KR101602884B1 - 비타민 ｕ를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물에 관한 것으로, 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 분해하여 배출하는 과정을 촉진하고 체지방을 감소시키고, 피하 지방층을 감소시켜 날씬한 몸매를 만드는데 효과적이며, 울퉁불퉁한 피부의 원인이 되는 셀룰라이트를 감소시키는 효과가 있어 탄력있고 매끈한 피부를 만들어 줄 뿐만 아니라, 인체에 무해하고 피부자극을 일으키지 않는다.

비타민 U, 슬리밍, 지방 분해, 렙틴, 중성지방

Description

비타민 Ｕ를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물 {Cosmetic compositions for slimming comprising vitamin U}

본 발명은 비타민 U를 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로, 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 분해하고 셀룰라이트를 감소시킴으로써 바디 슬리밍 효과가 탁월한 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물에 관한 것이다.

1990년대 이후 국내 경제의 발전과 과학기술의 고도성장은 특히 식생활의 풍요로움을 가져왔다. 이에 따른 서구적 식생활 패턴과 생활의 편리화로 인하여, 인스턴트식품의 섭취 및 운동 부족을 야기하여 비만의 발병률은 계속해서 증가하고 있는 실정이다.

비만과 과체중은 섭취한 에너지 중 체내에서의 대사활동으로 소비하고 남은 것이 지방조직에서 중성지방으로 전환되어 축적되어 발생한다. 비만의 원인은 아직 완전히 규명된 것은 아니나 유전, 내분비 장애, 과다한 열량 섭취, 신진대사, 운동 부족, 잘못된 식습관, 스트레스 등 복합적인 요인에 의해 생기며 어떤 원인에 의한 것이든 신체에서 소모되는 에너지보다 섭취되는 에너지가 많음에 기인한다고 볼 수 있다.

비만인 사람은 자신의 체형 때문에 열등감을 느끼고, 대인관계가 원만치 못하므로 사회생활에도 지장을 초래하는 질병이기도 하지만, 최대문제는 비만에 의해 발생되는 합병증이다. 비만으로 인하여, 혈액 내의 콜레스테롤과 중성지방의 양이 증가되는 고지혈증이 발생되어 고혈압, 심혈관계 질환 및 뇌졸중의 발생이 증가하며, 말초조직과 복부지방조직에서의 중성지방 축적 또는 말초조직 중성지방의 증가로 인슐린 저항성이 유발되어 제 2형 당뇨병을 발생시킬 수 있다. 이는 비만인에서 당뇨병 발생 빈도가 정상인보다 40배 이상 높은 이유이기도 하다. 또한, 비만은 관절염, 호흡기능 장애, 불임 및 월경불순, 악성종양 등과 같은 여러 가지 합병증이 유발되기 때문에 장기적인 관리와 치료가 절대적으로 필요하다. 따라서 비만은 외형적 및 심리적인 문제 뿐 아니라 성인병 발생의 제 1위험 요소이자 심각한 사회문제로 간주되고 있다.

또한 최근 들어 생활수준의 향상으로 피부 미용에 대한 관심과 기대가 증가하면서, 여성들의 화장품, 특히 기능성 미용제품에 대한 관심이 날로 고조되고 있다. 즉, 기초화장뿐만 아니라 미적 향상 수단 및 외부 자극인 햇빛, 바람, 비 등으로부터 피부를 보호하는 수단으로서 기능성 화장품 제품이 각광받고 있다. 이에 따라 과지방 제거 및 피부 탄력을 부여하는 슬리밍 제품에 대한 관심도 계속 증가되고 있다.

셀룰라이트(cellulite)는 여성의 피부 및 피하 지방에서 주로 발생하며, 과도한 지방과 노폐물의 축적으로 인한 순환장애로 인하여 거친 오렌지 껍질 같이 울퉁불퉁한 피부가 되는 현상이다. 상기 셀룰라이트의 발생 원인은 단순한 비만과는 차이가 있으나 근본적으로는 지방 세포의 증가나 비대에 그 원인이 있으므로, 지방 세포내의 지방을 분해하여 배출시켜 주는 것이 궁극적으로는 날씬하고 매끈한 몸매를 만드는데 도움을 줄 수 있다.

이러한 비만과 셀룰라이트를 개선하고 에너지 소비를 증대하기 위한 방법으로서 식이요법, 운동요법, 수술요법 및 약물 요법 등의 다양한 방법들이 현재 비만 치료를 위해 사용되고 있다. 그러나 이러한 방법들은 비만을 완전하게 제거할 수는 없으며 요요현상이나 심각한 부작용들이 보고되고 있어 아직은 안전성에 대한 명확한 보장이 없는 실정이다, 따라서, 종래의 물질과 동등하거나 그 이상의 효능을 나타내면서도 인체에 대해서는 좀 더 안전한 새로운 물질을 개발해야 할 필요성이 대두되고 있다.

슬리밍이란 국소비만 상태의 개선, 즉 지방세포 내의 트리글리세라이드 및 체액 축적을 감소시킴과 동시에 피부를 탄력 있게 가꾸어주는 것을 말하는데, 이와 같은 슬리밍 효과와 관련된 화장품들이 세계적으로 개발되고 있는바, 미국 특허 제5,215,759호에서는 카페인, 테오필린, 젖산나트륨 등의 성분을 이용하여 슬리밍 효과를 부여한 제품이 개시되어 있고, 미국 특허 제5,362,494호에서는 크산틴과 글리콜산을 이용하여 슬리밍 효과를 부여하고 있는 것이 개시되어 있으며, 미국 특허 제5,523,096호에서는 알파히드록시산 등을 이용한 슬리밍 효과를 개시하고 있다.

비만은 과잉 영양성분이 연소되지 않고 체내에 지방으로 축적되는 데서 기인하는데, 비타민, 미네랄, 효소와 같은 영양조절인자가 풍부하면 인체의 신진대사가 촉진되어 체내 지방축적을 방지할 뿐 아니라 축적된 지방을 배출할 수 있게 된다.

비타민 U는 1950년대에 발견된 지용성 비타민으로, 양배추와 신선한 야채즙 따위에 들어 있으며, 위궤양, 십이지장 궤양, 대장염, 위염 치료의 보조제로 사용되어지고 있다. 또한 창자에서 산의 분비와 효소 작용을 도와주는 역할을 한다. 비타민 U는 체내에서 콜린과 같은 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 과잉의 지방산이 체내에서 축적되는 것을 막아주고, 간장에서 지방을 제거시키는 작용을 갖고 있다.

상기 언급한 바와 같이, 슬리밍 효과와 관련된 기술들이 이전에도 개발되어 있긴 하지만 비타민 U의 슬리밍 효과에 대해서는 알려져 있지 않다. 따라서 본 발명자들은 건위채소로 잘 알려져 있는 양배추 등에 함유되어 있는 비타민 U가 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 분해하고 항-셀룰라이트 효과가 있음을 새롭게 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 지방세포 내에 축적되어 있는 중성지방을 분해하고 항-셀룰라이트 효과를 갖는 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 비타민 U를 유효성분으로 함유하는 슬리밍용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 도포 시 세포 내의 중성지방 분해가 촉진되어 피하지방을 선택적으로 제거하여 탄력 있는 몸매를 만드는데 도움을 줄 수 있다. 또한, 단지 피하지방의 감소효과만 갖는 것이 아니라, 여성의 셀룰라이트 부위에서 비대해진 지방세포에 의한 울퉁불퉁함을 감소시켜 탄력과 매끄러움 회복에 뛰어난 안티-셀룰라이트 효과도 갖는다. 특히, 본 발명의 조성물은 인체에 무해하고 피부에 대한 자극이 거의 없어 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “슬리밍(slimming)”은 국소비만 상태의 개선, 즉 지방세포 내의 트리글리세라이드 및 체액 축적을 감소시킴과 동시에 피부를 탄력 있게 가꾸어주는 것을 의미하며, 상기 ‘셀룰라이트(cellulite)’는 과도한 영양분을 섭취하거나 유전적으로 지방을 분해·합성하는 효소 또는 호르몬의 작용이 비정상적인 경우 지방이 과도하게 축적되어 지방세포의 부피가 증가되고 모세혈관을 압 박하거나 진피를 비정상적으로 변하게 하는 현상을 의미한다.

본 발명의 조성물에서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에서, 상기 비타민 U의 화학적 명칭은 S-메틸메티오닌(S-methylmethionine)이며, 천연 아미노산의 일종으로 양배추에 풍부하게 함유된 항위궤양성 인자로 알려져 있다. 비타민 U는 식물에서 추출하거나 화학적으로 합성할 수 있다.

식물에서 추출하는 방법은 본 명세서에 구체적으로 개시되어 있으며, 화학적 합성방법은 다음과 같다.

비타민 U(S-메틸메티오닌)는, S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine: AdoMet)과 메티오닌(methionine: Met)으로부터 S-메틸메티오닌(S-Methylmethionine: SMM)과 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine: AdoHcy)이 생성되는 과정 (Met + AdoMet → SMM + AdoHcy)에서 얻을 수 있는데, 티오글리콜레이트(thioglycolate)를 4% 부피비로 95℃에서 3 시간 처리한 L-메티오닌으로부터 만들 수 있고 AG-50(NH₄ ⁺)을 처리하여 이 과정에서 남아 있는 메티오닌 설폭사이드(Met sulfoxide) 등 기본적인 오염물질을 제거하여 비타민 U를 합성할 수 있다 (구조식 1 참조).

[구조식 1]

본 발명의 조성물에서, 상기 비타민 U는 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 항-셀룰라이트 또는 피부탄력 증진작용을 통해 슬리밍 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는, 비타민 U를 이용하여 지방세포의 렙틴 분비 실험, 지방세포 내 글리세롤 분비량 측정, 지방세포 내 중성지방 생성 억제 실험, 항-셀룰라이트 효과 실험, 피부탄력 증진 효과 실험 등을 수행하여 본 발명에 따른 비타민 U를 함유하는 화장료 조성물이 바디 슬리밍에 효과적임을 증명하였다.

본 발명의 조성물을 화장료 형태로 제조하는 경우, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

제조예 1. 양배추로부터 비타민 U의 추출

시중에서 구입한 양배추 잎을 잘게 파쇄하여 동결건조 시킨 샘플 100 g을 1 Kg의 80% 에탄올(물:95% 에탄올=2:8(부피비))로 일주일간 숙성한 후 여과하여 원물과 액을 분리하였다. 분리한 추출액을 농축한 후 회수되어진 용매와 동량의 0.2N-구연산나트륨 용액을 가한 후 2 내지 3분간 초음파 처리하면 정제되지 아니한 비타민U를 함유한 액을 얻을 수 있다. 이 액을 역상실리카겔(C18 silica gel, Merck社, USA) 컬럼크로마토그래피를 통하여 다섯 개로 분획하였다. 용매는 메탄올:정제수 = 1:1(부피비)을 사용하였으며, 얻어진 다섯 개의 분획을 TLC(박막크로마토그래피)를 통하여 비타민 U가 다량 함유되어있는 분획을 확인한 후 농축하였다. 농축되어진 파우더를 에탄올과 물의 혼합용매를 사용하여 재결정하여 정제되어진 비타민U 0.16g을 얻었다.

제조예 2. 다양한 채소를 이용한 비타민 U의 추출

시중에서 구입한 브로콜리, 시금치, 파슬리, 샐러리, 상추 및 배추의 잎 100 g을 이용하여 상기 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 추출, 분획, 농축 및 정제함으로써, 비타민 U는 각각 브로콜리로부터 0.07 g, 시금치로부터, 0.04 g, 파슬리로부터 0.07 g, 샐러리로부터 0.08 g, 상추로부터 0.05 g, 그리고 배추로부터 0.12 g을 얻을 수 있었다.

추출된 비타민 U는 농도별(10 mM, 25 mM, 50 mM, 70 mM, 90 mM 및 100 mM)로 제조한 후 이하 실험의 시료로 사용하였다.

실시예 1. 지방세포의 배양

마우스의 배아에서 유래한 세포주인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행(Korea cell line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 100 unit/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 3, 4일 후 세포가 컨플루언트(confluent) 상태가 되면 0.05% 트립신-EDTA(Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)로 처리하여 계대 배양하였으며 배지는 2~3일마다 교환하였다. 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포밀도가 3.3×10³ cell/cm²가 되도록 현탁액 용액을 만들어 12-웰 플레이트에 1 ml씩 분주하여 2차 배 양하였다. 세포가 80% 컨플루언트 상태가 되면, 5 μg/ml 인슐린, 0.25 μM 덱사메타존(dexamethazone), 0.5 mM IBMX(isobutyl-methylxanthine)가 함유된 10% FBS-DMEM 배양액으로 교환하여 분화를 유도한 후 2일 간격으로 5 ㎍/㎖ 인슐린을 함유한 배양액으로 교환하였다. 분화배지 처리 후 약 10일이 지나면 90% 이상이 지방세포로 분화된다.

실시예 2. 오일 레드 오 염색

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별 (10 mM, 50 mM, 100 mM)로 제조한 시료를 10 ㎕씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

24시간 반응 후 배지를 걷어내고 PBS로 두 차례 세척한 뒤 미리 차갑게 만들 어 둔 10% 포름알데히드가 함유된 PBS 1 ㎖을 넣고 1시간 동안 고정시킨 후 PBS를 이용하여 세 차례 세척하였다. 0.7% 오일 레드 오 용액(Muto Chemical, Tokyo, Japan)을 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 세포를 관찰하였으며 이 때, 붉은색으로 염색된 것이 지방세포이다. 이는 도 1에 나타내었으며, 비타민 U를 처리했을 때 지방 세포가 감소하는 것을 눈으로 확인할 수 있었다.

실시예 3. 비타민 U에 의한 렙틴 분비 감소 실험

분화된 지방세포를 5×10⁴ cells/well로 12-well 플레이트에서 24시간 배양시킨 후 HBSS(Hanks Balanced Salt Solutions)로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

지방세포에서 분비된 렙틴(leptin)의 양은 수집한 배지를 이용하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosolvent Assay, R&D systems) 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저 100 μl의 항-마우스 렙틴 IgG(anti-mouse leptin IgG, 2 ㎍/ml)를 Maxisorb ELISA plate(Nunc)에 넣어 오버나이트 동안 배양시킨 후 PBS-T (0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS)로 3차례 세척한 플레이트에 수집한 배지 100 ㎕를 넣어 1시간 배양하였다. 다시 PBS-T로 3차례 세척한 후 100 ㎕의 비오틴 처리한 항-마우스 렙틴 IgG (biotinylated anti-mouse leptin IgG, 200 ng/μl)을 넣고 1시간 상온에서 배양한 후 다시 PBS-T로 3번 세척하였다. 엑스트라아비딘-고추냉이 페록시다아제 (Extravidin-horse radish peroxidase, 희석율=1:200, R&D Systems)를 상온에서 1 시간 배양시킨 후 3번 세척하였다. 면역반응성 (Immunoreactivity)은 각 웰에 100 ㎕의 TMB(tetramethyl benzidine dihydrochloride substrate, TMB, Amresco)를 넣고 30분간 반응시킨 후 나타났다. 이 반응은 웰 당 50 ㎕의 2M H₂SO₄를 첨가함으로 반응을 종료시켰다. 반응 종료 후, 흡광도(Optical Density)는 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

비타민 U를 3T3-L1 지방세포에 처리하여 렙틴의 분비를 살펴본 결과, 도 2에서와 같이, 대조군(비타민U 비처리구)에 비하여 비타민 U를 처리하였을 때 렙틴의 분비가 감소하는 것으로 나타났다.

렙틴은 지방세포에서만 분비되는 단백질로서 지방세포에서 분비되어 시상하부에 있는 렙틴 수용체에 결합하여 신경계로 자극을 전달한다. 이러한 자극신호는 음식의 섭취를 억제하고, 에너지 소비를 증가시켜 비만 유도를 조절하는 역할을 한다. 지방세포에서의 렙틴 분비량의 증가는 지방세포 내의 지방이 축적되는 것을 의미하므로, 렙틴 분비의 감소는 처리한 비타민 U가 지방세포의 분화를 억제하거나 세포의 수 및 크기를 줄이는 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다.

실시예 4. 지방세포 독성 측정

지방세포인 3T3-L1 세포를 10% 우태아혈청(bovine calf serum)이 들어있는 DMEM에서 세포배양하였다. 세포밀도가 약 85∼90% 가량 될 때 비타민 U를 처리한 24시간 후 세포활성 정도를 측정하였다. 하기 표 1에서 보듯이 비타민 U를 지방세포주에 처리하였을 때, 세포독성이 없음을 관찰할 수 있었다.

[표 1]

	대조군	비타민 U 10 mM	비타민 U 25 mM	비타민 U 50 mM	비타민 U 100 mM
세포 생존율(%)	100±0.8	101±0.5	99±0.3	98±0.7	102±0.1

실시예 5. 비타민 U의 지방세포 내 중성지방(triglyceride) 생성 억제 효능 평가

분화된 지방세포를 5×10⁴ cells/well로 12-well 플레이트에서 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다.

상기 세포를 PBS로 3회 세척한 후 추출완충액(extraction buffer)(20 mM Tris, 1 mM EDTA 및 1 mM 2-머캅토에탄올)으로 수확하였다. 모은 세포를 얼음 상에서 G26 needle로 6회 통과한 다음, 500×g, 4℃에서 3분간 원심분리하고 상층액만을 취하여 실험에 사용하였다. 미국 시그마사(St. Louis, MO, U.S.A.)로부터 구입한 GPO-TRINDER kit를 사용하여 중성지방(triglyceride, TG)을 발색 반응시킨 후 540nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

	대조군	비타민 U 10 mM	비타민 U 25 mM	비타민 U 50 mM	비타민 U 100 mM
TG 생성량(%)	100 ± 0.8	40 ± 0.2	32 ± 0.3	27 ± 0.4	15 ± 0.1

표 2에 나타난 바와 같이, 비타민 U를 처리한 지방세포는 대조군에 비하여 비타민 U 농도의존적으로 중성지방의 농도가 감소되었다.

실시예 6. 웨스턴 블럿팅을 통한 비타민 U의 지방세포 내 AMPK (AMP-activated protein kinase)의 활성 측정

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 용해버퍼(lysis buffer: 20 mM tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 500 μM sodium orthovanadate, 1% triton X-100, 0.1% SDS, 10 mM NaF, 10 μg/mL leupeptin and 1 mM PMSF)를 처리하여 단백질을 분리하였다. 단백질의 농도는 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 기준으로 하여 Bio-Rad DC 단백질 분석법을 이용하여 측정하였다. 전체 단백질은 SDS-PAGE (10% acrylamide gel)을 실시한 후 그 젤을 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시켰다. 그 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 처리하여 블로킹한 후 PBST (Phosphate Buffered Saline Tween)로 세척하였다. 상기 막에 PBST로 1000배 희석한 1차 항체(p-AMPKa antibody, Santa Cruz Biotechnology, California, USA)를 4℃에서 오버나이트 동안 처리한 후 PBST로 세척하였다. PBST로 1000배 희석한 2차 항체(anti-rabbit IgG, Santa Cruz, California, USA)로 막을 1시간 반응시킨 후 PBST로 다시 세척하였다. 웨스턴 블럿팅의 검출은 Amersham ECL system (Amersham-Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)을 사용하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3a와 3b에서, AMPK 인산화(p-AMPK)는 지방세포내 활성이 비타민 U의 농도의 증가에 따라 유의적으로 증가하였다. 여기서, AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내 에너지 상태의 변화에 반응하여 대사 전환의 주된 조절자이며 탄수화물과 지방 대사에 중요한 역할을 담당하는 단백질로, AMPK를 활성화시킴으로써 에너지 대사 촉진과 지방 합성 저해 작용을 통해 항당뇨/비만 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 pAMPK의 활성의 증가는 비타민 U 처리가 항비만 효과가 있음을 의미한다.

실시예 7. RT-PCR을 통한 비타민 U의 지방세포 분화 저해능 검정

7-1. 3T3-L1 세포주로부터 mRNA 획득

분화된 지방세포를 1×10⁶ cells/well로 60 mm dish에 24시간 배양시킨 후 HBSS로 한차례 세척하고 FBS를 넣지 않은 배지로 교환한 후, 처리 농도별로 제조한 시료를 10 μl씩 첨가하여 24시간 반응시켰다. 배지를 제거한 후 1 ml의 QIAzol (Qiagen, Germany)을 가하여 세포를 파괴시켰다. 이를 각각 1.5 ml microfuge 튜브로 옮긴 후, 클로로포름 0.2 ml을 처리하여 잘 섞어준 후 15,000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하였다. RNA를 함유한 상층액과 75% 에탄올 350 μl을 RNeasy spin column (Qiagen, Germany)에 넣고 스핀다운하고 RNA외의 요소들을 제거한 후, RNase가 없는 증류수 40 μl을 첨가하여 mRNA를 획득하였다.

7-2. 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 실시

비타민 U의 지방세포 분화와 관련하여, 마우스 지방세포 특이적 마커인 PPAR-γ, C/EBP-α, ADD-1, adipsin, FAS, LPL의 발현량을 확인하기 위해 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응을 실시하였으며 이는 올인원 RT-PCR 키트 (Rexgene, Korea) 및 상기 키트의 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였다.

구체적으로, 상기에서 얻은 mRNA 1 μg, 5X reaction buffer 5 μl, 2.5 mM dNTP 3 μl, 10 pM 프라이머 (Bioneer, Korea) 각 3 μl씩, 올인원 Enzyme mix 1 μl에 최종 부피가 25 μl이 되게 증류수를 넣어 제조하였다. 상기 마우스 지방세포 특이적 유전자의 발현량을 확인하기 위해 사용한 프라이머 쌍은 하기 표 3에 각각 기재하였다. 또한 각 유전자의 발현을 비교하기 위해 Housekeeping 유전자 중 하나인 β-actin을 사용하였다.

[표 3]

구 분		염기서열 (5' -> 3')
PPAR-γ	정방향 (Forward, 20mer)	aga cat cag cgc cta cat cg
	역방향 (Reverse, 20mer)	gct ccc ggg tag tca aag tc
C/EBP-α	정방향 (Forward, 20mer)	aga cat cag cgc cta cat cg
	역방향 (Reverse, 20mer)	gct ccc ggg tag tca aag tc
ADD-1	정방향 (Forward, 21mer)	agg cac act tca tca agg cag
	역방향 (Reverse, 21mer)	ggt agc gct tct caa tgg cat
Adipsin	정방향 (Forward, 20mer)	gcc tga tgt cct gca tca ac
	역방향 (Reverse, 20mer)	ttt tcg atc cac atc cgg ta
LPL	정방향 (Forward, 20mer)	aga aaa ccc cag caa agc at
	역방향 (Reverse, 20mer)	gag aaa ttt cga agg cct gg
FAS	정방향 (Forward, 20mer)	tga agg tga aca agg caa gc
	역방향 (Reverse, 20mer)	ggg tcg ata tag atg gcg gt

여기서, 상기 PPARγ는 지방 조직에서 주로 발현되는데 PPARγ target 유전자는 지방조직에 집중되어 있고 지방 조직 생성과 지질(lipid) 저장에 중요한 역할을 담당한다. 지방조직생성(adipogenesis)은 지방전구세포(preadipocyte)가 증식과 분화 과정을 거쳐 성숙한 지방세포(adipocyte)로 되는 것으로써 지방분화 유도물질로 작용하는 지방산과 프로스타글란딘과 같은 리간드가 PPARδ (proliferator activated receptor δ)에, 글루코코르티코이드(Glucocorticoids)와 같은 호르몬은 C/EBPβ (CCAAT/enhancer binding protein β)와 δ에 작용하는 것으로 분화유도가 시작되고 인슐린은 ADD-1 (adipocyte determination and differentiation factor-1)에 작용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 인자들에 의하여 분화가 유도되면서 활성을 받은 전사인자 PPARδ는 분화과정에서 PPARγ의 발현을 유도하며 C/EBPβ와 C/EBPδ는 C/EBPα와 PPARγ의 발현에 관여하고 인슐린에 의한 ADD-1의 활성은 PPARγ의 전사를 유도하는 것으로 보고 되고 있다. 이렇게 전사활성을 받은 C/EBPα와 PPARγ는 지방세포로 분화하는데 관여하는 유전자들(adipsin, LPL (Lipoprotein lipase), FAS (Fatty acid synthase) 등)의 전사활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

상기 RT-PCR을 수행한 결과, 도 4에서와 같이, 비타민U 100 mM 처리시 C/EBP-α 및 PPAR-γ, ADD-1의 발현량이 현저히 감소하였고 그에 따라 adipsin의 mRNA 발현량이 감소하였다. 또한 FAS의 발현량이 비타민U 농도 의존적으로 유의적으로 감소하였으며 지방분해효소인 LPL의 발현량은 거의 일정하게 유지되었다. 따라서 비타민 U 처리시 지방세포 분화가 감소된 것을 알 수 있다.

실시예 8. 비타민 U의 피부 자극 정도 평가

뉴질랜드산 흰토끼의 피부에 10% 비타민 U 용액을 1일 2회 간격으로 4일간 총 8회 도포하였다. 도포 후 홍반 및 가피형성 평점과 부종 평점 값을 누적시켜 피부누적자극 지수를 구하였다. 피부누적자극 지수는 하기 표 4에 나타낸 판정 기준에 따라 평가하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 결과에 나타낸 자극 지수는 일반적으로 많이 이용되는 Draize의 피부 일차자극지수(Primary Irritation Index, P.I.I.)의 산출방법에 따랐다(Draize, J.H., Appraisal of the safety of chemical in foods, drugs and cosmetics).

[표 4]

피부 자극의 정도		평점
홍반과 가피 형성	홍반이 없음	0
	아주 경도의 홍반 (육안으로 겨우 식별할 정도)	1
	명료한 홍반	2
	중증도에서 강한 홍반	3
	심홍색의 강한 홍반과 가피 형성	4
부종형성	부종 없음	0
	매우 가벼운 부종 (육안으로 겨우 식별할 정도)	1
	명료한 부종 (주위와 명료한 구분이 됨)	2
	중증도의 부종 (1mm 정도 부어올랐을 경우)	3
	강한 부종 (1mm이상 부어오르고 노출 부위 밖에까지 확장된 상태)	4
[주] 피부 일차자극지수=(홍반 평점과 부종 평점의 합의 평균치)/4

[표 5]

	피부 일차자극지수 (0~4)
부형제 (vehicle)	1.2
10% 비타민 U 용액	0.4

상기 표 5로부터 비타민 U가 대조군(부형제)과 비교했을 때 피부 자극이 거 의 없음을 알 수 있다.

실시예 9. 비타민 U의 항-셀룰라이트 효과에 대한 임상실험

비타민 U의 슬리밍 효과를 확인해 보기 위하여, BMI(Body Mass Index)가 23∼25인 20∼30대 성인 여성 중 다른 대사성 이상이 발견되지 않은 여성 40명(각 군당 20명)을 대상으로 8주 동안 매일 아침과 저녁 하루 2회 허벅지 부위에 하기 표 6에 명시한대로 제조한 비타민 U가 함유된 시료를 사용하게 한 후 8주 동안 사용 전, 사용 후 피하지방 두께를 측정하여 비교함으로써 슬리밍 효과 여부를 판단하였다.

단, 본 실험에 참여한 피검자는 시험기간 동안 규칙적인 생활과 일정한 식생활을 유지하도록 관리되었다. 측정방법은 자(ruller)를 이용하여 줄어든 길이 (△L = L₁₂ - L₀)를 측정하였다. 이와 같은 실험의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

[표 6]

성 분	시료 (비타민 U)	대조군
	함량 (중량%)	함량 (중량%)
비타민 U	5.0
소르비탄 스테아레이트 & 소르비탈 라우레이트	2.0	2.0
스쿠알란	3.0	3.0
이소프로필미리스테이트	2.0	2.0
카보머	0.2	0.2
포타슘하이드록사이드	0.1	0.1
방부제	적량	적량
향료	미량	미량
정제수	upto 100	upto 100

[표 7]

구 분	허벅지 둘레 변화 (cm)
	L 0	L 12	ΔL
시료 (비타민 U)	53.4	50.0	-3.4
대조군	53.2	53.3	+0.1

상기 표 7의 결과를 살펴보면, 대조군의 경우 허벅지 둘레 변화가 거의 관찰되지 않았으며, 비타민 U를 사용한 실험자에게서는 비타민 U가 우수한 항-셀룰라이트 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이 때, 시험기간 동안 피검자의 몸무게는 변화가 없었다.

또한 셀룰라이트에 미치는 영향을 알아보기 위해서 초음파를 이용하여 피하 지방층의 두께(단위: mm)를 Ultrasound-EuB 415 US 스캐너를 이용하여 측정하였고, 얻어진 수치는 양측검정(Student t test)을 통하여 사용 전과 사용 후를 비교하여 통계적인 유의성을 분석(유의성 p<0.05)하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 비타민 U를 함유하는 제형(시료)은 대조군과 비교할 때 피하지방 두께 감소율이 12배 이상 증가한 것으로 보아 비타민 U의 처리에 의해 셀룰라이트의 두께가 월등히 감소되는 것으로 판단할 수 있다.

실시예 10. 탄력 증진 효과에 대한 설문 평가

상기 실시예 10의 실험에 참가한 여성 지원자 중 비타민 U 함유 조성물을 사용한 참가자에 대해 시험 기간 동안 탄력 증진 효과에 대한 설문 평가를 실시하였다. 그 결과는 하기 표 8에 정리하였다. 이 때 탄력 증진 정도를 다음의 5등급으로 분류하여 평가하였다.

< 탄력 증진 정도 등급 >

-2 : 탄력 매우 감소.

-1 : 탄력 약간 감소.

0 : 탄력 변화 없음.

1 : 탄력 약간 증진.

2 : 탄력 매우 증진.

[표 8]

구 분	탄력 증진 정도
	대조군	비타민 U
설문평가	-	1.7

상기 표 8의 결과로부터 비타민 U가 우수한 탄력 증진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터, 지방 분해 효과가 우수한 비타민 U를 적용한 슬리밍 화장료 조성물의 경우 지방세포의 피하지방 분해 효과, 셀룰라이트 제거 효과 및 탄력 증진 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실시예 11. 세포독성 측정

근육세포인 C2C12 세포를 10% bovine calf serum이 들어있는 DMEM에서 세포 배양하였다. 세포밀도가 약 85∼90% 가량 될 때 세포독성을 측정하는 용액을 넣어 세포활성 정도를 측정하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 비타민 U를 근육 세포주에 처리하면 세포독성이 없음을 관찰할 수 있었다.

이하, 상기한 실시예의 결과를 근거로 하여 지방분해 효과가 우수한 비타민 U를 적용한 슬리밍 화장료 조성물을 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 슬리밍 화장료 조성물이 하기의 제형예들로 한정되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수 (스킨로션)

하기 표 9에 나타난 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 유연화장수를 제조하였다.

[표 9]

배합 성분	함량　(중량%)
비타민 U	1.0
1.3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
소르비탄스테아레이트 & 소르비틸라우레이트	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향,방부제	미량
정제수	upto 100

제형예 2: 영양화장수 (밀크로션)

하기 표 10에 나타난 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다.

[표 10]

배합 성분	함량 (중량%)
비타민 U	3.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페닐아세테이트	3.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다이아너트오일	2.0
소르비탄스테아레이트 & 소르비틸라우레이트	2.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
BHT	0.01
EDTA-2Na	0.01
향,방부제	미량
정제수	upto 100

제형예 3: 영양크림

하기 표 11에 나타난 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.

[표 11]

배합 성분	함량 (중량%)
비타민 U	10.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
소르비탄스테아레이트 & 소르비틸라우레이트	2.0
스쿠알란	5.0
유동 파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
BHT	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산타검	0.1
EDTA-2Na	0.05
향, 방부제	미량
정제수	upto 100

제형예 4: 마사지크림

하기 표 12에 나타난 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 마사지크림을 제조하였다.

[표 12]

배합 성분	함량 (중량%)
비타민 U	1.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
소르비탄스테아레이트 & 소르비틸라우레이트	4.0
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	미량
정제수	upto 100

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비타민 U를 함유하는 화장료 조성물은 세포 독성이 없고 인체에도 무해하면서 체내 피하지방 분해, 셀룰라이트 제거 및 탄력 증진에 매우 효과가 있으므로 바디 슬리밍을 위한 화장품의 개발에 적용할 경우 시장 경쟁력이 매우 우수할 것으로 기대된다.

도 1은 비타민 U를 처리한 지방세포를 오일 레드 오 염색을 통해 나타낸 것으로 처리 농도별 세포 사진과 측정 결과이다.

도 2는 비타민 U를 처리한 지방세포에서 분비된 렙틴의 양을 측정한 결과이다.

도 3은 비타민 U의 처리에 의한 AMPK의 활성을 웨스턴 블럿팅을 통해 측정한 결과이다.

도 4는 비타민 U의 처리에 의한 지방 세포 특이적 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다.

도 5는 비타민 U를 함유하는 조성물을 사용한 후 피하지방 두께 감소율을 측정한 결과이다.

도 6은 근육 세포에 대한 비타민U의 세포독성을 나타내는 그래프이다.

Claims (5)

1. 비타민 U를 유효성분으로 함유하고, 상기 비타민 U는 지방세포의 렙틴 분비 감소, 지방세포 내 중성지방 분해 촉진, 항-셀룰라이트 또는 피부탄력 증진작용을 통해 슬리밍 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 슬리밍용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 비타민 U는 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 슬리밍용 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 비타민 U는 양배추, 브로콜리, 시금치, 파슬리, 샐러리, 상추 및 배추로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 채소로부터 추출된 것을 특징으로 하는 슬리밍용 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 슬리밍용 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 슬리밍용 화장료 조성물.

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