DE102022201532A1

DE102022201532A1 - Verfahren zur Kalibrierung eines Analysesystems für Lab-on-Chip-Kartuschen

Info

Publication number: DE102022201532A1
Application number: DE102022201532.0A
Authority: DE
Inventors: Ingo Ramsteiner; Julia Heinz
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2023-08-17
Also published as: WO2023156414A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kalibrierung von Messkanälen eines Analysesystems für Lab-on-Chip-Kartuschen mittels einer Kalibrierkartusche. Es werden vorzugsweise folgende Schritte durchgeführt. Ein Befüllen einer Probenkammer (1, 2) der Kalibrierkartusche mit einer fluorophorfreien Lösung, ein Messen der Hintergrund-Fluoreszenzintensität für für jeden der Messkanäle, ein Pumpen der Lösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und zurück in die Probenkammer (1, 2), ein erneutes Messen der Hintergrund-Fluoreszenzintensität für für jeden Messkanäle, ein Mitteln der gemessenen Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten zu einer gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität, ein Befüllen der Probenkammer (1, 2) mit einer Farbstofflösung mit definierter Konzentration von mindestens einem Fluorophor, ein Messen der Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung für jeden der Messkanäle, ein Pumpen der Lösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und zurück in die Probenkammer (1, 2), ein erneutes Messen der Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung für jeden der Messkanäle, ein Mitteln der gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Farbstofflösung zu gemittelten Fluoreszenzintensitäten für jeden der Messkanäle und ein Berechnen der Kalibriermatrix aus der gemittelten Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung und, vorzugsweise unter Berücksichtigung einer bevorzugt gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität für für jeden der Messkanäle.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kalibrierung eines Analysesystems für Lab-on-Chip-Kartuschen mittels einer Kalibrierkartusche. Zudem betrifft die Erfindung ein Analysesystem mit einem elektronischen Steuergerät, welches eingerichtet ist, die Kalibrierung durchzuführen.
Stand der Technik
Für verschiedene Anwendungsbereiche kommen mikrofluidische Vorrichtungen, wie beispielsweise Mikrofluidikchips, zum Einsatz. Derartige, in der Regel aus Kunststoff ausgebildete, fluidische Vorrichtungen können beispielsweise für analytische, präparative oder diagnostische Anwendungen in der Medizin eingesetzt werden. Die mikrofluidischen Vorrichtungen können beispielsweise in Form eines sogenannten Lab-on-Chip-Systems verwendet werden, wobei die Funktionalitäten eines Labors gewissermaßen im Scheckkartenformat zusammengefasst werden. In der Regel bestehen derartige mikrofluidische Vorrichtungen aus strukturierten Kunststoffträgerplatten, die ein Kanalsystem, verschiedene Probenkammern und andere funktionale Elemente, wie z. B. Pumpen, integrieren. Derartige Systeme eignen sich in besonderer Weise für automatisierte Anwendungen, sodass sie beispielsweise für eine zeitnahe Diagnostik in Arztpraxen oder Krankenhäusern eingesetzt werden können.
Viele molekulardiagnostische Verfahren, wie z.B. die quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) beruhen auf der Messung der Fluoreszenz einer Probe. Die Probe wird dazu mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlängen innerhalb der Absorptionsbande eines in der Probe enthaltenen Farbstoffs liegen. Die fluoreszenzaktiven Farbstoffmoleküle absorbieren die Strahlung und strahlen ihrerseits Fluoreszenzlicht ab, dessen Wellenlängen durch die Emissionsbande des betreffenden Farbstoffs definiert sind. Solche fluoreszenzaktiven Farbstoffmoleküle werden als Fluorophore bezeichnet. Bei typischen Verfahren werden mehrere Fluorophore in derselben Probe parallel verwendet. Dabei wird Licht mit mehreren unterschiedlichen Wellenlängen mittels Multiplexing auf die Probe gestrahlt und über mehrere verschiedene Messkanäle ausgelesen.
Die intrinsische spektrale Breite der Absorptions- und Fluoreszenzbanden typischer Fluorophore ist dabei so groß, dass Überlappungen unvermeidlich sind. Das gilt insbesondere, wenn drei oder mehr Fluorophore kombiniert werden sollen. Dann ist es in der Regel nicht mehr möglich, die Anregungsbanden, also die Frequenzbereiche des eingestrahlten Lichts, so zu wählen, dass jeweils nur ein einziger Farbstoff angeregt wird. Zur selektiven Messung eines bestimmten Fluorophors wird daher ein bestimmtes Anregungsband mit einem bestimmten Nachweisband, also dem Frequenzbereich des Messkanals, kombiniert, um ein Übersprechen der Messkanäle zu unterbinden. Somit wird einerseits das Anregungslicht spektral auf ein bestimmtes Anregungsband eingeengt und andererseits bei der Messung Fluoreszenzlicht bei Wellenlängen außerhalb eines definierten Nachweisbandes verworfen, z.B. durch die Verwendung geeigneter Bandpassfilter.
Trotz dieses Verfahrens kommt es in der Praxis zu Übersprech-Effekten (spillover), bei denen sich ein Signalanstieg in dem einen Messkanal auf einen anderen Messkanal überträgt. Es ist bekannt, diesen Effekt mit einer linearen Kalibriermatrix zu korrigieren. Um die durch den Farbstoffe DYi (i gibt jeweils den Farbstoff aus einer Gesamtzahl Farbstoffe von N an) in dem jeweiligen Messkanal CHj (j gibt jeweils den Messkanal aus einer Gesamtzahl Messkanäle von N an - es werden also die gleiche Anzahl Messkanäle wie Farbstoffe verwendet) verursachten Fluoreszenzbeiträge x_DYj zu ermitteln, kann die nachfolgende Formel 1 verwendet werden: $(\begin{matrix} x_{D Y 1} \\ ⋮ \\ x_{D Y N} \end{matrix}) = (\begin{matrix} C_{D Y 1, C H 1} & \dots & C_{D Y 1, C H N} \\ ⋮ & ⋱ & ⋮ \\ C_{D Y N, C H 1} & \dots & C_{D Y N, C H N} \end{matrix}) \cdot (\begin{matrix} y_{C H 1} - b_{C H 1} \\ ⋮ \\ y_{C H N} - b_{C H N} \end{matrix})$
Dabei sind (x_DY1 ... x_DYN)^T die Fluoreszenzbeiträge für die jeweiligen Farbstoffe DY1 ... DYN, (y_CH1 ... y_CHN)^T die im jeweiligen Messkanal CH1 ... CHN gemessenen Fluoreszenzintensitäten, (b_CH1 ... b_CHN)^T die Hintergrund-Frequenzintensitäten in dem jeweiligen Messkanal CH1 ... CHN und die Matrix ist die Kalibriermatrix.
Die Kalibriermatrix wird durch Messungen an einer Referenzproben mit bekannter Konzentration von Fluorophoren erhalten. Hierfür wird zuerst eine Lösung verwendet, die der Referenzprobe möglichst ähnlich ist, selbst aber keine Fluorophore enthält. Nun wird eine Messung dieser fluorophorfreien Lösung mit allen Messkanälen durchgeführt und somit Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten erhalten. Anschließend werden Messungen an den Referenzproben mit verschiedenen Fluorophoren mit jeweils allen Messkanälen durchgeführt. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden mit den Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten korrigiert und in eine Farbstreumatrix eingetragen, wobei an sich bekannte Methoden der linearen Algebra verwendet werden, um die Matrix zu erzeugen. Das Übersprechen zeigt sich in den Nebendiagonalen der Farbstreumatrix. Die Kalibriermatrix wird als inverse Matrix der Farbstreumatrix berechnet. Somit stellen die Fluoreszenzbeiträge (x_DY1 ... x_DYN)^T das Verhältnis der Fluoreszenzstrahlung zur Referenzprobe, die bei der Kalibrierung benutzt wurde, dar. Ein Fluoreszenzbeitrag von 1 (x_DYi = 1) bedeutet also, dass der betreffende Farbstoff der untersuchten Probe genauso stark leuchtet wie in der Referenzprobe.
In der EP 1 080 364 B1 ist ein solches Kalibrierverfahren für ein Analysesystem für Lab-on-Chip-Kartuschen beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zur Kalibrierung eines Analysesystems, insbesondere zur Kalibrierung von Messkanälen des Analysesystems, für Lab-on-Chip-Kartuschen mittels einer Kalibrierkartusche offenbart. Das Analysesystem weist Mittel zur Betätigung funktionaler Elemente in der Kartusche, wie z. B. Pneumatikpumpen, und Messeinrichtungen auf. Es ist hier eine optische Messeinrichtungen zur Fluoreszenzmessung der Probe in der Kartusche vorgesehen, die zumindest eine Lichtquelle, mit der Licht in unterschiedlichen Frequenzbereichen auf eine Probe in der Kartusche gestrahlt werden kann, und ein Sensor, der Licht in einem vorbestimmten Frequenzbereich aufnimmt. Zur Selektion der Frequenzbereiche kann ein Bandpassfilter vorgesehen sein.
Die Kalibrierkartusche ist für das jeweilige Analysesystem ausgelegt. Dabei weist die Kalibrierkartusche mindestens eine Vorlagerungskammer und mindestens eine Probenkammer sowie funktionale Elemente, wie z. B. Pumpen, auf. Die Kalibrierkartusche ist so ausgebildet, dass sie einer Kartusche, die durch das Analysesystem analysiert werden soll, möglichst ähnlich ist. Insbesondere entspricht die zumindest eine Probenkammer in Design, Material und Position der zu analysierenden Kartusche. In der mindestens einen Vorlagerungskammer sind Lösungen mit definierten Konzentrationen von Fluorophoren, die als Kalibrierflüssigkeiten dienen, vorgesehen. Die Lösungen enthalten jeweils einen der relevanten Fluorophore in genau definierter Konzentration, wobei die chemische Zusammensetzung eines relevanten molekulardiagnostischen Assays so weit möglich übernommen bzw. imitiert wird. Dabei ist insbesondere vorteilhaft, dass die chemische Umgebung der Farbstoffmoleküle, also z.B. die Kopplung an Oligonukleotide, die lonenkonzentrationen in der Pufferlösung und Ähnliches, identisch sind. Dadurch werden Faktoren, die die Lage und Form von spektralen Absorptions- und Emissionsbanden der Farbstoffe beeinflussen, übernommen. Außerdem wird eine fluorophorfreie Lösung vorgehalten, also eine Flüssigkeit, die keine Fluorophore aufweist und die für eine Hintergrundmessung und zum Spülen der Probenkammer genutzt werden kann. Vorzugsweise gleicht diese fluorophorfreie Lösung zumindest in ihren optischen Eigenschaften (abgesehen von den spektralen Merkmale der Farbstoffe selbst) den Farbstofflösungen. Es kann beispielsweise die verwendete Pufferlösung ohne Fluorophore vorgesehen sein.
Es werden vorzugsweise folgende Schritte ausgeführt: Zu Beginn wird eine Probenkammer der Kalibrierkartusche mit der fluorophorfreien Lösung befüllt. Wie vorstehend beschrieben, ist die fluorophorfreien Lösung möglichst ähnlich zu den verwendeten Farbstofflösungen, ohne die Farbstoffe selbst zu enthalten, und kann beispielsweise die verwendete Pufferlösung sein. Dann wird eine Messung mittels der optischen Messeinrichtung über die zu kalibrierenden Messkanäle durchgeführt und dabei die Hintergrund-Fluoreszenzintensität gemessen. Bei den zu kalibrierenden Messkanäle kann es sich bevorzugt um alle Messkanäle des Analysesystems oder alternativ um ausgewählte Messkanäle handeln, welche kalibriert werden sollen. Anschließend wird die Lösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs gepumpt und dann zurück in die Probenkammer gepumpt. Im Anschluss wird eine erneute Messung mittels derselben optischen Messeinrichtung über die Messkanäle durchgeführt und dabei erneut die Hintergrund-Fluoreszenzintensität gemessen. Es kann nun optional vorgesehen sein, die Lösung erneut innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und dann zurück in die Probenkammer zu pumpen und eine erneute Messung durchzuführen. Diese beiden Schritte des Pumpens und des Messens können beliebig oft wiederholt werden. Die gemessenen Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten werden anschließend gemittelt. Hierbei können an sich bekannte Methoden zur Mittelung von Signalen verwendet werden. Es wird eine gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität über die Messkanäle erhalten. Dieser vorzugsweise erste Teil des Verfahrens dient somit vorteilhafterweise der Bestimmung der Hintergrund-Fluoreszenzintensität für die zu kalibrierenden Messkanäle. Statt einer solchen Bestimmung können für die Hintergrund-Fluoreszenzintensität insbesondere auch Werte für die Messkanäle angenommen und/oder festgelegt werden. Beispielsweise können die Werte auf 0 festgesetzt werden, insbesondere wenn die Hintergrund-Fluoreszenzintensität als vernachlässigbar angesehen wird. Ferner können bereits vorhandene und vorzugsweise bereits im Analysesystem hinterlegte Werte für die Hintergrund-Fluoreszenzintensität der zu kalibrierenden Messkanäle verwendet werden, beispielsweise Werte aus einer Werkskalibrierung. In weiterer Ausgestaltung kann das Analysesystem eingerichtet sein, Werte für die Hintergrund-Fluoreszenzintensität der zu kalibrierenden Messkanäle einzulesen, beispielsweise optisch über einen Barcode-/QR-Code oder über eine (drahtlose) elektronische Übertragung, beispielsweise über WLAN oder RFID.
Im zweiten Teil des Verfahrens wird die Probenkammer mit einer Farbstofflösung mit definierter Konzentration von mindestens einem Fluorophor befüllt. Insbesondere weist die Farbstofflösung nur einen Fluorophor mit genau definierter Konzentration auf. Dann wird eine Messung mittels der optischen Messeinrichtung über die Messkanäle durchgeführt und dabei die Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung gemessen. Erfindungsgemäß wird die Farbstofflösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs gepumpt und dann zurück in die Probenkammer gepumpt. Im Anschluss wird eine erneute Messung mittels derselben optischen Messeinrichtung über die Messkanäle durchgeführt und dabei erneut die Fluoreszenzintensität gemessen. Es kann nun optional vorgesehen sein, die Farbstofflösung erneut innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und dann zurück in die Probenkammer zu pumpen und eine erneute Messung durchzuführen. Diese beiden Schritte des Pumpens und des Messens können auch hier beliebig oft wiederholt werden. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Farbstofflösung werden anschließend gemittelt. Hierbei können an sich bekannte Methoden zur Mittelung von Signalen verwendet werden. Es wird eine gemittelte Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung über die Messkanäle erhalten.
Schließlich wird die Kalibiermatrix aus der gemittelten Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung für die Messkanäle berechnet, vorzugsweise unter Berücksichtigung der oben beschriebenen gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität und/oder alternativ unter Berücksichtigung von angenommenen und/oder im Analysesystem hinterlegten Werten für die Hintergrund-Fluoreszenzintensität der zu kalibrierenden Messkanäle wie oben ausgeführt.
In den Lösungen sind oftmals mikrofluidische Artefakte, wie z. B. Luftblasen oder Schwebeteilchen, enthalten. Diese haben einen Einfluss auf die bei der Kalibrierung durchgeführten Messungen, sodass die Kalibrierung verschlechtert wird. Das Pumpen der Lösung - sowohl der fluorophorfreien Lösung als auch der Farbstofflösung - innerhalb des mikrofluidischen Systems führt dazu, dass die mikrofluidischen Artefakte in der Lösung bewegt oder sogar entfernt werden. Wenn die Lösung dann in die Probenkammer zurückgepumpt wird, ändert sich die Position, die Größe und/oder die Zahl der mikrofluidischen Artefakte, sodass sie bei einer erneuten Messung einen anderen Effekt ausüben. Durch Mittelung der Messungen kann der Einfluss der mikrofluidischen Artefakte auf die jeweilige Messung und somit schließlich auch auf die Kalibrierung reduziert werden. Dies führt dazu, dass Fehler in der Kalibrierung reduziert werden und die Kalibrierung insgesamt verbessert wird. Es ist dabei ausreichend, die Lösungen beispielsweise in eine benachbarte Kammer zu pumpen, die zumindest in diesem Zeitabschnitt nicht befüllt ist.
Die Kalibriermatrix hängt von vielen unterschiedlichen Einflussfaktoren ab, die teilweise durch das Analysesystem, teilweise durch die Zusammensetzung des Assays und teilweise durch die Kartusche bestimmt werden. Typische Einflussfaktoren für das Analysesystem sind die Intensität und die spektrale Verteilung der Anregungsbänder, sowie die spektrale Empfindlichkeit der Nachweisbänder. Diese Parameter werden maßgeblich von den Eigenschaften der optischen Komponenten, also z. B. von Lichtquellen, Bandpass- und/oder Kantenfiltern, dichroitischen Spiegeln, Linsen, Gittern, Prismen usw., sowie von deren Justage bestimmt. Diese Eigenschaften der optischen Komponenten und die Justage unterliegen Herstellungstoleranzen und Alterungseffekten. Typische Einflussfaktoren des Assays sind die Lage der Anregungs- und Fluoreszenzspektren und die Quanteneffizienz der verwendeten Fluorophore. Diese Einflussfaktoren sind von der Auswahl der Fluorophore als auch von der chemischen Umgebung in dem Assay abhängig. Somit ist die Kalibrierung abhängig von dem jeweiligen Assay und insbesondere von der bestimmten Kombination von Farbstoffen darin. Die Einflussfaktoren der Kartusche beziehen sich auf das Probenvolumen und dessen Geometrie sowie das Design der Kartusche. Auch das Material, durch das das Licht in die Probenkammer der Kartusche eingebracht wird, ist zu berücksichtigen. Die durch die genannten Einflussfaktoren notwendigen Korrekturen lassen sich nicht in unabhängige Teile zerlegen. Die Kalibrierung wird somit vorteilhafterweise für jede Kombination aus dem Analysesystem (gekennzeichnet durch seine Hardware-Eigenschaften), der Assay-Familie (gekennzeichnet durch die optisch relevanten Farbstoffeigenschaften) und des Kartuschentyps (gekennzeichnet durch Material und Design) durchgeführt. Insbesondere kann die Kalibrierung für jede optische Messeinrichtung in dem Analysesystem separat durchgeführt werden. Zudem kann die Kalibrierung in vorgebbaren Zeitintervallen wiederholt werden, um Alterungseffekten auszugleichen.
Einige Lichtquellen ändern je nach Leistung ihre Charakteristik. Bei Analysesystemen, deren Lichtintensität regelbar ist, ist es vorzugsweise vorgesehen, die Kalibrierung bei verschiedenen Leistungsstufen durchzuführen und jeweils gesonderte Kalibriermatrizen zu erstellen.
Weiter ist bekannt, dass die Temperatur der Lösung die genaue Lage der Anregungs- und Emissionsbanden beeinflusst. Temperaturänderungen der Lösung - oftmals von über 50 K - sind intrinsischer Bestandteil der meisten molekulardiagnostischen Verfahren. Daher verfügen die Analysesysteme typischerweise über eine Temperaturregulierung. Es ist vorteilhaft, die Kalibrierungen bei verschiedenen Temperaturen durchzuführen, bei denen in der Analyse die Messungen vorgenommen werden. Handelt es sich hierbei um mehrere Temperaturen, die sich deutlich unterscheiden, werden bevorzugt mehrere Kalibriermatrizen ermittelt.
Das Analysesystem kann mehrere optische Messeinrichten aufweisen, welche unterschiedliche optische Pfade aufweisen und somit in separaten Probekammern der Kartusche messen. Vorzugsweise werden die Kalibriermatrizen individuell berechnet. Dabei werden vorteilhafterweise für beide Probenkammern dieselben Lösungen verwendet. Hierfür werden die Lösungen insbesondere nach jeder Messung in einer Probenkammer in die jeweils andere Probenkammer gepumpt und dort die Messung in gleicher Weise durchgeführt. Durch das Pumpen der Lösung von einer Probenkammer in die andere Probenkammer wird in vorteilhafter Weise das erfindungsgemäße Pumpen der Lösung in dem mikrofluidischen Kreislauf realisiert.
Um die Kalibriermatrix in besonders einfacher Weise berechnen zu können, ist es bevorzugt vorgesehen, mehrere unterschiedliche Farbstofflösungen mit jeweils einem Fluorophoren zu verwenden und die Messung der Fluoreszenzintensität mit diesen mehreren Farbstofflösungen durchzuführen. Die Fluorophore unterscheiden sich dabei in ihren Absorptions- und Emissionsbanden voneinander, wobei Überlappungen möglich sind. Dabei ist jedem Fluorophor abhängig von seinem Emissionsband ein Messkanal zugeordnet. Im Einzelnen werden hierfür die Schritte Befüllen, Messen, Pumpen, erneutes Messen und Mitteln für jede der mehreren Farbstofflösungen wiederholt. Die Anzahl der mehreren unterschiedlichen Farbstofflösungen, die verwendet werden, und somit die Anzahl der Wiederholungen der Schritte entspricht dabei der Anzahl von Messkanälen des Analysesystems. Somit ergeben sich die gleiche Anzahl ermittelter gemittelter Fluoreszenzintensitäten für die jeweilige Farbstofflösung und Messkanäle des Analysesystems. Für jede Farbstofflösung können separat von den gemittelten Fluoreszenzintensitäten die Hintergrund- Fluoreszenzintensitäten für jeden Messkanal abgezogen werden. Durch an sich bekannte Methoden der linearen Algebra kann daraus eine Farbstreumatrix für die mehreren Farbstofflösungen und die mehreren Messkanäle ermittelt werden. Da die Anzahl der Farbstofflösungen und der Messkanäle gleich ist, handelt es sich um eine quadratische Matrix. Durch Bilden der inversen Matrix der Farbstreumatrix wird die Kalibriermatrix berechnet.
Beim Befüllen der Probenkammer mit einer neuen Farbstofflösung kann die sich vorher in der Probenkammer befindliche Lösung - also entweder die fluorophorfreie Lösung oder, wie vorstehend beschrieben, eine andere Farbstofflösung - entweder durch die neue Farbstofflösung verdrängt werden oder durch einen Aktor aus der Probenkammer ausgepresst werden, woraufhin die neue Farbstofflösung in die Probenkammer eingeleitet wird.
Vorzugsweise wird, bevor die Probenkammer mit der neuen Farbstofflösung befüllt wird, die Probenkammer mit der fluorophorfreien Lösung gespült. Währenddessen wird die Fluoreszenzintensität gemessen. Der Spülvorgang wird vorzugsweise so lange ausgeführt, bis die gemessene Fluoreszenzintensität sich um weniger als ein Schwellenwert von der Hintergrund-Fluoreszenzintensität unterscheidet oder dieser entspricht. Dadurch wird sichergegangen, dass eine sich vorher in der Probenkammer befindliche Farbstofflösung insoweit entfernt wurde, dass diese keinen Einfluss mehr auf die Messungen der neuen Farbstofflösung im Zuge der Kalibrierung hat. Ist zuvor nur die fluorophorfreie Lösung in der Probekammer, wird auf den Spülvorgang verzichtet.
Das Befüllen der Probenkammer mit der neuen Farbstofflösung wird vorzugsweise mehrmals wiederholt. Optional kann eine Messung in dem der neuen Farbstofflösung zugeordneten Messkanal durchgeführt werden. Das Befüllen der Probenkammer wird vorzugsweise so lange wiederholt, bis die gemessene Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung nicht mehr ansteigt. In diesem Fall ist die Maximalkonzentration des Fluorophors in der Probenkammer erreicht.
Es kann vorgesehen sein, einen Funktionstest für die ermittelte Kalibriermatrix durchzuführen. Im Folgenden werden zwei Arten von Funktionstests beschrieben:

Bei der ersten Art wird eine Analyse derselben Farbstofflösung(en) ausgeführt, bei der die Verfahrensschritte Befüllen, Messen, Pumpen, erneutes Messen und Mitteln mit der neu berechneten Kalibriermatrix erneut durchgeführt werden. Zudem können die vorher genannten Maßnahmen, also das Spülen und/oder das Befüllen, bis die Maximalkonzentration erreicht ist, ebenfalls durchgeführt werden. Die zu Beginn gemessenen gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten werden von den mit der neuen Kalibriermatrix gemessenen gemittelten Fluoreszenzintensitäten der Farbstofflösung(en) abgezogen. Es wird geprüft, ob dieser Wert nur für den jeweils zugeordneten Messkanal einen Schwellenwert übersteigt. Ist dies der Fall, gilt der Funktionstest als bestanden und die neue Kalibriermatrix wird verwendet. Für den oben genannten Fall mit mehreren Farbstofflösungen, die jeweils einen Fluorophor aufweisen, der einem Messkanal zugeordnet ist, wird geprüft ob nur die Kombination aus der Farbstoffstofflösung mit dem Fluorophor und dem entsprechenden Messkanal die Fluoreszenzintensität den Schwellenwert übersteigt. Andernfalls wird die neue Kalibriermatrix verworfen und eine Fehlermeldung ausgegeben.

Bei der zweiten Art des Funktionstests wird eine Referenzprobe mit einer Mischung von Fluorophoren mit definierten Anteilen in einer Vorlagerungskammer der Kalibrierkartusche vorgelagert. Die Verfahrensschritte Befüllen, Messen, Pumpen, erneutes Messen und Mitteln werden erneut mit der der Referenzprobe anstelle der Farbstofflösung und mit der neu berechneten Kalibriermatrix durchgeführt. Zudem können die vorher genannten Maßnahmen, also das Spülen und/oder das Befüllen, bis die Maximalkonzentration erreicht ist, ebenfalls durchgeführt werden. Die zu Beginn gemessenen gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten werden von den mit der neuen Kalibriermatrix gemessenen gemittelten Fluoreszenzintensitäten der Referenzlösung abgezogen. Aus diesen Werten werden dann mittels der neuen Kalibriermatrix gemäß Formel 1 die Fluoreszenzbeiträge der Fluorophoren in der Referenzprobe berechnet, die den Anteilen der Fluorophoren in der Referenzprobe entsprechen. Es wird geprüft, ob die berechneten Anteile der Fluorophoren in der Referenzprobe von den tatsächlichen, definierten Anteilen der Fluorophoren in der Referenzprobe um höchstens einen Schwellenwert abweichen. Ist dies der Fall, gilt der Funktionstest als bestanden und die neue Kalibriermatrix wird verwendet. Andernfalls wird die neue Kalibriermatrix verworfen und eine Fehlermeldung ausgegeben. Bei der zweiten Art des Funktionstests werden zur Analyse die gemittelten Fluoreszenzintensitäten der Referenzprobe nur einmal ermittelt. Wiederholte Messungen mit unterschiedlichen Farbstofflösungen sind dabei nicht notwendig.
Es wird darüber hinaus ein Analysesystem für Lab-on-Chip-Kartuschen vorgeschlagen, welches ein elektronisches Steuergerät aufweist, welches eingerichtet ist, um mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens eine Kalibrierung des Analysesystems durchzuführen.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

1 zeigt eine schematische Darstellung zweier Probenkammern einer Kalibrierkartusche.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
3 zeigt die Probekammern aus 1 während verschiedener Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ausführungsbeispiele der Erfindung
In 1 sind zwei Probekammern 1, 2 einer ansonsten nicht weiter dargestellten Kalibrierkartusche gezeigt. Die Kalibrierkartusche wird mit dem unten beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kalibrierung eines ebenfalls nicht dargestellten Analysesystems, wie z. B. eines Vivalytic-Systems, verwendet. Die Kalibrierkartusche ähnelt in ihrem Aufbau einer herkömmlichen mikrofluidischen Kartusche für das Analysesystem und hält Kalibrierflüssigkeiten 3 in nicht gezeigten Vorlagerungskammern vor. Die Kalibrierflüssigkeiten 3 sind zum einen Farbstofflösungen DYi, die je einen Fluorophor in definierter Konzentration aufweisen und zum anderen eine fluorophorfreie Lösung, welche kein Fluorophor enthält - also beispielsweise eine Pufferlösung, die bei den vorstehend genannten Farbstofflösungen verwendet wird. Zudem kann die Kalibrierkartusche, wenn das Verfahren gemäß 2 c ausgeführt wird, eine Referenzprobe R mit einer Mischung mehrerer Fluorophore mit definierten Anteilen als Kalibrierflüssigkeit 3 in einer Vorlagerungskammer vorhalten. Jede Probenkammer 1, 2 wird durch eine separate optische Messeinrichtung des Analysesystems auf Fluoreszenz untersucht. Die optischen Messeinrichtungen weisen mehrere Messkanäle auf, die in unterschiedlichen Frequenzbereichen messen. Die Anzahl N der Messkanäle entspricht der Anzahl N der Fluorophore, die untersucht werden sollen, und somit auch der Anzahl N der unterschiedlichen Farbstofflösungen, die verwendet werden. Jeder Messkanal ist dabei einem Fluorophor zugeordnet. In 1 ist die erste Probenkammer 1 mit einer der obengenannten Kalibrierflüssigkeiten 3 gefüllt. In den mikrofluidischen Kartuschen kann es zu mikrofluidischen Artefakten in den Flüssigkeiten kommen, so auch in der Kalibrierkartusche, wie in 1 gezeigt in Form von Luftblasen 4 in der Kalibrierflüssigkeit 3 oder als Schwebeteilchen oder Ähnliches. Diese mikrofluidischen Artefakte können das Ergebnis der Kalibrierung verfälschen.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem beispielhaft alle Messkanäle kalibriert werden. In alternativen Ausgestaltung können auch nur ausgewählte Messkanäle entsprechend kalibriert werden. In 2 a ist die Berechnung einer Kalibriermatrix C gezeigt und in den 2 b und 2c ist jeweils ein Funktionstest für die berechnete Kalibriermatrix C gezeigt. Zu Beginn wird die erste Probenkammer 1 mit der fluorophorfreien Lösung befüllt 100. Anschließend wird eine erste Messung 110 der Fluoreszenzintensität der fluorophorfreien Lösung für alle Messkanäle CHj durchgeführt und dabei die Hintergrund-Fluoreszenzintensität gemessen. Dann erfolgt ein Pumpen 111 der fluorophorfreien Lösung in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 112 der Fluoreszenzintensität der fluorophorfreien Lösung für alle Messkanäle CHj durchgeführt und dabei ebenfalls die Hintergrund-Fluoreszenzintensität gemessen. Die Schritte Pumpen 111 und Messen 112 können beliebig oft wiederholt werden. Schließlich werden die gemessenen Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten gemittelt 115 und eine gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für alle Messkanäle CHj erhalten.
Die Probenkammer 1 wird nun mit der ersten Farbstofflösung DY1, welche einen ersten Fluorophor in definierter Konzentration aufweist, befüllt 120. Dabei wird entweder die fluorophorfreie Lösung durch die Farbstofflösung verdrängt oder die fluorophorfreie Lösung zuerst ausgepresst und dann die Farbstofflösung DY1 eingefüllt. Das Befüllen 120 wird so lange durchgeführt, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität in dem zu der Farbstofflösung gehörenden Messkanal CH1 nicht mehr ansteigt 121. Dann ist eine Maximalkonzentration des Fluorophors in der ersten Probenkammer 1 gegeben. Anschließend erfolgt eine erste Messung 130 der Fluoreszenzintensität für diese erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj. Dann erfolgt ein Pumpen 131 der ersten Farbstofflösung DY1 in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür ebenfalls auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 132 der Fluoreszenzintensität der ersten Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj durchgeführt. Die Schritte Pumpen 131 und Messen 132 können beliebig oft wiederholt werden. Schließlich werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für die erste Farbstofflösung DY1 gemittelt 135 und eine gemittelte Fluoreszenzintensität y_CHj,DY1,m für die erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj erhalten. Von dieser gemittelten Fluoreszenzintensität y_CHj,DY1,m für die erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj wird die gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für alle Messkanäle CHj subtrahiert 136 und das Ergebnis als Eintrag S_CHj,DY1 gespeichert.
Die nachfolgend beschriebenen Schritte 140 bis 166 werden für jede Farbstofflösung DYi wiederholt. Aus Gründen der Kürze und der Übersicht, wird dies nachfolgend nur für die Farbstofflösung DYN beschrieben.
Es wird die alte Farbstofflösung aus der ersten Probenkammer 1 gespült 140. Hierfür wird die fluorophorfreien Lösung, also beispielsweise die Pufferlösung verwendet. Das Spülen 140 wird so lange durchgeführt, bis sich eine gemessene Fluoreszenzintensität für einen oder mehrere Messkanäle CH1...CHN um weniger als ein Schwellenwert ε₀ von der gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für den oder die Messkanäle unterscheidet 141. Die Probenkammer 1 wird nun mit einer n-ten Farbstofflösung DYN, analog zu oben Beschriebenem, befüllt 150, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität in dem zu der Farbstofflösung gehörenden Messkanal CHN nicht mehr ansteigt 151.
Anschließend erfolgt eine erste Messung 160 der Fluoreszenzintensität für diese n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj. Dann erfolgt ein Pumpen 161 der n-ten Farbstofflösung DYN in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür ebenfalls auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 162 der Fluoreszenzintensität der n-ten Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj durchgeführt. Die Schritte Pumpen 161 und Messen 162 können beliebig oft wiederholt werden. Schließlich werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für die n-te Farbstofflösung DYN gemittelt 135 und eine gemittelte Fluoreszenzintensität y_CHj,DYN,m für die n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj erhalten. Von dieser gemittelten Fluoreszenzintensität y_CHj,DYN,m für die n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj wird die gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für alle Messkanäle CHj subtrahiert 166 und das Ergebnis als Eintrag S_CHj,DYN gespeichert.
Aus den Einträgen S_CHj,DY1 ... S_CHj,DYN für alle Farbstofflösungen DYi und alle Messkanäle CHj (Bei den Messungen 130, 132, 160, 162 wurde stets über alle Messkanäle CHj gemessen) wird mittels an sich bekannter Methoden der linearen Algebra eine Farbstreumatrix S mit folgender Form berechnet 170: $\underline{\underline{S}} = (\begin{matrix} S_{C H 1, D Y 1} & \dots & S_{C H 1, D Y N} \\ ⋮ & ⋱ & ⋮ \\ S_{C H N, D Y 1} & \dots & S_{C H N, C Y N} \end{matrix})$
Die Farbstreumatrix
wird invertiert 180, um die Kalibriermatrix
mit folgender Form zu erhalten: $\underline{\underline{C}} = (\begin{matrix} C_{D Y 1, C H 1} & \dots & C_{D Y 1, C H N} \\ ⋮ & ⋱ & ⋮ \\ C_{D Y N, C H 1} & \dots & C_{D Y N, C H N} \end{matrix})$
In 2 b ist ein erster Funktionstest für die Kalibriermatrix C gezeigt. Die erste Probenkammer 1 wird mit der fluorophorfreien Lösung gespült 200, bis sich eine gemessene Fluoreszenzintensität für einen oder mehrere Messkanäle CH1...CHN um weniger als ein Schwellenwert ε₀ von der in 2 a ermittelten gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für den oder die Messkanäle unterscheidet 201.
Die Probenkammer 1 wird nun mit der obengenannten ersten Farbstofflösung DY1, wie oben beschrieben, befüllt 210, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität in dem zu der Farbstofflösung gehörenden Messkanal CH1 nicht mehr ansteigt 211. Anschließend erfolgt eine erste Messung 220 der Fluoreszenzintensität für diese erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj mit der neu berechneten Kalibriermatrix C. Dann erfolgt ein Pumpen 221 der ersten Farbstofflösung DY1 in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür ebenfalls auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 222 der Fluoreszenzintensität der ersten Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj mit der neu berechneten Kalibriermatrix C durchgeführt. Die Schritte Pumpen 221 und Messen 222 können beliebig oft wiederholt werden, vorzugsweise genauso oft wie das Pumpen 131 und das Messen 132 in 2 a. Schließlich werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für die erste Farbstofflösung DY1 gemittelt 225 und eine gemittelte Fluoreszenzintensität y*_CHj,DY1,m für die erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C erhalten. Von dieser gemittelten Fluoreszenzintensität y_CHj,DY1,m für die erste Farbstofflösung DY1 für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C wird die gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m, welche zu Beginn in 2 a ermittelt wurde, für alle Messkanäle CHj subtrahiert 226 und das Ergebnis als Eintrag S*_CHj,DY1 gespeichert.
Analog zu 2 a werden die nachfolgend beschriebenen Schritte 230 bis 256 für jede Farbstofflösung DYi wiederholt und nachfolgend nur für die Farbstofflösung DYN beschrieben.
Es wird die alte Farbstofflösung, mittels der fluorophorfreien Lösung aus der ersten Probenkammer 1 gespült 230, bis sich eine gemessene Fluoreszenzintensität für einen oder mehrere Messkanäle CH1...CHN um weniger als ein Schwellenwert ε₀ von der gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für den oder die Messkanäle unterscheidet. Die Probenkammer 1 wird nun mit einer n-ten Farbstofflösung DYN, analog zu oben Beschriebenem, befüllt 240, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität in dem zu der Farbstofflösung gehörenden Messkanal CHN nicht mehr ansteigt 241. Anschließend erfolgt eine erste Messung 250 der Fluoreszenzintensität für diese n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj mit der neuen Kalibriermatrix C. Dann erfolgt ein Pumpen 251 der n-ten Farbstofflösung DYN in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür ebenfalls auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 252 der Fluoreszenzintensität der n-ten Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj mit der neu berechneten Kalibriermatrix C durchgeführt. Die Schritte Pumpen 251 und Messen 252 können beliebig oft wiederholt werden, vorzugsweise genauso oft wie das Pumpen 161 und das Messen 162 in 2 a. Schließlich werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für die n-te Farbstofflösung DYN gemittelt 255 und eine gemittelte Fluoreszenzintensität y*_CHj,DYN,m für die n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C erhalten. Von dieser gemittelten Fluoreszenzintensität y*_CHj,DYN,m für die n-te Farbstofflösung DYN für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C wird die gemittelte Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für alle Messkanäle CHj subtrahiert 256 und das Ergebnis als Eintrag S*_CHj,DYN gespeichert.
Nun wird geprüft, ob bei den Einträgen S*_CHj,DYi nur die Elemente S*_CH1,DY1 ... S*_CHN,DYN, die für eine entsprechende Kombination der Farbstofflösung DYi und dem zugeordneten Messkanal CHj stehen, einen Schwellenwert ε₁ übersteigen und die anderen Elemente den Schwellenwert ε₁ nicht übersteigen. Die Schwellenwert ε₁ kann auch Null sein. Mit anderen Worten wird geprüft, ob bei einer Farbstreumatrix aus den neu gemessenen Einträgen - diese muss hier allerdings nicht berechnet werden - lediglich die Elemente der Hauptdiagonalen größer als der Schwellenwert ε₁ (im Idealfall größer 0) sind und die Elemente der Nebendiagonalen kleiner oder gleich dem Schwellenwert ε₁ (im Idealfall gleich 0) sind. In erstgenanntem Fall ist der Funktionstest bestanden 261 und die neu berechnete Kalibriermatrix C wird verwendet. Im letztgenannten Fall wird die Kalibriermatrix C verworfen 262 und eine Fehlermeldung ausgegeben.
In 2 c ist ein zweiter Funktionstest für die Kalibriermatrix C gezeigt. Die erste Probenkammer 1 wird mit der fluorophorfreien Lösung gespült 300, bis sich eine gemessene Fluoreszenzintensität für einen oder mehrere Messkanäle CH1...CHN um weniger als ein Schwellenwert ε₀ von der in 2 a ermittelten gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_Chj,m für den oder die Messkanäle unterscheidet 301.
Die Probenkammer wird nun mit einer Referenzprobe R befüllt 310, welche eine Lösung mit einer Mischung von Fluorophoren mit definierten Anteilen x_i ist. Dabei wird entweder die fluorophorfreie Lösung durch die Referenzprobe R verdrängt oder die fluorophorfreie Lösung zuerst ausgepresst und dann die Referenzprobe R eingefüllt. Das Befüllen 310 wird so lange durchgeführt, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität in einem Messkanal, der zu einem Fluorophor in der Referenzprobe R zugeordnet ist, nicht ansteigt 311. Dann ist eine Maximalkonzentration des Fluorophors in der ersten Probenkammer 1 gegeben. Es können hierbei auch mehrere Messkanäle gleichzeitig verwendet werden, um mehrere Fluorophore der Referenzprobe zu testen. Anschließend erfolgt eine erste Messung 320 der Fluoreszenzintensität für die Referenzprobe R für alle Messkanäle CHj mit der neu berechneten Kalibriermatrix C. Dann erfolgt ein Pumpen 321 der Referenzprobe R in die zweite Probenkammer 2 und anschließend zurück in die erste Probenkammer 1. Es wird hierfür ebenfalls auf 3 und die zugehörige Beschreibung verwiesen. Daraufhin wird eine zweite Messung 322 der Fluoreszenzintensität der Referenzprobe R für alle Messkanäle CHj mit der neu berechneten Kalibriermatrix C durchgeführt. Die Schritte Pumpen 321 und Messen 322 können beliebig oft wiederholt werden, vorzugsweise genauso oft wie das Pumpen 131 und das Messen 132 und/oder das Pumpen 161 und das Messen 162 in 2 a. Schließlich werden die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für Referenzprobe R gemittelt 135 und eine gemittelte Fluoreszenzintensität y*_CHj,R,m für die Referenzprobe R für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C erhalten.
Aus der gemittelte Fluoreszenzintensität y*_CHj,R,m für die Referenzprobe R für alle Messkanäle CHj für die neu berechnete Kalibriermatrix C, der in 2 a ermittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität b_CHj,m und der neu berechneten Kalibriermatrix C wird gemäß Formel 1 die Fluoreszenzbeiträge x_DYi der Fluorophore in der Referenzprobe R berechnet 330. Die Fluoreszenzbeiträge x_DYi sind direkt abhängig von den Anteilen x_i der Fluorophore in der Referenzprobe R und können somit als berechnete Anteile Fluorophore in der Referenzprobe R interpretiert werden. Es wird geprüft 340, ob die berechneten Anteile der Fluorophoren, die den Fluoreszenzbeiträgen x_DYi entsprechen, und die tatsächlichen Anteile x_i der Fluorophoren um höchstens einen Schwellenwert ε₂ voneinander abweichen. Der Schwellenwert ε₂ kann eine Konstante sein oder auch zu null gewählt werden, sodass der berechneten Anteile der Fluorophoren den tatsächlichen Anteilen x_i der Fluorophoren entsprechen. Alternativ kann der Schwellenwert ε₂ auch eine prozentuale Abweichung vom Absolutbetrag der Anteile x_i der Fluorophore oder eine prozentuale Abweichung vom Absolutbetrag der Fluoreszenzbeiträge x_DYi sein pder in sonstiger Abhängigkeit von den Fluoreszenzbeiträgen x_DYi und/oder von den Anteilen x_i der Fluorophore gewählt werden. In erstgenanntem Fall ist der Funktionstest bestanden 261 und die neu berechnete Kalibriermatrix C wird verwendet. Im letztgenannten Fall wird die Kalibriermatrix C verworfen 262 und eine Fehlermeldung ausgegeben.
In 3 wird das Pumpen 111, 131, 161; 221, 251 oder 321 gemäß dem Verfahren aus 2 anhand der Probekammern 1, 2 der Kalibrierkartusche aus 1 näher erläutert. Zu Beginn, in 3 a befindet sich die Kalibrierflüssigkeit 3, also entweder die fluorophorfreie Lösung oder eine der Farbstofflösungen DYi oder für den Fall, dass das Pumpen 321 ausgeführt wird, die Referenzprobe R, in der ersten Probenkammer 1. Von dort wird die Kalibrierflüssigkeit 3, wie in 3 b gezeigt, in die zweite Probenkammer 2 gepumpt. Durch das Pumpen bewegen sich die Luftblasen 4 innerhalb der Kalibrierflüssigkeit 3. Nachdem die Kalibrierflüssigkeit 3 in 3 c wieder in die erste Probenkammer 1 zurückgepumpt wurde, befinden sich die Luftblasen 4 nun an einer anderen Stelle in der Probenkammer 1. Nun kann die Kalibrierflüssigkeit 3 nach der Messung 130, 132, 160, 162; 220, 222, 250, 252; 320, 322 wieder in die zweite Probekammer 2 gepumpt werden. Dies kann beliebig oft wiederholt werden. Dadurch haben sie einen andere Einfluss auf die Messung als an der Stelle in 3 a. Durch die Mittelung 115, 135, 165; 225, 255; 325 wird der Einfluss der Luftblasen und anderer mikrofluidischer Artefakte reduziert werden.
Die beiden Probekammern 1 und 2 werden von unterschiedlichen optischen Messeinrichtungen untersucht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kalibrierung wird für beide optischen Messeinrichtungen durchgeführt. Das Pumpen der Kalibrierflüssigkeit 3 in die zweite Probenkammer 2 ist gleichzeitig das Befüllen der zweiten Probenkammer 2 mit der gleichen Kalibrierflüssigkeit 3 wie der ersten Kammer. Es kann nun also das erfinderische Verfahren für die zweite Probenkammer ausgeführt werden. Die Messungen 130, 132, 160, 162; 220, 222, 250, 252; 320, 322 in den Probenkammern 1, 2 werden also während des Pumpens 111, 131, 161; 221, 251; 321 abwechselnd durchgeführt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1080364 B1 [0008]

Claims

Verfahren zur Kalibrierung von Messkanälen eines Analysesystems für Lab-on-Chip-Kartuschen mittels einer Kalibrierkartusche, gekennzeichnet durch folgende Schritte: vi) Befüllen (120) der Probenkammer (1, 2) mit einer Farbstofflösung (DY1, DYN) mit definierter Konzentration von mindestens einem Fluorophor; vii) Messen (130, 160) der Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung (DY1, DYN) für jeden der Messkanäle; viii) Pumpen (131, 161) der Lösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und zurück in die Probenkammer (1, 2); ix) Erneutes Messen (132, 162) der Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung (DY1, DYN) für jeden der Messkanäle; x) Mitteln (135, 165) der gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Farbstofflösung zu gemittelten Fluoreszenzintensitäten (y_CHj,DY1,m, y_CHj,DYN,m) für jeden der Messkanäle; xi) Berechnen (180) der Kalibriermatrix (C) aus der gemittelten Fluoreszenzintensität (y_CHi,DY1,m, y_CHj,DYN,m) der Farbstofflösung (DY1, DYN), vorzugsweise unter Berücksichtigung einer bevorzugt gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität (b_CHj,m), für jeden der Messkanäle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren vor dem Schritt vi) folgende Schritte umfasst: i) Befüllen (100) einer Probenkammer (1, 2) der Kalibrierkartusche mit einer fluorophorfreien Lösung; ii) Messen (110) der Hintergrund-Fluoreszenzintensität für jeden der Messkanäle; iii) Pumpen (111) der Lösung innerhalb des mikrofluidischen Kreislaufs und zurück in die Probenkammer (1, 2); iv) Erneutes Messen (112) der Hintergrund-Fluoreszenzintensität für jeden der Messkanäle; v) Mitteln (115) der gemessenen Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten zu einer gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensität (b_CHj,m) für jeden der Messkanäle.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für unterschiedliche optische Messeinrichtungen des Analysesystems, welche separate Probekammern (1, 2) untersuchen, die Kalibriermatrizen (C) individuell berechnet (180) werden, wobei dieselben Lösungen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte vi) bis x) für mehrere unterschiedliche Farbstofflösungen (DY1, DYN) mit jeweils einem Fluorophor wiederholt werden, wobei die Anzahl (N) der unterschiedlichen Farbstofflösungen (DY1, DYN) der Anzahl (N) der Messkanäle des Analysesystems entspricht.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach jeder Wiederholung vor dem Schritt vi) die Probenkammer (1, 2) so lange mit einer fluorophorfreien Lösung gespült (140) wird, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität sich um weniger als einen Schwellenwert (ε₀) von der Hintergrund-Fluoreszenzintensität unterscheidet (141).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt vi) so lange wiederholt wird, bis die gemessene Fluoreszenzintensität der Farbstofflösung nicht mehr ansteigt (121, 151).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass für einen Funktionstest die Schritte vi) bis x) mit der neu berechneten Kalibriermatrix (C) erneut durchgeführt werden und, wenn die mit der neuen Kalibriermatrix (C) gemessenen gemittelten Fluoreszenzintensitäten (y*_CH1,DY1, y*_CHN,DYN) der Farbstofflösung (DY1, DYN) abzüglich der gemessenen gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten (b_CHj.m) nur für den jeweils zugeordneten Messkanal einen Schwellenwert (ε₁) übersteigt, der Funktionstest als bestanden (261) gilt und die neue Kalibriermatrix (C) verwendet wird, und andernfalls die neue Kalibriermatrix (C) verworfen (262) wird und eine Fehlermeldung ausgegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass für einen Funktionstest eine Referenzprobe (R) mit einer Mischung von Fluorophoren mit definierten Anteilen (x_i) in einer Vorlagerungskammer vorgelagert wird, die Schritte vi) bis x) mit der Referenzprobe (R) anstelle der Farbstofflösung (DY1, DYN) und mit der neu berechneten Kalibriermatrix
erneut durchgeführt werden, die Anteile (x_DYi) der Fluorophoren in der Referenzprobe (R) aus den mit der neuen Kalibriermatrix
gemessenen gemittelten Fluoreszenzintensitäten (y*_CHj,R,m) abzüglich der der gemessenen gemittelten Hintergrund-Fluoreszenzintensitäten (b_CHj,m) berechnet (330) werden und, wenn die berechneten Anteile (x_DYi) der Fluorophoren in der Referenzprobe (R) von den tatsächlichen Anteilen (x_i) der Fluorophoren in der Referenzprobe (R) um höchstens einen Schwellenwert (ε₂) abweichen, der Funktionstest als bestanden (341) gilt und die neue Kalibriermatrix
verwendet wird, und andernfalls die neue Kalibriermatrix
verworfen (342) wird und eine Fehlermeldung ausgegeben wird.
Analysesystem für Lab-on-Chip-Kartuschen mit einem elektronischen Steuergerät, welches eingerichtet ist, um mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eine Kalibrierung durchzuführen.