WO2021192910A1 - 画像生成方法、画像生成装置及びプログラム - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an image generation method, an image generation device, and a program.
- fluorescent bright spots are extracted from a fluorescent image obtained by imaging a tissue sample in which a specific biological substance is stained with fluorescent nanoparticles containing a large number of fluorescent dyes (fluorescent substances), and expression of the specific biological substance in the fluorescent image.
- Patent Documents 1 and 2 disclose a method of eliminating the influence of noise fluorescence by utilizing the difference in fluorescence wavelength and specifying a fluorescent substance.
- Fluorescent substance-accumulated nanoparticles are based on particles made of organic or inorganic substances, and a plurality of fluorescent substances (for example, the quantum dots, fluorescent dyes, etc.) are contained therein. It is a nano-sized particle having a structure that is and / or is adsorbed on its surface. As the fluorescent substance-accumulated nanoparticles, it is preferable that the matrix and the fluorescent substance have substituents or sites having opposite charges and electrostatically interact with each other. As the fluorescent substance integrated nanoparticles, quantum dot integrated nanoparticles, fluorescent dye integrated nanoparticles and the like are used.
- an autoclave As the heating device, an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
- the temperature is not particularly limited, but it can be carried out at room temperature.
- the temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
- tissue specimen after the immunostaining step is subjected to treatments such as immobilization / dehydration, permeation, and encapsulation so as to be suitable for observation.
- the fluorescence emitted from the tissue sample 30 after immunostaining includes fluorescence derived from a fluorescent substance that labels the target substance and fluorescence derived from a substance other than the fluorescent substance (noise fluorescence). Further, as an example of noise fluorescence, there is typically fluorescence (so-called autofluorescence) that is naturally emitted by a fluorescent substance (coenzyme, amino acid, protein, intracellular pigment substance, etc.) that is naturally present in a tissue sample. In addition, for example, substances other than the fluorescent substance contained in the tissue sample and fluorescence emitted by an instrument such as a slide glass can be mentioned.
- step S15 the number of bright spots is measured for the image from which the bright spot region is extracted. That is, the expression level of the target substance can be quantitatively evaluated by measuring one bright spot as one fluorescent nanoparticle.
- the number of bright spots is simply measured here, for example, a bright field image on the same plane as the fluorescence image and in the same range is imaged, a cell region or a cell nucleus region is extracted, and the bright spot region image is superimposed. Therefore, the number of bright spots for each cell region or each cell nucleus region can be calculated.
- the attenuation rate (M%) of noise fluorescence at a predetermined time (t) is calculated in advance by the following equation (1).
- M% F (t) / F0 ... (1)
- F0 fluorescence intensity before excitation is stopped
- F (t) fluorescence intensity at exposure time (t).
- the pixel values of the original fluorescence image and the fading fluorescence image are compared, and a pixel having a fluorescence intensity attenuation rate of M% or less and M0% or more is determined to contain noise fluorescence, and is M0% or less. Pixels are determined to be free of noise fluorescence.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is acquired by setting the pixel value of the pixel determined to contain noise fluorescence to 0.
- the pixel values of the original fluorescence image and the noise fluorescence exclusion image are compared, and it is determined that pixels having a fluorescence intensity attenuation rate of more than N% include noise fluorescence, and pixels of N% or less are noise. Judged as not containing fluorescence.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is acquired by setting the pixel value of the pixel determined to contain noise fluorescence to 0.
- the pixel values of the original fluorescence image and the noise fluorescence exclusion image are compared, and it is determined that pixels having a fluorescence intensity attenuation rate of more than N% include noise fluorescence, and pixels of N% or less are noise. Judged as a fluorescent substance containing no fluorescence.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is acquired by setting the pixel value of the pixel determined to contain noise fluorescence to 0.
- the processing flow of pattern 7 is as follows. (1) The tissue specimen stained with the fluorescent substance is irradiated with excitation light for a time shorter than a predetermined time (t) (t0, t0 ⁇ x), and the original derived from the fluorescence of a part of the fluorescent substance and the fluorescence of noise fluorescence. Acquire a fluorescence image. (2) The fluorescent substance is completely faded by exposure for a predetermined time (t) in the same field of view as the original fluorescence image, and a noise fluorescence image is acquired.
- the processing flow of pattern 9 is as follows. (1) The tissue specimen stained with the fluorescent substance is irradiated with excitation light for a time shorter than a predetermined time (t) (t0, x ⁇ t0 ⁇ T1), and is derived from the fluorescence of a part of the fluorescent substance and the fluorescence of noise fluorescence. Acquire the original fluorescence image. (2) In the same visual field as the original fluorescence image, the fluorescence of the fluorescent substance is forcibly faded by exposure for a predetermined time (t) to obtain a faded fluorescence image in which a part of the fluorescence of the fluorescent substance is faded. (3) Using the attenuation curve of the fluorescence intensity of the fluorescent substance, the attenuation rate (N% and N0%) of the fluorescent substance is calculated in advance by the above formula (2) at the exposure time (t and t0).
- the fluorescence image is faded in a predetermined time (t0) based on the fluorescence intensity of the faded fluorescence image.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is obtained by supplementing the fluorescence intensity of the fluorescence.
- the processing flow of pattern 10 is as follows. (1) Tissue specimens stained with a fluorescent substance are irradiated with excitation light for a time shorter than a predetermined time (t) (t0, t0 ⁇ y1), and the fluorescence of the fluorescent substance, the fluorescence of long noise fluorescence, and the fluorescence of short noise fluorescence are performed. Obtain the original fluorescence image derived from. (2) An image excluding short noise fluorescence is acquired by exposure for a predetermined time (t) in the same field of view as the original fluorescence image.
- the pixel values of the original fluorescence image and the short noise fluorescence exclusion image are compared, and it is determined that pixels having a fluorescence intensity attenuation rate of less than M% contain noise fluorescence, and others are noise fluorescence. Is not included.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is acquired by setting the pixel value of the pixel determined to contain noise fluorescence to 0.
- the processing flow of pattern 11 is as follows. (1) Tissue specimens stained with a fluorescent substance are irradiated with excitation light for a time shorter than a predetermined time (t) (t0, T2-1 ⁇ t0 ⁇ x) to obtain fluorescence of the fluorescent substance and fluorescence of long noise fluorescence. Obtain the original fluorescence image (short noise fluorescence exclusion) from which it is derived. (2) A faded fluorescence image is obtained by forcibly fading the fluorescence of a fluorescent substance and long noise fluorescence by exposure for a predetermined time (t) in the same field of view as the original fluorescence image.
- the attenuation rate (N%) of the fluorescent substance and the attenuation rate (M%) of long noise fluorescence are calculated by a predetermined exposure time (t).
- the attenuation rate of the fluorescent substance is N%> the attenuation rate of long noise fluorescence is M%. Further, the above equations (1) and (2) can be used.
- the pixel values of the original fluorescence image and the fading fluorescence image are compared, and it is determined that the pixels having a fluorescence intensity attenuation rate of less than M% contain noise fluorescence, and the others contain noise fluorescence. Judge as not.
- the target fluorescence image from which the fluorescence intensity of the fluorescent substance is extracted is acquired by setting the pixel value of the pixel determined to contain noise fluorescence to 0.
- the processing flow of pattern 13 is as follows. (1) Tissue specimens stained with a fluorescent substance are irradiated with excitation light for a time shorter than a predetermined time (t) (t0, T2-1 ⁇ t0 ⁇ x) to obtain fluorescence of the fluorescent substance and fluorescence of long noise fluorescence. Obtain the original fluorescence image (short noise fluorescence exclusion) from which it is derived. (2) A faded fluorescence image in which a part of the fluorescence of the fluorescent substance is faded is obtained by forcibly fading the fluorescence of the fluorescent substance by exposing it for a predetermined time (t) in the same field of view as the original fluorescent image. (3) Using the attenuation curve of the fluorescence intensity of the fluorescent substance, the attenuation rate (N%) of the fluorescent substance is calculated by the above formula (2) according to the predetermined exposure time (t).
- a tissue sample stained with a fluorescent substance is irradiated with excitation light and exposed for a predetermined time, and a part of the fluorescence generated from the tissue sample is faded. It includes a fading fluorescence image acquisition step of acquiring a fluorescence image and a target fluorescence image acquisition step of acquiring a target fluorescence image from which fluorescence of a fluorescent substance is extracted based on the fading fluorescence image. Therefore, it is possible to obtain a target fluorescence image obtained by extracting only the fluorescence of the fluorescent substance based on the faded fluorescence image in which a part of the fluorescence is forcibly faded.
- the faded fluorescence image acquisition step a faded fluorescence image obtained by fading the fluorescence of the fluorescent substance is acquired.
- image processing is performed to remove the fluorescence intensity of the faded fluorescence image from the fluorescence intensity of the original fluorescence image, and the target fluorescence image is acquired.
- the fading fluorescence image acquisition step after the noise fluorescence fades.
- a fading fluorescence image is acquired, and in the target fluorescence image acquisition step, the fading fluorescence image is determined as the target fluorescence image. Therefore, the target fluorescence image can be obtained from one faded fluorescence image.
- the pixel value of the original fluorescence image is corrected to acquire the target fluorescence image. Therefore, even when the fluorescence of the fluorescent substance and the first noise fluorescence and the second noise fluorescence having different time until fading can be mixed, the target fluorescence image is obtained from the original fluorescence image and the fading fluorescence image. Can be obtained.
- the focusing position of the fluorescence image is specified by using the general-purpose microscope image acquisition device 1A.
- a known hall slide scanner may be used instead of the microscope image acquisition device 1A. According to the hall slide scanner, not only the focus is automatically adjusted in the thickness direction (Z direction) of the tissue sample, but also the stage can be moved in the length and width direction (XY direction) of the tissue sample. A wide range of fluorescent images can be generated. Even with a hall slide scanner, after the in-focus position of the fluorescent image is specified, the focal position can be automatically moved to the in-focus position of the specified fluorescent image.
- a tissue section is targeted as a biological sample, and the tissue sample is stained with an immunostaining agent containing fluorescent nanoparticles as a fluorescence marker to identify the in-focus position of the fluorescence image.
- the target of the biological sample may be a cultured cell or a gene (DNA).
- a fluorescent dye can be used as a fluorescent marker. Both the fluorescent nanoparticles and the fluorescent dye are examples of fluorescent markers, and other known fluorescent markers may be used.
- an HDD, a non-volatile memory of a semiconductor, or the like is used as a computer-readable medium for the program according to the present invention, but the present invention is not limited to this example.
- a portable recording medium such as a CD-ROM can be applied.
- a carrier wave is also applied as a medium for providing the data of the program according to the present invention via a communication line.
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Abstract
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、を有する。
Description
本発明は、画像生成方法、画像生成装置及びプログラムに関する。
病理診断において、組織切片で過剰発現をしている生体物質の発現量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。
従来、多数の蛍光色素（蛍光物質）を内包した蛍光ナノ粒子を用いて特定の生体物質を染色した組織標本を撮像した蛍光画像から、蛍光輝点を抽出し蛍光画像における特定の生体物質の発現量を定量解析する方法が開発されている。
従来、多数の蛍光色素（蛍光物質）を内包した蛍光ナノ粒子を用いて特定の生体物質を染色した組織標本を撮像した蛍光画像から、蛍光輝点を抽出し蛍光画像における特定の生体物質の発現量を定量解析する方法が開発されている。
しかしながら、組織切片のようにノイズ蛍光を発する標本を用いた観察時には、蛍光ナノ粒子の輝度をシグナル（Ｓ）、ノイズ蛍光の輝度をノイズ（Ｎ）とした場合のＳ／Ｎ比が低いと、ノイズ蛍光まで輝点数に含めてしまう可能性が高くなり、やはり定量的な解析が困難であった。
このような問題に対し、例えば、特許文献１、２には、蛍光波長の差異を利用することで、ノイズ蛍光による影響を排除し、蛍光物質を特定する手法が開示されている。
しかしながら、上記特許文献１、２の手法においては、高い光安定性を有する蛍光物質が必要であり、このような蛍光物質を用意するのが困難であった。
本発明の課題は、使用する蛍光物質の種類に関わらず、ノイズ蛍光の影響を抑制して蛍光物質の蛍光を抽出した計測を可能とすることである。
上記課題を解決するため、本発明の画像生成方法は、
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、
を備える。
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、
を備える。
本発明の画像生成装置は、
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段と、
を備える。
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段と、
を備える。
本発明のプログラムは、
コンピューターを、
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段、
として機能させるためのプログラムである。
コンピューターを、
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段、
として機能させるためのプログラムである。
本発明によれば、使用する蛍光物質の種類に関わらず、ノイズ蛍光の影響を抑制して蛍光物質の蛍光を抽出した計測が可能となる。
以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。
［蛍光画像の生体物質定量システムの構成］
図１に、生体物質定量システム１００の全体構成例を示す。
図１に示すように、生体物質定量システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
図１に、生体物質定量システム１００の全体構成例を示す。
図１に示すように、生体物質定量システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルタなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
顕微鏡画像取得装置１Ａでは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
なお、公知の任意の顕微鏡（たとえば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置１Ａとして用いることができる。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルタなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
顕微鏡画像取得装置１Ａでは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
なお、公知の任意の顕微鏡（たとえば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置１Ａとして用いることができる。
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、たとえば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（たとえば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）などを用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における細胞ごとの合焦位置を特定する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。
図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５などを備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。
図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５などを備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。
たとえば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理を実行し、褪色蛍光画像取得手段、目的蛍光画像取得手段としての機能を実現する。
たとえば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理を実行し、褪色蛍光画像取得手段、目的蛍光画像取得手段としての機能を実現する。
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、各種機能キーなどを備えたキーボードと、マウスなどのポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
表示部２３は、たとえばＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などのモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、蛍光画像及び形態画像の入力手段としての機能を実現する。
記憶部２５は、たとえばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリーなどで構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ、及び後述する抽出された輝点領域の座標や合焦位置等が記憶される。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーターなどを備え、ＬＡＮなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーターなどを備え、ＬＡＮなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
［組織標本］
続いて、組織標本について説明する。
組織標本は標的物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色され、染色後の組織標本が顕微鏡画像取得装置１Ａのステージに設置される。
続いて、組織標本について説明する。
組織標本は標的物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色され、染色後の組織標本が顕微鏡画像取得装置１Ａのステージに設置される。
（１）標的物質
標的物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいう。
標的物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原などのバイオマーカーが選択される。例えば、組織切片に発現しているタンパク質（抗原）などの生体物質を標的物質とすることができる。その他にも、ペプチド等のタンパク質より小さな単位や、ＲＮＡなどのバイオマーカーを標的物質としても良い。また、標的物質は、試料に存在するものであれば、生体固有のものでなくても良い。例えば、標的物質は、体外から生体内に導入された薬剤などであっても良い。
典型的な標的物質としては、各種の癌組織の細胞膜等で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
標的物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいう。
標的物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原などのバイオマーカーが選択される。例えば、組織切片に発現しているタンパク質（抗原）などの生体物質を標的物質とすることができる。その他にも、ペプチド等のタンパク質より小さな単位や、ＲＮＡなどのバイオマーカーを標的物質としても良い。また、標的物質は、試料に存在するものであれば、生体固有のものでなくても良い。例えば、標的物質は、体外から生体内に導入された薬剤などであっても良い。
典型的な標的物質としては、各種の癌組織の細胞膜等で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
（２）免疫染色剤（抗体－蛍光ナノ粒子の結合体）
免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
免疫染色剤の一例として、［標的物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］～［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“～”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“～”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
（３）抗体
一次抗体には、標的物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＨＥＲ２を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
一次抗体には、標的物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＨＥＲ２を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を標的物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
（４）蛍光ナノ粒子
蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、標的物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。蛍光ナノ粒子の輝度は、ノイズ蛍光の輝度の５倍以上であることが望ましい。
蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、標的物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。蛍光ナノ粒子の輝度は、ノイズ蛍光の輝度の５倍以上であることが望ましい。
（４．１）量子ドット
量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
（４．２）蛍光物質集積ナノ粒子
蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
蛍光物質集積粒子の発光波長は、蛍光顕微鏡の撮像素子の感度域内であれば任意である。具体的には、発光波長が４００～７００ｎｍであることが好ましい。
蛍光物質集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞のノイズ蛍光）に埋もれてしまうことから、２０～２００ｎｍ程度のものが好適である。
また、粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
蛍光物質集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞のノイズ蛍光）に埋もれてしまうことから、２０～２００ｎｍ程度のものが好適である。
また、粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
（４．２．１）母体
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
（４．２．２）量子ドット集積ナノ粒子
量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（４．２．３）蛍光色素集積ナノ粒子
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（５）組織切片の染色方法
染色方法の一例について説明する。
この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
染色方法の一例について説明する。
この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
（５．１）標本作製工程
（５．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
（５．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（５．１．２）賦活化処理
公知の方法に倣い、標的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０～８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
公知の方法に倣い、標的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０～８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
（５．２）免疫染色工程
免疫染色工程では、標的物質を染色するために、標的物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、標的物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程では、標的物質を染色するために、標的物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、標的物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
（５．３）標本後処理工程
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
（５．４）形態観察染色工程
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
［蛍光画像の生体物質定量方法］
続いて、蛍光画像の生体物質定量方法について説明する。
かかる方法は、蛍光画像の生体物質定量システム１００を用いて、免疫染色後の組織標本３０から発せられた蛍光のうち、蛍光物質以外の物質に由来する蛍光（以降、ノイズ蛍光とも言う。）を除去した蛍光画像を生成し、その蛍光画像から組織標本における生体物質の発現量を定量的に評価する際に行われる方法である。
免疫染色後の組織標本３０から発せられた蛍光には、標的物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光と、蛍光物質以外の物質に由来する蛍光（ノイズ蛍光）が含まれている。また、ノイズ蛍光の例として、典型的には組織標本において元から存在する蛍光物質（補酵素、アミノ酸、タンパク質、細胞内色素物質など）が自然に発する蛍光（いわゆる自家蛍光）が挙げられるが、その他にも、例えば組織標本に含まれる蛍光物質以外の物質や、スライドガラスなどの器具が発する蛍光が挙げられる。
続いて、蛍光画像の生体物質定量方法について説明する。
かかる方法は、蛍光画像の生体物質定量システム１００を用いて、免疫染色後の組織標本３０から発せられた蛍光のうち、蛍光物質以外の物質に由来する蛍光（以降、ノイズ蛍光とも言う。）を除去した蛍光画像を生成し、その蛍光画像から組織標本における生体物質の発現量を定量的に評価する際に行われる方法である。
免疫染色後の組織標本３０から発せられた蛍光には、標的物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光と、蛍光物質以外の物質に由来する蛍光（ノイズ蛍光）が含まれている。また、ノイズ蛍光の例として、典型的には組織標本において元から存在する蛍光物質（補酵素、アミノ酸、タンパク質、細胞内色素物質など）が自然に発する蛍光（いわゆる自家蛍光）が挙げられるが、その他にも、例えば組織標本に含まれる蛍光物質以外の物質や、スライドガラスなどの器具が発する蛍光が挙げられる。
図３に、画像処理装置２Ａにおける生体物質定量処理のフローチャートを示す。図３に示す生体物質定量処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
ステップＳ１１（判断工程）では、前処理として、予め、蛍光物質が完全に褪色するまでの時間（以下、蛍光物質褪色時間：Ｔ１）と、蛍光物質が褪色する開始の時間（ｘ）と、ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間（以下、ノイズ蛍光褪色時間：Ｔ２）と、ノイズ蛍光が褪色する開始の時間（ｙ）を取得する。
なお、褪色するまでの時間が異なる複数のノイズ蛍光が存在する場合には、それぞれの時間を算出する。
例えば、２つの場合は、短いほうのノイズ蛍光が褪色するまでの時間（Ｔ２－１）、及び、長いほうのノイズ蛍光が褪色までの時間（Ｔ２－２）を算出する。
なお、褪色するまでの時間が異なる複数のノイズ蛍光が存在する場合には、それぞれの時間を算出する。
例えば、２つの場合は、短いほうのノイズ蛍光が褪色するまでの時間（Ｔ２－１）、及び、長いほうのノイズ蛍光が褪色までの時間（Ｔ２－２）を算出する。
次に、ステップＳ１２では、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）とノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２）とを比較して、以下の「第１処理：Ｔ１＞Ｔ２」、「第２処理：Ｔ１＜Ｔ２」、「第３処理：Ｔ２－１＜Ｔ１＜Ｔ２－２」のいずれかを選択する。
次に、ステップＳ１３（目的蛍光画像取得工程）では、第１処理～第３処理のうち選択した処理を実行する。この時に、撮影のタイミング（ｔ）により所要の処理は異なってくることがあり、撮影のタイミングを自由に選択し、それに合った画像処理を行うことで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された蛍光画像（目的蛍光画像）を取得する。目的蛍光画像としては、蛍光物質の蛍光のみが抽出された画像であることが好ましい。
具体的には、第１処理～第３処理は、表Ｉに示すように、複数のパターンに分類される。即ち、第１の所定時間（ｔ）と、蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ１）、ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ２）、蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間（ｘ）、及びノイズ蛍光が褪色し始める時間（ｙ）のうち少なくとも１つの時間との関係、並びに、第２の所定時間（ｔ０）と、蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ１）、ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ２）、蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間（ｘ）、ノイズ蛍光が褪色し始める時間（ｙ）、及び第１の所定時間（ｔ）のうち少なくとも１つの時間との関係に応じて、目的蛍光画像を取得するための方法（例えば、パターン１～１３）が決定されるのである。各パターンの処理の詳細については後述する。
具体的には、第１処理～第３処理は、表Ｉに示すように、複数のパターンに分類される。即ち、第１の所定時間（ｔ）と、蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ１）、ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ２）、蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間（ｘ）、及びノイズ蛍光が褪色し始める時間（ｙ）のうち少なくとも１つの時間との関係、並びに、第２の所定時間（ｔ０）と、蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ１）、ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間（Ｔ２）、蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間（ｘ）、ノイズ蛍光が褪色し始める時間（ｙ）、及び第１の所定時間（ｔ）のうち少なくとも１つの時間との関係に応じて、目的蛍光画像を取得するための方法（例えば、パターン１～１３）が決定されるのである。各パターンの処理の詳細については後述する。
次に、ステップＳ１４では、第１処理～第３処理のいずれかにより取得した目的蛍光画像から輝点領域を抽出する。
具体的には、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる。例えば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。次いで、抽出された画像に閾値処理が施され、二値化画像が生成され、輝点領域が抽出される。その後、輝点領域にラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される。以上の処理により、輝点領域の抽出が完了する。
具体的には、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる。例えば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。次いで、抽出された画像に閾値処理が施され、二値化画像が生成され、輝点領域が抽出される。その後、輝点領域にラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される。以上の処理により、輝点領域の抽出が完了する。
次に、ステップＳ１５では、輝点領域が抽出された画像について、輝点数を計測する。即ち、一輝点を一蛍光ナノ粒子として計測することで、標的物質の発現量を定量評価することができる。なお、ここでは単に輝点数を計測するものとしたが、例えば蛍光画像と同一平面上かつ同一範囲の明視野画像を撮像して、細胞領域又は細胞核領域を抽出し輝点領域画像と重ね合わせることで、細胞領域ごと又は細胞核領域ごとの輝点数を算出することができる。
以下、表Ｉに記載した、第１処理～第３処理の各パターンについて説明する。
（パターン１）Ｔ１＞Ｔ２、且つ、Ｔ２＜ｔ＜ｘである場合
図４に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（ｔ,Ｔ２＜ｔ＜ｘ）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべて蛍光物質を抽出することができる。
パターン１の場合、蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して、ノイズ蛍光が完全に褪色した後、蛍光物質の褪色が始まるよりも前に、所定露光時間（t）にて１度撮影することで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
なお、ノイズ蛍光の完全な褪色が必要だが、撮影は１回でよい。
図４に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（ｔ,Ｔ２＜ｔ＜ｘ）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべて蛍光物質を抽出することができる。
パターン１の場合、蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して、ノイズ蛍光が完全に褪色した後、蛍光物質の褪色が始まるよりも前に、所定露光時間（t）にて１度撮影することで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
なお、ノイズ蛍光の完全な褪色が必要だが、撮影は１回でよい。
（パターン２）Ｔ１＞Ｔ２、ｙ＜ｔ＜Ｔ２＜ｘ、且つ、ｔ０＜yである場合
図５に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｙ＜ｔ＜Ｔ２）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図５に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｙ＜ｔ＜Ｔ２）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン２の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、ノイズ蛍光の蛍光一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）ノイズ蛍光の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（t）におけるノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を、以下の式（１）にて予め算出する。
Ｍ％＝Ｆ（ｔ）／Ｆ０・・・（１）
ただし、Ｆ０：励起停止前の蛍光強度、Ｆ（ｔ）：露光時間（ｔ）における蛍光強度
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、ノイズ蛍光の蛍光一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）ノイズ蛍光の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（t）におけるノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を、以下の式（１）にて予め算出する。
Ｍ％＝Ｆ（ｔ）／Ｆ０・・・（１）
ただし、Ｆ０：励起停止前の蛍光強度、Ｆ（ｔ）：露光時間（ｔ）における蛍光強度
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＭ％以下の画素をノイズ蛍光を含まないとして判定し、Ｍ％以上の画素をノイズ蛍光を含むとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン３）Ｔ１＞Ｔ２、ｙ＜ｔ＜Ｔ２＜ｘ、且つ、y＜ｔ０＜ｔの場合
図６に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｙ＜ｔ＜Ｔ２）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図６に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｙ＜ｔ＜Ｔ２）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン３の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,y＜ｔ０＜ｔ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の一部蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と、同一視野において所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、ノイズ蛍光の蛍光一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）ノイズ蛍光の蛍光強度の減衰曲線を利用し、露光時間（t及びｔ０）でノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％及び、Ｍ０％）を、上記式（１）にて予め算出する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,y＜ｔ０＜ｔ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の一部蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と、同一視野において所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、ノイズ蛍光の蛍光一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）ノイズ蛍光の蛍光強度の減衰曲線を利用し、露光時間（t及びｔ０）でノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％及び、Ｍ０％）を、上記式（１）にて予め算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＭ％以下かつＭ０％以上の画素をノイズ蛍光を含むとして判定し、Ｍ０％以下の画素をノイズ蛍光を含まないとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン４）Ｔ１＞Ｔ２、ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、ｔ０＜ｙである場合
図７に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図７に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン４の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光を完全に褪色させ、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、以下の式（２）にて予め算出する。
Ｎ％＝Ｆ（ｔ）／Ｆ０・・・（２）
ただし、Ｆ０：励起停止前の蛍光強度、Ｆ（ｔ）：露光時間（ｔ）における蛍光強度
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、ノイズ蛍光を完全に褪色させ、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、以下の式（２）にて予め算出する。
Ｎ％＝Ｆ（ｔ）／Ｆ０・・・（２）
ただし、Ｆ０：励起停止前の蛍光強度、Ｆ（ｔ）：露光時間（ｔ）における蛍光強度
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記ノイズ蛍光除外画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％を超える画素はノイズ蛍光を含むとして判定し、Ｎ％以下の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン５）Ｔ１＞Ｔ２、Ｔ２＜ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、ｙ＜ｔ０＜Ｔ２である場合
図８に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図８に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも長い場合（Ｔ１＞Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することでノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン５の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ0,y＜ｔ0＜Ｔ２）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の一部蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、ノイズ蛍光を完全に褪色させ、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ0,y＜ｔ0＜Ｔ２）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の一部蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、ノイズ蛍光を完全に褪色させ、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記ノイズ蛍光除外画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％を超える画素はノイズ蛍光を含むとして判定し、Ｎ％以下の画素はノイズ蛍光を含まない蛍光物質として判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン６）Ｔ１＜Ｔ２、Ｔ１＜ｔ＜ｙ、且つ、ｔ０＜ｘである場合
図９に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,Ｔ１＜ｔ＜y）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべてノイズ蛍光と判断することができる。
図９に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,Ｔ１＜ｔ＜y）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべてノイズ蛍光と判断することができる。
パターン６の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質を完全に褪色させ、ノイズ蛍光画像を取得する。
（３）前記オリジナル蛍光画像の輝度（蛍光強度）から、前記ノイズ蛍光画像の輝度（蛍光強度）を除く画像処理を実行し、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質を完全に褪色させ、ノイズ蛍光画像を取得する。
（３）前記オリジナル蛍光画像の輝度（蛍光強度）から、前記ノイズ蛍光画像の輝度（蛍光強度）を除く画像処理を実行し、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン７）Ｔ１＜Ｔ２、Ｔ１＜ｔ＜ｙ、且つ、ｘ＜ｔ０＜Ｔ１である場合
図１０に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,Ｔ１＜ｔ＜y）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべてノイズ蛍光と判断することができる。
図１０に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,Ｔ１＜ｔ＜y）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、残った部分はすべてノイズ蛍光と判断することができる。
パターン７の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の一部の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質を完全に褪色させ、ノイズ蛍光画像を取得する。
（３）前記オリジナル蛍光画像の輝度（蛍光強度）から、前記ノイズ蛍光画像の輝度（蛍光強度）を除く画像処理を実行し、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光を含めない褪色後蛍光画像を取得する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の一部の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質を完全に褪色させ、ノイズ蛍光画像を取得する。
（３）前記オリジナル蛍光画像の輝度（蛍光強度）から、前記ノイズ蛍光画像の輝度（蛍光強度）を除く画像処理を実行し、蛍光物質の蛍光一部を褪色させたノイズ蛍光を含めない褪色後蛍光画像を取得する。
（４）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（５）前記褪色後蛍光画像に対して、予め算出された蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を利用すると、前記褪色蛍光画像の蛍光強度に基づき、所定時間（ｔ）で褪色させた蛍光の蛍光強度を補足して、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記褪色後蛍光画像に対して、予め算出された蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を利用すると、前記褪色蛍光画像の蛍光強度に基づき、所定時間（ｔ）で褪色させた蛍光の蛍光強度を補足して、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン８）Ｔ１＜Ｔ２、ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、ｔ０＜ｘである場合
図１１に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図１１に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン８の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％以上の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定し、Ｎ％未満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％以上の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定し、Ｎ％未満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン９）Ｔ１＜Ｔ２、ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、ｘ＜ｔ０＜Ｔ１である場合
図１２に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
図１２に示すように、蛍光物質褪色時間が、ノイズ蛍光褪色時間よりも短い場合（Ｔ１＜Ｔ２）、励起光を照射して所定時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）露光することで蛍光物質の蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用し、蛍光物質を抽出することができる。
パターン９の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｘ＜ｔ０＜Ｔ１）照射して、蛍光物質の一部の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、露光時間（ｔ及びｔ０）で蛍光物質の減衰率（Ｎ％及び、Ｎ０％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｘ＜ｔ０＜Ｔ１）照射して、蛍光物質の一部の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野において、所定時間（ｔ）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、露光時間（ｔ及びｔ０）で蛍光物質の減衰率（Ｎ％及び、Ｎ０％）を、上記式（２）にて予め算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率が（Ｎ％－Ｎ０％）／Ｎ％以上の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定し、（Ｎ％－Ｎ０％）／Ｎ％見満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、ノイズ蛍光を含まない蛍光画像を取得する。
（６）前記ノイズ蛍光を含まない蛍光画像に対して、予め算出された蛍光物質の減衰率（Ｎ０％）を利用すると、前記褪色蛍光画像の蛍光強度に基づき、所定時間（ｔ０）で褪色させた蛍光の蛍光強度を補足して、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、ノイズ蛍光を含まない蛍光画像を取得する。
（６）前記ノイズ蛍光を含まない蛍光画像に対して、予め算出された蛍光物質の減衰率（Ｎ０％）を利用すると、前記褪色蛍光画像の蛍光強度に基づき、所定時間（ｔ０）で褪色させた蛍光の蛍光強度を補足して、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン１０）Ｔ２－１＜Ｔ１＜Ｔ２－２、ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、ｔ０＜ｙ１である場合
図１３に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（ｔ,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
図１３に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（ｔ,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
パターン１０の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ１）照射して、蛍光物質の蛍光、長いノイズ蛍光の蛍光及び短いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、短いノイズ蛍光を除外した画像を取得する。
（３）蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）と長いノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を算出する。なお、蛍光物質の減衰率Ｎ％＞長いノイズ蛍光の減衰率Ｍ％である。また、上記式（１）及び式（２）を用いることができる。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ１）照射して、蛍光物質の蛍光、長いノイズ蛍光の蛍光及び短いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、短いノイズ蛍光を除外した画像を取得する。
（３）蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）と長いノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を算出する。なお、蛍光物質の減衰率Ｎ％＞長いノイズ蛍光の減衰率Ｍ％である。また、上記式（１）及び式（２）を用いることができる。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記短いノイズ蛍光除外画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＭ％未満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定し、その他のものはノイズ蛍光を含まないとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン１１）Ｔ２－１＜Ｔ１＜Ｔ２－２、ｘ＜ｔ＜Ｔ１、且つ、Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘである場合
図１４に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
図１４に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（t,ｘ＜ｔ＜Ｔ１）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、ノイズ蛍光の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
パターン１１の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ0,Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及び、長いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像（短いノイズ蛍光除外）を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、蛍光物質及び長いノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）と長いノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を算出する。なお、蛍光物質の減衰率Ｎ％＞長いノイズ蛍光の減衰率Ｍ％である。また、上記式（１）及び式（２）を用いることができる。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ0,Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及び、長いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像（短いノイズ蛍光除外）を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、蛍光物質及び長いノイズ蛍光の蛍光を強制褪色させて、褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）と長いノイズ蛍光の減衰率（Ｍ％）を算出する。なお、蛍光物質の減衰率Ｎ％＞長いノイズ蛍光の減衰率Ｍ％である。また、上記式（１）及び式（２）を用いることができる。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＭ％未満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定し、その他のものはノイズ蛍光を含まないとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン１２）Ｔ２－１＜Ｔ１＜Ｔ２－２、ｘ＜ｔ＜ｙ２、且つ、ｔ０＜ｙ１である場合
図１５に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（ｔ,ｘ＜ｔ＜ｙ２）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
図１５に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（ｔ,ｘ＜ｔ＜ｙ２）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
パターン１２の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ１）照射して、蛍光物質の蛍光、長いノイズ蛍光の蛍光及び短いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、短いノイズ蛍光を完全に褪色させて、短いノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）により算出する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（ｔ）より短い時間（ｔ０,ｔ０＜ｙ１）照射して、蛍光物質の蛍光、長いノイズ蛍光の蛍光及び短いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（ｔ）露光して、短いノイズ蛍光を完全に褪色させて、短いノイズ蛍光除外画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（ｔ）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）により算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記短いノイズ蛍光除外画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％を超える画素はノイズ蛍光を含むとして判定し、その他の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（パターン１３）Ｔ２－１＜Ｔ１＜Ｔ２－２、ｘ＜ｔ＜ｙ２、且つ、Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘである場合
図１６に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（t,ｘ＜ｔ＜ｙ２）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
図１６に示すように、褪色するまでの時間が異なる複数（例えば、２つ）のノイズ蛍光が存在する場合であって、蛍光物質褪色時間（Ｔ１）が、短いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－１）と、長いノイズ蛍光褪色時間（Ｔ２－２）の中間にある場合、所定露光時間（t,ｘ＜ｔ＜ｙ２）で短いノイズ蛍光を強制褪色させてしまえば、蛍光物質の減衰率を利用して、蛍光物質を抽出することができる。
パターン１３の処理の流れは以下のとおりである。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及び、長いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像（短いノイズ蛍光除外）を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）により算出する。
（１）蛍光物質で染色された組織標本に励起光を所定時間（t）より短い時間（ｔ０,Ｔ２－１＜ｔ０＜ｘ）照射して、蛍光物質の蛍光及び、長いノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像（短いノイズ蛍光除外）を取得する。
（２）前記オリジナル蛍光画像と同一視野における、所定時間（t）露光して、蛍光物質の蛍光を強制褪色させて、蛍光物質の蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する。
（３）蛍光物質の蛍光強度の減衰曲線を利用し、所定露光時間（t）により蛍光物質の減衰率（Ｎ％）を、上記式（２）により算出する。
（４）前記オリジナル蛍光画像と、前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、蛍光強度の減衰率がＮ％以上の画素はノイズ蛍光を含まないとして判定し、Ｎ％未満の画素はノイズ蛍光を含むとして判定する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
（５）前記オリジナル蛍光画像において、ノイズ蛍光を含むと判定した画素の画素値を０とすることで、蛍光物質の蛍光強度が抽出された目的蛍光画像を取得する。
[実施形態の効果]
以上説明したように、本実施の形態の画像生成方法は、蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して所定時間露光させ、組織標本から発生する蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、を有する。
このため、蛍光の一部を強制的に褪色させた褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光のみを抽出した目的蛍光画像を取得することができるので、例えば、高い光安定性を有する蛍光物質等を用意しなくても、ノイズ蛍光による影響を効果的に抑制して蛍光物質の蛍光のみを抽出した計測が可能となる。よって、生体分子量の定量精度を向上させることができる。
以上説明したように、本実施の形態の画像生成方法は、蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して所定時間露光させ、組織標本から発生する蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、を有する。
このため、蛍光の一部を強制的に褪色させた褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光のみを抽出した目的蛍光画像を取得することができるので、例えば、高い光安定性を有する蛍光物質等を用意しなくても、ノイズ蛍光による影響を効果的に抑制して蛍光物質の蛍光のみを抽出した計測が可能となる。よって、生体分子量の定量精度を向上させることができる。
また、本実施の形態によれば、組織標本に前記励起光を所定時間より短い時間照射して、蛍光物質の蛍光及びノイズ蛍光の蛍光に由来するオリジナル蛍光画像を取得するオリジナル蛍光画像取得工程を有し、褪色蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像と同一視野において、蛍光物質の蛍光又はノイズ蛍光を褪色させた褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像に基づいて、目的蛍光画像を取得する。
このため、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像の２枚から、目的蛍光画像を取得することができる。
このため、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像の２枚から、目的蛍光画像を取得することができる。
具体的には、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間より短い場合、褪色蛍光画像取得工程では、蛍光物質の蛍光を褪色させた褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像の蛍光強度から、褪色蛍光画像の蛍光強度を除く画像処理を実行し、目的蛍光画像を取得する。
一方、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間より長い場合、褪色蛍光画像取得工程では、ノイズ蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像との画素値を比較して、予め取得されたノイズ蛍光の減衰率に基づいて、オリジナル蛍光画像の画素値を補正して目的蛍光画像を取得する。
このため、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間と、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間との比較結果から、適切な処理を選択することが可能となる。
一方、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間より長い場合、褪色蛍光画像取得工程では、ノイズ蛍光の一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像との画素値を比較して、予め取得されたノイズ蛍光の減衰率に基づいて、オリジナル蛍光画像の画素値を補正して目的蛍光画像を取得する。
このため、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間と、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間との比較結果から、適切な処理を選択することが可能となる。
また、本実施の形態によれば、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光の蛍光が褪色するまでの時間より長い場合、褪色蛍光画像取得工程では、ノイズ蛍光を褪色させた後、蛍光物質の蛍光の褪色が始まる前に、褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、褪色蛍光画像を目的蛍光画像と決定する。
このため、１枚の褪色蛍光画像から、目的蛍光画像を取得することができる。
このため、１枚の褪色蛍光画像から、目的蛍光画像を取得することができる。
また、本実施の形態によれば、組織標本からは、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間に対して、褪色するまでの時間が短い第１ノイズ蛍光と、褪色するまでの時間が長い第２ノイズ蛍光が発光し、褪色蛍光画像取得工程では、第１ノイズ蛍光を褪色させた褪色蛍光画像を取得し、目的蛍光画像取得工程では、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像との画素値を比較して、予め取得された蛍光物質及び第２ノイズ蛍光の減衰率に基づいて、オリジナル蛍光画像の画素値を補正して目的蛍光画像を取得する。
このため、蛍光物質の蛍光、及び、褪色するまでの時間が異なる第１ノイズ蛍光と第２ノイズ蛍光が混ざり得る場合であっても、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像の２枚から、目的蛍光画像を取得することができる。
このため、蛍光物質の蛍光、及び、褪色するまでの時間が異なる第１ノイズ蛍光と第２ノイズ蛍光が混ざり得る場合であっても、オリジナル蛍光画像と褪色蛍光画像の２枚から、目的蛍光画像を取得することができる。
また、本実施の形態によれば、組織標本及び蛍光物質の種類に応じて、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間より長いか否かを判断する判断工程を有する。
このため、判断工程の判断結果に基づいて、適切な処理を選択することが可能となる。
このため、判断工程の判断結果に基づいて、適切な処理を選択することが可能となる。
[他の実施形態]
その他、生体物質定量システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
その他、生体物質定量システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
本実施形態では、汎用の顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて蛍光画像の合焦位置を特定している。顕微鏡画像取得装置１Ａに代えて公知のホールスライドスキャナを用いてもよい。ホールスライドスキャナによれば、組織標本の厚さ方向（Ｚ方向）に自動でピントを合わせるだけでなく、組織標本の長さおよび幅方向（Ｘ－Ｙ方向）にもステージ移動が可能であり、広範囲の蛍光画像を生成することができる。ホールスライドスキャナでも、蛍光画像の合焦位置を特定した後は、焦点位置を、その特定した蛍光画像の合焦位置に自動で移動させうる。
本実施形態では、生体サンプルとして組織切片を対象とし、蛍光マーカーとして蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤で組織標本を染色し、蛍光画像の合焦位置を特定している。生体サンプルの対象は培養細胞であってもよいし、遺伝子（ＤＮＡ）でもよい。生体サンプルの対象が遺伝子である場合には蛍光マーカーとして蛍光色素を用いることができる。蛍光ナノ粒子も蛍光色素も蛍光マーカーの一例であり、その他の公知の蛍光マーカーが使用されてもよい。
また、上記実施形態においては、蛍光ナノ粒子のみによって組織標本を染色するものとしたが、これに限定されず、もちろん複数の蛍光ナノ粒子を用い、あるいは蛍光ナノ粒子と他の蛍光色素とを用いて多重染色してもよい。これらの場合も、上記実施形態と同様に蛍光ナノ粒子に対してフォーカシングを行うことが有効である。
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピューター読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピューター読み取り可能な媒体として、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
本発明は、使用する蛍光物質の種類に関わらず、ノイズ蛍光の影響を抑制して蛍光物質の蛍光を抽出した計測に利用することができる。
１Ａ 顕微鏡画像取得装置
２Ａ 画像処理装置
３Ａ ケーブル
２１ 制御部（褪色蛍光画像取得手段、目的蛍光画像取得手段）
２２ 操作部
２３ 表示部
２４ 通信Ｉ／Ｆ
２５ 記憶部
２６ バス
１００ 生体物質定量システム
２Ａ 画像処理装置
３Ａ ケーブル
２１ 制御部（褪色蛍光画像取得手段、目的蛍光画像取得手段）
２２ 操作部
２３ 表示部
２４ 通信Ｉ／Ｆ
２５ 記憶部
２６ バス
１００ 生体物質定量システム
Claims (19)
- 蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得工程と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得工程と、
を有する画像生成方法。 - 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間が、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より長い時間であり、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間及び前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間と同じであり、又は前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間より短く、且つ前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より長い時間であり、
前記目的蛍光画像取得工程においては、前記褪色蛍光画像を前記目的蛍光画像として取得する請求項１に記載の画像生成方法。 - 前記組織標本に前記励起光を前記第１の所定時間とは異なる第２の所定時間照射して、蛍光物質の蛍光の少なくとも一部及び前記ノイズ蛍光の少なくとも一部に由来するオリジナル蛍光画像を取得するオリジナル蛍光画像取得工程を有し、
前記褪色蛍光画像取得工程では、前記オリジナル蛍光画像と同一視野において前記褪色蛍光画像を取得し、
前記目的蛍光画像取得工程では、前記オリジナル蛍光画像と前記褪色蛍光画像に基づいて、前記目的蛍光画像を取得する請求項１に記載の画像生成方法。 - 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間が、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より短い時間であり、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間及び前記ノイズ蛍光が褪色し始める時間と同じであり、又は前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間より長く、且つ前記ノイズ蛍光が褪色し始める時間より短い時間であり、
前記第２の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間と同じであり、又は前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間よりも短い時間であり、
前記目的蛍光画像取得工程においては、前記オリジナル蛍光画像の蛍光強度から前記褪色蛍光画像の蛍光強度を除いた画像を、前記目的蛍光画像として取得する請求項３に記載の画像生成方法。 - 前記目的蛍光画像取得工程においては、予め取得された前記蛍光物質の蛍光の減衰率、又は前記ノイズ蛍光の減衰率に基づいて、前記目的蛍光画像を取得する請求項３に記載の画像生成方法。
- 前記目的蛍光画像取得工程においては、前記褪色蛍光画像における所定の第１範囲内の画素値と、前記第１範囲に対応する前記オリジナル蛍光画像における所定の第２範囲内の画素値とを比較し、画素値の減少率が前記ノイズ蛍光の減衰率以上の画素について画素値を０とした画像、又は画素値の減少率が前記蛍光物質の減衰率未満の画素について画素値を０とした画像を、前記目的蛍光画像を取得する請求項５に記載の画像生成方法。
- 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間が、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より長い時間であり、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間より長い時間であり、又は前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より短い時間である請求項６に記載の画像生成方法。 - 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間が、前記ノイズ蛍光の蛍光が完全に褪色するまでの時間より短い時間であり、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間より短い時間である請求項６に記載の画像生成方法。 - 前記組織標本からは、完全に褪色するまでの時間が互いに異なる第１のノイズ蛍光及び第２のノイズ蛍光が発せられ、前記第１のノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間は前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間よりも短く、前記第２のノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間は前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間よりも長く、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間及び前記第２のノイズ蛍光が褪色し始める時間と同じ時間であり、又は前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間より長く、且つ前記第２のノイズ蛍光が褪色し始める時間より短い時間である請求項６に記載の画像生成方法。 - 前記第２の所定時間は、前記第１の所定時間よりも短い時間であり、
前記目的蛍光画像取得工程においては、前記ノイズ蛍光の減衰率に基づいて、前記目的蛍光画像を取得する請求項７に記載の画像生成方法。 - 前記第２の所定時間は、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間よりも短い時間であり、
前記目的蛍光画像取得工程においては、前記蛍光物質の減衰率に基づいて、前記目的蛍光画像を取得する請求項７に記載の画像生成方法。 - 前記第２の所定時間は、前記第１のノイズ蛍光が褪色し始める時間よりも短い時間であり、又は前記第１のノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より長く、且つ前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間より短い時間である請求項９に記載の画像生成方法。
- 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間が、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間より短い時間であり、
前記第１の所定時間は、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間及び前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間と同じであり、又は前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間より短く、且つ前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間より長い時間であり、
前記目的蛍光画像取得工程においては、前記オリジナル蛍光画像の蛍光強度から前記褪色蛍光画像の蛍光強度を除いて褪色後蛍光強度を算出し、前記蛍光物質の蛍光の減衰率に基づいて前記褪色後蛍光強度を補正した画像を、前記目的蛍光画像として取得する請求項５に記載の画像生成方法。 - 前記組織標本からは、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間に対して、褪色するまでの時間が短い第１ノイズ蛍光と、褪色するまでの時間が長い第２ノイズ蛍光とが発光し、
前記褪色蛍光画像取得工程では、前記第１ノイズ蛍光を褪色させた前記褪色蛍光画像を取得し、
前記目的蛍光画像取得工程では、前記オリジナル蛍光画像と前記褪色蛍光画像との画素値を比較して、予め取得された蛍光物質及び前記第２ノイズ蛍光の減衰率に基づいて、前記オリジナル蛍光画像の画素値を補正して前記目的蛍光画像を取得する請求項３に記載の画像生成方法。 - 前記組織標本及び蛍光物質の種類に応じて、蛍光物質の蛍光が褪色するまでの時間が、ノイズ蛍光が褪色するまでの時間より長いか否かを判断する判断工程を有する請求項１から１４のいずれか一項に記載の画像生成方法。
- 前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間と、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間との関係、並びに、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間と、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間と、前記第１の所定時間との関係に基づいて、前記オリジナル蛍光画像を取得するか否かを決定する判断工程を有する請求項３から１４のいずれか一項に記載の画像生成方法。
- 前記第１の所定時間と、前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間、及び前記ノイズ蛍光が褪色し始める時間の少なくとも１つの時間との関係、並びに、前記第２の所定時間と、前記蛍光物質の蛍光が完全に褪色するまでの時間、前記ノイズ蛍光が完全に褪色するまでの時間、前記蛍光物質の蛍光が褪色し始める時間、前記ノイズ蛍光が褪色し始める時間、及び前記第１の所定時間の少なくとも１つの時間との関係に基づいて、前記目的蛍光画像を取得する方法を決定する請求項３から１４のいずれか一項に記載の画像生成方法。
- 蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段と、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段と、
を備える画像生成装置。 - コンピューターを、
蛍光物質で染色された組織標本に励起光を照射して第１の所定時間露光させ、前記蛍光物質の蛍光の少なくとも一部を褪色させ、又は前記蛍光物質とは異なる物質から発せられるノイズ蛍光の少なくとも一部を褪色させた褪色蛍光画像を取得する褪色蛍光画像取得手段、
前記褪色蛍光画像に基づいて、蛍光物質の蛍光が抽出された目的蛍光画像を取得する目的蛍光画像取得手段、
として機能させるためのプログラム。
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|---|---|
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| Date | Code | Title | Description |
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| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21776049 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
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| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2022509485 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 21776049 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |