DE4239016C2 - Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs - Google Patents

Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bzw. des Patentanspruchs 7, wie aus EP 0 339 582 A2 bekannt.
Bei der quantitativen Bestimmung von Konzentrationen freier Ionen, wie etwa Calciumionen, die in einer lebenden Zelle vorhanden sind, werden Fluoreszenzindikatorfarbstoffe wie etwa Fura-2 oder Indo-1 verwendet. Die Syntheseverfahren und Eigenschaften dieser Farbstoffe sind in "The Journal of Biological Chemistry, Band 260, Nr. 6, Seiten 3440-3450 (1988)" und "Biophysical Journal, Band 54, Seiten 1089-1104 (1988)" beschrieben. Diese Indikatorfarbstoffe haben die Eigenschaft, daß sie an bestimmte Ionen binden und von diesen dissoziieren, so daß sie verschiedene Fluoreszenzeigenschaften haben. Dank dieser Eigenschaft wird ein Indikatorfarbstoff in die Zelle eingebracht und die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch einen Anregungsstrahl erzeugt wird, wird gemessen, wodurch eine Ionenkonzentration in der Zelle bestimmt werden kann.
Die Messung, die auf Anregungsstrahlen mit nur einer Wellenlänge und der Fluoreszenzstrahlung bei nur einer Wellenlänge beruht, kann keine exakt gemessenen Werte ergeben, wenn die Verteilung eines Indikatorfarbstoffs in der Zelle uneinheitlich ist. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, daß Änderungen einer Fluoreszenzintensität, wie etwa die Abschwächung der Fluoreszenzstrahlung, die von einer Ionenkonzentration unabhängig ist, mitgemessen werden.
Um einen solchen Nachteil auszugleichen, wird ein Verfahren verwendet, in welchem ein Fluoreszenzindikatorfarbstoff, der einen isosbestischen Punkt hat, benutzt wird, um Fluoreszenzintensitäten zu messen, die Anregungsstrahlen bei zwei verschiedenen Wellenlängen entsprechen oder in dem die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung von zwei Wellenlängen, die einem Anregungsstrahl bei einer Wellenlänge entsprechen, jeweils gemessen und ihre Verhältnisse angegeben werden.
Die eingangs genannte EP 0 339 582 A2 beschreibt ein Fluoreszenzmikroskop zum Messen analytischer Eigenschaften einer Probe, wie beispielsweise der Calciumionenkonzentration in einer lebenden Zelle, ausgehend von entweder dem Fluoreszenzspektrum oder dem Anregungsspektrum eines in die Probe eingebrachten Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, wobei das System u. a. eine Filtereinheit zum Filtern der von der Lichtquelle emittierten Anregungsstrahlung umfaßt, die aus mehreren Interferenzfiltern aufgebaut ist, welche die Anregungsstrahlung jeweils einer verschiedenen Wellenlänge passieren lassen. Mit diesem Fluoreszenzmikroskop kann die Konzentration von Calciumionen in einer Probe dadurch gemessen werden, daß eine einen Fluoreszenzindikatorfarbstoff enthaltende Probe Anregungsstrahlen zweier verschiedener Wellenlängen ausgesetzt wird und das Intensitätsverhältnis der beiden vom Fluoreszenzindikatorfarbstoff emittierten Fluoreszenzstrahlungen bestimmt wird.
EP 0 175 352 A2 offenbart ein Verfahren und eine Anordnung zur schnellen Bestimmung der Parameter eines Probenmediums. Licht definierter Wellenlänge wird auf eine lumineszierende Schicht gelenkt, die mit dem Probenmedium in Kontakt kommt und deren Lumineszenzeigenschaften von dem zu bestimmenden Parameter abhängen. Das Lumineszenzlicht wird über Detektoren bestimmt, deren Signale ein Maß für den Parameter sind. Um auch beim Vorliegen mehrerer die Lumineszenzeigenschaften beeinflussender Parameter eine zuverlässige Bestimmung eines Parameters mit extrem kurzer Einstellzeit zu ermöglichen, ist vorgesehen, die Lumineszenzintensität für die Anzahl der Parameter entsprechende unterschiedliche Wellenlängenbereiche zu bestimmen, wobei die Parameter die Lumineszenzeigenschaften in mindestens einem Wellenlängenbereich unterschiedlich beeinflussen. Die erhaltenen Signale werden einer Signalbearbeitungseinrichtung zugeführt, die daraus die Größe des zu messenden Parameters bestimmt.
DD 2 42 869 A1 beschreibt eine optische 4-Kanal-Mehrfachmeßeinrichtung zum gleichzeitigen Bestimmen der Differenz zwischen Fluoreszenzsignalen und den Reflexionssignalen des Anregungslichtes. Durch die Bildung von Differenzen und Quotienten aus jeweils zwei Meßkanälen können sowohl korrigierte Fluoreszenz- als auch Absorptionssignale und damit aussagekräftige Meßgrößen von biologischen Materialien erhalten werden.
US 4 900 934 offenbart ein Gerät zum Messen mehrerer Wellenlängen von Fluoreszenzstrahlung, die von mit einem Fluoreszenzfarbstoff behandelten Zellen, Gewebepräparationen oder Lösungen emittiert wird. Das Gerät kann zum Bestimmen der Calciumionenkonzentration innerhalb von Zellen verwendet werden.
Ähnliche Geräte werden auch in DE 25 08 637 A1 und in "Cell Calcium, 6, Seiten 145-157 (1985)" beschrieben.
Die Fig. 1A und 1B zeigen Beispiele von Anregungsspektren und Emissionsspektren eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, der in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet wird. Die Fig. 1A zeigt die Anregungsspektren von Fura-2 zum Bestimmen der Konzentration von Calciumionen in Proben, wobei die Zahlen oberhalb der Kurven, welche die Spektren abbilden, die Calciumkonzentrationen in den Proben angeben. Wie gezeigt, hat Fura-2 die Eigenschaft, daß es an Calciumionen in einer Zelle bindet, wodurch die Fluoreszenzintensität durch einen Anregungsstrahl bei 340 nm Wellenlänge erhöht und umgekehrt seine Fluoreszenzintensität durch einen Anregungsstrahl bei 380 nm Wellenlänge herabgesetzt wird. Eine andere Eigenschaft von Fura-2 ist, daß die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch einen Anregungsstrahl bei 360 nm Wellenlänge erzeugt wird, unabhängig von den Konzentrationen der Calciumionen ist. Im Falle, in dem Fura-2 verwendet wird, wird eine Calciumionenkonzentration angegeben auf der Basis eines Fluoreszenzintensitätsverhältnisses zwischen z. B. 340 nm und 380 nm, oder 340 nm und 360 nm und auf Grundlage einer zuvor hergestellten Kalibrierkurve. Die Kalibrierkurve zum Umwandeln eines Wertes eines Fluoreszenzintensitätsverhältnisses in einen absoluten Konzentrationswert kann erhalten werden durch Herstellen einer Probe, die Calciumionen einer bekannten Konzentration enthält, Einbringen eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs in diese und Messen eines Fluoreszenzintensitätsverhältnisses.
In Fig. 1B sind Fluoreszenzspektren von Indo-1 dargestellt und die Figur zeigt Spektren bei jeweiligen Wellenlängen der Fluoreszenzstrahlung, die erzeugt wird, wenn die Zelle mit einem Anregungsstrahl von 355 nm Wellenlänge bestrahlt wird. In der Nähe einer Fluoreszenzwellenlänge von 440 nm hat Indo-1, wie auch Fura-2 einen isosbestischen Punkt. Demgemäß kann in der gleichen Weise, wie im oben beschriebenen Fall, unter Verwendung von Fura-2, eine Calciumionenkonzentration in der Zelle auf der Basis eines Fluoreszenzintensitätsverhältnisses zwischen zwei Wellenlängen der Fluoreszenzstrahlung, die durch die Bestrahlung mit einem Anregungsstrahl mit einer Wellenlänge erzeugt wird, angegeben werden.
Meßvorrichtungen zur Verwendung in den oben beschriebenen Meßverfahren unter Verwendung von Fluoreszenzindikatorfarbstoffen sind Spectrofluorimeter, Mikrophotometer, welche Fluoreszenzmikroskope und Photomultiplier kombinieren oder Bildanalysatoren, die Fluoreszenzmikroskope und Fernsehkameras kombinieren.
Die oben beschriebenen Verfahren sind ausführlich beschrieben von "A. Miyakawa et al., Bunseki Kagaku, Band 38, Nr. 11, Seiten 643-649 (1989)", und "A. Miyakawa, Photomedicine and Photobiology, Band 13, Seiten 15-18 (1991)".
In dem oben beschriebenen Zwei-Wellenlängen- Fluoreszenzmeßverfahren kann ein Fehler, der von einer inhomogenen Konzentration eines Indikatorfarbstoffs, welcher in eine Zeile eingebracht wurde, herrührt, durch Berechnen eines Fluoreszenzintensitätsverhältnisses korrigiert werden.
Das oben beschriebene Verfahren kann in einem Fall verwendet werden, daß ein Indikatorfarbstoff nur mit bestimmten Ionen reagiert, aber es wird berücksichtigt, daß in einer Zelle der Indikatorfarbstoff auch an Protein oder Membrankomponenten bindet, die darin in hohen Konzentrationen vorhanden sind. Demgemäß ändern sich die Fluoreszenzspektren des Indikatorfarbstoffs und eine Chelatbildungskonstante davon mit Ionen in ungünstiger Weise. Dann besteht ein Problem eines Zwei- Wellenlängen-Fluoreszenzmeßverfahrens darin, daß ein Fehler, der von solchen Wechselwirkungen zwischen dem Farbstoff und Komponenten, die von Ionen verschieden sind herrührt, nicht korrigiert werden kann und eine genaue Ionenkonzentration nicht angegeben werden kann.
Aufgabe dieser Erfindung ist, ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle bereitzustellen, welches erfolgreich das oben beschriebene Problem löst.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß bei einem Verfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bzw. 7 durch die in dem jeweiligen kennzeichnenden Teil angegebenen Merkmale.
Substanzen, die Fluoreszenz in einer Zelle, in die ein Fluoreszenzindikatorfarbstoff eingebracht worden ist, durch einen Anregungsstrahl erzeugen, sind der Indikatorfarbstoff, Komplexe des Indikatorfarbstoffs und die zu messenden freien Ionen (im folgenden Ionen genannt), Komplexe des Indikatorfarbstoffs und verschiedener Proteine (im folgenden Protein genannt), und Komplexe des Indikatorfarbstoffs, der Ionen und des Proteins. Diese fluoreszierenden Substanzen sind in der Zelle in einem chemischen Gleichgewichtszustand mit den Ionen und dem Protein vorhanden. Das heißt, unter den in der Zelle vorhandenen Substanzen sind sechs Arten von Substanzen an der Fluoreszenzmessung beteiligt. Bei der Fluoreszenzmessung sind die Konzentrationen dieser Substanzen unbekannte Werte. Um diese sechs unbekannten Werte zu bestimmen, ist es nötig, sechs Beziehungsgleichungen zu erhalten, die voneinander unabhängig sind.
Drei dieser sechs Beziehungsgleichungen können auf der Basis der folgenden chemischen Gleichgewichtsbedingungen angegeben werden.
KFI = XF · XI/XFI
KPF = XP · XF/XPF
KPFI = XP · XFI/XPFI
(oder KPFI = XPF · XI/XPFI)
worin
XF die Konzentration eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs,
XI die Konzentration der freien Ionen,
XP die Konzentration von Protein,
XFI die Konzentration von Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
XPF die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff- Komplexen,
XPFI die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
KFI die Gleichgewichtskonstante zwischen Fluoreszenzindikatorfarbstoff und freien Ionen,
KPF die Gleichgewichtskonstante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff,
KPFI die Gleichgewichtskontante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen
ist.
Die verbleibenden drei Beziehungsgleichungen können wie folgt durch Messen der Fluoreszenzintensitäten, welche den Anregungsstrahlen von drei verschiedenen Wellenlängen entsprechen oder der Intensitäten der Fluoreszenz bei drei Wellenlängen, die einem Anregungsstrahl bei einer Wellenlänge entspricht, erhalten werden.
Iλ 1 = Iλ 1,F · XF + Iλ 1,PF · XPF + Iλ 1,FI · XFI + Iλ 1,PFI · XPFI
Ig 2 = Iλ 2,F · XF + Iλ 2,PF · XPF + Iλ 2,FI · XFI + Ig 2,PFI · XPFI
Iλ 3 = Iλ 3,F · XF + Iλ 3,PF · XPF + Iλ 3,FI · XFI + Iλ 3,PFI · XPFI
worin
Iλ i die gemessene Fluoreszenzintensität für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,F der Fluoreszenzintensitätskoeffizient des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PF der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff-Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,FI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Ig i,PFI ein Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
i 1, 2, 3, oder
Iλ i die gemessene Fluoreszenzintensität für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,F der Fluoreszenzintensitätskoeffizient des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PF der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,FI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PFI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
i 1, 2, 3
ist.
Wie oben beschrieben werden sechs unabhängige Beziehungsgleichungen für die sechs unbekannten Werte erhalten, wodurch eine Konzentration von freien Ionen in der Zelle angegeben werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 2 werden erfindungsgemäß freie Ca2+-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Fura-2 bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 3 werden erfindungsgemäß freie Na⁺-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Natrium-bindendes Benzofuranisophthalat bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 4 werden erfindungsgemäß freie H⁺-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs 2′,7′-bis-(2-Carboxyethyl)-(5-(und -6)- carboxyfluorescein) bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 5 werden erfindungsgemäß freie H⁺-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Carboxyseminaphthorhodafluor-6 bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 6 werden erfindungsgemäß freie Mg2+-Ionen unter der Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Mag-Fura-2 bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 8 werden erfindungsgemäß freie Ca2+-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Indo-1 bestimmt.
In einer weiteren Ausführungsform gemäß Anspruch 9 werden erfindungsgemäß freie Na⁺-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs FCryp-2 bestimmt.
In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen gemäß den Ansprüchen 10 bis 13 werden erfindungsgemäß freie H⁺-Ionen unter der Verwendung der Fluoreszenzindikatorfarbstoffe Carboxyseminaphthorhodafluor-1, Carboxyseminaphthorhodafluor2, Carboxyseminaphthorhodafluor-6 oder Carboxyseminaphthorhodafluor-X bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 14 werden erfindungsgemäß freie Mg2+-Ionen unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs Mag-Indo-1 bestimmt.
Fig. 1A ist eine graphische Darstellung, die die Beziehungen zwischen den Konzentrationen von Calciumionen in einer Lösung, der Anregungswellenlänge und den Intensitäten der erzeugten Fluoreszenzstrahlung zeigt.
Fig. 1B ist eine graphische Darstellung, die die Beziehungen zwischen der Konzentration von Calciumionen in einer Lösung, den Emissionswellenlängen und den Fluoreszenzintensitäten zeigt.
Fig. 2 ist eine Ansicht, die Wechselwirkungen von Substanzen in einer Zelle mit in diese eingebrachtem Furan-2 zeigt.
Beispiele dieser Erfindung werden nachfolgend anhand von Fällen erklärt, in denen das Verfahren zum Messen der Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge entsprechend Anregungsstrahlen von drei Wellenlängen verwendet wird.
Um Proben herzustellen wurde Fura-2 als Indikatorfarbstoff verwendet, und Fura-2 wurde mittels eines bekannten Verfahrens in eine Zelle eingebracht.
Fig. 2 zeigt ein Schema, das die Wechselwirkungen zwischen Fura-2 und Calciumionen (Ca2+) oder Protein in der Zelle annähernd darstellt. Fig. 2 betrifft einen Fall der Messung von Ca2+ unter Verwendung von Fura-2, aber die gleiche Näherung kann für einen Fall der Messung von Ca2+ unter Verwendung anderer Indikatorfarbstoffe, z. B. Indo-1, gemacht werden. In der Zelle bindet Fura-2 mit einer Gleichgewichtskonstante K(FC) an Ca2+ und mit einer Gleichgewichtskonstante K(PF) auch an Protein. Außerdem gehen die drei Komponenten Fura-2, Ca2+ und Protein mit einer Gleichgewichtskonstante K(PFC) oder K′(PFC) miteinander eine Bindung ein. Demgemäß gelten die folgenden Gleichungen (1) bis (4) für diese drei bindenden Komponenten:
K(FC) = [F] [C]/[FC] (1)
K(PF) = [P] [F]/[PF] (2)
K(PFC) = [P] [FC]/[PFC] (3)
K′(PFC) = [PF] [C]/[PFC] (4)
In den oben beschriebenen Gleichungen bedeutet F Fura-2; C, Ca2+; P, Protein und [  ], eine Konzentration einer Komponente.
Die oben beschriebene Probe wurde mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt, und die Spektren der erzeugten Fluoreszenzstrahlung wurden gemessen. Die Anregungsstrahlung hat drei Wellenlängen von 340 nm, 360 nm und 380 nm. In der Zelle waren 4 Komponenten vorhanden, nämlich freies Fura-2, Fura-2-Calciumionen-Komplexe, Fura-2-Protein-Komplexe und Fura-2-Calciumionen-Protein-Komplexe. Eine Intensität der Fluoreszenzstrahlung entsprechend jeder Wellenlänge ist die Summe der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der jeweiligen Komponenten. Demgemäß gelten die folgenden Gleichungen (5) bis (7):
I₃₄₀ = [F]I(F)₃₄₀ + [PF]I(PF)₃₄₀ + [FC]I(FC)₃₄₀ + [PFC]I(PFC)₃₄₀ (5)
I₃₆₀ = [F]I(F)₃₆₀ + [PF]I(PF)₃₆₀ + [FC]I(FC)₃₆₀ + [PFC]I(PFC)₃₆₀ (6)
I₃₈₀ = [F]I(F)₃₈₀ + [PF]I(PF)₃₈₀ + [FC]I(FC)₃₈₀ + [PFC]I(PFC)₃₈₀ (7)
In diesen Gleichungen sind bekannte Werte die Gleichgewichtskonstante K(FC) zwischen Fura-2 und Ca2+, die Gleichgewichtskonstante K(PF) zwischen Fura-2 und Protein, die Gleichgewichtskonstante K(PFC) zwischen Fura-2-Calciumionen-Komplexen und Protein, die Gleichgewichtskonstante K′(PFC) zwischen Fura- 2-Protein-Komplexen und Calciumionen, die Fluoreszenzintensitäten I(F) von freiem Fura-2 bei 340 nm, 360 nm und 380 nm Wellenlänge der Anregungsstrahlung, die Fluoreszenzintensität I(FC) von Fura-2-Calciumionen-Komplexen, die Fluoreszenzintensität I(PF) von Fura-2-Protein-Komplexen und die Fluoreszenzintensität I(PFC) von Fura-2-Calciumionen-Protein- Komplexen.
So kann die Konzentration von freien Ca2+-Ionen in der Zelle angegeben werden durch Messen der Intensitäten I₃₄₀, I₃₆₀, I₃₈₀ in einer Zelle mit darin eingebrachtem Fura-2 bei 340 nm, 360 nm und 380 nm Wellenlängen der Anregungsstrahlung. Zusätzlich zu Konzentrationen von gesamtem Fura-2, das in eine Zelle eingebracht wurde, können Calciumionen und Protein, die mit dem Fluoreszenzindikatorfarbstoff wechselwirken, bestimmt werden.
In dem oben beschriebenen Meßverfahren wurde Fura-2 als Fluoreszenzindikatorfarbstoff verwendet, aber andere Indikatorfarbstoffe, z. B. Indo-1, können verwendet werden. Im Falle, in dem Indo-1 verwendet wird, ist es aufgrund seiner Fluoreszenzeigenschaften vorzuziehen, die Intensitäten der Fluoreszenz bei drei Wellenlängen entsprechend einer anregenden Strahlung einer Wellenlänge zu messen. In diesem Fall wird eine Zelle, die in der gleichen Weise wie bei der Messung einer Intensität der Fluoreszenz einer Wellenlänge entsprechend einer Anregungsstrahlung von drei Wellenlängen präpariert wurde, mit einer Strahlung einer Wellenlänge (355 nm), welche am meisten Indo-1 anregt, bestrahlt und die Intensitäten der erzeugten Fluoreszenz bei drei Wellenlängen werden gemessen. Anschließend werden die gleichen Meßschritte wie bei der Messung der Fluoreszenz bei einer Wellenlänge entsprechend einer anregenden Strahlung von einer Wellenlänge befolgt und eine Gleichgewichtsreaktionsgleichung und eine Beziehungsgleichung zwischen den Konzentrationen der jeweiligen Komponenten und den Fluoreszenzintensitäten werden als simultane Gleichungen verwendet, wodurch unbekannte Konzentrationen der Komponenten in der Zelle genau bestimmt werden können.

Claims (15)

1. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, bei welchem der Fluoreszenzindikatorfarbstoff in die Zelle eingebracht wird und die Konzentration der freien Ionen in der Zelle auf der Basis der gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlen der Zelle mit einer Anregungsstrahlung mit mehreren Wellenlängen erzeugt wird, bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß die Anregungsstrahlung drei verschiedene Wellenlängen aufweist und die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch die Anregungsstrahlung erzeugt wird, entsprechend den jeweiligen drei verschiedenen Wellenlängen bei einer Wellenlänge erfaßt wird, und
daß die simultanen Gleichungen für die Gleichgewichtskonstanten des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, des Proteins, der freien Ionen und ihrer Komplexe in der Zelle und die Beziehungsgleichungen zwischen den Intensitäten der Fluoreszenz, die durch die Anregungsstrahlung der jeweiligen Wellenlänge erzeugt wird und den Konzentrationen des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, des Proteins, der freien Ionen und ihrer Komplexe, KFI = XF · XI/XFI
KPF = XP · XF/XPF
KPFI = XP · XFI/XPFI
(oder KPFI = XPF · XI/XPFI)
Iλ 1 = Iλ 1,F · XF + Iλ 1,PF · XPF + Iλ 1,FI · XFI + Iλ 1,PFI · XPFI
Iλ 2 = Iλ 2,F · XF + Ig 2,PF · XPF + Iλ 2,FI · XFI + Iλ 2,PFI · XPFI
Iλ 3 = Iλ 3,F · XF + Iλ 3,PF · XPF + Iλ 3,FI · XFI + Ig 3,PFI · XPFIgelöst werden, wobei in den Gleichungen
XF die Konzentration des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs,
XI die Konzentration der freien Ionen,
XP die Konzentration von Protein,
XFI die Konzentration von Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
XPF die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff- Komplexen,
XPFI die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
KFI die Gleichgewichtskonstante zwischen Fluoreszenzindikatorfarbstoff und freien Ionen,
KPF die Gleichgewichtskonstante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff,
KPFI die Gleichgewichtskonstante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionenkomplexen,
Iλ i die gemessene Fluoreszenzintensität für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,F der Fluoreszenzintensitätskoeffizient des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PF der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,FI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Fluoreszenzindikatorfarbstoff- freien Ionen-Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PFI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen für die Anregungsstrahlung der Wellenlänge λi,
i 1, 2, 3,
ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für Ca2+ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Fura-2 ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für Na⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Natrium- bindendes Benzofuranisophthalat ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff 2′,7′-bis- (2-Carboxyethyl)-(5-(und -6)-carboxyfluorescein) ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Carboxyseminaphthorhodafluor-6 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für Mg2+ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Mag- Fura-2 ist.
7. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von freien Ionen innerhalb einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, bei welchem der Fluoreszenzindikatorfarbstoff in die Zelle eingebracht wird und die Konzentration der freien Ionen in der Zelle auf der Basis der gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung bei mehreren Wellenlängen, die durch Bestrahlen der Zelle mit der Anregungsstrahluung erzeugt wird, bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß
die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge aufweist, die Intensität der Fluoreszenzstrahlung bei drei Wellenlängen, die von der Anregungsstrahlung erzeugt werden, erfaßt wird, und
daß die simultanen Gleichungen für die Gleichgewichtskonstanten des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, des Proteins, der freien Ionen und ihrer Komplexe in der Zelle und die Beziehungsgleichungen zwischen den Intensitäten der Fluoreszenz bei den drei Wellenlängen, die durch die Anregungsstrahlung erzeugt wird, und den Konzentrationen des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs, des Proteins, der freien Ionen und ihrer Komplexe, KFI = XF · XI/XFI
KPF = XP · XF/XPF
KPFI = XP · XFI/XPFI
(oder KPFI = XPF · XI/XPFI)
Iλ 1 = Iλ 1,F · XF + Iλ 1,PF · XPF + Iλ 1,FI · XFI + Iλ 1,PFI · XPFI
Iλ 2 = Ig 2,F · XF + Iλ 2,PF · XPF + Iλ 2,FI · XFI + Iλ 2,PFI · XPFI
Iλ 3 = Iλ 3,F · XF + Iλ 3,PF · XPF + Iλ 3,FI · XFI + Iλ 3,PFI · XPFIgelöst werden, wobei in den Gleichungen
XF die Konzentration des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs,
XI die Konzentration der freien Ionen,
XP die Konzentration von Protein,
XFI die Konzentration von Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
XPF die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff- Komplexen,
XPFI die Konzentration von Protein-Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen-Komplexen,
KFI die Gleichgewichtskonstante zwischen Fluoreszenzindikatorfarbstoff und freien Ionen,
KPF die Gleichgewichtskonstante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff,
KPFI die Gleichgewichtskontante zwischen Protein und Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionenkomplexen,
Iλ i die gemessene Fluoreszenzintensität für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Ig i,F der Fluoreszenzintensitätskoeffizient des Fluoreszenzindikatorfarbstoffs für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PF der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,FI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Fluoreszenzindikatorfarbstoff- freien Ionen-Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
Iλ i,PFI der Fluoreszenzintensitätskoeffizient von Protein- Fluoreszenzindikatorfarbstoff-freien Ionen- Komplexen für die Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge λi,
i 1, 2, 3
ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Ca2+ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Indo-1 ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Na⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff FCryp-2 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Carboxyseminaphthorhodafluor-1 ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Carboxyseminaphthorhodafluor-2 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Carboxyseminaphthorhodafluor-6 ist.
13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für H⁺ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Carboxyseminaphthorhodafluor-X ist.
14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Mg2+ als freie Ionen der Fluoreszenzindikatorfarbstoff Mag- Indo-1 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Extinktion der Fluoreszenzintensität gemessen wird.
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