JP4634304B2 - 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム - Google Patents
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Description
図1は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。定量システム100は、光源10、蛍光顕微鏡20、マルチバンドカメラ30およびパーソナルコンピュータ40を有する。コンピュータ40には、ディスプレイ装置42およびプリンタ44が接続されている。定量システム100は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素の濃度を定量する。定量システム100は、3種類までの蛍光色素の濃度を定量できる。なお、本実施形態では、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が何であるかはあらかじめ分かっている。
図1に示されるように、本実施形態の蛍光色素定量システム200は、上記の定量システム100の構成に加えて分光器35を有している。分光器35は、蛍光顕微鏡20によって取得された蛍光像を受光できるように配置されている。蛍光顕微鏡20は、カメラ30と分光器35の双方に蛍光像を送るための光学素子、例えばハーフミラーを有していてもよい。あるいは、分光器35は、カメラ30との交換で設置されてもよい。
本実施形態は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が4種類以上のときの定量に関する。蛍光色素が4種類以上の場合、マルチバンドカメラの検出波長帯の数を蛍光色素の数に応じて増やしていけば、検出波長帯と同数までの蛍光色素を定量できる。実際、「NHK技研 R&D」(No.52、53〜60頁、1998年)に記載される光学系を使用すれば、4バンドのマルチカメラを得ることはできる。しかし、5バンドや6バンドのカメラを実現するための光学系を考案することは難しい。
本実施形態は、第3実施形態と同様に、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が4種類以上のときの定量に関する。第3実施形態では、マルチバンドカメラの感度モードを2種類用意し、それにより検出波長帯の数×2までの蛍光色素の定量を可能にする。これに対し、本実施形態では、異なる波長スペクトルを有する複数の種類の励起光を用いて試料を励起し、それにより検出波長帯の数×励起光の種類数までの蛍光色素の定量を可能にする。
本実施形態は、基礎データおよびターゲットデータの取得に使用する光学装置が上記実施形態と異なる。上記実施形態では、マルチバンドカメラまたは分光器を用いて基礎データを取得するが、本実施形態では、複数のバンドパスフィルタとモノクロカメラを用いて基礎データを取得する。また、上記実施形態ではマルチバンドカメラを用いてターゲットデータを取得するが、本実施形態では、複数のバンドパスフィルタとモノクロカメラを用いてターゲットデータを取得する。
本実施形態は、本発明を細胞の生理的活性の測定に応用する。すなわち、本実施形態ではターゲット試料が細胞である。細胞の生理的活性を測定するために、細胞がもつ受容体や酵素などの機能性分子を蛍光色素で標識し、蛍光色素の濃度を定量することにより、機能性分子の量や分布を測定することができる。同一の細胞内に存在する複数の種類の分子を同時に測定する場合は、それらの分子を励起波長および蛍光波長の異なる複数の蛍光色素で標識し、蛍光色にしたがって分子を識別する。
IRC:シェーディング情報が与えられた基準試料画像の輝度
IR:元の基準試料画像の輝度
IS:シェーディング画像の輝度
IS−MAX:シェーディング画像の輝度の最大値
ITC:シェーディングが補正されたターゲット試料画像の輝度
IT:元のターゲット試料画像の輝度
IS:シェーディング画像の輝度
IS−MAX:シェーディング画像の輝度の最大値
本実施形態は、本発明をFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の測定に応用する。FRETは、ある蛍光分子に対して与えられた励起エネルギーが別の蛍光分子に移動する現象である。励起エネルギーを与える蛍光分子はドナーと呼ばれ、励起エネルギーを受け取る蛍光分子はアクセプタと呼ばれる。ドナーおよびアクセプタは、分子に蛍光色素を与えることにより生成される。
以下では、幾つかの実施例を挙げて本発明を更に説明する。本発明者は、図1に示される定量システム100を使用し、第1実施形態の方法にしたがって蛍光色素の定量を行った。マルチバンドカメラ30としては、浜松ホトニクス社製3板式カラーカメラORCA−3CCD C7780を使用した。図9は、カメラ30の分光感度特性を示している。すでに述べたように、カメラ30はLaw LightモードとHigh Lightモードという2種類の感度モードを有している。図9における実線がLaw Lightモードにおける感度特性を示し、波線がHigh Lightモードにおける感度特性を示している。本実施例では、Low LightモードでのR、GおよびB値を定量計算に使用した。
本発明者は、カメラ30の代わりに分光器35を用いて基礎データおよびターゲットデータを取得することも行った。分光器35としては、浜松ホトニクス社製PMA−11(c7473、BTCCD 200−950nm)を用いた。分光器35を用いた基準試料からの蛍光の測定は、光源モードでs/n=18、Gain=Middle、波長間隔=1nmの条件下で行った。コンピュータ40は、分光器35によって取得された分光データに5point(5nm)のsmoothing処理を施した。
本発明者は、第5実施形態の方法にしたがって蛍光色素の濃度を定量することも行った。この実施例では、基準試料およびターゲット試料から発する蛍光の強度をバンドパスフィルタを通して測定した。3種類の蛍光色素の蛍光スペクトルに応じて三つのバンドパスフィルタを使用した。第1のバンドパスフィルタは、中心波長440nmとバンド幅21nmを有している。第2のバンドパスフィルタは、中心波長510nmとバンド幅23nmを有している。第3のバンドパスフィルタは、中心波長546nmとバンド幅10nmを有している。
本発明者は、上記実施例との比較のため、ターゲット試料から発する蛍光からバンドパスフィルタを用いて各色素の蛍光を抽出し、その蛍光をモノクロカメラで撮影した。使用したバンドパスフィルタは、第3実施例と同じである。モノクロカメラとしては、浜松ホトニクス社製モノクロデジタルカメラORCA−IIを使用した。蛍光画像の撮像は、露光30msec、Gain=Low、ビニング4*4の条件下で行った。
まず、図14および図15を参照しながら、蛍光スペクトルの重なりが少ないAlexa FluorおよびCascade Yellowの定量結果を説明する。図14は、第1および第2実施例で算出されたAlexa FluorおよびCascade Yellowの濃度を示している。図15は、第3実施例および比較例で算出されたAlexa FluorおよびCascade Yellowの濃度を示している。これらの図において、横軸は色素の混合比を示し、縦軸は色素の濃度を示している。濃度は各色素の単位濃度を1として表示されている。Alexa Fluorの単位濃度は2μM(マイクロモル)であり、Cascade Yellowの単位濃度は1μMである。
以下では、本発明の別の実施形態を説明する。図21は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。この定量システム800は、第1実施形態の定量システム100におけるマルチバンドカメラ30をマルチバンドカメラ30aに置き換えた構成を有している。本実施形態では、パーソナルコンピュータ40の代わりに、マルチバンドカメラ30a内に設けられた論理回路が上記(7)式の演算を実行する。
Claims (12)
- ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を、異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法であって、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度を取得することと、
前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出すること
を備える方法。
- 前記撮像装置は、前記第1〜第k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、前記マルチバンドカメラを用いて各前記基準試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像し、各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍光画像から取得し、
前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmの算出は、前記第i検出波長帯で撮像された前記第j基準試料の蛍光画像から取得された前記画素の値を前記行列Jの成分Jijとして使用する
請求項1に記載の方法。 - 前記撮像装置は、前記第1〜第k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、各前記基準試料から発する蛍光の分光強度を分光器を用いて測定し、前記分光強度と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での前記測定強度を算出する
請求項1に記載の方法。 - ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を撮像装置を用いて定量する方法であって、
前記撮像装置は、異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯と、前記撮像装置の異なる感度特性を設定する第1〜第q(qは2以上の整数)の感度モードとを有しており、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯および各前記感度モードでの測定強度を取得することと、
前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯および各前記感度モードで撮像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出すること
を備える方法。
- ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を、異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法であって、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料を用意し、異なる波長スペクトルを有し前記第1〜第m蛍光色素をすべて励起する第1〜第r(rは2以上の整数)の励起光の各々を前記第1〜第m基準試料に照射し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度を取得することと、
各前記励起光を前記ターゲット試料に照射し、前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出すること
を備える方法。
- 前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第1〜第k検出波長帯で撮像して第1〜第kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第1〜第kの画像信号が入力される演算回路と、を含んでおり、
前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmの算出は、前記演算回路が前記第1〜第kの画像信号を用いて前記演算を実行する処理を含んでおり、
前記演算回路に、前記ターゲット試料の複数の部位における前記濃度c1〜cmを算出させ、第1〜第mの蛍光色素の濃度分布を表す第1〜第mの画像信号を生成させることを更に備える請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、
異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出する演算装置と、
を備える蛍光色素濃度定量システム。
- 前記光検出器および前記撮像装置は、前記第1〜第k検出波長帯を有するマルチバンドカメラであり、
前記光検出器は、各前記検出波長帯にて各前記基準試料の蛍光画像を撮像し、各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍光画像から取得し、
前記演算装置は、前記第i検出波長帯で撮像された前記第j基準試料の蛍光画像から取得された前記画素の値を前記行列Jの成分Jijとして使用する
請求項7に記載の定量システム。 - 前記光検出器は、各前記基準試料から発する蛍光の分光強度を測定する分光器を含んでおり、
前記撮像装置は、前記第1〜第k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでおり、
前記演算装置は、前記分光強度と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での強度を算出し、算出された強度を前記行列Jの各成分として使用する
請求項7に記載の定量システム。 - ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料の各々から発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、
異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯と前記撮像装置の異なる感度特性を設定する第1〜第q(qは2以上の整数)の感度モードとを有し、前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯および各前記感度特性で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出する演算装置と、
を備える蛍光色素濃度定量システム。
- ターゲット試料中に含まれる第1〜第m(mは2以上6以下の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムであって、
異なる波長スペクトルを有し前記第1〜第m蛍光色素をすべて励起する第1〜第r(rは2以上の整数)の励起光を生成する光源と、
前記第1〜第m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第1〜第mの基準試料への各前記励起光の照射に応じて各前記基準試料から発する蛍光の強度を測定する光検出器と、
異なる第1〜第k(kは2以上6以下の整数)の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料への各前記励起光の照射に応じて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第1〜第m蛍光色素の濃度c1〜cmを算出する演算装置と、
を備える蛍光色素濃度定量システム。
- 前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第1〜第k検出波長帯で撮像して第1〜第kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第1〜第kの画像信号が入力される、前記演算装置としての演算回路と、を含んでおり、
前記演算回路は、前記第1〜第kの画像信号を用いて前記演算を実行し、前記ターゲット試料の複数の部位における前記濃度c1〜cmを算出して、第1〜第mの蛍光色素の濃度分布を表す第1〜第mの画像信号を生成する、請求項7〜11のいずれかに記載の定量システム。
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