CN108349928A - 用于生物样品染色的基于植物的染料、提取方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了包含氧化巴西木素的组合物，其可用作荧光染料以用于核酸如DNA和RNA的增强的可视化。本说明书还提供了从树皮原材料中提取氧化巴西木素的简单的、有时间和成本效益的方法。

Description

用于生物样品染色的基于植物的染料、提取方法及其用途
技术领域
本公开内容涉及用于核酸检测的试剂的领域。特别地，本公开内容提供了包含氧化巴西木素(brazilein)的组合物以用于核酸的增强检测。还提供了分离和纯化氧化巴西木素的快速和有成本效益的方法。
背景技术
染色是用于生物样品的鉴定、检测、可视化、标记、靶向和纯化的重要辅助技术。此外，其也被广泛用于显微术检查以增强显微图像中的对比度。特别地，由于多种原因，例如组织检查、细胞群分类或单个细胞内的细胞器，染色剂和染料常用于化学、生物学和医学中以显示和量化核酸、蛋白质和其他生物材料以突出组织中的结构。染色剂是在与特定靶标接触时表现出可检测响应的化合物。在不存在靶标时，染色剂并不表现出可检测响应。这些特性使染色剂在检测样品中特定靶标的存在或不存在时具有价值。根据化合物、靶标和测定参数，可检测响应可以是定性或定量的。
核酸，特别是DNA的检测和量化是非常常见的任务。早期的化学染色剂对于DNA染色有效，但是也使RNA染色。在从天然来源分离时，DNA和RNA通常一起得到。对DNA不具有选择性的染色剂使分离的DNA的量化变得困难，需要在量化之前进行纯化步骤。专业研究需要区分不同类型的核酸，如单链DNA、双链DNA和质粒DNA。通过牺牲安全性，核酸筛选应用使用了目前可获得的有毒和致突变的荧光染色剂。该方法涉及繁琐的安全协议和昂贵的处理实践。特别地，荧光染色剂/染料广泛用于核酸研究以显示和量化琼脂糖凝胶中的DNA/RNA片段。由于低成本和足够的灵密度，溴化乙锭(Ethidium bromide，EtBr)是数十年来用于核酸筛选的主要染料。然而，与去污和废物处理相关的安全危害和成本可最终使得该染料昂贵且对研究人员和环境不安全。
已经开发了多种替代染料如SYBR染料组、凝胶红(Gel red)、凝胶绿(Gel green)、Pico绿、二聚花青素(Dimeric cyanine)等来代替高毒性的EtBr。一致地，所有这些染料是对检测核酸高度灵敏的合成芳香环结构。尽管其灵敏性较高，但它们表现出一定程度的毒性和致突变性。这些染料反映的安全性要求与高毒性EtBr相当。因此，没有可用于安全地筛选生物样品或核酸的安全荧光染料。
化合物氧化巴西木素来源于在亚洲广泛分布的灌木苏木(Caesalpinia sappan)的树皮。此外，通过简单方法从苏木物种提取氧化巴西木素并获得良好产率是十分繁琐和困难的。有报道从云石属(Caesalpinia)物种中提取和分离巴西木素和氧化巴西木素化合物(WO 2007066926 A1，WO/2007/066926)。所有这些方法作为食品和织物的染色剂解释了氧化巴西木素的提取和表征。然而，未尝试氧化巴西木素在基于凝胶的系统中的核酸染色特性和相关应用。此外，已经使用许多不同的方法和策略来从云石属物种中提取和纯化氧化巴西木素化合物。在题为“Method for purifying Brazilein”的CN102241660(A)中，所涉及的发明解释了从巴西苏木(brazil wood)中提取氧化巴西木素的方法。该发明使用包含乙醇、乙酸乙酯的溶剂的组合来提取氧化巴西木素。提取方案随后的柱纯化步骤还涉及乙腈、磷酸作为流动相且硅胶作为过滤介质来洗脱氧化巴西木素。该方法还使用制备型高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)来从植物提取物中纯化氧化巴西木索。该方法昂贵且涉及两个纯化方案，导致了冗长和繁琐的程序。
题为“Method for extracting brazilein from sappan wood”的专利noCN102219771 A中涉及的发明要求保护从苏木(sappan wood)提取氧化巴西木素的方法。该方法涉及甲醇作为主要溶剂来处理原材料，然后基于大孔树脂(macroporous resin)的吸附来分离氧化巴西木素。尽管该方法使用甲醇作为纯化氧化巴西木素的溶剂，但使用的浓度、溶剂组合和孵育持续时间并不相同，此外该方法使用了多个其他步骤来提取，包括添加水用于分散、使用大孔树脂用于吸附、使用甲醇梯度进行洗脱、使晶体结晶、洗涤并溶解晶体以及最终在乙醇和乙酸乙酯中重结晶。
在题为“a mass production method of brazilein from Caesalpinia sappan”的WO 2007066926 A1中，该发明要求保护用于大规模生产的基于醇的氧化巴西木素提取方法。然而，所述提取涉及两阶段结晶，其中醇是纯化氧化巴西木素的唯一溶剂。
在题为“Rapid and inexpensive mass production method of brazileinhaving high purity from Caesalpinia sappan”的韩国专利1020050120665中公开了使用水或醇提取氧化巴西木素的方法，然而其需要重结晶并使用受控的条件和更长的孵育期。
发明概述
在本公开内容的一方面，提供了组合物，其包含：(a)氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；(b)至少一种溶剂；以及(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。
在本公开内容的一方面，提供了获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：(a)从苏木获得树皮；(b)处理所述树皮以获得粉化树皮；(c)使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；(d)使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；(e)过滤所述第二混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；以及(f)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
在本公开内容的一方面，提供了样品中核酸的检测方法，所述方法包括：(i)获得组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素；(b)至少一种溶剂；和(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁和二甲基亚砜的至少一种化合物；以及(ii)使所述组合与所述样品接触。
在本公开内容的一方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素；(b)至少一种溶剂；和(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁、和二甲基亚砜的至少一种化合物，所述组合物用于样品中核酸的体外或体内检测。
在本公开内容的一方面，提供了核酸染色试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；(b)至少一种溶剂；以及(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁和二甲基亚砜的至少一种化合物。
在本公开内容的一方面，提供了氧化巴西木素，其用于样品中核酸的体外或体内检测。
通过参考以下描述和所附权利要求，本主题的这些和其他特征、方面、和优点将更好理解。提供本概述以用于以简化的形式介绍概念的选择。本概述不旨在确定要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在限制要求保护的主题的范围。
附图简述
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本公开内容的一些方面。通过结合本文给出的一些具体实施方案的详细描述来参照附图，可以更好的理解本公开内容。
图1a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的HPLC色谱图中对应于氧化巴西木素的单峰。
图1b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的确认提取的氧化巴西木素的纯度的GC-MS中的主峰。
图1c描绘了根据本发明内容的一个实施方案的质谱图，示出对应于氧化巴西木素的284mw的峰。
图2a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的甲醇提取物的具有450nm的发射最大值(激发波长340nm.)的荧光发射光谱。
图2b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的甲醇提取物的具有560nm的发射最大值(激发波长491nm)的荧光发射光谱。
图3a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的通过溴化乙锭的多种浓度的DNA的染色。
图3b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的通过 Gold的多种浓度的DNA的染色。
图3c描绘了根据本发明内容的一个实施方案的通过氧化巴西木素的甲醇提取物的多种浓度的DNA的染色。
图3d描绘了根据本发明内容的一个实施方案的通过氧化巴西木素的乙醇提取物的多种浓度的DNA的染色。
图3e描绘了根据本发明内容的一个实施方案的氧化巴西木素对RNA的染色能力。
图3f描绘了根据本发明内容的一个实施方案的氧化巴西木素对PCR扩增子的染色能力。
图4a至4d描绘了根据本发明内容的一个实施方案的经染色的多种核酸如质粒DNA(a)、基因组DNA(b)、ss DNA(c)和RNA(d)的电泳结果，指示了氧化巴西木素在对不同类型核酸染色的效力。
图5a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的三种氧化巴西木素提取物(tm-甲醇、te-乙醇和tw-水)检测低至1ng的DNA的浓度的能力。
图5b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的三种氧化巴西木素提取物(tm-甲醇、te-乙醇和tw-水)检测低至400pg的DNA的浓度的能力。
图6a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的与当量浓度的氧化巴西木素的甲醇(tm)或乙醇(te)提取物相比，溴化乙锭的浓度依赖的荧光光谱。
图6b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的溴化乙锭的浓度依赖的荧光光谱。
图6c描绘了根据本发明内容的一个实施方案的氧化巴西木素的甲醇提取物的浓度依赖的荧光光谱。
图7a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 5对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图7b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 6对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图7c描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 7对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图7d描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 8对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图7e描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 9对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图7f描绘了根据本发明内容的一个实施方案的PH 10对多种浓度的氧化巴西木素的荧光的影响。
图8描绘了根据本发明内容的一个实施方案的荧光光谱图，示出了向氧化巴西木素中添加甘油对荧光的增强效果。
图9描绘了根据本发明内容的一个实施方案的多种金属离子对氧化巴西木素的甲醇提取物的荧光强度的影响。
图10描绘了根据本发明内容的一个实施方案的荧光光谱图，示出了向氧化巴西木素中添加氯化钠对荧光的增强效果。
图11描绘了根据本发明内容的一个实施方案的荧光光谱图，示出了向氧化巴西木素中添加硫酸镁对荧光的增强效果。
图12a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的在暴露于多种浓度的包含氧化巴西木素的水提取物的多种组合物之后HeLa细胞的细胞活力。
图12b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的在暴露于多种浓度的包含氧化巴西木素的甲醇提物的多种组合物之后HeLa细胞的细胞活力。
图13描绘了根据本发明内容的一个实施方案的氧化巴西木素对洋葱表皮细胞核的染色。
图14a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的没有氧化巴西木素的对照细胞的FACS分析。
图14b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的通过FACS确定的活细胞摄取氧化巴西木素的效力。
图15a描绘了根据本发明内容的一个实施方案的添加氧化巴西木素之后活细胞核的可视化(绿色滤光器)。
图15b描绘了根据本发明内容的一个实施方案的活酵母细胞的相衬图像。
图15c描绘了根据本发明内容的一个实施方案的添加氧化巴西木素之后活细胞核的可视化(红色滤光器)。
图15d描绘了根据本发明内容的一个实施方案的添加氧化巴西木素之后活细胞核的可视化(远红色滤光器)。
图15e描绘了根据本发明内容的一个实施方案的图15a至15d的合并图像。
图16描绘了根据本发明内容的一个实施方案的使用氧化巴西木素作为DNA染料的FISH图像。
发明详述
本领域技术人员知道，除了具体描述的那些以外，本公开内容可以变化和修改。应理解，本公开内容包括所有这些变化和修改。本公开内容还包括在本说明书单独地或共同地涉及或指出的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及任一个或更多个这些步骤或特征的任何和所有组合。
定义
为方便起见，在进一步描述本公开内容之前，在这里收集了本说明书和实施例中使用的某些术语。这些定义应根据本公开内容的其余部分和本领域技术人员的理解来阅读。本文使用的术语具有本领域技术人员认识和已知的含义，然而，为了方便和完整性，下面给出了一些特定术语及其含义。
未用数量词限定的名词用于指一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)指示对象。
术语“SS DNA”是指单链DNA。
术语“SS RNA”是指单链RNA。
术语“tm”可与氧化巴西木素的甲醇提取物互换使用。
术语“tw”可与氧化巴西木素的水提取物互换使用。
术语“te”可与氧化巴西木素的乙醇提取物互换使用。
术语“EtBr”是指溴化乙锭，并且可互换使用。
包含“协同活性”的组合物或“协同组合物”是组合物的组合，其表现出作为单一化合物的生物或功能活性的非线性倍数的升高的生物或功能活性。换言之，两个或更多个待测化合物的组合生物或功能活性显著大于基于在分别测试时化合物单独作用的预期结果。协同作用可仅在某些范围或浓度下是明显的。另外，对于不同种类的待测生物学效果，化合物的协同组合可不同。
术语“包含”和“含有”以包含性开放式含义使用，意指可包含额外要素。其不旨在解释为“仅由……组成”。
贯穿本说明书，除非语境要求，否则词语“包含”一词和其变化形式如“含有”和“含”应理解为意指包含所指出的要素或步骤或者要素或步骤的组，但不排除任何其他要素或步骤或者要素或步骤的组。
术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料都可用于本公开发明的实践或测试，但现在描述优选方法和材料。本文提到的所有出版物通过引用并入本文。
本公开内容的范围并不限于本文描述的一些具体实施方案，所述实施方案仅旨在示例目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开内容的范围中。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；(b)至少一种溶剂；以及(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.000284至0.0284％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素浓度为10μM至1mM。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素浓度为1rnM。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中所述溶剂重量百分比为足以溶解氧化巴西木素的量。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述化合物为氯化钠。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述化合物为硫酸镁。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述化合物为甘油。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述化合物为二甲基亚砜(DMSO)。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与氯化钠的w/w比为1∶0.0035至1∶3.52。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氯化钠重量百分比为0.0001至0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氯化钠重量百分比为0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与氯化钠的w/w比为1∶0.352。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中氯化钠重量百分比为0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与硫酸镁的w/w比为1∶0.0035至1∶3.52。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中硫酸镁重量百分比为0.0001至0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中硫酸镁重量百分比为0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与硫酸镁的w/w比为1∶0.352。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中硫酸镁重量百分比为0.001％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶887至1∶133098。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为25.2至37.8％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为25.2％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为37.8％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶887.3。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶1330.9。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中甘油重量百分比为25.2％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中甘油重量百分比为37.8％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶2464至1∶316901。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中DMSO重量百分比为70至90％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中DMSO重量百分比为70％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中DMSO重量百分比为90％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶2464.7。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶3169。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中DMSO重量百分比为70％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.0284％并且所述组合物中DMSO重量百分比为90％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：(a)获得苏木(Caesalpinia sappan)的树皮；(b)处理所述树皮以获得粉化树皮；(c)使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；(d)使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；(e)过滤所述第二混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；以及(f)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至15％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至14％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至12％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至10％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至8％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中苏木树皮的含水量为5至6％。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为水。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为乙醇。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为甲醇。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为丙酮。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为甲醇和乙醇的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为v/V比为1∶1的甲醇和乙醇的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为甲醇和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为v/v比为4∶1的甲醇和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为乙醇和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为v/v比为4∶1的乙醇和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为甲醇和丙酮的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为v/v比为1∶1的甲醇和丙酮的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为丙酮和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述溶剂为v/v比为1∶1的丙酮和水的组合。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中在步骤(c)中，所述第一混合物中粉化树皮与溶剂的w/W比为1∶5至1∶20。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中在步骤(c)中，所述第一混合物中粉化树皮与溶剂的w/w比为1∶20。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中在步骤(c)中，粉化树皮量为5克并且溶剂体积为100ml。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中步骤(c)任选地还包括使至少一种氧化剂与所述第一混合物接触。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中还包括使至少一种氧化剂与步骤(c)中的所述第一混合物接触。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：(a)获得苏木(Caesalpinia sappan)的树皮；(b)处理所述树皮以获得粉化树皮；(c)使所述粉化树皮与至少一种溶剂和至少一种氧化剂接触以获得第一混合物；(d)使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；(e)过滤所述第二混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；以及(f)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述氧化剂为丙酮。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中对来自步骤(e)(ii)的所述残留物进行重复提取，其包括以下步骤：(a)使所述残留物与至少一种溶剂接触以获得第三混合物；(b)使所述第三混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第四混合物；(c)过滤所述第四混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；(d)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述重复提取过程进行3至5个循环。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述重复提取过程进行3个循环。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述重复提取过程进行4个循环。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述重复提取过程进行5个循环。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：(a)获得苏木(Caesalpinia sappan)的树皮；(b)处理所述树皮以获得粉化树皮；(c)使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；(d)使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；(e)过滤所述第二混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；(f)对所述残留物进行步骤(c)至(i)的提取3-5个循环；(g)合并来自每个提取循环的滤液；以及(f)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克所述粉化树皮产生15至30g结晶氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生20g氧化巴西木素，并且所述溶剂为甲醇。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生21.5g氧化巴西木素，并且所述溶剂为v/v比1∶1的甲醇和乙醇。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生19g氧化巴西木素，并且所述溶剂为v/v比4∶1的甲醇和水。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生22g氧化巴西木素，并且所述溶剂为v/v比4∶1的乙醇和水。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生18g氧化巴西木素，并且所述溶剂为水。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生25g氧化巴西木素，并且所述溶剂为乙醇。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生28.5g氧化巴西木素，并且所述溶剂为丙酮。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生25g氧化巴西木素，并且所述溶剂为v/v比1∶1的甲醇和丙酮。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的获得结晶氧化巴西木素的方法，其中所述方法每100克粉化树皮产生26g氧化巴西木素，并且所述溶剂为v/v比1∶1的丙酮和水。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了样品中核酸的检测方法，所述方法包括：(a)获得本文所述的组合物；以及(b)使所述组合物与所述样品接触。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中通过本文所述方法获得氧化巴西木素。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法检出所述样品中至少500pg DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法检出所述样品中至少40pg RNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测RNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测ss DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法的适合于检测ss RNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测质粒DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测线性化质粒DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测PCR扩增子。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于检测活细胞中的DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸检测方法，其中所述方法适合于实时PCR。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中核酸的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中DNA的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中RNA的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中质粒DNA的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中线性化质粒DNA的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中ssDNA的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于PCR扩增子的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于实时PCR扩增的体外检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于样品中核酸的体内检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其用于活细胞中DNA的体内检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的组合物，其中所述组合物对细胞无毒。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了包含组合物的核酸染色试剂盒，所述组合物如本文所述。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了本文所述的核酸染色试剂盒，其还包含说明手册。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了核酸染色试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的组合物和说明手册。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于样品中核酸的体外和体内检测。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测RNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测质粒DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测PCR扩增子。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测线性DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测单链DNA。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于使用共聚焦显微术检测核酸。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting)。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于荧光原位杂交。
在本公开内容的一个实施方案中，提供了氧化巴西木素，其用于检测如本文所述的核酸，其中氧化巴西木素由如本文所述的方法制备。
尽管已经关于其某些优选实施方案相当详细地描述了本主题，但是其他的实施方案也是可能的。
实施例
现在利用可行的实施例来说明本公开内容，所述实施例旨在说明本公开内容的可行性并且不旨在限制性地暗示对本公开的范围的任何限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料都可用于所公开方法和组合物的实践，但本文描述了示例性方法、装置和材料。应理解，本公开内容不限于描述的特定的方法和实验条件，因为这些方法和条件可以改变。
实施例1
使用多种溶剂从苏木树皮中分离氧化巴西木素
使用100克阴干的苏木树皮组织作为提取氧化巴西木素的来源/原料。将树皮组织机械粉碎，随后与作为溶剂的蒸馏水(500至2000ml)混合并加热(约80℃)，直到总溶液体积减少至初始体积的20％。将该溶液通过简单的过滤技术如使用滤纸或细棉布(muslincloth)等过滤，以得到滤液和残留物。收集滤液并在室温(22至30℃)下放置3至5天以将巴西木素氧化成氧化巴西木素。通过加热或通过放置3至5天的时间来通过蒸发除去溶剂，其允许巴西木素完全氧化为氧化巴西木素。在此期间，还将经氧化的氧化巴西木素干燥形成结晶粉末。为了使氧化巴西木素的提取最大化，如上所述对过滤后得到的残留物进行重复提取以得到第二滤液。该重复提取进行3至5次以得到多个滤液，随后合并滤液用于分离经氧化的氧化巴西木素。
上述过程也可通过将溶剂(上文给出的水)替换成以下来进行：(a)甲醇；或(b)v/v比为1∶1的甲醇和乙醇的混合物；或(c)v/v比为4∶1的甲醇和水的混合物；或(d)v/v比为4∶1的乙醇和水的混合物；或(e)乙醇；或(f)丙酮；或(g)v/v比为1∶1的丙酮和甲醇的混合物；或(h)v/v比为1∶1的丙酮和水的混合物。
下表1给出了使用多种方法分离后的氧化巴西木素的产量。表1还提供了加热时间。所述粉化树皮与溶剂的w/v比保持在20∶1。应理解，加热时间将取决于溶剂的体积和选择而改变。
表1
如上表1所示，使用不同溶剂的产量为每100g粉化树皮18至28.5g。在氧化巴西木素的丙酮提取物的情况下可看到最大产量，其中100g粉化树皮提供28.5g氧化巴西木素。
使用20μl的参考体积，利用HPLC(图1a，氧化巴西木素的水提取物)和GC分析(图1b，氧化巴西木素的甲醇提取物)确认了氧化巴西木素的纯度和热稳定性。将纯化晶体重新溶解在溶剂中并进行HPLC、GC-MS和MS-MS(图1c)，其给出了对应于氧化巴西木素分子质量的单一主峰。使用HPLC图中每个峰的面积积分来估算产物浓度。如所示，通过GC和质谱分析确认了纯化化合物的结构。
实施例2
氧化巴西木素的荧光发射光谱
如图2a所示，氧化巴西木素的甲醇提取物具有发射最大值为450nm(激发波长340nm)的荧光发射光谱。图2b显示氧化巴西木素的甲醇提取物具有发射最大值为560nm(激发波长491nm)的荧光发射光谱。这些数据表明，可以使用现有技术如UV透照器(UVtransilluminator)和凝胶成像系统(gel documentation system)有效地捕获使用氧化巴西木素的核酸检测。荧光光谱也可用于体内成像和共聚焦显微术。
实施例3
氧化巴西木素的核酸染色活性
为了确定氧化巴西木素在荧光辅助的DNA可视化中的效用，用溴化乙锭(EtBr)(50μg/50ml染色体积)(图3a)、或 Gold(图3b)、或tm(氧化巴西木素的甲醇提取物)(1mM氧化巴西木素)(图3c)、或te(氧化巴西木素的乙醇提取物)(1mM氧化巴西木素)(图3d)对50ng至250ng的多种量的DNA梯带(DNA ladder)进行染色。从图3a至3d中可以推断出，在100ng至250ng的DNA浓度，与EtBr或 Gold相比，tm或te将DNA染色得更加明亮。然而，te和tm还能有效地对浓度为25至50ng的DNA染色，而其不能被EtBr或 Gold染色，这表明以下事实：在测试浓度下氧化巴西木素不仅有效将DNA染色以用于DNA的荧光可视化，而且在测试浓度下比EtBr或 Gold更加灵敏。
如图3e所示，氧化巴西木素(tm)也可将RNA(最低RNA浓度为40ng，高至320ng)染色。此外，如图3e所示，与溴化乙锭的染色灵敏度相比，可以看出tm更强烈地将(1mM)RNA(使用TRIZOL法从大肠杆菌分离RNA；A260/A280＝2.04；量＝3000ng/ml)染色。
如图3f所示，多种氧化巴西木素提取物(1mM/50ml染色体积)(tw：氧化巴西木素的水提取物；te：氧化巴西木素的乙醇提取物；tm：氧化巴西木素的甲醇提取物)也可有效地将通过PCR产生的DNA片段染色。如图3f所示，多种氧化巴西木素提取物(tW、或te、或tm)能够将浓度为100至300ng的2kb的扩增子染色，其比得上溴化乙锭的染色效果。
氧化巴西木素也可对多种类型/形式的核酸染色，如图4a至图4c所示。图4a示出了DNA浓度为0.2至1mg/ml的质粒DNA的染色。图4b表明氧化巴西木素能有效地将基因组DNA(待测250至500ng)染色。如图4c所示，氧化巴西木素也可将ssDNA染色。此外，如图4d所示，氧化巴西木素(1μl的1mM氧化巴西木素储液/50ml染色液)也可将RNA染色(每泳道200μgRNA。大小差异是由于两种不同的RNA制剂)。使用的氧化巴西木素染料的量为1mM。
实施例4
氧化巴西木素的染色灵敏度
通过使用本公开内容如前所述用甲醇(tm)、乙醇(te)或水(tw)提取的氧化巴西木素对琼脂糖凝胶中200pg至4ng的多种量的DNA片段进行染色，来测定琼脂糖凝胶中氧化巴西木素的染色灵敏度。
如图5a所示，te(1mM)(氧化巴西木素的乙醇提取物)和tw(氧化巴西木素的水提取物)能够检出1ng DNA。然而，氧化巴西木素的甲醇提取物(tm)不能够检出1ng DNA。
在200pg至800pg的较低DNA浓度下(图5b)，对于tm、te或tw，在低至400pg的DNA浓度下带是可见的，但在更低浓度下染色不可靠，表明染料的灵敏度约为200pg。
实施例5
氧化巴西木素与溴化乙锭(EtBr)的荧光比较
为了确定和建立氧化巴西木素作为DNA可视化剂时相对于广泛和常用的化合物EtBr的优势，对多种氧化巴西木素提取物和EtBr的浓度依赖的荧光进行了评估。
图6a示出了浓度范围为1至20μM时EtBr的荧光强度，其结果以表格的形式示出在下表2中。
表2
EtBr浓度(μM) 荧光强度(AU)
1 ＜20
5 约60
10 约10
15 约180
20 约230
图6b示出了浓度范围为1至20μM时氧化巴西木素的甲醇提取物的荧光强度，其结果以表格的形式示出在下表3中。
表3
图6c示出了浓度范围为1至20μM时氧化巴西木素的乙醇提取物的荧光强度，其结果以表格的形式示出在下表4中。
表4
EtBr浓度(μM) 荧光强度(AU)
1 ＜50
5 约150
10 约350
15 约500
20 约650
如图6a至c和表2至4所示，可以很容易理解，在与溴化乙锭相当的浓度下，氧化巴西木素给出了显著更高的荧光强度，表明氧化巴西木素是溴化乙锭的优秀替代物。
实施例6
PH对氧化巴西木素荧光的影响
为了测定多种PH条件下氧化巴西木素作为染料的应用，研究了5至10的不同PH对荧光强度的影响(图7a至图7f)。
图7a描绘了PH为5时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素提取物(te)的荧光强度。如图7a所示，在PH5时，在所有测试浓度下te的荧光强度都非常弱，表明至少在测试的多种浓度下，氧化巴西木素不能在PH5下可靠地用作指示剂染料。
图7b描绘了PH为6时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素乙醇提取物(te)的荧光强度。如图7b所示，在PH6时，观察到25μM浓度的te的最大强度为约40AU。20μM浓度的te表现出约30AU的荧光强度，而其余表现出强度＜20AU。
图7c描绘了PH为7时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素乙醇提取物(te)的荧光强度。如图7c所示，25μM浓度的te表现出约110AU的荧光强度，而20μM浓度的te表现出约80AU的荧光强度。
图7d描绘了PH为8时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素乙醇提取物(te)的荧光强度。如图7d所示，25μM浓度的te表现出约250AU的荧光强度，而20μM浓度的te表现出约180AU的荧光强度。15μM浓度的te表现出约120AU的荧光强度。
图7e描绘了PH为9时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素乙醇提取物(te)的荧光强度。如图7e所示，25μM浓度的te表现出约450AU的荧光强度，而20μM浓度的te表现出约350AU的荧光强度。15μM浓度的te表现出约250AU的荧光强度，而10μM浓度的te表现出约150AU的荧光强度。
图7f描绘了PH为10时多种浓度(5至25μM)的氧化巴西木素乙醇提取物(te)的荧光强度。如图7f所示，25μM浓度的te表现出约200AU的荧光强度，而20μM浓度的te表现出约150AU的荧光强度，15μM浓度的te表现出约110AU的荧光强度。
总之，基于图7a至f，可以理解，氧化巴西木素(te)是适合在20μM至25μM的浓度下5-10的宽的PH范围内使用的荧光染料。在7-9的PH下氧化巴西木素最有效，其中即使在测试的较低浓度下也观察到了高荧光强度。
实施例7
氧化巴西木素增强的荧光活性
惊讶和出乎意料地发现，当存在特定分子例如甘油、或钠盐或镁盐时，荧光强度增强。如图8所示，虽然5μM氧化巴西木素的甲醇提取物(tm)给出了约200AU的最高荧光强度，但是对于tm的组合(氧化巴西木素的甲醇提取物和甘油，其中甘油wt％为约25％，而氧化巴西木素wt％为约0.00003％)，观察到荧光强度为约550AU，其比单独的氧化巴西木素的效果强约2.75倍。这种观察到的增强是出乎意料和令人惊讶的，因为单独的甘油对DNA检测并不具有任何显著的荧光活性。
还评估了多种金属离子对氧化巴西木素的荧光强度的影响，因为已知金属离子充当佐剂并通过形成稳定络合物或通过改变电荷增强分子中的荧光。如图9所示，在与浓度为(1mM)的氧化巴西木素一起的以100μM浓度下测试多种金属离子中，观察到除了钠离子和镁离子，其他测试离子都没有增强tm(氧化巴西木素的甲醇提取物)的荧光活性。事实上，可以理解，其他离子的存在抑制了氧化巴西木素的荧光活性。
如图10更明显示出的，在10μM浓度的钠离子(氯化钠)的存在下，其中氧化巴西木素(tm：氧化巴西木素的甲醇提取物)浓度为1mM，荧光强度为约3倍。类似地，如图11所示，与单独的tm(氧化巴西木素的甲醇提取物)产生的荧光强度相比，在镁离子(硫酸镁)的存在下荧光强度大于约4倍。未知钠或钾会赋予任何可有助于检测核酸的重要荧光特性。
这些图表共同表明，甘油或钠或镁离子出乎意料地并且令人惊讶地导致巴西木素的荧光强度的明显的协同提高。
实施例8
氧化巴西木素的细胞毒性
为了评估氧化巴西木素作为诱变剂溴化乙锭的合适的替代物的安全性，基于HeLa细胞存活力测试了多种浓度的氧化巴西木素或者与甘油或金属离子的组合。
根据标准方案进行MTT测定。首先，将培养的HeLa细胞在胰蛋白酶消化后收集在培养基中。用另一20ml的培养基稀释培养物以减少细胞数。每100μl约10000个细胞。使用血细胞计数器对细胞进行计数。将100μl培养物加入到96孔板的每个孔中并允许贴壁过夜。次日，将HeLa细胞用不同浓度的氧化巴西木素(0.152至10μM)处理24小时，然后在37℃下进行MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)处理4小时。观察到紫色晶体出现后，轻轻从孔内吸出培养基。加入200μl DMSO以溶解紫色晶体。于暗处培养15分钟后，在UV-可见分光光度计中测定540nm下的吸光度。将每一条件(未处理和处理)下细胞存活百分比相对于使用的染料的浓度作图。
图12a中，tw是指氧化巴西木素的水提取物，tw(gly)是指氧化巴西木素的水提取物和甘油，tw+Na是指氧化巴西木素的水提取物和钠盐，而tw+Mg是指氧化巴西木素的水提取物和镁盐。如图12a所示，在0.156至10μM的浓度测试了所述多个组合。可以看到，即使在最高的测试浓度下(10μM)，所有测试组合都是安全的，对细胞存活没有显著影响。
在图12b中，tm是指氧化巴西木素的甲醇提取物，tm(gly)是指氧化巴西木素的甲醇提取物和甘油，tw+Na是指氧化巴西木素的甲醇提取物和钠盐，而tw+Mg是指氧化巴西木素的甲醇提取物和镁盐。如图12b所示，在0.156至10μM的浓度测试了所述多个组合。可以看到，即使在最高的测试浓度下(10μM)，所有测试组合都是安全的，对细胞存活没有显著影响。图12a至b中示出的数据表明，在测试浓度下，氧化巴西木素是安全的染料，其可以使用而无任何细胞毒性作用。
实施例9
生物样品的染色方法
本公开内容中描述的氧化巴西木素组合物(染色剂)可用于对琼脂糖凝胶中DNA的染色以用于在紫外透射系统(uv transilluminator system，UV)可视化。可通过在上样之前将DNA直接加入到染色剂中，或在胶凝化之前将染色剂加入凝胶中，或在电泳后将染色剂加入凝胶中来进行染色。观察到当在DNA迁移后将染色剂(500ng/ml)加入凝胶中时，可视化可在孵育的30至60秒内进行，这显著快于溴化乙锭，后者无论怎样需要10至30分钟来有效结合地DNA。当在上样前直接加入DNA时，发现结合DNA所需的最佳染色剂量为50ng/250pgDNA。
实施例10
荧光/共聚焦显微术
使用荧光显微术在洋葱表皮细胞中分析氧化巴西木素对活细胞的染色。简单地说，轻轻取下洋葱皮并分成两部分，透化细胞(permeabilized cell)和非透化细胞。对于非透化细胞，将细胞在水中浸泡10分钟，而对于透化细胞，将细胞在福尔马林中浸泡10分钟。取出皮并浸泡在不同浓度的氧化巴西木素的甲醇提取物(500nM至1mM)中并允许在暗处孵育15分钟。取出孵育后的样品并放置在载玻片上，上面放置盖玻片并密封以避免样品干燥。将玻片在荧光显微镜下可视化。如图13所示，10μM氧化巴西木素能够将洋葱表皮细胞核染色，表明氧化巴西木素能够穿透细胞，均匀且可靠地将细胞核染色，特别是具有最小背景。进一步观察到细胞的透化不是必然要求，因为氧化巴西木素还能够将非透化细胞中的核染色。此外，尽管所有氧化巴西木素提取物(如上所述水、乙醇、丙酮或其组合)均能够对细胞中的核染色，图13的代表性图像描述了氧化巴西木素的甲醇提取物，因为其表现了最好的结果。关于细胞核染色所需的氧化巴西木素的浓度，推断10μM的氧化巴西木素是最优的。低于10μM的浓度给出弱的荧光信号，而高于10μM的浓度给出更高的噪声和背景。
实施例11
荧光激活细胞分选(FACS)
使用FACS分析来分析染料对固定细胞和非固定细胞的进入，如在细胞周期研究中所适用的。使用胰蛋白酶以合适的方式收集沙门氏菌(Salmonella)细胞。将细胞培养物中胰蛋白酶消化的细胞在1300rpm下离心5分钟以使细胞沉淀。为了固定细胞，将冷的70％乙醇添加到细胞中。在4℃下固定30分钟。200μl氧化巴西木素(甲醇提取物)(来自50μg/ml的储液)。将细胞在室温下以1300rpm再次离心5分钟并轻轻倒出上清液。为将细胞透化，加入1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)和皂苷(saponin，0.1％)的混合物并孵育5分钟。将细胞离心并用PBS洗涤细胞以除去皂苷。用1μg/mL工作浓度的核糖核酸酶(100μg/mL)处理细胞以确保仅DNA染色而RNA未染色。除了向细胞中添加乙醇和皂苷外，对非固定细胞进行相同处理。加入不同浓度的氧化巴西木素(500nM至10μM)并在室温下孵育15分钟，对管进行FACS分析。图14b示出的数据表明氧化巴西木素(5μM)(饱和浓度)进入了96.8％的总活菌细胞，因此显示了使用氧化巴西木素用于FACS分析的效力(图14a为未用任何染料处理的对照细胞)
实施例12
使用氧化巴西木素进行活细胞染色
为了确定氧化巴西木素在活细胞染色中的效用，用1mM氧化巴西木素对酵母细胞染色并在共聚焦显微镜下以40倍放大倍数观察。将细胞在多个滤光器下可视化以确定最优可视化条件。如图15a所示，绿色滤光器显示出了细胞核物质的模糊可视化。图15b为细胞的相衬图像。图15c描绘了使用红色滤光器使细胞可视化，而15d描绘了使用远红色滤光器使细胞可视化。图15a、15c、和15d表明，红色滤光器最适于使细胞(核物质)可视化。图15e为15a至15d的合并图像。总之，这组图表明，氧化巴西木素可作为染料以在活细胞中对核染色，并且可在共聚焦显微镜的红色通道中可视化。
实施例13
荧光原位杂交(FISH)
如图16所示，氧化巴西木素也可用于FISH(本领域已知的标准方案)。从图16推断出，10μM氧化巴西木素可将人细胞的染色体有效染色。
总之，本公开内容提供了氧化巴西木素，其用作染料用于使用多种方法如凝胶染色、活细胞染色、FISH、FACS和荧光显微术来使核酸如DNA和RNA可视化。本公开内容还提供了溶剂介导的从苏木树皮(现有技术中未将其报道为可用来源)中提取氧化巴西木素的有成本和时间效益的方法。此外，惊讶和出乎意料地，还观察到并且在本文中公开了在某些添加剂如甘油、DMSO或金属盐的存在下，氧化巴西木素的荧光强度得到了协同地增强。在本说明书中公开的作为核酸染料的氧化巴西木素是无毒的、高灵敏度的、可用在活细胞中用于DNA可视化，并且是其他染料(例如已知致突变的溴化乙锭，或者例如已知致突变且昂贵的染料如 Gold)的可行且优秀的替代物。因此，本公开内容的组合物是安全且更灵敏的替代物。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于检测核酸的组合物，其包含：
a.氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；
b.选自甲醇、乙醇、丙酮及其组合的至少一种溶剂；以及
c.选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中所述溶剂的重量百分比为足以溶解氧化巴西木素的量。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.000284至0.0284％。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氯化钠或硫酸镁重量百分比为0.0001％至0.001％。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为25.2至37.8％。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中二甲基亚砜重量百分比为70至90％。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与氯化钠或硫酸镁的w/w比为1∶0.0035至1∶3.52。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶887至1∶133098。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶2464至1∶316901。
10.获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：
a.获得苏木(Caesalpinia sappan)的树皮；
b.处理所述树皮以获得粉化树皮；
c.使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；
d.使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；
e.过滤所述第二混合物以获得：
i.包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和
ii残留物；以及
f.使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
11.根据权利要求10所述的方法，其中来自苏木(C.sappan)的树皮的含水量为5至15％。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，所述第一混合物中粉化树皮与溶剂的w/w比为1∶5至1∶20。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，任选地还包括使至少一种氧化剂与步骤(c)中的所述第一混合物接触。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中对来自步骤(e)(ii)的所述残留物进行重复提取，其包括以下步骤：
a.使所述残留物与至少一种溶剂接触以获得第三混合物；
b.使所述第三混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第四混合物；
c.过滤所述第四混合物以获得：
i.包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和
ii残留物，
d.使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重复提取过程进行3至5个循环。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法每100克所述粉化树皮产生15至30g结晶氧化巴西木素。
18.检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：
a.获得根据权利要求1至9中任一项所述的组合物；以及
b.使所述组合物与所述样品接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过根据权利要求10至17中任一项所述的方法获得氧化巴西木素。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的方法，其中所述方法检出所述样品中至少40pg的核酸。
21.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其用于样品中核酸的体外和体内检测。
22.核酸染色试剂盒，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。
23.氧化巴西木素，其用于样品中核酸的体外和体内检测。
24.根据权利要求24所述使用的氧化巴西木素，其中通过根据权利要求10至17中任一项所述的方法制备氧化巴西木素。

Claims (25)

1.用于检测核酸的组合物，其包含：
a.氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；
b.至少一种溶剂；以及
c.选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物中所述溶剂的重量百分比为足以溶解氧化巴西木素的量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.000284至0.0284％。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氯化钠或硫酸镁重量百分比为0.0001％至0.001％。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为25.2至37.8％。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中二甲基亚砜重量百分比为70至90％。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与氯化钠或硫酸镁的w/w比为1∶0.0035至1∶3.52。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶887至1∶133098。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶2464至1∶316901。
11.获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：
a.从苏木(Caesalpinia sappan)获得树皮；
b.处理所述树皮以获得粉化树皮；
c.使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；
d.使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；
e.过滤所述第二混合物以获得：
i.包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和
ii残留物；以及
f.使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
12.根据权利要求11所述的方法，其中来自苏木(C.sappan)的树皮的含水量为5至15％。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，所述第一混合物中粉化树皮与溶剂的w/w比为1∶5至1∶20。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，任选地还包括使至少一种氧化剂与步骤(c)中的所述第一混合物接触。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中对来自步骤(e)(ii)的所述残留物进行重复提取，其包括以下步骤：
a.使所述残留物与至少一种溶剂接触以获得第三混合物；
b.使所述第三混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第四混合物；
c.过滤所述第四混合物以获得：
i.包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和
ii残留物，
d.使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述重复提取过程进行3至5个循环。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法每100克所述粉化树皮产生15至30g结晶氧化巴西木素。
19.检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：
a.获得根据权利要求1至10中任一项所述的组合物；以及
b.使所述组合物与所述样品接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中通过根据权利要求11至18中任一项所述的方法获得氧化巴西木素。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的方法，其中所述方法检出所述样品中至少40pg的核酸。
22.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其用于样品中核酸的体外和体内检测。
23.核酸染色试剂盒，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的组合物。
24.氧化巴西木素，其用于样品中核酸的体外和体内检测。
25.根据权利要求24所述使用的氧化巴西木素，其中通过根据权利要求11至18中任一项所述的方法制备氧化巴西木素。
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