CN106018355B - 待测样品分析方法及待测样品分析装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及待测样品分析方法，其包括：对测定样品加热而使DNA发生变性的S14的处理工序，进行抑制自测定样品发生的自身荧光的脱色处理的S21的处理工序，使荧光染料结合于测定样品中的被检物质的S16、S17的处理工序，及向测定样品照射光而对自荧光染料发生的荧光进行摄像的S19的摄像工序。在S21的脱色工序之前进行S14的DNA变性处理工序。

Description

待测样品分析方法及待测样品分析装置
【技术领域】
本发明涉及由对测定样品摄像的摄像图像分析测定样品中的被检物质的待测样品分析方法及待测样品分析装置。
【背景技术】
在指定的疾病中，特定的基因或特定的蛋白质等与病情的发展相关。对于从受试者采集的细胞确认特定的物质的存在及状况在决定这些疾病的诊断或治疗方针时极其有用。
特定的物质的检测，例如，通过由荧光染料标记特定的物质，对自荧光染料发生的荧光进行摄像来进行。通过向含被检细胞的测定样品照射光而荧光自荧光染料被激发，但有时因测定样品，由激发用的光的照射而自测定样品自身发生自身荧光。此自身荧光对于自荧光染料发生的荧光成为背景噪声。
在US2010/0120060A1中记载有抑制此自身荧光的方法。在专利文献1中记载的方法中，通过向测定样品照射光而自身荧光的发生被抑制。通常将这样向测定样品赋予指定的作用而抑制自身荧光称为脱色。
作为根据病情的发展而扩增的特定的基因，已知作为乳腺癌的预后因子的HER2基因。本申请发明人等在对于由模拟自受试者的病变组织采集的乳腺癌的异种移植制成的测定样品进行乳腺癌的细胞分析时，适用上述专利文献1的方法尝试了自身荧光的抑制。但是，无法有效抑制自测定样品发生的自身荧光，无法高精度检测自荧光染料得到的荧光。
【发明概述】
本发明的范围由随附的权利要求定义，不以任何方式受此发明概述部分的限制。
本发明的第1实施方式中涉及的待测样品分析方法包括：对测定样品加热而使DNA发生变性的DNA变性处理工序，抑制自上述测定样品发生的自身荧光的脱色工序，使荧光染料结合于上述测定样品中的被检物质的标记工序，及向上述测定样品照射光而对自上述荧光染料发生的荧光进行摄像的摄像工序。待测样品分析方法在上述脱色工序之前进行上述DNA变性处理工序。
本发明的第2实施方式中涉及的待测样品分析装置具备：对上述测定样品实施用于对测定样品中所含的被检物质进行摄像的预处理的预处理部，对由上述预处理部实施预处理的上述测定样品进行摄像的摄像部，及处理由上述摄像部得到的摄像图像而提取上述被检物质的解析部。上述预处理部包括：进行上述对测定样品加热而使DNA发生变性的DNA变性处理的处理单元，对上述测定样品进行用于抑制自身荧光的脱色处理的处理单元，进行使荧光染料结合于上述测定样品中的被检物质的标记处理的处理单元。上述进行DNA变性处理的处理单元先于上述进行脱色处理的处理单元对上述测定样品进行处理。上述摄像部向实施上述预处理的上述测定样品照射光而对自上述荧光染料发生的荧光进行摄像。
【发明效果】
由本发明可有效抑制从测定样品固有地发生的自身荧光，可高精度检测来自与特定的物质结合的荧光染料的荧光。
【附图说明】
图1是显示实施方式中涉及的待测样品分析方法的处理的流程图。
图2是显示实施方式中涉及的荧光染料与被检物质结合的状态的图。
图3是显示实施方式中涉及的摄像部和解析部的构成的图。
图4(a)是显示实施方式中涉及的2个焦点根据光轴方向的荧光的发光点的位置在光接收面上旋转的图。
图4(b)是显示实施方式中涉及的摄像工序的处理的流程图。
图5(a)是显示实施方式中涉及的解析工序的处理的流程图。
图5(b)是显示实施方式中涉及的3维超分辨率图像的图。
图6(a)是显示实施方式的验证1中涉及的脱石蜡处理之后立即进行脱色处理，其后进行活化处理时的自身荧光的验证结果的图。
图6(b)是显示实施方式的验证1中涉及的活化处理之后立即进行脱色处理，其后依次进行蛋白酶处理和DNA变性处理时的自身荧光的验证结果的图。
图6(c)是显示实施方式的验证1中涉及的DNA变性处理之后立即进行脱色处理，其后依次进行封闭处理和第1抗体处理时的自身荧光的验证结果的图。
图7是综合实施方式中涉及的验证1的验证结果的表。
图8(a)是对将实施方式的验证2中涉及的进行脱色处理的测定样品于室温放置20分钟时的自身荧光的恢复状况进行摄像的摄像图像。
图8(b)是对将实施方式的验证2中涉及的进行脱色处理的测定样品于44℃加热20分钟时的自身荧光的恢复状况进行摄像的摄像图像。
图8(c)是对将实施方式的验证2中涉及的进行脱色处理的测定样品于62℃加热20分钟时的自身荧光的恢复状况进行摄像的摄像图像。
图9是综合实施方式的验证2的验证结果的坐标图。
图10(a)～(c)各自是，以因实施方式的验证3的操作1～操作3而不同的波长的光进行脱色处理时的荧光染料的检测程度与未进行脱色处理时的荧光染料的检测程度比较而显示的坐标图。
图11(a)是在由脱色处理抑制实施方式的验证3中涉及的测定样品的自身荧光的状态下对被检物质的荧光进行摄像的摄像图像。
图11(b)是在不抑制实施方式的验证3中涉及的测定样品的自身荧光的状态下对被检物质的荧光进行摄像的摄像图像。
图12是显示实施方式中涉及的待测样品分析装置的构成的图。
【实施方式】
以下参照附图说明本发明的优选的实施方式。
接下来示的实施方式是在对于自受试者的病变组织采集的测定样品进行乳腺癌分析的待测样品分析方法及待测样品分析装置中适用本发明。在实施方式中，将作为乳腺癌的预后因子之一的HER2基因作为被检物质检测。在对由荧光染料标记的HER2基因进行摄像时，自测定样品发生的固有的光释放、即测定样品的自身荧光成为背景噪声而使被检物质的检测精度降低。本申请发明人发现了在预处理测定样品的预处理工序中有效抑制自测定样品发生的自身荧光的方法。以下说明本申请发明人的验证及其方法。
【1.基本工序】
如图1所示，待测样品分析方法，作为对从病变组织采集的测定样品的预处理工序，实行脱石蜡处理工序、活化处理工序、蛋白酶处理工序、DNA变性处理工序、封闭处理工序、第1抗体处理工序、第2抗体处理工序及保存工序。各处理工序中使用的试剂等具体性的处理内容在后述的验证中示出。其中总括地说明各处理工序中的处理。
步骤S11的脱石蜡处理工序是从测定样品除去石蜡的处理工序。为了保存作为测定样品的组织切片而在测定样品中使用石蜡。在步骤S11中，为了使染色探针、即，DNP标记的核酸或染料标记的抗体变得容易进入测定样品的细胞内，自测定样品除去石蜡。在步骤S11中，使测定样品的温度提高到75℃而进行处理。也可在石蜡熔融的44℃以上100℃以下进行步骤S11的反应。
步骤S12的活化处理工序及步骤S13的蛋白酶处理工序是为了提高细胞内的核酸的反应性而进行的处理工序。由步骤S12、S13的处理，亚甲基交联等被切断而抗原被活化，特定氨基酸残基的肽键被切断。在步骤S12中，将测定样品的温度提高到90℃进行处理。在步骤S13中，将测定样品的温度提高到37℃而进行处理。
步骤S14的DNA变性处理工序含DNA变性处理、杂交处理及严格度清洗处理。由步骤S14的处理，双链的DNA分离为单链。由此，染色探针、即DNP标记的核酸结合的部位露出。通过将温度保持在95℃的高温，分离的DNA的再结合被抑制。其后，使温度降低到44℃，使DNP标记的核酸探针结合于结合部位。在本反应中，合适的温度随核酸探针的序列或盐浓度等溶液的组成而变。本反应的温度是室温以上、80℃以下的范围。其后，于62℃进行严格度清洗。严格度清洗的温度成为相比使核酸探针结合于结合部位的温度更高的温度。在步骤S14中，将测定样品的温度提高到95℃、44℃、62℃而进行处理。
步骤S15的封闭处理工序是为了用于对核酸探针进行荧光标记的抗体、即，第一抗体或第二抗体不非特异性地结合于测定样品的组织切片地在组织切片上实施封闭处理的处理工序。由此处理，摄像图像的噪声被降低。在步骤S15中，为了反应时间的缩短，将测定样品的温度提高到37℃而进行处理。步骤S15的反应在室温即24℃左右进行也没问题。
步骤S16的第1抗体处理工序是用于使第1抗体结合于与测定样品中的被检物质结合的DNP标记核酸探针的处理工序。步骤S17的第2抗体处理工序是用于使荧光染料、即荧光标记的第2抗体进一步结合于与DNP标记核酸探针结合的第1抗体的处理工序。步骤S16及S17是用于对测定样品中的被检物质进行荧光标记的标记工序。在步骤S16、S17中，为了反应时间的缩短，将测定样品的温度提高到37℃而进行处理。步骤S16、S17的反应在室温即24℃左右进行也没问题。
HER2基因之外，CEP17等其他物质也作为被检物质时，在步骤S14、步骤S16及步骤S17中，还进行对其他被检物质的标记处理。在步骤S17的第2抗体处理工序中，也可使用对核染色的染料一并进行测定样品中的核的染色。
如图2所示，第1抗体结合于与作为被检物质的HER2基因结合的DNP标记核酸探针，第2抗体结合于该结合的第1抗体。第2抗体含荧光染料。第2抗体的荧光染料也可以能切换为通过照射激发用的光而发生荧光的活性状态和即使照射激发用的光也不发生荧光的无活性状态。在本实施方式中，标记HER2基因的荧光染料在活化状态之时以指定的强度和时间照射激发用的光则在发荧光的同时失活，其后，照射与激发用的光不同的波长的光则活化。以下，将失活称为“消光”。代替由光的作用，也可由热或化学药品等的作用进行荧光染料的活化。
回到图1，步骤S18的保存工序是清洗及干燥进行步骤S11～S17的处理的测定样品，在冷暗处保存至摄像的工序。对测定样品立即摄像时，也可不在冷暗处保存测定样品。
步骤S19的摄像工序是对进行了预处理的测定样品进行摄像的工序。在步骤S19中，自与被检物质结合的荧光染料发生的荧光被摄像。步骤S20的解析工序是解析步骤S19的摄像工序中取得的摄像图像而检测细胞内所含的被检物质而计数的工序。
步骤S19的摄像工序，例如，由图3所示的摄像部100进行。步骤S20的解析工序，例如，由图3所示的解析部200进行。摄像部100基于由解析部200的处理部201的控制，实行对测定样品的摄像处理。
摄像部100具备光源部101、快门102、1/4波长板103、扩束器104、聚光透镜105、二向色镜106、物镜107、镜台108、扩束器109，相位板110、聚光透镜111、及摄像元件112。摄像元件112，例如，是CCD、EMCCD、CMOS、scientificCMOS图像传感器。在镜台108上设置有加载测定样品的载玻片121。
光源部101发射2个波长的光。第1波长的光使与作为被检物质的HER2基因结合的荧光染料激发荧光。第2波长的光使对核染色的荧光染料激发荧光。第2波长的光也在与HER2基因结合的荧光染料的活化中使用。第1波长是例如640nm，第2波长是例如405nm。除HER2基因之外，CEP17等其他物质也作为被检物质时，光源部101再发射第3波长的光。第3波长是例如750nm。光源部101由例如发射各波长的光的光源和使这些光的光轴一致的二向色镜构成。光源部101优选使用激光源，但也可使用汞灯、氙灯、LED等。
快门102由控制器123驱动。控制器123将快门102切换为使自光源部101发射的光通过的状态和阻断自光源部101发射的光的状态。由此，对被检物质的光的照射时间被调整。
1/4波长板103将自光源部101发射的直线偏光的光变换为圆偏光。荧光染料与指定的偏光方向的光反应。从而，通过将激发用的光变换为圆偏光，使得激发用的光的偏光方向易变得与荧光染料反应的偏光方向一致。由此，可对被检物质中所含的荧光染料有效激发荧光。不使激发用的光变为圆偏光，不考虑激发效率时，也可省略1/4波长板103。扩束器104扩大载玻片121上的光的照射区域。聚光透镜105使光聚光而使平行光从物镜107照射到载玻片121。
二向色镜106反射自光源部101发射的光，透过自被检物质发生的荧光。物镜107将由二向色镜106反射的光导向载玻片121。镜台108由控制器122驱动，在水平面内移动。由此，光广泛地照射到载玻片121上。自被检物质发生的荧光通过物镜107，透过二向色镜106。
透镜109a对透过二向色镜106的荧光进行聚光而使成像。相位板110被配置在由透镜109b形成的傅里叶面上。相位板110给透过扩束器109的荧光赋予调相作用。聚光透镜111对透过相位板110的荧光进行聚光，导入摄像元件112的光接收面。摄像元件112对荧光进行摄像，将摄像图像输出到解析部200。
相位板110被配置在傅里叶面上，有使点像分布函数变调的作用，以使摄像元件112的光接收面呈现2点的焦点。自测定样品中之一的荧光染料发生的荧光因相位板110的作用，在摄像元件112的光接收面上成像为2个焦点。此时，2个焦点，如图4(a)所示，根据物镜107的光轴方向中的荧光的发光点的位置在光接收面上旋转。即，连接2个焦点的直线和成为基准的直线的夹角根据光轴方向中的荧光的发光点的位置，在摄像元件112的光接收面上变化。
例如，在载玻片121中自在物镜107的光轴方向上不同的2个位置的荧光染料发生的荧光各自因相位板110而分割为2个，照射到摄像元件112的光接收面上。此时，连接光接收面上的2个焦点的直线，例如，如图4(a)所示，对于一方的荧光染料与基准线成+θ1的角，对于另一方的荧光染料与基准面成+θ2的角。从而，如果取得连接2个焦点的直线对于基准线的夹角，则可取得在光轴方向的荧光染料的位置。
回到图3，解析部200是例如个人计算机。解析部200具备处理部201，存储部202，接口203，显示部204及输入部205。
处理部201是例如CPU。存储部202是ROM、RAM、硬盘等。处理部201基于在存储部202中存储的程序实行各种各样的功能。处理部201在处理由摄像元件112得到的图像的同时，进行其他各种各样的处理。另外，处理部201经接口203，控制光源部101，摄像元件112和控制器122、123。显示部204是用于表示由处理部201的处理结果等的显示器。输入部205是用于接受由使用者的指示性输入的键盘和鼠标。
在图1的步骤S19的摄像工序中，解析部200的处理部201控制光源部101及摄像元件112，取得测定样品中的核的图像和与被检物质结合的荧光染料的图像。在图1的步骤S20的解析工序中，处理部201根据在步骤S19中取得的图像检测核及荧光染料。处理部201基于核及荧光染料的图像，提取核中所含的被检物质、即HER2基因而进行计数。
如图4(b)所示，在步骤S101中，处理部201将来自光源部101的第2波长的光照射到测定样品，从对核染色的染料使荧光发生。处理部201将发生的荧光用摄像元件112摄像，取得核的图像。处理部201在光照射到测定样品期间重复摄像而取得指定张数、例如100张核的图像。在步骤S101中摄像的图像的张数不限于100张，也可为例如1张。处理部201使物镜107在光轴方向位移，在光轴方向不同的多个焦点位置，实行上述核的图像的取得处理。由此，在各焦点位置取得例如100张核的图像。
在步骤S102中，处理部201从光源部101将第1波长的光照射到测定样品，使与被检物质结合的荧光染料消光。在步骤S103中，处理部201从光源部101将第2波长的光照射到测定样品，活化与被检物质结合的荧光染料。在步骤S104中，处理部201从光源部101将第1波长的光照射到测定样品，从荧光染料使荧光发生，将发生的荧光由摄像元件112摄像。
在步骤S104中，处理部201在第1波长的光照射到测定样品之间重复摄像而取得指定张数、例如100张荧光的图像。在步骤S104中摄像的图像的张数不限于100张，也可为例如1张。在步骤S104中从光源部101照射第1波长的光期间，与被检物质结合的荧光染料被消光。
在步骤S105中，处理部201判断荧光的摄像图像的取得结束与否。处理部201将步骤S103、S104的处理重复指定次数。例如，步骤S103、S104的处理被重复30次。由此，处理部201取得3000张荧光的摄像图像。如图4(a)一样，自一个荧光染料发生的荧光在摄像元件112的光接收面，成像为2个焦点。因此，荧光的摄像图像仅含步骤S103中活化的荧光染料的数的2个荧光的亮点的对。
在步骤S103中，并非与被检物质结合的全部的荧光染料被活化。在一个被检物质上结合有多个荧光染料。在S103中，其中指定的比例的荧光染料活化。与一个被检物质结合的多个荧光染料，在每次重复步骤S103的活化中，也不必然是相同的荧光染料被活化。在各次的活化处理中活化的荧光染料的分布是随机的。
从而，由步骤S103、S104的处理，多次重复活化处理、摄像处理及失活处理，由此可使荧光染料均发光的同时，在各自的摄像图像中使荧光染料的荧光分散。从而，可根据各自的摄像图像，顺利地提取基于荧光染料的亮点。
如图5(a)所示，在步骤S111中，处理部201从如上述一样重复消光和活化而取得的荧光染料的摄像图像，取得3维超分辨率图像。3维超分辨率图像是指显示3维空间中的被检物质的分布的图像。在步骤S111中，处理部201对于荧光染料的摄像图像，进行高斯拟合而提取荧光的亮点，再取得提取的亮点的亮度。接下来，处理部201使亮度为同程度并且距离在指定的范围以内的2个亮点配对。接下来，处理部201使配对的2个亮点与预先在存储部202中存储的2个亮点的模板拟合，使可在某精度以上拟合的2个亮点判断为基于来自1种荧光染料发生的荧光由相位板110分割的荧光。
接下来，处理部201将光接收面上的成对的2个亮点的中点作为荧光染料的摄像视野中的2维平面上的位置。处理部201基于连接如上所述成对的2个亮点的直线和基准线的夹角，决定在物镜107的光轴方向的荧光染料的位置。由此，处理部201基于2维平面上的位置和光轴方向的位置，在3维坐标轴中特别指定多个荧光染料的坐标点。处理部201通过使特别指定的坐标点相对于全部的摄像图像重合，制成3维超分辨率图像。由此，例如，取得图5(b)所示的3维超分辨率图像。在图5(b)中，X-Y平面是摄像视野中的2维平面，Z轴方向是物镜107的光轴方向。
在步骤S112中，处理部201将特别指定的坐标点分类为对应于被检物质的组而提取被检物质。坐标点的组化，例如，在3维坐标空间中扫描指定的参照空间，提取此参照空间内所含的坐标点的数相比阈值多、并且相比周围坐标点的数多的参照空间的位置，将在提取的位置中参照空间中所含的坐标点的组分类为对应于一种被检物质的组。处理部201从由此分类的坐标点的组，提取3维坐标空间中的被检物质的位置。
在步骤S113中，处理部201取得被检物质的在3维空间中的核的范围。处理部201，在图4(b)的步骤S101中，在光轴方向不同的多个焦点位置，分别取得多个核的摄像图像。处理部201将在各焦点位置取得的多个核的图像平均化，取得各焦点位置中的核的平均化图像。处理部201在每幅各焦点位置的平均化图像，根据检测到荧光的区域取得核的轮郭。处理部201基于各焦点位置和其位置的核的轮郭，取得3维空间中的核的范围。
在步骤S114中，处理部201基于步骤S112中特别指定的被检物质的位置和步骤S113中取得的核的范围，取得核的范围中所含的被检物质的数。由此，处理部201结束解析工序中的处理。S114中取得的被检物质、即HER2基因的数，在诊断中，作为用于决定治疗方针的指标被医师等参照。医师等基于参照的HER2基因的数，可掌握HER2基因的扩增程度，从而可决定给药等、治疗方针。
再有，除了HER2基因之外，CEP17等其他物质也作为被检物质时，对于其他被检物质取得荧光的摄像图像，基于取得的摄像图像，取得核中所含的其他被检物质的数。当其他被检物质是CEP17时，算出核中所含的HER2基因的数和核中所含的CEP17的数的比。算出的比，在诊断中，作为用于决定治疗方针的指标，被医师等参照。
回到图1，在步骤S19及步骤S20中，如上所述进行测定样品的摄像和基于摄像图像的被检物质的解析。在步骤S19中，要求可确实地摄像核的荧光和与被检物质结合的荧光染料的荧光。但是，由于测定样品发出自身荧光，因此在摄像时，此自身荧光成为核的荧光及荧光染料的荧光的背景噪声。特别是，由于自各个荧光染料发生的荧光是微弱的，因此可产生自荧光染料发生的荧光与自身荧光混杂而无法识别的情况。再者，如上述一样，在自一个荧光染料发生的荧光由相位板110被分割为2个时，分割的各自的荧光的强度变得更加微弱。因此，自身荧光发生，则分割的荧光的识别变得更困难。
再有，图3的摄像部100是由相位板110分割荧光的构成，但也可为省略相位板110而将自荧光染料发生的荧光直接导向摄像元件112的构成。即，在透镜109a之后形成的成像面配置摄像元件112。此时，在物镜107的光轴方向无法分离荧光染料的位置，但能在摄像视野中的2维平面上特别指定荧光染料的位置。当摄像部100是这样的构成时，与如上述一样用相位板110分割荧光时相比，摄像元件112接收光的荧光的强度变高。但是，此时，也由于荧光染料的荧光是微弱的，因此自测定样品发生的自身荧光可成为检测自荧光染料发生的荧光时的障碍。
由于以上的问题，在图1的处理中，为了抑制自测定样品发生的自身荧光，进行步骤S21的脱色工序。在脱色工序中，指定波长的光照射到测定样品指定时间，自身荧光被抑制。
本申请发明人为了抑制自测定样品发生的自身荧光，在预处理工序中，尝试对测定样品进行脱色处理。但是，即使进行脱色处理，在步骤S19的摄像工序中对荧光染料的荧光进行摄像时，测定样品的自身荧光也不被抑制，无法确实地摄像自荧光染料发生的荧光。
本申请发明人利用各种的验证锐意寻求对于无法抑制自身荧光的原因。结果新发现，要想有效抑制摄像时测定样品的自身荧光，只要在预处理工序的某时机实行脱色工序即可。图1所示的步骤S21的脱色工序的实行时机是本申请发明人发现的脱色工序的实行时机之一例。步骤S21的脱色工序在将测定样品的温度提高到62℃以上的步骤S11、S12、S14之后进行。步骤S14的DNA变性处理工序在步骤S21的脱色工序之前进行。步骤S11的脱石蜡处理工序及步骤S12的活化处理工序也在步骤S21的脱色工序之前进行。另外，在步骤S21的脱色工序和步骤S19的摄像工序之间，不含将测定样品的温度提高到62℃以上的处理工序。
本申请发明人发现，通过将测定样品提高到摄氏62度以上而对测定样品实施处理的处理工序之后，进行脱色工序，并且，在从脱色工序到摄像工序之间，不包括将测定样品提高到摄氏62度以上而对测定样品实施处理的处理工序，由此，由脱色工序抑制的来自测定样品的荧光直至摄像工序不恢复。本申请发明人确认，由此方法可不受来自测定样品的自身荧光的影响地确实地检测自荧光染料发生的荧光。
【2.验证】
以下，验证及说明本申请发明人发现的方法。在验证中，将HER2基因及CEP17在预处理工序中标记。标记HER2基因的荧光染料的激发波长是640nm，标记CEP17的荧光染料的激发波长是730nm。对核染色的染料的激发波长是405nm。标记HER2基因的荧光染料由波长640nm的光消光，由波长405nm的光活化。在以下的验证中，以标记HER2基因的荧光染料作为对象，进行自细胞发生的自身荧光的影响等的探讨。
<预处理工序>
在验证中，用以下的方法进行预处理工序。
[测定样品]
使用Ventana INFORM Dual ISH HER2试剂盒(Roche Diagnostics株式会社)，实施HER2Dual ISH3-in-1对照载玻片(ventana)上的人乳腺癌细胞MCF7的FISH染色。
【脱石蜡工序】
在Dry Block Bath THB(ASONE)上，于65℃、使对照载玻片干燥20分钟。于75℃、将Ez Prep在载玻片上载乘5分钟而进行脱石蜡。将此操作重复5次后，将对照载玻片在反应缓冲液中浸渍。
【活化处理工序】
将Dry Block BathTHB设于90℃，在对照载玻片上滴下CC2，进行10分钟调理。适宜追加CC2而使对照载玻片不干燥。将此操作进行3次之后，将对照载玻片在反应缓冲液中浸渍4分钟。
【蛋白酶处理工序】
在对照载玻片上滴下ISH蛋白酶II，用盖玻片密封，在放入37℃的温育器的湿润箱中进行16分钟酶处理。将对照载玻片在2×SSC中经4分钟浸渍3次而清洗。
【DNA变性处理工序】
在对照载玻片上滴下混合有HybReady和HER2DNA混合物探针的混合液后，用盖玻片密封，用胶膜纸封上。在Dry Block BathTHB上于95℃对于对照载玻片的乳腺癌细胞进行热变性20分钟。其后，在放入44℃的温育器的湿润箱中，对于对照载玻片进行过夜杂交。将对照载玻片在62℃的2×SSC中浸渍4分钟而进行严格度清洗。将此操作重复3次后，将对照载玻片在反应缓冲液中浸渍。
【封闭处理工序】
在对照载玻片上滴下1％BSA/反应缓冲液，用盖玻片密封，在放入37℃的温育器的湿润箱中进行20分钟封闭。其后，将对照载玻片在反应缓冲液中浸渍，清洗。
【第一抗体处理工序】
在对照载玻片上滴下混合兔抗DNP Ab和小鼠抗DIG Ab的混合液，用盖玻片密封，在放入37℃的温育器的湿润箱中反应20分钟。其后，将对照载玻片在反应缓冲液中浸渍3分钟，清洗。将其进行3次。
【第二抗体处理工序】
在对照载玻片上滴下将山羊抗-兔IgG(H+L)的Alexa Fluor 647F(ab’)2片段(Life Technologies，A-21246)、Alexa Fluor 750山羊抗小鼠IgG(H+L)(LifeTechnologies,A-21037)、Hoechst 33342(Life Technologies，H1399在PBS中稀释保存的)用1％BSA/反应缓冲液稀释的混合液，用盖玻片密封，在放入37℃的温育器的湿润箱中反应20分钟。其后，将对照载玻片在TBST中浸渍5分钟而清洗。将此操作进行3次。
Alexa Fluor 647是标记HER2基因的荧光染料。Alexa Fluor 750是标记CEP17的荧光染料。Hoechst33342是对核染色的荧光染料。
【保存工序】
将对照载玻片于纯化水中浸渍而清洗。将此操作进行2次之后，将对照载玻片在37℃的温育器中干燥15分钟，在观察前保存在4℃的暗处。
<验证1>
在验证1中，在由上述处理的预处理工序中，改变进行脱色工序时机而确认了自身荧光的抑制状态。在验证1中，在3个实施例1～3中可确认了自身荧光的抑制效果，但在2个比较例中确认，一度被抑制的自身荧光恢复。在实施例1～3及比较例1、2中，如以下一样进行脱色工序。
【实施例1】
在蛋白酶处理工序前在对照载玻片上滴下反应缓冲液，用盖玻片密封。其后，将对照载玻片设置在荧光显微镜上而取得荧光图像后，将波长640nm的激光以470W/cm2的功率照射到对照载玻片2分钟而进行脱色处理。蛋白酶处理后，再次在相同视野取得荧光图像。
【实施例2】
在封闭处理工序前在对照载玻片上滴下反应缓冲液，用盖玻片密封。其后，将对照载玻片设置在荧光显微镜上，在与实施例1不同的视野取得荧光图像后，将波长640nm的激光以470W/cm2的功率照射到对照载玻片2分钟而进行脱色处理。封闭处理后，再次在相同视野取得荧光图像。
【实施例3】
对于在实施例2中进行观察的视野，第一抗体处理后，再次取得荧光图像。
【比较例1】
在活化处理工序前在对照载玻片中滴下反应缓冲液，用盖玻片密封。其后，将对照载玻片设置在荧光显微镜上，在与实施例1～3不同的视野取得荧光图像之后，将波长640nm的激光以470W/cm2的功率照射到对照载玻片上2分钟而进行脱色处理。活化处理后，再次在相同视野取得荧光图像。
【比较例2】
对于在实施例1中取得荧光图像的视野，进行DNA变性处理工序之后，再次取得荧光图像。
在实施例1～3、比较例1、2中，在摄像中使用的荧光显微镜中，不含图3所示的相位板110。
【验证结果】
图6(a)是显示比较例1的验证结果的图。图6(a)之左端的图像是，在对于对照载玻片的人乳腺癌细胞进行脱石蜡处理工序之后，进行活化处理工序之前对对照载玻片进行摄像的摄像图像。如图6(a)之左端的摄像图像所示，在脱石蜡处理后的乳腺癌细胞中，自身荧光被摄像到。摄像图像上的发白光的部分是自身荧光。
图6(a)之中央的图像是如上述一样照射波长640nm的激光而进行脱色处理之后的摄像图像。摄像视野与图6(a)之左端的摄像图像相同。激光被照射到用虚线白色圆点包围的区域。如从图6(a)之中央的图像所知，由脱色处理使得自身荧光被抑制。
图6(a)之右端的图像是，脱色处理之后，再对对照载玻片进行活化处理工序之后的摄像图像。此摄像图像对应于比较例1的验证结果。摄像视野与图6(a)之左端及中央的摄像图像相同。如从图6(a)之右端的图像所知，确认了由活化处理使得自身荧光恢复。
图6(b)是显示实施例1及比较例2的验证结果的图。图6(b)的摄像视野与图6(a)的情况不同。图6(b)之左端的图像是对于对照载玻片的人乳腺癌细胞进行活化处理工序之后，进行蛋白酶处理工序之前对对照载玻片进行摄像的摄像图像。如图6(b)之左端的摄像图像所示，在活化处理后的乳腺癌细胞中自身荧光被摄像。摄像图像上发白光的部分是自身荧光。
从图6(b)之左起第2图像是如上述一样照射波长640nm的激光而进行脱色处理之后的摄像图像。摄像视野与图6(b)之左端的摄像图像相同。向用虚线白色圆点包围的区域照射激光。如从图6(b)之左起第2图像所知，由脱色处理使得自身荧光被抑制。
从图6(b)之左起第3图像是，脱色处理之后，再对对照载玻片进行蛋白酶处理工序之后的摄像图像。此摄像图像对应于实施例1的验证结果。摄像视野与图6(b)之左端及从左起第2摄像图像相同。如从图6(b)之左起第3图像所知，确认了即使进行蛋白酶处理工序，自身荧光也基本不恢复。
图6(b)之右端的图像是再对对照载玻片进行DNA变性处理工序之后的摄像图像。此摄像图像对应于比较例2的验证结果。摄像视野与图6(b)的其他摄像图像相同。如从图6(b)之右端的图像所知，确认由DNA变性处理工序使得自身荧光恢复。
图6(c)是显示实施例2及实施例3的验证结果的图。图6(c)的摄像视野与图6(a)、(b)的情况不同。图6(c)之左端的图像是对于对照载玻片的人乳腺癌细胞进行DNA变性处理工序之后，进行封闭处理工序之前对对照载玻片进行摄像的摄像图像。如图6(c)之左端的摄像图像所示，在DNA变性处理后的乳腺癌细胞中，自身荧光被摄像。摄像图像上的发白光的部分是自身荧光。
从图6(c)之左起第2图像是如上述一样照射波长640nm的激光而进行脱色处理之后的摄像图像。摄像视野与图6(c)之左端的摄像图像相同。向用虚线白色圆点包围的区域照射激光。如从图6(c)之左起第2图像所知，由脱色处理使得自身荧光被抑制。
从图6(c)之左起第3图像是脱色处理之后，再对对照载玻片进行封闭处理工序之后的摄像图像。此摄像图像对应于实施例2的验证结果。摄像视野与图6(c)之左端及从左起第2摄像图像相同。如从图6(c)之左起第3图像所知，确认即使进行封闭处理工序，自身荧光也基本不恢复。
图6(c)之右端的图像是再对对照载玻片进行第1抗体处理工序之后的摄像图像。此摄像图像对应于实施例3的验证结果。摄像视野是与图6(c)的其他摄像图像相同。如从图6(c)之右端的图像所知，确认即使进行第1抗体处理工序，自身荧光也基本不恢复。
图7是综合以上的验证结果的表。在实施例1～3及比较例1、2中，各自进行带圆圈标记工序，最后，进行带圆圈标记工序后，进行摄像。在最下段，以+标的数显示基于摄像图像的自身荧光的恢复度。在+是1个时，显示自身荧光基本未恢复，随着+的数增加而显示自身荧光的恢复度高。在“温度”的栏中，显示在各工序的处理中对照载玻片被加热的加热温度。
在实施例1中，脱色处理之后，即使以37℃的加热温度进行蛋白酶处理工序，自身荧光也基本不恢复。在实施例2中，脱色处理之后，即使以37℃的加热温度进行封闭处理工序，自身荧光也基本不恢复。在实施例3中，脱色处理之后，即使以37℃的加热温度进行封闭处理工序，再以37℃的加热温度进行第1抗体处理，自身荧光也基本不恢复。
从这些验证结果确认，脱色处理工序之后，即使以37℃以下的加热温度进行处理工序，用脱色处理抑制的自身荧光也基本不恢复。即是指，在脱色处理工序之后进行的处理工序中，如果不是提高到至少超37℃的温度而进行处理，可以说用脱色处理抑制的自身荧光基本不恢复。在图1的处理工序及上述验证时的预处理工序中，在从脱色工序至摄像工序期间也不含将测定样品提高到超37℃的温度而进行处理的处理工序。由此可以说，用脱色处理抑制的自身荧光在摄像时基本不恢复。
在比较例1中，脱色处理之后，通过由90℃的加热温度进行活化处理工序，使得自身荧光大幅地恢复。在比较例2中，脱色处理之后，由37℃的加热温度进行蛋白酶处理工序，再者，于95℃、44℃、62℃加热温度进行DNA变性处理工序，由此自身荧光进一步显著地恢复。比较比较例2和实施例1而知，由于在比较例2中与实施例1比，仅追加有DNA变性处理工序，因此在比较例2中自身荧光显著地恢复的原因在于DNA变性处理工序。但是，从比较例2的验证结果看不出，自身荧光恢复的原因是否在于95℃、44℃、62℃之任一的加热温度。从而，仅是从比较例1、2的验证结果可知，脱色处理工序之后，进行将加热温度提高到至少90℃以上的处理工序，则用脱色处理抑制的自身荧光大幅地恢复。
<验证2>
在验证2中，探讨加热温度和自身荧光的恢复度的关系。在验证2中，脱色处理之后，将对照载玻片的温度在3个温度下维持相同时间，其后，确认自身荧光的恢复度。在验证2中，对于对照载玻片的人乳腺癌细胞仅进行脱石蜡处理工序之后，进行脱色处理。在脱色处理中，将平行光由视场光阑阑住而对于对照载玻片照射一定时间。在脱色处理之前后，分别将对照载玻片用荧光显微镜摄像而取得自身荧光的摄像图像。其后，将对照载玻片在指定的温度维持一定时间后，再用荧光显微镜对自身荧光进行摄像。在摄像中使用的荧光显微镜中，不含图3所示的相位板110。
图8(a)～(c)之左端的图像各自是，在脱色处理前，在互相不同的视野对对照载玻片进行摄像的摄像图像。如图8(a)～(c)之左端的摄像图像所示，在脱石蜡处理后的乳腺癌细胞中，自身荧光被摄像。摄像图像上的发白光的部分是自身荧光。
图8(a)～(c)之中央的图像是，如上述一样照射波长640nm的激光而进行脱色处理之后的摄像图像。这些摄像图像的摄像视野各自与图8(a)～(c)之左端的摄像图像相同。向用虚线白色圆点包围的区域照射激光。如从图8(a)～(c)之中央的图像所知，由脱色处理使得自身荧光被抑制。
图8(a)之右端的图像是，脱色处理之后，将对照载玻片于24℃室温放置20分钟后，对对照载玻片进行摄像的摄像图像。摄像视野与图8(a)之左端及中央的图像相同。图8(b)之右端的图像是脱色处理之后，将对照载玻片于44℃温度加热20分钟后，对对照载玻片进行摄像的摄像图像。摄像视野与图8(b)之左端及中央的图像相同。图8(c)之右端的图像是，脱色处理之后，将对照载玻片于62℃温度加热20分钟后，对对照载玻片进行摄像的摄像图像。摄像视野与图8(c)之左端及中央的图像相同。
在图8(a)中可确认，如果比较中央的摄像图像和右端的摄像图像，则在脱色处理之后，当将对照载玻片于24℃室温放置时，由脱色处理抑制的自身荧光基本不恢复。同样地，在图8(b)中可确认，如果比较中央的摄像图像和右端的摄像图像，则在脱色处理之后，当将对照载玻片加热到44℃温度时，由脱色处理抑制的自身荧光也基本不恢复。对此，在图8(c)中可确认，如果比较中央的摄像图像和右端的摄像图像，则脱色处理之后，当将对照载玻片加热到62℃温度时，由脱色处理抑制的自身荧光恢复。
图9是显示将在图8(a)～(c)中自身荧光的状态从中央的摄像图像变化为右端的摄像图像时的自身荧光恢复率基于各图像的亮度值算出的算出结果的坐标图。
自身荧光恢复率如以下一样求出。例如，在图8(a)的情况中，求出在脱色处理前的左端的摄像图像中虚线的圆圈内所含的细胞内的任意的位置的亮度。在脱色处理后的中央的摄像图像及维持温度指定时间后的右端的摄像图像中，也求出相同的位置的亮度，从求出的亮度，由以下的式，算出自身荧光恢复率。
(温度维持后的亮度-脱色后的亮度)/(脱色前的亮度-脱色后的亮度)×100…(1)
同样对于虚线的圆圈内的不同的8处，算出自身荧光恢复率，对于总计9处求出平均值和标准偏差。图8(b)、(c)的情况也用同样的方法，算出9处的自身荧光恢复率的平均值和标准偏差。
在图9中，“室温24(24℃)”、“44℃”及“62℃”的坐标图各自显示对图8(a)～(c)的摄像图像的自身荧光恢复率。在各坐标图的顶上，显示表示自身荧光恢复率的标准偏差的条。如果参照图9的坐标图，则在脱色处理后，在将对照载玻片放置在24℃室温的环境下的图8(a)的例中，自身荧光恢复率是20％左右，可知自身荧光基本不恢复。在脱色处理后将对照载玻片加热到44℃的图8(b)的例中，自身荧光恢复率也是稍微超越20％的程度，可知自身荧光基本不恢复。与此相对，在脱色处理后将对照载玻片加热到62℃的图8(c)的例中，自身荧光恢复率超越60％，可知自身荧光大幅地恢复。
从图8及图9的验证结果知，脱色处理工序之后，进行将加热温度提高到至少62℃以上的处理工序，则由脱色处理抑制的自身荧光大幅地恢复。从而，预处理工序有在脱色处理工序之后，不含将加热温度提高到至少62℃以上的处理工序的必要。由此，可避免由脱色处理抑制的自身荧光在摄像时恢复。
另外，从图8及图9的验证结果确认，脱色处理工序之后，即使以44℃以下的加热温度进行处理工序，由脱色处理抑制的自身荧光也不怎么恢复。即是指，在脱色工序之后进行的处理工序中，如果不提高到至少超44℃的温度而进行处理，由脱色处理抑制的自身荧光基本不恢复。在图1的处理工序及上述验证时的预处理工序中，从脱色工序至摄像工序之间也不含将测定样品提高到44℃以上的处理工序。由此，可确实地避免由脱色处理抑制的自身荧光在摄像时恢复。
<验证3>
在验证3中探讨，在预处理工序中在进行脱色处理时和不进行脱色处理时，在解析工序中来自荧光染料的荧光的检测程度如何变化。
【预处理工序】
在验证例3中也进行上述的预处理工序。在验证例3中，在第2抗体处理工序前将对照载玻片设置在显微镜上，用3轮的操作进行脱色处理。即如下操作，在操作1中，将波长405nm的激光以130W/cm2的功率照射到对照载玻片2分钟。在操作2中，将波长514nm的激光以200W/cm2的功率照射到对照载玻片2分钟。在操作3中，将波长640nm的激光以1100W/cm2的功率照射到对照载玻片10分钟。在各操作中，对于互相不同的3个的视野进行激光的照射。
【摄像准备工序】
对于在预处理工序中准备的对照载玻片，在载玻片上滴下以下的组成的包埋介质50μL后，用盖玻片密封，用指甲固定。
1M Tris(pH 7.4) 5μL
1M NaCl 1μL
25％葡萄糖 40μL
2-巯基乙醇 1μL
5000U/mL葡萄糖氧化酶 1μL
1000μg/mL过氧化氢酶 1μL
H<sub>2</sub>O 51μL
【摄像工序】
将在摄像准备工序中准备的对照载玻片设置在显微镜上，对于用脱色处理光照射的部位，一边以曝光时间15msec照射波长640nm的激光，一边取得500张荧光图像。曝光时的激光的功率设为690W/cm2。再有，在图像取得时，与图3的摄像部100同样地，在显微镜的镜体和荧光检测用的照相机之间设置相位板，在荧光被分割为2点的条件下进行摄像。
【解析工序】
由摄像工序取得的500张图像之内、对于第500张取得的图像，对于在一个视野之中心存在的任意的3个细胞的核，分别用圆围出收入于核内的任意的范围，算出圆内的荧光强度的标准偏差。对于在脱色处理工序中光照射的其他2个视野也进行此作业，得到总计9个细胞的标准偏差。接下来对于此9处的标准偏差，算出平均值和标准偏差。
【比较例】
对于在操作1～3中未照射光的部位，也一边以功率以15msec的曝光时间照射波长640nm的激光，一边取得500张荧光图像。曝光时的激光的功率设为690W/cm2。此时也使用相位板进行摄像。
对于操作1～3各自而言，由与上述同样的解析工序，取得任意的9个细胞的核内荧光强度的标准偏差，算出取得的标准偏差的平均值和标准偏差。
【验证结果】
在图10(a)中，右侧的坐标图是由操作1自照射激光的部位取得的核内荧光强度的标准偏差的平均值，左侧的坐标图是由操作1自未照射激光的部位取得的核内荧光强度的标准偏差的平均值。在各坐标图的顶上，显示表示核内荧光强度的标准偏差的标准偏差的条。在操作1中，由脱色处理照射激光的部相位比非照射部位，标准偏差的平均值更低。即，照射激光的部相位比非照射部位，荧光强度的偏差更小，可知来自荧光染料的荧光良好分离地被检测。
图10(b)、(c)也以与图10(a)同样的形态，显示对操作2、3的验证结果的坐标图。如图10(b)、(c)所示，在操作2、3中，由脱色处理照射激光的部相位比非照射部位，标准偏差的平均值也更低。即，照射激光的部相位比非照射部位，荧光强度的偏差更小，知来自荧光染料的荧光良好分离地被检测。
从验证3确认，通过照射激光而进行脱色处理，可提高来自荧光染料的荧光的检测程度。如果参照图10(a)～(c)，则来自荧光染料的荧光的检测程度在操作1～3大致相同。因此可知，在脱色处理时照射的光，波长越短，越可短时间并且低功率地抑制荧光。从而，要想更迅速并且有效进行脱色处理，优选使用波长更短的光。
再有，脱色处理，除用光之外，也可使用试剂进行。例如，可使用抑制脂褐素的自身荧光的试剂。如上述一样在脱色处理中使用光，则由于仅照射指定时间的光，可简易地进行脱色处理。特别是，使用短波长的激光，则可短时间并且低功率地进行脱色处理。
&lt;验证4&gt;
在验证4中，探讨自身荧光对荧光染料的荧光的影响。
【预处理工序、摄像准备工序】
在验证例4中也进行上述的预处理工序。在验证例4中，在第2抗体处理工序前将对照载玻片设置在显微镜上，将波长514nm的激光以200W/cm2的功率照射5分钟而进行脱色处理。摄像准备工序与上述验证3同样地进行。
【摄像工序】
将在摄像准备工序中准备的对照载玻片设置在显微镜上，对于用脱色处理光照射的部位，将波长640nm的激光以690W/cm2照射5秒钟后，一边以15msec曝光时间照射，一边取得30张荧光图像。再有，在图像取得时，与图3的摄像部100同样地，在显微镜的镜体和荧光检测用的照相机之间设置相位板，在荧光被分割为2点的条件下进行摄像。
【比较例】
对于在脱色处理中未照射光的部位，也在将波长640nm的激光以690W/cm2照射5秒钟后，一边以15msec曝光时间照射，一边取得30张荧光图像。此时也使用相位板进行摄像。
【验证结果】
图11(a)、(b)分别是进行脱色处理时的摄像图像和未进行脱色处理时的摄像图像。在图11(a)、(b)中，为方便起见、用于显示亮点的对的白色圆点被追加到摄像图像中。
如图11(a)所示，在进行脱色处理的部位的摄像图像中，可在由白色圆点包围的部分确认亮点的对。可确认的亮点的对的数是17。与此相对，在图11(b)中，因来自细胞的自身荧光的影响，仅能确认6个起点的对。从此验证结果知，通过进行脱色处理，自荧光染料发生的荧光被相位板分割为2个时也可良好地检测来自荧光染料的荧光。
【3.待测样品分析装置】
基于上述验证结果，本实施方式中涉及的待测样品分析装置1可如例如图12一样构成。
如图12所示，待测样品分析装置1，除上述的摄像部100及解析部200之外，具备预处理部300、输送机400和数据总线500。摄像部100及解析部200具备图3所示的构成，各自实行图4(b)的摄像工序的处理和图5(a)的解析工序的处理。摄像部100如上述一样摄像由预处理部300实施预处理的测定样品。解析部200如上述一样处理由摄像部100得到的摄像图像而提取被检物质。
预处理部300对测定样品实施用于对被检物质进行摄像的预处理。预处理部300进行图1所示的步骤S11～S17的处理和步骤S21的处理。再有，在图12中，预处理部300构成为图1的步骤S21的脱色工序在步骤S15的封闭处理工序之后段进行。但是，脱色工序的顺序只要在图1的步骤S15之后即可，例如，也可在步骤S16和步骤S17之间进行脱色工序。在预处理部300中，进行脱色工序的处理单元的配置也可适宜变更。
预处理部300具备7个处理单元301～307和输送机308。输送机308将加载有测定样品的载玻片121依次搬送到处理单元301～307之前。输送机308仅向左方向搬送载玻片121。处理单元301～306将搬送到前方的载玻片121从输送机308提取到内部而进行处理，处理结束的载玻片121返回到输送机308。处理单元307将搬送到前方的载玻片121从输送机308提取到内部而进行处理，将处理结束的载玻片121送出到左方的输送机400。
处理单元301～305分别进行图1的步骤S11～S15的处理。即，处理单元301～305分别对于载玻片121上的测定样品进行脱石蜡处理、活化处理、蛋白酶处理、DNA变性处理及封闭处理。
处理单元306进行图1的步骤S21的处理。即，处理单元306向载玻片121上的测定样品照射光而对测定样品进行脱色处理。处理单元306可具备例如激光源、将自激光源发射的光变换为平行光的准直管透镜、和阑住透过准直管透镜的光而向测定样品照射的阑的构成。通过如此使用光而进行脱色处理，可简易地进行脱色处理。
处理单元307进行图1的步骤S16、S17的处理。即，处理单元307实行用于使第1抗体结合于与测定样品中的被检物质结合的DNP标记核酸探针的处理，及用于再使荧光染料、即荧光标记的第2抗体结合于与DNP标记核酸探针结合的第1抗体的处理。处理单元301～307及输送机308经数据总线500与解析部200连接。处理单元301～307及输送机308由解析部200控制。处理单元301～307及输送机308具备检测载玻片121到达指定位置的传感器等的检测部。
由处理单元307进行的标记处理结束的载玻片121从处理单元307送出到左方的输送机400。输送机400将载玻片121搬送到摄像部100之前。摄像部100将搬送的载玻片121从输送机400提取到内部而摄像，将摄像结束的载玻片121返回到输送机400。输送机400将自摄像部100返回的载玻片搬送到回收单元。输送机400也由解析部200控制。输送机400具备检测载玻片121到达指定位置的传感器等的检测部。
再有，处理单元301～307不必一定作为个别的单元设置，也可多个处理单元综合到一个单元或装置，在其中进行各处理单元的处理。另外，预处理部300和摄像部100也可被整合为一体。
在图12的待测样品分析装置1中，在预处理部300中，对于将测定样品的温度提高到62℃以上而处理测定样品的处理单元304，在处理顺序的下游侧，配置有进行脱色处理的处理单元306。进行对测定样品加热而使DNA发生变性的DNA变性处理的处理单元304先于进行脱色处理的处理单元306对测定样品进行处理。进行脱石蜡处理的处理单元301及进行活化处理的处理单元302先于比进行脱色处理的处理单元306对测定样品进行处理。另外，预处理部300在相比进行脱色处理的处理单元306更下游侧不包括将测定样品加热到62℃以上而进行处理的处理单元。从而，如在上述验证中所示，在确实地抑制来自测定样品的自身荧光的状态下，测定样品被提供到摄像部100。由此，摄像部100可将来自与被检物质结合的荧光染料的荧光在来自测定样品的自身荧光被抑制的状态下摄像。解析部200由于解析抑制了自身荧光的摄像图像，可高精度检测结合染料的荧光。从而，解析部200可高精度解析测定样品中所含的被检物质。
在图12的待测样品分析装置1中，预处理部300在相比进行脱色处理的处理单元306处理顺序更下游侧不含将测定样品加热到44℃以上而进行处理的处理单元和将测定样品提高到比37℃高而进行处理的处理单元之任一者。从而，如在上述验证中所示，在更确实地抑制来自测定样品的自身荧光的状态下，测定样品被提供到摄像部100。由此，摄像部100可将来自与被检物质结合的荧光染料的荧光在来自测定样品的自身荧光进一步被抑制的状态下摄像。解析部200由于解析确实地抑制了自身荧光的摄像图像，因此，能以更高精度检测结合染料的荧光。从而，解析部200可更高精度解析测定样品中所含的被检物质。
本发明也可适用于分析HER2基因或CEP17以外的被检物质的待测样品分析方法及待测样品分析装置。另外，本发明还可在乳腺癌的检诊以外的疾病的诊断中使用。本发明也可适用于分析冷冻组织或活细胞等的待测样品分析方法及待测样品分析装置。此外，本发明也可在抑制自数字PCR中使用的磁性珠发生的自身荧光时适用。

Claims (15)

1.待测样品分析方法，其包括：
对测定样品加热而使DNA发生变性的DNA变性处理工序，
抑制自上述测定样品发生的自身荧光的脱色工序，
使荧光染料结合于上述测定样品中的被检物质的标记工序，及
向上述测定样品照射光而对自上述荧光染料发生的荧光进行摄像的摄像工序，
其中在上述脱色工序之前进行上述DNA变性处理工序。
2.权利要求1所述的待测样品分析方法，其还具备对上述测定样品的活化处理工序，
其中在上述脱色工序之前进行上述活化处理工序。
3.权利要求1所述的待测样品分析方法，其还具备对上述测定样品的脱石蜡处理工序，
其中在上述脱色工序之前进行上述脱石蜡处理工序。
4.权利要求1所述的待测样品分析方法，其中上述脱色工序向上述测定样品照射光而抑制自上述测定样品发生的上述自身荧光。
5.权利要求1所述的待测样品分析方法，其还包括处理由上述摄像工序得到的摄像图像而检测上述被检物质的解析工序。
6.权利要求1所述的待测样品分析方法，其中
上述测定样品是自乳腺癌的病变组织采集的细胞，
上述被检物质是HER2基因。
7.权利要求6所述的待测样品分析方法，其中上述荧光染料是Alexa Fluor 647。
8.权利要求1所述的待测样品分析方法，其中
上述荧光染料能切换为
照射激发用的光，则荧光被激发的活性状态，和
即使照射上述激发用的光，荧光也不被激发的无活性状态，
上述摄像工序包括：
使上述荧光染料消光的失活处理，
对消光的上述荧光染料之中一部分的上述荧光染料进行活化的活化处理，及
向测定样品照射上述激发用的光而对上述荧光进行摄像的摄像处理。
9.待测样品分析装置，其具备：
预处理部，其对测定样品实施用于对上述测定样品中所含的被检物质进行摄像的预处理，
摄像部，其对由上述预处理部实施预处理的上述测定样品进行摄像，及
解析部，其处理由上述摄像部得到的摄像图像而提取上述被检物质，
上述预处理部包括：
进行对上述测定样品加热而使DNA发生变性的DNA变性处理的处理单元，
进行用于对上述测定样品抑制自身荧光的脱色处理的处理单元，及
进行使荧光染料结合于上述测定样品中的被检物质的标记处理的处理单元，
上述进行DNA变性处理的处理单元先于上述进行脱色处理的处理单元对上述测定样品进行处理，
上述摄像部向实施上述预处理的上述测定样品照射光而对自上述荧光染料发生的荧光进行摄像。
10.权利要求9所述的待测样品分析装置，其还具备对于上述测定样品进行活化处理的处理单元，
其中上述进行活化处理的处理单元先于上述进行脱色处理的处理单元对上述测定样品进行处理。
11.权利要求9所述的待测样品分析装置，其还具备对于上述测定样品进行脱石蜡处理的处理单元，
其中上述进行脱石蜡处理的处理单元先于上述进行脱色处理的处理单元对上述测定样品进行处理。
12.权利要求9所述的待测样品分析装置，其中上述进行脱色处理的处理单元向上述测定样品照射光而抑制自上述测定样品发生的上述自身荧光。
13.权利要求9所述的待测样品分析装置，其中
上述测定样品是自乳腺癌的病变组织采集的细胞，
上述被检物质是HER2基因。
14.权利要求13所述的待测样品分析装置，其中上述荧光染料是Alexa Fluor 647。
15.权利要求9所述的待测样品分析装置，其中
上述荧光染料能切换为
照射激发用的光，则荧光被激发的活性状态，和
即使照射上述激发用的光，荧光也不被激发的无活性状态，
上述摄像部实行：
使上述荧光染料消光的失活处理，
对消光的上述荧光染料之中一部分的上述荧光染料进行活化的活化处理，及
向测定样品照射上述激发用的光而对上述荧光进行摄像的摄像处理。
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