JP6911855B2 - 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム - Google Patents

生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム Download PDF

Info

Publication number
JP6911855B2
JP6911855B2 JP2018525979A JP2018525979A JP6911855B2 JP 6911855 B2 JP6911855 B2 JP 6911855B2 JP 2018525979 A JP2018525979 A JP 2018525979A JP 2018525979 A JP2018525979 A JP 2018525979A JP 6911855 B2 JP6911855 B2 JP 6911855B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fluorescent dye
particles
luminance
accumulated particles
value
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018525979A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2018008309A1 (ja
Inventor
雄一 尾崎
雄一 尾崎
健作 高梨
健作 高梨
大輔 富岡
大輔 富岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Publication of JPWO2018008309A1 publication Critical patent/JPWO2018008309A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6911855B2 publication Critical patent/JP6911855B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T1/00—General purpose image data processing
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T1/00—General purpose image data processing
    • G06T1/0007—Image acquisition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Image Analysis (AREA)

Description

本発明は、生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに関し、特に病理診断に用いられる画像処理に関する。
病理診断において、組織切片で過剰発現をしている生体物質の発現量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。こうした生体物質の定量においては、組織切片内に設定した解析対象領域である関心領域内における特定の生体物質の発現量を解析することから、生体物質の定量及び関心領域の抽出を正確に行うことができる手法の開発が望まれている。
そこで、例えば特許文献１には、蛍光物質集積粒子を用いて特定タンパクを染色した組織標本を撮像した蛍光画像から、Top-hat変換等を用いて輝度値が極大となる画素を蛍光輝点として抽出し、画像における特定タンパクの発現量を解析する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法によれば、蛍光物質集積粒子は１粒子当たりの輝度が高く、蛍光染色された生体物質が蛍光画像においてドット状に観察されるため、定量が容易である。
また、例えば特許文献２には、蛍光物質集積粒子１粒子当たりの平均輝度値に基づいて、各輝点に含まれる粒子数を算出する方法が記載されている。特許文献２に記載の方法では、特許文献１と同様の蛍光画像から蛍光発光輝点の輝度値を算出して、最頻値となる輝度値を蛍光物質集積粒子１粒子当たりの平均輝度値として用いる。
国際公開２０１３／１４６８４１号 国際公開２０１２／０２９３４２号
しかし、特許文献１に記載の方法では、特定タンパクが高密度に発現している場合には、図８ＡのＳＥＭ画像に示されるようにクラスタ状となった複数の蛍光色素集積粒子が、図８Ｂのような蛍光画像に基づいて１つの輝点として計測される。その結果、特定タンパクの発現量が少なく算出されてしまうという問題点があった。
また、特許文献２に記載の方法では、特定タンパクが高密度に発現してクラスタ状の蛍光物質集積粒子が多く存在している場合には、最頻値となる輝度値が実際の１粒子当たりの平均輝度値よりも大きな値に算出されるという誤差が生じ易い。また、組織標本を撮影した蛍光画像から計測された輝度値は、蛍光物質集積粒子が発する蛍光の他に、細胞の自家蛍光等の様々なバックグラウンドノイズを含むため、結果に誤差が生じ易い。特許文献２に記載の技術では、このような誤差を補正して正確な定量を行うことは困難であるという問題点があった。
本発明の主な目的は、組織標本における特定の生体物質の定量を、生体物質に結合させた蛍光色素集積粒子を用いて正確かつ簡易に行うことができる生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することにある。
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
１． 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量する生体物質定量方法において、
前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程、
を備え、
前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出される
ことを特徴とする生体物質定量方法。
２． 前記プレパラートにおける前記蛍光色素集積粒子の密度は１０６個/mm２以下であることを特徴とする第１項に記載の生体物質定量方法。
３． 下記の式（１）を満たすことを特徴とする第１項又は第２項に記載の生体物質定量方法。
式（１）： ０≦ Ｓσ／Ｓａｖｅ ＜１．０
（式（１）中、Ｓσは輝点領域の面積の標準偏差、Ｓａｖｅは輝点領域の面積の平均値である。）
４． 下記の関係式（２）を満たすことを特徴とする第１項〜第３項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
式（２）： ０．１０＜ Ｓａｖｅ ／π（Ｒａｖｅ／２+Δ）２ ＜１０．００
（式（２）中、Ｓａｖｅは輝点領域の面積の平均値、Ｒａｖｅは蛍光色素集積粒子の平均粒径、Δは蛍光画像を撮像した機器の分解能である。）
５． 前記平均輝度値は、１０，０００個以上の前記輝点領域毎の輝度値を用いて算出されることを特徴とする第１項〜第４項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
６． 前記蛍光色素集積粒子の平均粒径が２０〜２００ｎｍであることを特徴とする第１項〜第５項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
７． 前記蛍光色素集積粒子の粒径の変動係数が１５％以下であることを特徴とする第１項〜第６項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
８．前記平均輝度値は、最頻値となる前記第２輝度積算値であることを特徴とする第１項〜第７項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
９．前記平均輝度値は、前記第２輝度積算値の分布に対してフィッティングもしくは補間を行って作成されたフィッティング曲線又は補間曲線における最大値の輝度値であることを特徴とする第１項〜第８項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
１０．前記平均輝度値は、平均粒径が異なる複数種類の蛍光色素集積粒子による前記第２輝度積算値の分布から作成されたルックアップテーブル又は補間曲線を用いて算出される任意の粒径の蛍光色素集積粒子の平均輝度値であることを特徴とする第１項〜第９項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
１１．前記平均輝度値は、発光波長が異なる複数種類の蛍光色素集積粒子による前記第２輝度積算値の分布から作成されたルックアップテーブル又は補間曲線を用いて、算出される任意の蛍光波長の平均輝度値であることを特徴とする第１項〜第１０項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
１２．前記蛍光色素集積粒子の発光特性が変化した場合に、前記１粒子当たりの平均輝度値をキャリブレーションするキャリブレーション工程を備えることを特徴とする第１項〜第１１項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
１３．前記蛍光色素集積粒子及び溶解可能な粒子をスライドガラス上に散布した後、前記粒子を溶解除去してプレパラートを作製するプレパラート作製工程を備える
ことを特徴とする第１項〜第１２項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
１４．溶解可能な樹脂を用いてパターニングされたスライドガラスに前記蛍光色素集積粒子を散布した後、前記樹脂を溶解除去してプレパラートを作製するプレパラート作製工程を備える
ことを特徴とする第１項〜第１２項の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量する画像処理装置において、
前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備え、
前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出される
ことを特徴とする画像処理装置。
１６． 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量するコンピュータを、
前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段、
前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させるためのプログラムであって、
前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出されることを特徴とする、プログラム。
１７． 第１５項に記載の画像処理装置と、
前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像を取得する画像取得装置と、
を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
本発明の生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムによれば、組織標本における特定の生体物質の定量を、生体物質に結合させた蛍光色素集積粒子を用いて正確かつ簡易に行うことができる。
本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。 図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。 図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。 第２蛍光画像の一例を示す図である。 第２輝点領域画像の一例を示す図である。 輝度分布曲線の一例である。 平均粒径ＲＡの蛍光色素集積粒子Ａの輝度分布曲線の一例である。 平均粒径ＲＢの蛍光色素集積粒子Ｂの輝度分布曲線の一例である。 発光波長λＡの蛍光色素集積粒子Ａの輝度分布曲線の一例である。 発光波長λＢの蛍光色素集積粒子Ｂの輝度分布曲線の一例である。 発光波長λＣの蛍光色素集積粒子Ｃの輝度分布曲線の一例である。 凝集した複数の蛍光色素集積粒子を撮影したＳＥＭ画像の一例である。 図８Ａの凝集した複数の蛍光色素集積粒子を撮影した蛍光画像の一例である。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された組織標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
病理診断支援システム１００は、図１に示すように、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはLAN（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。また、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａが一体に形成された装置でもよい。また、外部の任意の装置を用いて取得した画像をHDD、CD、DVD等のストレージを用いて画像処理装置に入力してもよい。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルタ等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge Coupled Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
画像処理装置２Ａは、図２に示すように、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
制御部２１は、CPU（Central Processing Unit）、RAM（Random Access Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理を実行し、（第１）輝度算出工程、第２輝度算出工程、平均輝度算出工程、粒子数算出工程及びキャリブレーション工程を実行する手段としての機能を実現する。
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
表示部２３は、例えば、CRT（Cathode Ray Tube）やLCD（Liquid Crystal Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施形態において、表示部２３は、例えば、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、（第１）入力工程及び第２入力工程を実行する手段として機能する。
記憶部２５は、例えばHDD（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
＜組織標本からの画像の取得＞
ここで、本発明に係る組織標本の準備について、染色試薬及び染色方法も含めて詳細に説明する。
（１）目的生体物質
本発明に係る組織標本は、目的生体物質を染色可能な蛍光色素集積粒子を含む染色試薬により染色されている。目的生体物質とは、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）である。典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
（２）蛍光色素集積粒子
本発明に係る蛍光色素集積粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光色素集積粒子の発光波長は、蛍光顕微鏡の撮像素子の感度域内であれば任意である。具体的には、発光波長が400〜700nmであることが好ましい。
蛍光色素集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれてしまうことから、20〜200nm程度のものが好適である。
また、粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
（２）蛍光色素集積粒子
蛍光色素集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光色素がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光色素集積粒子としては、母体と蛍光色素とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
（２．１）母体
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
（２．３）蛍光色素集積粒子
蛍光色素集積粒子とは、蛍光色素が上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Alexa Fluor（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、BODIPY（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Cy（登録商標、GEヘルスケア社製）系色素分子、HiLyte（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、DyLight（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ATTO（登録商標、ATTO-TEC社製）系色素分子、MFP（登録商標、Mobitec社製）系色素分子、CF（登録商標、Biotium社製）系色素分子、DY（登録商標、DYOMICS社製）系色素分子、CAL（登録商標、BioSearch Technologies社製）系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（２．２）量子ドット集積粒子
本発明においては、蛍光色素集積粒子として量子ドット集積粒子を用いてもよい。
量子ドット集積粒子とは、量子ドットが上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（３）染色試薬（抗体−蛍光色素集積粒子の結合体）
染色試薬は、目的生体物質の１つに対して、蛍光色素集積粒子の１つが結合するように設計される。
免疫染色に用いる染色試薬（免疫染色剤）の場合は、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光色素集積粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光色素集積粒子が直結している複合体を用いることもできる。
免疫染色剤の一例として、［目的生体物質を抗原とする一次抗体］…［一次抗体を抗原とする抗体（二次抗体）］〜［蛍光色素集積粒子］が挙げられる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“〜”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
一次抗体としては、目的生体物質を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いる。例えば、HER2を目的生体物質とする場合は抗HER2抗体を、HER3を目的生体物質とする場合は抗HER3抗体を、それぞれ用いる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いる。
抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択する。
（４）組織切片の染色方法
以下、組織標本の染色方法の一例について、パラフィン包埋された組織切片（以下、単に「切片」ともいう。）を染色する場合を例にとって説明するが、本発明に係る組織標本は、組織切片、針生検により取得した標本、培養細胞、等から任意のものを用いて良い。
（４．１）標本作製工程
（４．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（４．１．２）賦活化処理
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mのクエン酸緩衝液（pH6.0）、1mMのEDTA溶液（pH8.0）、5%尿素、0.1Mのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
pH条件は用いる組織切片に応じてpH2.0〜13.0の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はpH6.0〜8.0で行うが、特殊な組織切片ではたとえばpH3.0でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではなく、温度は50〜130℃、時間は5〜30分で行うことができる。室温で行うこともできる。
次いで、PBSを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
（４．２）免疫染色工程
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光色素集積粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、BSA含有PBSなど公知のブロッキング剤やTween20などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
（４．３）標本後処理工程
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定及び脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
固定及び脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定及び脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
（４．４）形態観察染色工程
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態の観察を容易にするための形態観察染色を行ってもよい。形態観察染色工程は、公知の任意の方法に従って行うことができ、免疫染色工程の前又は後の何れに行ってもよい。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質、間質、各種線維、赤血球及び角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核、石灰部、軟骨組織、細菌及び粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
＜蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製＞
次に、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値算出に用いられる蛍光色素集積粒子散布プレパラートについて説明する。
以下、蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製工程を具体的に説明するが、本発明の蛍光色素集積粒子散布プレパラートは、上述した蛍光色素集積粒子が凝集しないように散布された顕微鏡観察用の標本であれば任意である。
［作製方法１］
（１）任意の平均粒子径（例えば150nm）の蛍光色素集積粒子を準備する。
（２）蛍光色素集積粒子をPBSで希釈して、濃度0.005nMの蛍光色素集積粒子液を作製する。
（３）スライドガラスを準備する。
（４）スライドガラス上に蛍光色素集積粒子液7.5uLを滴下して、滴下面積が直径5.0mmの円と同程度になるようにする。
（５）10分間静置する。
（６）純水を入れた300mLビーカーにスライドガラスを漬けて洗浄する。
（７）スライドガラスを染色かごに嵌め、流水で１０分間洗浄する。
（８）染色かごを水から上げ、脱水のためにエタノール相を３相、キシレン置換のためにキシレン相を3相通す。
（９）スライドガラスをキシレン系封入剤（マリノール）で封入する。
作製方法１では、例えば蛍光色素集積粒子液の濃度を変更することにより、蛍光色素集積粒子の密度を制御することが可能である。蛍光色素集積粒子散布プレパラートにおける粒子密度は、好ましくは106個／mm2以下である。
［作製方法２：蛍光色素集積粒子とは異なる溶解可能な粒子の散布により散布密度を制御する方法］
（１）任意の平均粒子径（例えば、150nm）の蛍光色素集積粒子を準備する。
（２）蛍光色素集積粒子をPBSで希釈して、濃度0.005nMの蛍光色素集積粒子液を作製する。
（３）200nm径のポリスチレン粒子（インビトロジェン社製）を準備する。
（４）ポリスチレン粒子をPBSで希釈して、濃度0.500nMのポリスチレン粒子液を作製する。
（５）スライドガラスを準備する。
（６）スライドガラス上にポリスチレン粒子液7.5uLを滴下して、滴下面積が直径5.0mmの円と同程度になるようにする。
（７）10分間静置する。
（８）純水を入れた300mLビーカーにスライドガラスを漬けて、スライドガラスから余剰のポリスチレン粒子液を除く。
（９）スライドガラスにポリスチレン粒子液と同じ場所に（２）で準備した蛍光色素集積粒子液を載せる。
（１０）10分間静置する。
（１１）純水を入れた300mLビーカーにスライドガラスを漬けて洗浄する。
（１２）スライドガラスを染色かごに嵌め、流水で１０分間洗浄する。
（１３）染色かごを水から上げ、脱水のためにエタノール相を３相、キシレン置換のためにキシレン相を3相通す。
（１４）スライドガラスをキシレン系封入剤（マリノール）で封入する。
作製方法２によれば、（１３）のキシレン置換後には、スライドガラスに直接付着した蛍光色素集積粒子のみがスライドガラス上に残る。（６）でポリスチレン粒子をスライドガラスに散布することにより、（９）の時点でスライドガラスが露出している領域は、狭く、かつ、低密度であるため、蛍光色素集積粒子が凝集せずに分散したプレパラートが得られる。
なお、作製方法２において、（２）及び（４）で蛍光色素集積粒子液及びポリスチレン粒子液を準備した後、これらの液を混合してスライドガラス上に滴下しても良い。混合液の滴下後は、上記（１０）〜（１４）の処理を行う。
作製方法２では、例えばポリスチレン粒子及び蛍光色素集積粒子液の濃度の比率を変更することにより、蛍光色素集積粒子の密度を制御することが可能である。
［作製方法３：パターニングされた溶解可能な樹脂の塗布により散布密度を制御する方法］
（１）スライドガラスを準備する。
（２）スライドガラスにキシレンで溶解する感光性樹脂を塗布する。
（３）感光性樹脂膜を露光し、穴径が200nm、ピッチが1000umのパターンを作製する。
（４）任意の平均粒子径（例えば、150nm）の蛍光色素集積粒子を準備する。
（５）蛍光色素集積粒子をPBSで希釈して、濃度0.005nMの蛍光色素集積粒子液を作製する。
（６）スライドガラス上の感光性樹脂塗布部分に、蛍光色素集積粒子液100uLを滴下して、滴下面積が100mm2程度となるようにする。
（７）10分間静置する。
（８）純水を入れた300mLビーカーにスライドガラスを漬けて洗浄する。
（９）スライドガラスを染色かごに嵌め、流水で１０分間洗浄する。
（１０）染色かごを水から上げ、脱水のためにエタノール相を３相、キシレン置換のためにキシレン相を3相通す。
（１１）スライドガラスをキシレン系封入剤（マリノール）で封入する。
作製方法３によれば、（１０）のキシレン置換後には、感光性樹脂が溶解してスライドガラスに直接付着した蛍光色素集積粒子のみがスライドガラス上に残る。これにより、蛍光色素集積粒子が凝集せずに分散したプレパラートが得られる。
作製方法３では、例えば、（３）で作製するパターンの穴径と蛍光色素集積粒子の平均粒径の比率を変更することにより蛍光色素集積粒子の密度を制御することが可能である。
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、上述した組織標本及び蛍光色素集積粒子を分散させたプレパラートを撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
まず、操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と、目的生体物質に結合する蛍光色素集積粒子を用いた染色試薬を用いて組織標本を染色する。さらに、組織標本の染色に用いた蛍光色素集積粒子と同様にして作製された蛍光色素集積粒子をスライドガラス上に散布させた蛍光色素集積粒子散布プレパラートを準備する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、組織標本の明視野画像及び蛍光画像（第１蛍光画像）、及び蛍光色素集積粒子を分散させたプレパラートの蛍光画像（第２蛍光画像）を取得して、各画像のデータを画像処理装置２Ａに送信する。
図３に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図３に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像が入力されると（ステップＳ１）、明視野画像から細胞核の領域が抽出された細胞核画像が作成される（ステップＳ２）。ステップＳ２では、公知の任意の方法を用いて抽出することとしてよく、また、細胞核に限らず任意の領域を関心領域（ROI）として抽出してよい。
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１蛍光画像が入力されると（ステップＳ３：（第１）入力工程）、制御部２１により、第１蛍光画像から所定の領域（以下、第１領域とする）を抽出した第１領域画像が作成される（ステップＳ４）。所定の領域は、任意の関心領域であり、例えば、輝点領域である。次いで、各第１領域の輝度値（第１輝度積算値）が算出される（ステップＳ５：第１輝度算出工程）。
ステップＳ４〜Ｓ５の処理は、公開解析ソフトImageJ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Count等、公知の任意の方法を用いて計測することができる。
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２蛍光画像(図４Ａ)が入力されると（ステップＳ６：第２入力工程）、制御部２１により、第２蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域（以下、第２領域とする）を抽出した第２輝点領域画像（図４Ｂ）が作成され（ステップＳ７）、第２領域の輝度積算値（第２輝度積算値）が算出される（ステップＳ８：第２輝度算出工程）。ステップＳ７〜Ｓ８の処理は、ステップＳ４〜Ｓ５と同様に、公知の任意の方法を用いて計測することができる。
次いで、第２輝度積算値の分布を示す図が作成される（ステップＳ９）。図５は、第２領域の輝度積算値を横軸、第２輝度積算値の頻度を縦軸とした輝度分布曲線の一例を示す。なお、ステップＳ９では、第２輝度積算値の頻度を示すヒストグラムを作成してもよい。
第２輝度積算値の分布に基づき、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値が算出される（ステップＳ１０：平均輝度算出工程）。具体的には、例えば、最頻値となる第２輝度積算値（輝度分布曲線のピークの輝度積算値Ｌ、図５参照）が平均輝度値として算出される。
算出される平均輝度値の精度を高める観点から、ステップＳ８（第２輝度算出工程）では１００００個以上の第２領域から第２輝度積算値が算出され、その分布に基づいて平均輝度値が算出されることが好ましい。
また、最頻値の算出においては、第２輝度積算値の分布に対してフィッティング又は補間を行い、フィッティング曲線または補間曲線のピークの輝度積算値を前記平均輝度値とすることが好ましい。本発明の第２輝度積算値の分布は、例えば、ガウス曲線、二次曲線、ポアソン分布、二項分布、等に好適にフィッティングさせることができる。
また、蛍光色素集積粒子を分散させたプレパラートにおいて蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されている場合は、第２領域の面積のばらつき（変動係数）が小さいと考えられることから、第２領域の面積に関する以下の式（１）が満たされることが好ましい。
式（１）： ０ ≦ Ｓσ／Ｓａｖｅ ＜ １．０
（式（１）中、Ｓσは第２領域の面積の標準偏差、Ｓａｖｅは第２領域の面積の平均値である。）
式（１）において、変動係数が１以上である場合、プレパラートにおいて凝集した蛍光色素集積粒子が多く存在している可能性が高い。
また、蛍光色素集積粒子の平均粒径から算出される面積と、第２領域の平均面積の比が所定の範囲内であれば、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されていると考えられることから、第２領域の面積に関する以下の式（２）が満たされることが好ましい。
式（２）： ０．１０ ＜ Ｓａｖｅ ／π（Ｒａｖｅ／2+Δ）2 ＜ １０．００
（式（２）中、Ｓａｖｅは第２領域の平均面積、Ｒａｖｅは蛍光色素集積粒子の平均粒径、Δは蛍光画像を撮像した機器の分解能である。）
式（２）において、比の値が１０以上である場合は、抽出された第２領域の平均面積が大きく、プレパラートにおいて凝集した蛍光色素集積粒子が多く存在している可能性が高い。
ステップＳ５とステップＳ１０の処理の終了後、第１輝度積算値及び蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、第１領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ１１：粒子数算出工程）。具体的には、例えば、第１輝度積算値を平均輝度値で割った値が蛍光色素集積粒子数である。
なお、ステップＳ６〜Ｓ１０の処理は、必ずしも、画像処理の都度行う必要はなく、以前に算出した平均輝度値のデータを使用してもよい。
ステップＳ２及びＳ１１の処理の終了後、細胞核画像と第１領域画像の加算処理が行われ（ステップＳ１２）、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される（ステップＳ１３）。
［平均輝度算出工程（ステップＳ１０）の変形例１］
図６Ａ及び図６Ｂは、平均粒径ＲＡの蛍光色素集積粒子Ａ、及び平均粒径ＲＢの蛍光色素集積粒子Ｂをそれぞれ散布した蛍光色素集積粒子散布プレパラートを用いて作成された輝度分布曲線を示す。ただし、ＲＡ＜ＲＢであり、蛍光色素集積粒子Ａ及びＢは、粒径以外の特徴は同一となるように作製されている。また、輝度分布曲線の作成条件も同一とする。
粒径以外の特徴が同一の蛍光色素集積粒子であれば、粒径が大きいほど蛍光色素の含有量が多いため、輝度値が高いと考えられる。つまり、蛍光物質集積粒子の１粒子当たりの平均輝度値、すなわち蛍光色素の量は、粒子の体積（粒径の３乗）に比例すると考えられる。
このことに基づき、平均輝度算出工程の変形例１では、蛍光色素集積粒子Ａ及びＢの平均粒径ＲＡ及びＲＢと、その平均輝度値ＬＡ及びＬＢ（図６Ａ及び図６Ｂ参照）の関係を示すルックアップテーブル又は補間曲線を作成して用いて、任意の平均粒径Ｒｘの蛍光色素集積粒子Ｘの平均輝度値Ｌｘを算出する。
なお、平均粒径が互いに異なる蛍光色素集積粒子が２種類である場合を例として説明したが、さらに多くの種類を用いることとすれば、より正確な平均輝度値を算出可能となる。
［平均輝度算出工程（ステップＳ１０）の変形例２］
図７Ａ〜図７Ｃは、発光波長のピークがそれぞれλＡ、λＢ及びλＣである蛍光色素集積粒子Ａ、Ｂ、及びＣの蛍光色素集積粒子散布プレパラートに基づいて作成された輝度分布曲線を示す。ただし、λＡ、λＢ及びλＣの値は互いに異なる。
平均輝度算出工程の変形例２では、蛍光色素集積粒子Ａ、Ｂ及びＣの発光波長λＡ、λＢ及びλＣと、その平均輝度値ＬＡ、ＬＢ及びＬＣ（図７Ａ〜図７Ｃ参照）の関係を示すルックアップテーブル又は補間曲線を作成して用いて、任意の波長λｘの蛍光色素集積粒子Ｘの平均輝度値Ｌｘを算出する。変形例２においては、平均輝度値ＬＡ、ＬＢ及びＬＣは、励起光のスペクトル及び強度、画像取得に用いるフィルタやカメラの特性、蛍光色素集積粒子に含まれる蛍光物質の種類及び量、等を考慮してキャリブレーションされた後、ルックアップテーブル又は補間曲線が作成されることが好ましい。
なお、蛍光波長が異なる蛍光色素集積粒子が３種類である場合を例として説明したが、２種類でも良いし、さらに多くの種類を用いることとすれば、より正確な平均輝度値を算出可能となる。
なお、上記キャリブレーション工程では、蛍光色素集積粒子の発光特性（例えば、輝度）が変化した場合に、１粒子当たりの平均輝度値をキャリブレーション可能であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の輝度値が変動は、例えば、励起光の強度や波長特性、画像取得に用いるフィルタやカメラの特性の継時的変化に起因して生じ得る。キャリブレーション工程では、例えば、発光特性が一定である標準サンプルの輝度値を測定して輝度値の変化の有無を調べ、変化があった場合には、変化量に応じてキャリブレーションを行う。
以上説明した本発明の実施形態によれば、蛍光色素集積粒子の１粒子当たりの平均輝度値に基づいて、蛍光画像からの輝点数ではなく粒子数算出が容易である。これにより、評価精度の向上が可能である。
また、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを用いているため、組織切片等で見られるような、蛍光色素集積粒子が凝集したクラスタを１つの粒子と換算してしまう可能性が低減される。また、ノイズ（細胞の自家蛍光等）が少ない画像を取得可能である。これにより、より正確な平均輝度値を算出可能である。
また、蛍光色素集積粒子散布プレパラートを用いることにより、視野全体において蛍光色素集積粒子が凝集せずに均一に散布された画像が得られる。これにより、組織標本に付着した蛍光色素集積粒子を利用する場合よりも容易に、十分なデータ数を取得可能である。
また、組織標本を撮影した蛍光画像においては、標本（細胞）の厚さと蛍光色素集積粒子の付着位置により、フォーカスが合っている蛍光色素集積粒子と合っていない蛍光色素集積粒子とが混在している。しかし、本発明の蛍光色素集積粒子散布プレパラートは、スライドガラスに蛍光色素集積粒子が直接付着しているため、フォーカスを合わせることが容易である。
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
その他、診断支援情報生成システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
以上のように、本発明は、組織標本における特定の生体物質の定量を、生体物質に結合させた蛍光色素集積粒子を用いて正確かつ簡易に実行可能な生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することに適している。
１Ａ 顕微鏡画像取得装置
２Ａ 画像処理装置
２１ 制御部
２２ 操作部
２３ 表示部
２４ 通信Ｉ／Ｆ
２５ 記憶部
２６ バス
３Ａ ケーブル
１００ 診断支援情報生成システム

Claims (17)

  1. 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量する生体物質定量方法において、
    前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力工程と、
    前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出工程と、
    前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程、
    を備え、
    前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出される
    ことを特徴とする生体物質定量方法。
  2. 前記プレパラートにおける前記蛍光色素集積粒子の密度は１０６個/mm２以下であることを特徴とする請求項１に記載の生体物質定量方法。
  3. 下記の式（１）を満たすことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体物質定量方法。
    式（１）： ０≦ Ｓσ／Ｓａｖｅ ＜１．０
    （式（１）中、Ｓσは輝点領域の面積の標準偏差、Ｓａｖｅは輝点領域の面積の平均値である。）
  4. 下記の式（２）を満たすことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
    式（２）： ０．１０＜ Ｓａｖｅ ／π（Ｒａｖｅ／２＋Δ）2 ＜１０．００
    （式（２）中、Ｓａｖｅは輝点領域の面積の平均値、Ｒａｖｅは蛍光色素集積粒子の平均粒径、Δは蛍光画像を撮像した機器の分解能である。）
  5. 前記平均輝度値は、１０，０００個以上の前記輝点領域毎の輝度値を用いて算出されることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  6. 前記蛍光色素集積粒子の平均粒径が２０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  7. 前記蛍光色素集積粒子の粒径の変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  8. 前記平均輝度値は、最頻値となる前記第２輝度積算値であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  9. 前記平均輝度値は、前記第２輝度積算値の分布に対してフィッティングもしくは補間を行って作成されたフィッティング曲線又は補間曲線における最大値の輝度値であることを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  10. 前記平均輝度値は、平均粒径が異なる複数種類の蛍光色素集積粒子による前記第２輝度積算値の分布から作成されたルックアップテーブル又は補間曲線を用いて算出される任意の粒径の蛍光色素集積粒子の平均輝度値であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  11. 前記平均輝度値は、発光波長が異なる複数種類の蛍光色素集積粒子による前記第２輝度積算値の分布から作成されたルックアップテーブル又は補間曲線を用いて、算出される任意の蛍光波長の平均輝度値であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  12. 前記蛍光色素集積粒子の発光特性が変化した場合に、前記１粒子当たりの平均輝度値をキャリブレーションするキャリブレーション工程を備えることを特徴とする請求項１〜１１の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  13. 前記蛍光色素集積粒子及び溶解可能な粒子をスライドガラス上に散布した後、前記粒子を溶解除去してプレパラートを作製するプレパラート作製工程を備える
    ことを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  14. 溶解可能な樹脂を用いてパターニングされたスライドガラスに前記蛍光色素集積粒子を散布した後、前記樹脂を溶解除去してプレパラートを作製するプレパラート作製工程を備える
    ことを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の生体物質定量方法。
  15. 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量する画像処理装置において、
    前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段と、
    前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
    前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
    を備え、
    前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出される
    ことを特徴とする画像処理装置。
  16. 特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された標本における、前記特定の生体物質を定量するコンピュータを、
    前記標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段、
    前記第１蛍光画像から所定の領域を抽出し、前記所定の領域の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段、
    前記第１輝度積算値及び前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、前記所定の領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
    として機能させるためのプログラムであって、
    前記平均輝度値は、蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第２蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域毎の輝度値を積算した第２輝度積算値の分布から算出されることを特徴とする、プログラム。
  17. 請求項１５に記載の画像処理装置と、
    前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像を取得する画像取得装置と、
    を備えることを特徴とする病理診断支援システム。
JP2018525979A 2016-07-05 2017-06-02 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム Active JP6911855B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016132975 2016-07-05
JP2016132975 2016-07-05
PCT/JP2017/020646 WO2018008309A1 (ja) 2016-07-05 2017-06-02 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2018008309A1 JPWO2018008309A1 (ja) 2019-04-25
JP6911855B2 true JP6911855B2 (ja) 2021-07-28

Family

ID=60912671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018525979A Active JP6911855B2 (ja) 2016-07-05 2017-06-02 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10656092B2 (ja)
EP (1) EP3483592B1 (ja)
JP (1) JP6911855B2 (ja)
WO (1) WO2018008309A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112424825A (zh) * 2018-05-15 2021-02-26 文塔纳医疗系统公司 染色聚集体中信号的定量
CN112469991A (zh) 2018-07-24 2021-03-09 索尼公司 信息处理装置、信息处理方法、信息处理系统以及程序
CN112805559B (zh) * 2018-11-20 2024-03-22 株式会社岛津制作所 成像数据解析装置
CN112666139B (zh) * 2020-12-11 2023-04-07 南阳理工学院 一种基于微观构造的古建筑木构件材质状况评估方法
CN113570583B (zh) * 2021-07-30 2024-06-07 北京市商汤科技开发有限公司 图像处理方法及装置、电子设备和存储介质
CN116990101B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 四川大学华西医院 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL126659A (en) * 1996-04-19 2003-05-29 Dow Global Technologies Inc Fluorescent chelates as visual tissue specific imaging agents
CN100354430C (zh) * 2001-09-06 2007-12-12 基因描绘系统有限公司 一种检测样品中靶细胞或病毒的方法
JP4634304B2 (ja) * 2003-10-10 2011-02-16 浜松ホトニクス株式会社 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム
US20110081664A1 (en) * 2008-10-17 2011-04-07 University Of Massachusetts Multipurpose microfluidic device for mimicking a microenvironment within a tumor
JP5393216B2 (ja) * 2009-03-24 2014-01-22 オリンパス株式会社 蛍光観察システムおよび蛍光観察システムの作動方法
WO2010115530A1 (de) * 2009-04-09 2010-10-14 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Vorrichtung und verfahren zum nachweis und zur quantitativen analyse von analyten insbesondere mykotoxinen
WO2011150023A1 (en) * 2010-05-25 2011-12-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Detection of damage to dna
US10809167B2 (en) * 2010-08-30 2020-10-20 Konica Minolta, Inc. Tissue staining method with staining agent containing particle holding plural phosphors
EP2618154B1 (en) * 2010-09-17 2016-12-14 Tohoku University Method for determining effectiveness of medicine containing antibody as component
JP5892238B2 (ja) 2012-03-30 2016-03-23 コニカミノルタ株式会社 医用画像処理装置及びプログラム
US10080484B2 (en) * 2014-01-31 2018-09-25 University Of Washington Multispectral wide-field endoscopic imaging of fluorescence
WO2015146938A1 (ja) * 2014-03-26 2015-10-01 コニカミノルタ株式会社 組織評価方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
JP6504160B2 (ja) * 2014-04-21 2019-04-24 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及び画像処理プログラム
US20150314019A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Clarkson University Functionalized ultrabright fluorescent silica particles
EP3171161A4 (en) * 2014-07-11 2017-12-13 Konica Minolta, Inc. Biological substance quantitative determination method, image processing device, pathological diagnosis support system, and program
WO2016129061A1 (ja) * 2015-02-10 2016-08-18 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018008309A1 (ja) 2019-04-25
EP3483592B1 (en) 2020-07-22
EP3483592A4 (en) 2019-06-12
US10656092B2 (en) 2020-05-19
EP3483592A1 (en) 2019-05-15
WO2018008309A1 (ja) 2018-01-11
US20190162667A1 (en) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6911855B2 (ja) 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
WO2016093090A1 (ja) 画像処理装置及び画像処理プログラム
JP6597316B2 (ja) 画像処理装置及びプログラム
WO2017126420A1 (ja) 画像処理装置及びプログラム
JP6960224B2 (ja) 生体物質定量方法、病理診断支援システム及びプログラム
US20210192721A1 (en) Image Processing Device, In-Focus Position Specifying Method, and In-Focus Position Specifying Program
JP6493398B2 (ja) 診断支援情報生成方法、画像処理装置、診断支援情報生成システム及び画像処理プログラム
JP2020173204A (ja) 画像処理システム、画像処理方法及びプログラム
JP2016223931A (ja) 蛍光画像の合焦システム、合焦方法および合焦プログラム
EP3327427A1 (en) Target biological substance analysis method and analysis system
JP7235036B2 (ja) 画像処理方法、画像処理装置及びプログラム
US11423533B2 (en) Image processing method and image processing system
JP7160047B2 (ja) 生体物質定量方法、画像処理装置及びプログラム
JP6578928B2 (ja) 蛍光画像の合焦位置特定システム、合焦位置特定方法および合焦位置特定プログラム
US11600020B2 (en) Biological substance quantification method, image processing device, pathological diagnosis support system, and recording medium storing computer readable program
WO2017110974A1 (ja) 画像処理装置及びプログラム
WO2020166469A1 (ja) 情報提供方法、情報提供装置及びプログラム
WO2021192910A1 (ja) 画像生成方法、画像生成装置及びプログラム
WO2020262117A1 (ja) 画像処理システム、画像処理方法及びプログラム
WO2021124866A1 (ja) 画像処理方法、画像処理システム及びプログラム
WO2020209217A1 (ja) 画像処理システム、画像処理方法及びプログラム
WO2021039592A1 (ja) 創薬支援方法、創薬支援装置及びプログラム

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200318

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201027

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201228

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210608

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210621

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6911855

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150