1%

구연산 -------------------- 5%

비타민C ------------------- 0.02%

비타민 U ------------------ 2%

오렌지과즙농축액 ---------- 25%

물 ------------------------ 67%

제형예 5. 음료의 제조

젖산칼슘 50 ㎎

구연산 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

아르기닌 30 ㎎

비타민 U 100 ㎎

물 200 ml

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비타민 U를 함유하는 조성물은 세포 독성이 없고 인체에도 무해하면서 체내 피하지방 분해, 셀룰라이트 제거 및 탄력 증진에 매우 효과가 있으므로 비만의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 뿐만 아니라 항비만 활성을 갖는 건강기능 식품의 개발에 적용할 경우 시장 경쟁력이 매우 우수할 것으로 기대된다.

도 1은 비타민 U를 처리한 지방세포를 오일 레드 오 염색을 통해 나타낸 것으로 처리 농도별 세포 사진과 측정 결과이다.

도 2는 비타민 U를 처리한 지방세포에서 분비된 렙틴의 양을 측정한 결과이다.

도 3은 비타민 U의 처리에 의한 AMPK의 활성을 웨스턴 블럿팅을 통해 측정한 결과이다.

도 4는 비타민 U의 처리에 의한 지방 세포 특이적 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다.

도 5는 비타민 U의 처리에 의한 비만 동물 모델에서 체중감소의 변화를 나타낸 결과이다.

Claims

비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 1 내지 70 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제 및 연고제로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
비타민 U를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 U는 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 또는 췌장 리파아제 활성 저해를 통해 항비만 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민 U는 양배추, 브로콜리, 시금치, 파슬리, 샐러리, 상추 및 배추로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 채소로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.