JP6492897B2 - 工程処理実施の有無を判別する手段を有するスライドグラス、組織切片スライド、組織切片用処理容器、および工程処理実施の有無の判別方法 - Google Patents
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Description
[1]
プレパラートを作製する過程に含まれる工程処理の、実施の有無を判別できる表示を提示する手段(以下「判別手段」と称する。)を有する、プレパラート作製用スライドグラス。
[2]
複数の工程処理のそれぞれに対応した複数の判別手段を有する、[1]に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[3]
判別手段が、工程処理で使用される溶液と反応して発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである、[1]または[2]に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[4]
判別手段が、工程処理で使用される溶液の温度に反応して発色、変色または溶融することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである、[1]または[2]に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[5]
判別手段が、工程処理で使用される溶液のpHに反応して発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである、[1]または[2]に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[6]
工程処理の実施の有無を判別できる表示を文字または図柄によって提示する、[1]〜[5]のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[7]
脱着可能なシールマスク材が判別手段を覆うように貼着している、[1]〜[3],[5],[6]のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[8]
判別手段がさらに、工程処理で用いられる溶液に組織切片スライドを浸漬させるべき深さを把握できる目盛りを有する、[1]〜[7]のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[9]
判別手段が、工程処理で使用される溶液に含まれる蛍光体を捕捉する機構を有し、その蛍光体の蛍光発光により工程の処理実施の有無を判別できる表示を提示するものである、[1]〜[3],[6]〜[8]のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
[10]
[1]〜[9]のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラスと、そこに載置された組織切片を含む、組織切片スライド。
[11]
[10]に記載の組織切片スライドを、その判別手段が所定の機能を発揮できるよう、工程処理で用いられる溶液にしかるべき深さで浸漬させた状態で保持することのできる収容部を備えた、組織切片スライド用処理容器。
[12]
組織切片スライドの複数の判別手段のそれぞれに対応した複数の収容部を備える、[11]に記載の組織切片スライド用処理容器。
[13]
[11]または[12]に記載の組織切片スライド用処理容器で、[10]に記載の組織切片スライドを工程処理で用いられる溶液にしかるべき深さで浸漬し、その判別手段の表示によって工程処理の実施の有無を判別する方法。
本発明のプレパラート作製用スライドグラスは、組織切片を載置し、プレパラートを作製するためのスライドグラスであって、プレパラートを作製する過程に含まれる工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示する手段(判別手段)を有するものである。このようなスライドグラスは、予め判別手段が形成されていて、これに組織切片を載置するように用いられるものであってもよいし、スライドグラスに組織切片を載置した後、判別手段を形成するように用いられるものであってもよい。いずれにしても、プレパラート作製過程を開始する段階で、組織切片が載置され、かつ判別手段が形成されている状態にあるスライドグラス(組織切片スライド)は、本発明のスライドグラスを利用しているといえる。
プレパラートの典型例としては、特定のタンパク質を標識化(染色)の対象とする実施形態(組織免疫染色プレパラート)と、特定の核酸(遺伝子)を標識化の対象とする実施形態(FISHプレパラート)が挙げられる。以下、これらのプレパラートの作製過程の一般的な実施形態について、まず組織免疫染色プレパラートについて記載し、次にFISHプレパラートの作製過程について記載する。本発明において、このような作製過程に含まれる工程処理は必要に応じて改変することができる。
(1)脱パラフィン工程
脱パラフィン工程ではまず、パラフィン包埋された組織切片をキシレンに浸漬し、パラフィンを除去する。通常、このキシレンを用いた処理の温度は室温であり、時間は3〜30分である。必要により、浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
賦活化工程では、脱パラフィン工程を経た組織切片を賦活液に浸漬し、加熱して、タンパク質(抗原)への抗体の結合能を回復させる。賦活液としては、例えば、0.01Mクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器としては、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。通常、加熱処理の温度は50〜130℃、時間は5〜30分である。
標識工程を免疫染色に基づいて行う場合、賦活化工程を経た組織切片を組織免疫染色用の標識液に浸漬し、標識液中の1または複数の標識剤を直接的または間接的に標的とするタンパク質(抗原)に結合させて、標識化する。
プレパラート作製の最終段階として、標識工程を経た組織切片を、エタノール(水溶液)に浸漬して脱水処理し、次いでキシレンに浸漬して透徹処理をした後、封入液に浸漬して封入処理をする。
標識工程(免疫染色工程)において標識物質として蛍光体集積ナノ粒子を用いる場合、細胞ないし組織の形態観察用の染色液で細胞膜等を染色しても、目的とするタンパク質を標識した蛍光体集積ナノ粒子を識別することが可能である。したがって、その場合は必要に応じて、標識工程を経た組織切片を染色液に浸漬し、細胞膜等を染色する工程を行ってもよい。
標識工程(免疫染色工程)において標識物質として蛍光体集積ナノ粒子を用いた場合、特に封入剤として油系封入剤を用いる場合は、必要に応じて、標識工程を経た組織切片を固定化処理液に浸漬し、蛍光体集積ナノ粒子等を組織に強固に結合させて安定させた状態とする、固定化工程を行ってもよい。
FISHプレパラートの作製過程では、脱パラフィン工程(1)、および封入工程(4)については、前述した組織免疫染色プレパラートと同様に実施することができる一方、標識工程が、タンパク質を目的とする免疫染色工程(3A)ではなく、核酸(遺伝子)を目的とするFISH工程(3B)に変更される。また、賦活化工程(2A)に代わるFISH独自の工程として、細胞膜および核膜を除去するための工程、すなわち膜除去工程(2B)を実施する。
したがって、FISHプレパラートの作製過程については、上記工程(1)および(4)についての記載を省略し、工程(2B)および(3B)について以下に記載する。
プローブをハイブリダイゼーション反応に供する前には、膜除去工程として、前処理(加熱処理および/または酸処理)と酵素処理の2段階の処理を施すことによって、細胞膜および核膜を除去し、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにすることが好ましいこと知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さやスライドの作製条件などに応じて、最適なものとなるよう適宜決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もある。以下に、膜除去工程の一実施形態の手順を示す。
前処理としては、加熱処理および酸処理のいずれか一方またはこれら両方が行われる。すなわち、酸を用いない(緩衝溶液またはその他の溶液を用いた)加熱処理を行ってもよいし、加熱を行わない(室温で反応させる)酸処理を行ってもよいし、酸を用い、かつ加熱を行う処理を行ってもよい。前処理としては、上記のような処理を1回(1種類)のみ行ってもよいし、2回(2種類)以上行ってもよい。
酵素処理としては、プロテアーゼ(ペプチド結合加水分解酵素)を用いた処理が行われる。このような処理は、細胞膜および核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために行うことが好ましい。プロテアーゼとしては、プロテイナーゼ(タンパク質中の所定のアミノ酸配列を認識してそのペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼ)またはペプチダーゼ(ペプチドのN末端またはC末端のペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼ)を用いることができるが、ペプシン、プロテイナーゼKといったプロテイナーゼが好ましい。
標識工程をFISHに基づいて行う場合、膜除去工程を経た組織切片をまず変性液に浸漬させ、所定の温度で一定時間保持し、核酸(染色体)の2本鎖DNAを1本鎖DNAに解離させる変性処理を行う。続いて、変性処理を経た組織切片をFISH用の標識液に浸漬し、変性処理よりも低い所定の温度で一定時間保持し、標識液中の一または複数の標識剤を直接的または間接的に標的とする核酸(遺伝子)に結合させて標識化する、ハイブリダイゼーション処理を行う。
標識工程(FISH工程)において標識物質として蛍光体集積ナノ粒子を用いる場合、核染色液で核を染色しても、目的とするタンパク質を標識した蛍光体集積ナノ粒子を識別することが可能である。したがって、その場合は必要に応じて、標識工程を経た組織切片を染色液に浸漬し、核を染色する工程を行ってもよい。
本発明のスライドグラスが備える判別手段、すなわち工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示する手段は特に限定されるものではないが、例えば、以下のような実施形態が挙げられる。以下、いくつかの具体例を挙げながら本発明について説明するが、本発明の実施形態はそれらに限定されるものではなく、具体例に示した以外の公知の様々な手法を用いることができる。
判別手段は、一つの工程処理に対応したものだけでなく、複数の工程処理のそれぞれに対応した複数のものとすることができる。例えば、一つの工程処理の実施の有無を判別できる表示を、スライドグラス上の一つの領域(本明細書において、このような領域の一つずつを「表示部」と称することにする。)に提示するようにし、それらの表示部を、相互の表示の提示やそのための反応を阻害しないような適切な配置でもって、スライドグラス上に複数形成するようにすればよい。複数の判別手段(表示部)は、プレパラートを作製する過程に含まれる全ての工程処理に対応していてもよいし、それらの工程処理のうちの一部に対応していてもよい。また、複数の判別手段で所定の表示を提示するために用いられる手法は、1種類(共通)であってもよいし、2以上の種類(一部または全部が互いに相違)であってもよい。
工程処理の実施の有無を判別できる表示は、一般的に、表示部の発色(無色から有色への色の変化)、変色(有色から有色、または有色から無色への色の変化)、溶解・溶融(有色から無色への色の変化)などによって提示することができる。また、このような提示は、判別手段(表示部)が、工程処理で使用される溶液と反応すること、工程処理で使用される溶液の温度に反応すること、または工程処理で使用される溶液のpHに反応することによって、引き起こすことができる。
判別手段の第1の実施形態として、工程処理で使用される“溶液”と反応して、発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものが挙げられる。
表示部が溶液と反応して“発色”する実施形態としては、上記(ii)または(iii)に相当するものであって、溶液中の“発色”のための物質を表示部において捕捉するものが挙げられる。“発色”のための物質としては、発光強度や視認性、検出性の観点から蛍光体を用いることが好ましい。本発明における好ましい実施形態としては、判別手段(表示部)が工程処理で使用される溶液に含まれる蛍光体を捕捉する機構を有し、その蛍光体の蛍光発光により工程の処理実施の有無を判別できる表示を提示するものが挙げられる。
表示部が溶液と反応して“変色”する実施形態としては、上記(i)に相当するものであって、工程処理で用いられる多くの溶液の溶媒となっている水と反応して、表示部に固定された物質が“変色”するものが挙げられる。
表示部が溶液と反応して“溶解”する実施形態としては、上記(i)に相当するものであって、工程処理で用いられる多くの溶液の溶媒となっている水と反応して、表示部に固定された物質が“溶解”するものが挙げられる。たとえば、グルコースは水に容易に溶解するので、着色したグルコースを表示部に塗布しておき、工程処理で用いられる水溶液に浸漬することにより、その着色したグルコースが水溶液中に溶解して、表示部は無色になる。このほかにも、工程処理で用いられる溶液の溶媒に応じて、それと反応して“溶解”する様々な物質を表示部に固定しておくことができる。
判別手段の第2の実施形態として、所定の工程処理で使用される溶液の“温度”に反応して、発色、変色または溶融することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものが挙げられる。その所定の工程処理で使用される溶液の温度と異なる環境下では、つまりその所定の工程処理以外の工程処理において溶液に浸漬させても、表示部の所定の発色、変色または溶融は起こらない。
判別手段の第3の実施形態として、工程処理で使用される溶液の“pH”に反応して、発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものが挙げられる。その所定の工程処理で使用される溶液のpHと異なる環境下では、つまりその所定の工程処理以外の工程処理において溶液に浸漬させても、表示部の所定の発色、変色または溶解は起こらない。
判別手段により提示される、工程処理の実施の有無を判別するための表示は、円、矩形等の単純な図形であってもよいが、判別性を向上させるために、文字または図柄とすることもできる。
判別手段には、脱着可能なシールマスク材がそこを覆うように貼着していてもよい。このシールマスク材は、対応する工程が開始される前に剥がされる。シールマスク材が貼着した状態では、判別手段(表示部)に工程処理で使用される溶液が接触するなどの、工程処理の実施の有無を判別できる表示の提示が抑制されるが、シールマスク材が剥がされると、そのような溶液の接触などの抑制が解かれ、所定の表示の提示が可能となる。必要であれば、シールマスク材は対応する工程が終了した後に再び貼着してもよく、それにより提示された表示がその後の工程処理によって変化することを防ぐことができる。一方で、対応する工程が終了した判別手段のシールマスク材は剥がされたままとして、まだ実施されていない工程の判別手段と区別しやすくしてもよい。
判別手段はさらに、工程処理で用いられる溶液に組織切片スライドを浸漬させるべき深さを把握できる目盛りを有していてもよい。例えば、浸漬用容器(組織切片スライド用保持具)に組織切片スライドを挿入した後、工程処理で使用する溶液を、それに対応する判別手段(表示部)が浸漬する位置に付された目盛りに液面が達するまで注入するようにして使用する。また、工程処理で使用する溶液を浸漬用容器にあらかじめ十分な深さで注入しておき、そこに組織切片スライドを、液面が目盛りに一致するところまで挿入するといった使用方法も可能である。これにより、工程処理で使用される溶液を、対応する本来の判別手段だけでなく、後に行われる工程処理に対応する判別手段まで、誤って接触させることを防止しやすくなる。
本発明の組織切片スライド処理用容器は、上述したような本発明のスライドグラスを使用して作製される組織切片スライドと組み合わせて使用するのに好適な器具である。
2:組織切片
8:第1表示部
8a:[A]文字による判別手段を有する第1表示部(工程処理済み)
8b:[B]図柄による判別手段を有する第1表示部(工程処理済み)
8c:シールマスク材が剥がされた判別手段を有する第1表示部(工程処理済み)
8d:目盛りが付された判別手段を有する第1表示部
8e:[A]第1〜第3収容部の各自の深さによって浸漬する判別手段を有する第1表示部
8f:[B]溶液の液面の高さによって浸漬する判別手段を有する第1表示部
9:第2表示部
9c:シールマスク材で覆われた判別手段を有する第2表示部(工程未処理)
9d:目盛りが付された判別手段を有する第2表示部
9e:[A]第1〜第3収容部の各自の深さによって浸漬する判別手段を有する第2表示部
9f:[B]溶液の液面の高さによって浸漬する判別手段を有する第2表示部
10:第3表示部
10c:シールマスク材で覆われた判別手段を有する第3表示部(工程未処理)
10d:目盛りが付された判別手段を有する第3表示部
10e:[A]第1〜第3収容部の各自の深さによって浸漬する判別手段を有する第3表示部
10f:[B]溶液の液面の高さによって浸漬する判別手段を有する第3表示部
11a:文字による判別手段を有する第2及び第3表示部(工程未処理)
11b:図柄による判別手段を有する第2及び第3表示部(工程未処理)
12:シールマスク材
13:浸漬用容器(組織切片用スライド用保持具)
14:第1目盛り
15:第2目盛り
16:第3目盛り
17:組織切片スライド処理用容器
18a:[A]組織切片スライド処理用容器の第1収容部
18b:[B]組織切片スライド処理用容器の第1収容部
19a:[A]組織切片スライド処理用容器の第2収容部
19b:[B]組織切片スライド処理用容器の第2収容部
20a:[A]組織切片スライド処理用容器の第3収容部
20b:[B]組織切片スライド処理用容器の第3収容部
Claims (10)
- プレパラートを作製する過程に含まれる工程処理の、実施の有無を判別できる表示を提示する手段(以下「判別手段」と称する。)を有し、
前記工程処理は、複数の工程処理であり、
前記判別手段は、前記複数の工程処理それぞれの実施の有無を判別できる複数の表示を提示する手段(以下「複数の判別手段」と称する。)であり、
前記複数の判別手段が、それぞれ独立に下記(a)〜(c)から選択されるプレパラート作製用スライドグラス。
(a)前記判別手段が、工程処理で使用される溶液と反応して発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである
(b)前記判別手段が、工程処理で使用される溶液の温度に反応して発色、変色または溶融することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである
(c)前記判別手段が、工程処理で使用される溶液のpHに反応して発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものである - 工程処理の実施の有無を判別できる表示を文字または図柄によって提示する、請求項1に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
- 脱着可能なシールマスク材が判別手段を覆うように貼着している、請求項1または2に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
- 判別手段がさらに、工程処理で用いられる溶液に組織切片スライドを浸漬させるべき深さを把握できる目盛りを有する、請求項1に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
- 工程処理で使用される溶液と反応して発色、変色または溶解することにより、工程処理の実施の有無を判別できる表示を提示するものが、工程処理で使用される溶液に含まれる蛍光体を捕捉する機構を有し、その蛍光体の蛍光発光により工程の処理実施の有無を判別できる表示を提示するものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラス。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のプレパラート作製用スライドグラスと、そこに載置された組織切片を含む、組織切片スライド。
- 請求項6に記載の組織切片スライドを、その判別手段が所定の機能を発揮できるよう、工程処理で用いられる溶液にしかるべき深さで浸漬させた状態で保持することのできる収容部を備えた、組織切片スライド用処理容器。
- 組織切片スライドの複数の判別手段のそれぞれに対応した複数の収容部を備える、請求項7に記載の組織切片スライド用処理容器。
- 請求項7または8に記載の組織切片スライド用処理容器で、請求項6に記載の組織切片スライドを工程処理で用いられる溶液にしかるべき深さで浸漬し、その判別手段の表示によって工程処理の実施の有無を判別する方法。
- プレパラートを作製する過程に含まれる工程処理の、実施の有無を判別できる表示を提示する手段(以下「判別手段」と称する。)を有し、
前記判別手段がさらに、前記工程処理で用いられる溶液に組織切片スライドを浸漬させるべき深さを把握できる目盛りを有する、プレパラート作製用スライドグラス。
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