JP7184046B2 - 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents
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Description
そこで、例えば特許文献1には、上記の方法と同様に蛍光画像から蛍光輝点を抽出し、蛍光色素集積粒子1粒子当たりの平均輝度値に基づいて、各輝点に含まれる粒子数を算出する方法が記載されている。特許文献1に記載の方法では、各輝点の輝度値を算出して、最頻値となる輝度値を蛍光色素集積粒子1粒子当たりの平均輝度値として用いている。
そこで、例えば特許文献4には、タンパク質の発現量が明らかな培養細胞を標準標本として対象標本と同じ条件下で観察を行い、蛍光輝点数の違いから標準標本における生体物質の発現量を算出する方法が開示されている。これにより、染色条件等の変動要因に影響されることなく定量評価することができる。
しかしながら、特許文献4の方法では、蛍光色素集積粒子1粒子当たりの輝度値が明らかではないため、例えば蛍光色素集積粒子の輝度が著しく低下する場合に、そもそも輝点を抽出することができないなど、標準標本における生体物質の発現量を算出することが困難となる。
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値の積算値である第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備え、
前記粒子数算出工程は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含むことを特徴とする。
請求項2に記載の生体物質定量方法は、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値の積算値である第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備え、
前記粒子数算出工程は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出工程と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出工程により算出された露光時間により撮影された画像であることを特徴とする。
前記粒子数補正工程は、
前記第2輝度積算値を用いて算出された前記第2蛍光画像における前記輝点部に結合する蛍光色素集積粒子数と、所定の条件下で予測される前記輝点部に結合する基準蛍光色素集積粒子数との比から算出される粒子数補正係数を用いて補正する
ことを特徴とする。
前記単位輝度値算出工程は、
最頻値となる第3輝度積算値を前記単位輝度値として算出することを特徴とする。
前記対象標本は、発光波長が異なり、各々の発光波長に対応する複数のフィルターを用いて撮像可能な複数種類の蛍光色素集積粒子を用いて染色され、
一の蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布され、前記複数のフィルターの各々を用いて撮像された複数の第3蛍光画像間の輝度比から算出されるクロストーク補正係数を用いて、当該蛍光色素集積粒子が対応しないフィルターを介して撮像されたクロストークを除去するクロストーク除去工程を含む
ことを特徴とする。
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備え、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含むことを特徴とする。
請求項7に記載の画像処理装置は、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備え、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出手段により算出された露光時間により撮影された画像であることを特徴とする。
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させ、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含む。
請求項9に記載のプログラムは、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させ、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出手段により算出された露光時間により撮影された画像である。
請求項6又は7に記載の画像処理装置と、
前記第1蛍光画像、前記第2蛍光画像及び前記第3蛍光画像を取得する画像取得装置を備えることを特徴とする。
以下、図面を参照して本発明を実施するための第1実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
図1に、本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システム100の全体構成例を示す。病理診断支援システム100は、所定の染色試薬で染色された組織標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
病理診断支援システム100は、図1に示すように、顕微鏡画像取得装置1Aと、画像処理装置2Aと、がケーブル3A等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2Aとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2AはLAN(Local Area Network)により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。また、病理診断支援システム100は、顕微鏡画像取得装置1Aと画像処理装置2Aが一体に形成された装置でもよい。また、外部の任意の装置を用いて取得した画像をHDD、CD、DVD等のストレージを用いて画像処理装置に入力してもよい。
顕微鏡画像取得装置1Aは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信I/F等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信I/Fは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置2Aに送信する。
画像処理装置2Aは、図2に示すように、制御部21、操作部22、表示部23、通信I/F24、記憶部25等を備えて構成され、各部はバス26を介して接続されている。
操作部22は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部21に出力する。
表示部23は、例えば、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)等のモニタを備えて構成されており、制御部21から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施形態において、表示部23は、例えば、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。
通信I/F24は、顕微鏡画像取得装置1Aをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信I/F24は、入力工程を実行する手段として機能する。
記憶部25は、例えばHDD(Hard Disk Drive)や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部25には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置2Aは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
ここで、本発明に係る、目的生体物質定量の対象となる組織標本(対象標本)の準備について、染色試薬及び染色方法も含めて詳細に説明する。
本発明に係る組織標本は、目的生体物質を染色可能な蛍光色素集積粒子を含む染色試薬により染色されている。目的生体物質とは、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質(抗原)である。典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質(例えば、HER2タンパク質等)が挙げられる。
本発明に係る蛍光色素集積粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を1分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光色素集積粒子の発光波長は、蛍光顕微鏡の撮像素子の感度域内であれば任意である。具体的には、発光波長が400~700nmであることが好ましい。
また、粒径の変動係数が15%以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、1粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
蛍光色素集積粒子としては、母体と蛍光色素とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂;スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、AS樹脂(アクリロニトリル-スチレン共重合体)、ASA樹脂(アクリロニトリル-スチレン-アクリル酸メチル共重合体)など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂;ポリ乳酸等のその他の樹脂;多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
特に、メラミン樹脂を母体として用いると、シリカ等を用いる場合に比べて粒径のバラつきを抑えることができるため、好適である。
蛍光色素集積粒子とは、蛍光色素が上記母体の中に内包されている、及び/又はその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、Cy(登録商標、GEヘルスケア社製)系色素分子、HiLyte(登録商標、アナスペック社製)系色素分子、DyLight(登録商標、サーモサイエンティフィック社製)系色素分子、ATTO(登録商標、ATTO-TEC社製)系色素分子、MFP(登録商標、Mobitec社製)系色素分子、CF(登録商標、Biotium社製)系色素分子、DY(登録商標、DYOMICS社製)系色素分子、CAL(登録商標、BioSearch Technologies社製)系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
本発明においては、蛍光色素集積粒子として量子ドット集積粒子を用いてもよい。
量子ドット集積粒子とは、量子ドットが上記母体の中に内包されている、および/またはその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットとしては、II-VI族化合物、III-V族化合物またはIV族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geなどが挙げられる。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
染色試薬は、目的生体物質の1つに対して、蛍光色素集積粒子の1つが結合するように設計される。
免疫染色に用いる染色試薬(免疫染色剤)の場合は、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光色素集積粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光色素集積粒子が直結している複合体を用いることもできる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“~”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いる。
抗体を産生する動物(免疫動物)の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択する。
以下、組織標本の染色方法の一例について、パラフィン包埋された組織切片(以下、単に「切片」ともいう。)を染色する場合を例にとって説明するが、本発明に係る組織標本は、針生検により取得した標本等から任意のものを用いて良い。
(4.1.1)脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mのクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMのEDTA溶液(pH8.0)、5%尿素、0.1Mのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
pH条件は用いる組織切片に応じてpH2.0~13.0の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はpH6.0~8.0で行うが、特殊な組織切片ではたとえばpH3.0でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではなく、温度は50~130℃、時間は5~30分で行うことができる。室温で行うこともできる。
次いで、PBSを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光色素集積粒子を含む免疫染色剤の溶液を切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、BSA含有PBSなど公知のブロッキング剤やTween20などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液(ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤)に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液(キシレンなど)に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態の観察を容易にするための形態観察染色を行う。形態観察染色工程は、公知の任意の方法に従って行うことができ、免疫染色工程の前又は後の何れに行ってもよい。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤~濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色~淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている(これら2つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)として知られている)。
次に、細胞へ付着する蛍光色素集積粒子数の補正に用いられる、標準標本の準備について説明する。
以下、市販されているスライドガラス等の基材上に培養され、目的生体物質を発現する培養細胞を標準標本とする場合を例にとり説明する。
標準標本として用いる培養細胞から、目的生体物質の濃度を定量する。目的生体物質の定量は、例えばELISA、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット等、周知の任意の方法により行うことができ、一細胞当たりの目的生体物質の濃度が算出可能である。なお、ELISA及びウエスタンブロットによれば、所定の溶液中に溶解した細胞から目的生体物質を定量可能であり、また、フローサイトメトリーによれば、所定の溶液中に分散させた細胞に対してレーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、一細胞当たりの生体分子の検出や定量が可能である。
まず、目的生体物質を定量した培養細胞と均一な品質である同一ロットの培養細胞を標準標本として選択する。選択する標準標本の種類数は任意であるが、標準標本の計測結果に基づく検量線を作成して制度の高い定量結果を得るために、予め定量された目的生体物質濃度の差が大きな、複数種類の標準標本を用いることが好ましい。
培養細胞に対して、組織切片の染色と同一条件下で免疫染色及び形態観察染色を行い、標準標本を得る。これらの染色方法は、組織切片の染色方法(上記(4.2)免疫染色工程、及び(4.4)形態観察染色工程)と同様であるため、詳細な説明は省略する。なお、同一条件で染色するとは、例えば、一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて染色を行い、かつ、染色における各行程の所要時間、温度及び湿度がほぼ一定であることを示す。一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて、標準標本及び組織標本の染色作業を並行して順次行うこととすれば、染色条件を容易に同一にすることができるため、好ましい。
次に、蛍光色素集積粒子1粒子当たりの平均輝度値算出に用いられる蛍光色素集積粒子散布プレパラートについて説明する。
以下、蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製工程を具体的に説明するが、本発明の蛍光色素集積粒子散布プレパラートは、上述した蛍光色素集積粒子が凝集しないように散布されたものであれば任意である。
(1)任意の平均粒径(例えば150nm)の蛍光色素集積粒子を準備する。
(2)蛍光色素集積粒子をPBSで希釈して、濃度0.005nMの蛍光色素集積粒子液を作製する。
(3)スライドガラスを準備する。
(4)スライドガラス上に蛍光色素集積粒子液7.5uLを滴下して、滴下面積が直径5.0mmの円と同程度になるようにする。
(5)10分間静置する。
(6)純水を入れた300mLビーカーにスライドガラスを漬けて洗浄する。
(7)スライドガラスを染色かごに嵌め、流水で10分間洗浄する。
(8)染色かごを水から上げ、脱水のためにエタノール相を3相、キシレン置換のためにキシレン相を3相通す。
(9)スライドガラスをキシレン系封入剤(マリノール)で封入する。
以下、病理診断支援システム100において、上述した組織標本、標準標本及び蛍光色素集積粒子を散布させたコントロールスライドを撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
その後、顕微鏡画像取得装置1Aを用いて、組織標本の明視野画像(第1明視野画像)及び蛍光画像(第1蛍光画像)、標準標本の明視野画像(第2明視野画像)及び蛍光画像(第2蛍光画像)並びに散布された蛍光色素集積粒子(以降、散布粒子と表記)の蛍光画像(第3蛍光画像)を取得して、各画像のデータを画像処理装置2Aに送信する。
通信I/F24により顕微鏡画像取得装置1Aからの第1明視野画像が入力されると(ステップS301)、第1明視野画像から細胞核の領域が抽出された第1細胞核画像が作成される(ステップS302)。ステップS302では、公知の任意の方法を用いて抽出することとしてよく、また、細胞核に限らず任意の領域を関心領域(ROI)として抽出してよい。
なお、ステップS304~S305の処理は、公開解析ソフトImageJ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Count等、公知の任意の方法を用いて計測することができる。
具体的には、第3輝点領域画像が生成されると(図4B)、輝点領域ごとにX座標位置及びY座標位置における輝度値を数値化した輝度分布が作成され、この値を乗算したものが当該輝点領域における第3輝度積算値である。
また、最頻値の算出においては、第3輝度積算値の分布に対してフィッティング又は補間を行い、フィッティング曲線または補間曲線のピークの輝度積算値を前記平均輝度値とすることが好ましい。本発明の第3輝度積算値の分布は、例えば、ガウス曲線、二次曲線、ポアソン分布、二項分布、等に好適にフィッティングさせることができる。
ステップS302及びS315の処理の終了後、制御部21により、第1細胞核画像と第1輝点領域画像の加算処理が行われ(ステップS316)、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される(ステップS317:暫定粒子数算出工程)。
ステップS307及びS318の処理の終了後、制御部21により、第2細胞核画像と第2領域画像の加算処理が行われ(ステップS319)、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される(ステップS320)。
以下、図面を参照して本発明を実施するための第2実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
<病理診断支援システム100の構成>、<組織標本からの画像の取得>、<標準標本からの画像の取得>及び<蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製>については第1実施形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
以下、病理診断支援システム100において、組織標本、標準標本、及び散布粒子を撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
第2実施形態に係る画像解析処理は、輝度値補正処理と粒子数補正処理とからなる。図6に示す輝度値補正処理は、顕微鏡画像取得装置1Aを用いた第1蛍光画像及び第2蛍光画像の撮像時における露光時間を決定するための処理である。図7に示す粒子数補正処理は、第1実施形態と同様に、標準標本を用いて粒子数補正係数を算出することにより、組織標本における一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を算出・補正する処理である。
具体的には、例えば、第3蛍光画像の平均輝度値に対する基準輝度値の比を算出し、これを第3蛍光画像の撮像条件下における露光時間に積算することで、第1蛍光画像及び第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出することができる。
通信I/F24により顕微鏡画像取得装置1Aからの第1明視野画像が入力されると(ステップS701)、第1明視野画像から細胞核の領域が抽出された第1細胞核画像が作成される(ステップS702)
以下、図面を参照して本発明を実施するための第3実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
<病理診断支援システム100の構成>、<組織標本からの画像の取得>、<標準標本からの画像の取得>及び<蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製>については第1実施形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
以下、病理診断支援システム100において、組織標本、標準標本、及び散布粒子を撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
第2実施形態に係る画像解析処理は、クロストーク除去処理と輝度値・粒子数補正処理とからなる。蛍光波長の異なる複数の蛍光物質で組織切片を染色する場合、特定の色の輝点を対象とした解析を行う際に他色の蛍光物質のシグナルが漏れこんでしまう、所謂クロストークという現象が生じる。本実施形態に係るクロストーク除去処理は、このようなノイズを除去することを目的とする。また、本実施形態に係る輝度値・粒子数補正処理は、クロストークを除去したうえで蛍光色素集積粒子ごとに輝度値及び蛍光色素集積粒子数を補正するものである。
また、以降は蛍光色素集積粒子Aをフィルターaによって撮像した蛍光画像を第3蛍光画像Aa、蛍光色素集積粒子Aをフィルターbによって撮像した蛍光画像を第3蛍光画像Ab、・・・、蛍光色素集積粒子Cをフィルターcによって撮像した蛍光画像を第3蛍光画像Ccと表記する。また、第3蛍光画像Aaにおける蛍光色素集積粒子Aの平均輝度値を(Aa)、第3蛍光画像Abにおける蛍光色素集積粒子Aの平均輝度値を(Ab)、・・・、第3蛍光画像Ccにおける蛍光色素集積粒子Cの平均輝度値を(Cc)と表記する。
ステップS809の処理によってクロストーク除去処理が完了し、続いて図9に示す輝度値・粒子数補正処理へと移行する。
ステップS902及びS909の処理の終了後、制御部21により、第1細胞核画像と第1輝点領域画像の加算処理が行われ(ステップS910)、蛍光色素集積粒子A,B,Cのそれぞれについて、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される(ステップS911)。
ステップS906及びS912の処理の終了後、制御部21により、第2細胞核画像と第2輝点領域画像の加算処理が行われ(ステップS913)、蛍光色素集積粒子A,B,Cのそれぞれについて、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される(ステップS914)。
ステップS916の処理によって輝度値補正処理が完了し、これにより画像解析処理を終了する。
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
その他、病理診断支援システム100を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
2A 画像処理装置
21 制御部
22 操作部
23 表示部
24 通信I/F
25 記憶部
26 バス
3A ケーブル
100 病理診断支援システム
Claims (10)
- 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値の積算値である第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備え、
前記粒子数算出工程は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含む生体物質定量方法。 - 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値の積算値である第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備え、
前記粒子数算出工程は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出工程と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出工程により算出された露光時間により撮影された画像である生体物質定量方法。 - 前記粒子数補正工程は、
前記第2輝度積算値を用いて算出された前記第2蛍光画像における前記輝点部に結合する蛍光色素集積粒子数と、所定の条件下で予測される前記輝点部に結合する基準蛍光色素集積粒子数との比から算出される粒子数補正係数を用いて補正する
請求項1又は2に記載の生体物質定量方法。 - 前記単位輝度値算出工程は、
最頻値となる第3輝度積算値を前記単位輝度値として算出する請求項1から3のいずれか一項に記載の生体物質定量方法。 - 前記対象標本は、発光波長が異なり、各々の発光波長に対応する複数のフィルターを用いて撮像可能な複数種類の蛍光色素集積粒子を用いて染色され、
一の蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布され、前記複数のフィルターの各々を用いて撮像された複数の第3蛍光画像間の輝度比から算出されるクロストーク補正係数を用いて、当該蛍光色素集積粒子が対応しないフィルターを介して撮像されたクロストークを除去するクロストーク除去工程を含む
請求項1から4のいずれか一項に記載の生体物質定量方法。 - 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備え、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含む画像処理装置。 - 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備え、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出手段により算出された露光時間により撮影された画像である画像処理装置。 - 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させ、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含むプログラム。 - 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第1蛍光画像を入力する入力手段、
前記第1蛍光画像から輝点部を抽出し、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域である前記輝点部の輝度値の積算値である第1輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第1輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第2蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第2輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させ、
前記粒子数算出手段は、
前記第3蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第3輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出手段と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子1粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出手段と、
前記第1輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出手段と、
前記第2輝度積算値を用いて、前記第1蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正手段と、を含み、
前記第1蛍光画像及び前記第2蛍光画像は、前記露光時間算出手段により算出された露光時間により撮影された画像であるプログラム。 - 請求項6又は7に記載の画像処理装置と、
前記第1蛍光画像、前記第2蛍光画像及び前記第3蛍光画像を取得する画像取得装置を備える病理診断支援システム。
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Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006177956A (ja) | 2004-12-21 | 2006-07-06 | Palo Alto Research Center Inc | 複数レーザ光源複数プローブ蛍光励起型検知システム用時分割多重走査型光源 |
JP2009098151A (ja) | 2001-08-28 | 2009-05-07 | Baylor College Of Medicine | カラーブラインド蛍光のためのパルスマルチライン励起法 |
JP2011212116A (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Sony Corp | 蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置 |
US20130338014A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-12-19 | Vala Sciences, Inc. | Calibration Standards For Digital Histocytometry |
WO2015093518A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 |
WO2015163211A1 (ja) | 2014-04-21 | 2015-10-29 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及び画像処理プログラム |
WO2016006096A1 (ja) | 2014-07-11 | 2016-01-14 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム |
WO2016042963A1 (ja) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、画像処理方法、及びプログラム |
WO2016125236A1 (ja) | 2015-02-02 | 2016-08-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 多色蛍光分析装置 |
WO2016129061A1 (ja) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004157018A (ja) | 2002-11-06 | 2004-06-03 | Dkk Toa Corp | 蛍光検出装置の感度校正方法及び蛍光検出装置 |
EP2162728B1 (en) | 2007-06-15 | 2016-07-27 | Novartis AG | Microscope system and method for obtaining standardized sample data |
EP2613145B1 (en) | 2010-08-30 | 2017-06-28 | Konica Minolta, Inc. | Tissue staining method, tissue evaluation method and biosubstance detection method |
US10746740B2 (en) * | 2015-01-22 | 2020-08-18 | Konica Minolta, Inc. | Biological substance quantitation method, pathological diagnosis support system, and recording medium storing computer readable program |
JP6372370B2 (ja) * | 2015-01-23 | 2018-08-15 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、及びプログラム |
-
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Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009098151A (ja) | 2001-08-28 | 2009-05-07 | Baylor College Of Medicine | カラーブラインド蛍光のためのパルスマルチライン励起法 |
JP2006177956A (ja) | 2004-12-21 | 2006-07-06 | Palo Alto Research Center Inc | 複数レーザ光源複数プローブ蛍光励起型検知システム用時分割多重走査型光源 |
JP2011212116A (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Sony Corp | 蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置 |
US20130338014A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-12-19 | Vala Sciences, Inc. | Calibration Standards For Digital Histocytometry |
WO2015093518A1 (ja) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、病理診断支援システム、画像処理プログラム及び画像処理方法 |
WO2015163211A1 (ja) | 2014-04-21 | 2015-10-29 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及び画像処理プログラム |
WO2016006096A1 (ja) | 2014-07-11 | 2016-01-14 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム |
WO2016042963A1 (ja) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | コニカミノルタ株式会社 | 画像処理装置、画像処理方法、及びプログラム |
WO2016125236A1 (ja) | 2015-02-02 | 2016-08-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 多色蛍光分析装置 |
WO2016129061A1 (ja) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム |
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