CN112924427B - 一种消除植物组织自体荧光的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种消除植物组织自体荧光的方法。该方法将植物组织的切片置于茚三酮溶液中孵育处理，可以有效去除自发荧光的干扰，提高图像信噪比，使特异性荧光清晰可见，简单快速、安全高效。

Description

一种消除植物组织自体荧光的方法
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种消除植物组织自体荧光的方法。
背景技术
随着生命科学研究的快速发展，生物荧光技术在细胞免疫学、微生物学、分子生物学、分子遗传学、医学、植物学等方面的应用越来越广泛。荧光技术已成为生命科学研究的重要手段之一。
但是，细胞中某些分子，在紫外光或某个可见光波段时可发出荧光。这种荧光是由于细胞内源性的分子造成的，所以叫做自发性荧光(auto-fluorescence)。例如紫外和紫光区域激发的有色氨酸类、吲哚胺类、纤维蛋白原、二聚体、胶原等，蓝光区域激发主要是NADH、脂褐质、吲哚胺类、二聚体、核黄素。
自发荧光干扰特定荧光信号的检测，降低荧光图像的信噪比，可能会产生很多假阳性结果，自发荧光的干扰已成为植物学荧光成像的一大瓶颈。
目前现有技术消除自体荧光的方法光漂白法和化学处理法。其中，光漂白技术对硬件条件要求高，一般实验室缺乏相关仪器，而且光漂白所造成的组织损伤不可逆。化学处理法主要采用的化学试剂为硼氢化钠、台盼蓝和苏丹黑等染料，硼氢化钠属于易燃易制爆物，不易购买且不易保存，使用效果重现性低。台盼蓝和苏丹黑等染料可能会造成染色不均匀，有背景荧光增强，且整体对自发荧光降低幅度不大，依然干扰特异性荧光标记。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述问题，提供一种消除植物细胞自发荧光的方法，该方法将植物组织的切片置于茚三酮溶液中孵育处理，可以有效去除自发荧光的干扰，提高图像信噪比，使特异性荧光清晰可见。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种消除植物细胞自发荧光的方法，将植物组织制成切片，于茚三酮溶液中孵育。
一些实施方案中，所述茚三酮溶液的浓度为1～40mg/ml，优选为20～30mg/ml。一些具体实施例中，所述茚三酮溶液的浓度为20mg/ml或30mg/ml。
本发明中，茚三酮溶液的溶剂为本领域常见的溶剂种类，能够溶解茚三酮即可，包括但不限于PBS缓冲液、蒸馏水等。一些实施方案中，所述茚三酮溶液的溶剂为PBS缓冲液。PBS缓冲液的pH没有特殊要求，可根据样本类型、实验需求、实验条件等具体情况进行确定。在一些优选方案中，茚三酮溶液的溶剂为pH5.6～8.4的1×PBS缓冲液，pH进一步优选为7.2～7.4。在一些具体实施例中，溶剂具体为pH7.4的1×PBS缓冲液或蒸馏水。
一些实施方案中，所述孵育在室温下进行，孵育的时间为1～30min。一些具体实施例中，孵育的时间为10～20min，具体可为10min、15min或20min。
本发明提供的方法中将植物组织制成切片，切片可以是本领域常见的切片类型，优选新鲜手工切片。
一些实施方案中，所述孵育前还包括对组织切片预处理的步骤。
进一步的，所述预处理为：用含0.3％曲拉通的X-100溶液浸泡20分钟，PBS冲洗两次，每次5min。
一些实施方案中，所述孵育后还包括冲洗组织切片的步骤。其中，所述冲洗为用PBS缓冲液冲洗两次，每次5min。
本发明提供一种消除植物细胞自发荧光的方法，该方法将组织切片置于茚三酮溶液中进行孵育处理，然后将切片进行特异性荧光探针标记后于生物荧光显微镜下观察，可以有效去除自发荧光干扰，提高图像信噪比，使特异性荧光清晰可见。
附图说明
图1示黄芪种子胚轴的组织切片随茚三酮溶液孵育时间的自发荧光猝灭情况；其中，曝光时间：绿色100ms，红色100ms,bar＝20μm；
图2示拟南芥根在茚三酮孵育之后自发荧光猝灭情况；其中，曝光时间：绿色100ms，红色100ms,bar＝100μm；
图3示使用和不使用茚三酮溶液孵育的黄芪种子胚轴的特异荧光标记的对比情况，曝光时间：A，B组100ms，C组200ms,bar＝100μm。
具体实施方式
本发明提供了一种消除植物细胞自发荧光的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明，英文缩写及部分名词，释义如下：
PBS：磷酸盐缓冲溶液；
pH:溶液酸度值；
EasyProbesTMGreen 488 Live Cell Stain：一种细胞核染料，可与DNA结合而发出明亮的绿色荧光；
PI:即碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光；
荧光技术：某些物质受到一定波长的光激发后，在极短时间内会发射出波长大于及激发波长的光，这种光称为荧光。这一发光现象在各方面的应用及有关的方法称为荧光技术；
自发荧光：也称自体荧光，即生物结构在它们吸收光时自然发射的光，并且被用于区分人工添加的荧光标记的光。自发荧光会干扰特定荧光信号的检测，特别是当感兴趣的信号非常暗淡时，它使得除了感兴趣的结构之外的结构变得清晰可见。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
包括以下步骤：
1.黄芪种子胚轴为试材，徒手切片。
2.切片在20mg/ml茚三酮溶液(溶剂为pH7.4的1×PBS缓冲液)中浸泡不同时间(0min、2min、10min、20min)。
3.浸泡完成后用PBS冲洗2次。
4.在荧光显微镜下观察不同浸泡时间切片的荧光猝灭程度。
结果如图1所示。
实施例2
1.取拟南芥的根，于30mg/ml茚三酮溶液(溶剂为蒸馏水)中浸泡15min。
2.在荧光显微镜下观察根自发荧光猝灭情况
结果如图2所示。
实施例3
包括以下步骤：
1.以黄芪种子胚轴为试材，徒手切片。
2.切片用0.3％曲拉通X-100溶液通透20分钟，PBS冲洗两次，每次五分钟。
3.再用茚三酮溶液(以pH7.4的1×PBS为溶剂，浓度为20mg/ml)孵育处理，在装有切片的EP管中加入溶液，没过切片，大约10-20分钟，常温进行，观察切片被染成蓝紫色即可，PBS冲洗两次，每次五分钟。
4.将组织切片用两种荧光探针同时标记细胞核，分别为EasyProbesTMGreen 488Live Cell Stain(60μl/100ml)、PI(6μg/ml)，避光反应15min，PBS冲洗两次，每次五分钟。
5.将切片在生物荧光显微镜下观察并拍照。激发和发射波长分别为：；蓝激发464-495nm，发射515-555nm(绿色)；绿激发528-554nm，发射575-633nm(红色)
实验处理分为A、B、C、D四组：
A组为没有经过任何处理的新鲜切片，观察其在明场、紫外激发、蓝激发、绿激发下的状态；
B组为经过三种细胞核荧光探针标记的切片，观察其在明场、紫外激发、蓝激发、绿激发下的状态；
C组为经过茚三酮溶液孵育后的切片，再使用三种细胞核荧光探针处理的切片，观察其在明场、蓝激发、绿激发下的状态；
D组为只经过茚三酮溶液处理不加荧光染料的切片，观察其在明场、蓝激发、绿激发下的状态。实验结果见图3。
注：PBS：磷酸盐缓冲溶液；pH:溶液酸度值；EasyProbesTMGreen 488 Live CellStain：一种细胞核染料，可与DNA结合而发出明亮的绿色荧光。PI:即碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
如图3所，A组没有经过任何处理的切片，细胞有绿色、红色自发荧光；B组未经自发荧光猝灭的切片，两种荧光染料标记的细胞核都能够看见，但是荧光标记模糊不清楚，可以看出自发荧光对标记荧光有干扰，背景较重；C组，为茚三酮浸泡处理后再进行荧光标记的切片，可以看出细胞核标记很明显，细胞核位置清晰可见。D组，为茚三酮溶液处理的未做细胞核荧光标记的切片在两种激发光下自发荧光都有大幅减弱，效果明显，说明本发明方法可以有效的消除黄芪胚轴细胞的自发荧光。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种消除植物组织自发荧光的方法，其特征在于，将植物组织制成切片，于茚三酮溶液中孵育；
所述茚三酮溶液的浓度为1~40mg/ml；
所述孵育在室温下进行，孵育的时间为1~30min；
所述自发荧光的激发和发射波长分别为：蓝激发464-495nm，发射515-555nm；绿激发528-554nm，发射575-633nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茚三酮溶液的溶剂为PBS缓冲液或蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茚三酮溶液的溶剂为pH5.6~8.4的1×PBS缓冲液或蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切片为新鲜切片。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育前还包括对组织切片预处理的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述预处理为：用含0.3%曲拉通的X-100溶液浸泡15~20min，PBS冲洗两次，每次五分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育后还包括冲洗组织切片的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冲洗为用PBS缓冲液冲洗两次，每次5min。
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