DE3343637C2

DE3343637C2 - Sensorelement für fluoreszenzoptische pH-Messungen sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE3343637C2
Application number: DE3343637A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dipl.-Ing. Dr. Kroneis; Helmut Graz Offenbacher; Otto Dr. Wolfbeis
Original assignee: Avl AG
Current assignee: Avl AG
Priority date: 1982-12-06
Filing date: 1983-12-02
Publication date: 1986-07-31
Also published as: US4568518A; DE3343637A1; ATA444382A; AT380957B

Abstract

Die Trägermembran, beispielsweise aus Cellulose, des Sensorelementes ist von einem unabhängigen Netzwerk durchdrungen, welches aus Indikatormaterial und reaktive Gruppen, beispielsweise Aminogruppen, enthaltendem Material aufgebaut ist. Das Netzwerk hat keine chemischen Bindungen zum Membranmaterial, womit z. B. die mechanischen Eigenschaften der Trägermembran nicht beeinträchtigt werden können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Sensorelement für fluoreszenzoptische pH-Messungen, bestehend aus einer Trägermembran mit d?ran immobilisiertem fluoreszenzoptischen Indikatormaterial. Für die Messung von pH-Werten ist der Einsatz von Glaselektroden nach potentiometrischem Prinzip weit verbreitet. Zum Beispiel werden solche Sensoren für die pH-Analyse biologischer Flüssigkeiten, etwa für die Blutgasanalyse, verwendet. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode besteht darin, daß das gesamte Meßsystem prinzipiell aus zwei Teilen aufgebaut wird, nämlich aus einer Meßelektrode und einer Referenzelektrode. Insbesondere entstehen Meßprobleme deshalb, weil die erforderliche Referenzelektrode störanfällig ist.

Aus diesem Grund wurde versucht, pH-Messungen auf optischem Wege sogenannter pH-Indikatoren durchzuführen. Dabei wird prinzipiell eine pH-abhängige Wechselwirkung bestimmter Stoffe mit Licht ausgenutzt

pH-Indikatoren sind üblicherweise Moleküle, welche Licht bestimmter Wellenlänge absorbieren können, wobei das Ausmaß dieser Absorption vom pH-Wert abhängt

pH-Messungen nach diesem Absorptionsprinzip können auf zweierlei Weise durchgeführt werden:

Man kann pH-Indikatoren dem Meßgut zusetzen, die Lichtabsorption von Meßmedium und Indikator wird dann mit dafür geeigneten Geräten durchgeführt (Cuvette, Fotometer). Die Nachteile bei dieser Verfahrensweise sind ein

hoher I ndikatorversuch, ein zu
großer Zeitaufwand und
optische Einflüsse des Meßgutes.

Die zweite Möglichkeit ist beispielsweise aus der DE-OS 28 51 138 bekannt Sie offenbart eine faseroptische pH-Sonde zur Implantation im Gewebe für physiologische Untersuchungen. Diese Sonde setzt sich aus einer ionendurchlässigen Membran in Form eines hohlen, länglichen Zylinders und zwei parallel zueinander angeordneten Faseroptiken zusammen. In die hohle Membran, deren Poren so beschaffen sein sollen, daß sie Wasserstoffionen durchtreten lassen, wird ein farbstoffhaltiges Material, das pH-Indikator-Eigenschaften besitzt, eingefüllt.

Eine der beiden optischen Fasern ist mit ihrem einen Ende an eine Lichtquelle angeschlossen, während die andere Faser mit dem Lichtdetektor in Verbindung steht.

Daraus ergibt sich, daß die Indikatoren räumlich vom Meßgut getrennt sind, so daß ein Meßgutraum und ein Indikatorraum entstehen. Ein Austausch vor Protonen zwischen Ir.dikatorraum und Meßgutraum ermöglicht so eine Bestimmung des pH-Wertes des Meßgutes durch Messung der Lichtabsorption im Indikatorraum.

Als pH-Indikatoren mit den oben beschriebenen Eigenschaften können vorteilhafterweise fluoreszierende Moleküle verwendet werden. In diesem Fall wird ein bestimmter Anteil von absorbiertem Licht vom Indikatormolekül als Fluoreszenzlicht abgegeben. Besteht nun eine pH-Abhängigkeit der Lichtabsorption eines fluoreszierenden Moleküls, so überträgt sich diese auf die Fluoreszenzlichtintensität. pH-Bestimmungen können also durch Messung der Fluoreszenzlichtintensität fluoreszierender pH-Indikatoren durchgeführt werden. SoI-ehe Indikatoren werden z. B. in »Practical Fluorescence« (Guilbault, 1973) im Kapitel »Fluorescent Indicators« aufgelistet.

Die sich bei der Verwendung von fluoreszierenden Indikatoren ergebenden Vorteile sind eine

hohe Empfindlichkeit, weiters eine
spektrale Unterscheidungsmöglichkeit zwischen
Anregungs- und Emissionslicht, sowie eine
große Variationsbreite bei der räumlichen Anordnung von Lichtquelle und Lichtempfänger.

Durch diese Vorteile wird es möglich, Meßvorrichtungen derart aufzubauen, daß flächenförmig ausgebildete Indikatorschichten auf der einen Seite der Schicht mit dem Meßgut in Wechselwirkung treten, während auf der anderen Seite der Schicht Beleuchtungs- und Lichtmeßvorrichtungen angeordnet sind.
Bei der Herstellung flächenförmig ausgebildeter Indi-

katorschichten muß berücksichtigt werden, daß die Indikatormoleküle einerseits durch das Meßgut nicht ausgewaschen werden, andererseits aber mit den Protonen des Lösungsmittels in Wechselwirkung treten können. Darüber hinaus soll die flächenförmige Indikatorschicht mechanisch stabil sein und der Indikator in ausreichend hoher Konzentration vorliegen.

Eine Immobilisierung von pH-Indikatoren erfolgt in hydrophilen Polymermembranen durch kovalente Verknüpfung des Indikators mit dem Membranmaterial. Dazu müssen entweder der Indikator oder die Polymermembran oder beides in aktivierter Form vorliegen. Beispielsweise ist es aus der DE-OS 30 01 669 bekannt, eine kovalente Bindung von Indikatoren — im speziellen Fall auf Cellophanfolien — durchzuführen, was eine vorangehende, zeitaufwendige chemische Modifizierung der Zellulose benötigt Die Immobilisierung eines Indikators, beispielsweise mittels Bromcyan, bedient sich einer schon seit langen bekannten chemischen Reaktion. Nachteilig dabei ist jedoch, daß Bromcyan eine hochgiftige Substanz darstellt, welche z. B. Blausäure abspaltet und weiters ein schweres Cancerogen ist, was gravierende Probleme bei der Handhabung dieser bekannten Methode mit sich bringt.

Eine Aktivierung wird üblicherweise durch Einführung reaktiver Gruppen, z. B. Aminogruppen, erreicht. Auf diese Weise gelang es z. B, Indikatoren wie /?-Methylumbelliferon oder Fluoresceinderivate an Cellulose zu binden.

Durch diese Immobilisierung verliert das Sensorelement jedoch mechanische Widerstandsfähigkeit, so daß es brüchig wird und einer Wiederverwendung kaum zugeführt werden kann. Außerdem treten durch die kovalente Bindung Verschiebungen in der fluoreszenzoptischen Eigenschaft auf, die dann in der Folge zu verfälschten Meßergebnissen führen.

Weiters kann eine Immobilisierung von Indikatoren auch durch Einkapselung derselben in geeignete Materialien erfolgen, wie sie aus der DE-OS 23 60 384 bekannt ist. Das Innere solcher sogenannter Nanokapseln ist erfüllt von wäßriger Indikatorlösung, das Kapselwandmaterial ist protonendurchlässig, aber indikatorundurchlässig.

Für die Herstellung von pH-Sensoren müssen diese Kapseln ihrerseits in flächenförmiger Anordnung immobilisiert werden.

Mechanische Instabilität, niedrige Indikatorbelastungsdichten und schlechte Einstellzeiten sind nur einige der Nachteile die diesen bekannten und beschriebenen pH-Sensoren anhaften.

Eine weitere Möglichkeit zur Immobilisierung von pH-Indikatoren ergibt sich durch Bindung der Indikatoren an die Oberfläche eines inerten, mechanisch stabilen, transparenten Träger.

Die sich anbietende Möglichkeit ist die Immobilisierung des pH-Indikators an einem chemisch reaktiven, aber mechanisch weniger geeigneten Material, wie z. B. Cellulose, welches dann auf einem festen und transparenten Träger, wie z. B. Glas oder Polyacrylester aufgespannt wird.

Diese Immobilisierung von Fluoreszenzindikatoren auf Cellulose oder Glas ist an sich bekannt. Man geht dabei von Cellulose oder Glas aus, an welches bereits in einem oder mehreren vorherigen Reaktionsschritten eine freie Aminogruppe angebracht worden war. An dieser Aminogruppe reagieren nun die reaktiven Gruppen eines Indikators, z. B. Fluorescein-isothiocyanat.

Allen bekannten Immobilisierungsverfahren für Glasoberflächen haftet der Nachteil an, daß an der Oberfläche nur relativ wenig Immobilisat überlagerungsfrei gebunden vorliegt Immobilisiert man hingegen auf fein verteiltem Material wie z. B. Glaspulver, wo die spezifisehe Oberfläche weit größer ist so darf man keine mechanische Festigkeit mehr erwarten.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Sensormembran zu schaffen, die keine Brüchigkeit aufweist und dem Indikator eine elastische stabile Basis für eine genügend ίο hohe Konzentration desselben bietet

Die Erfindung löst die Aufgabe dadurch, daß die Trägermembran von einer aus Indikatormaterial und mit diesem vernetzungsfähigen Material bestehenden, unabhängigen Netzstruktur durchdrungen ist Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal ist dadurch gegeben, daß die Trägermembran aus Cellulose besteht und daß das die Trägermembran durchdringende Netzwerk aus indikatormaterial und Aminogruppen aufweisendem Materia! aufgebaut ist Das Indikatormaterial ist also integrierter Bestandteil des die Trägermembran durchdringenden Netzwerkes. Dabei ist das vernetzungsfähige Material bereits ohne Trägermembran zur Bildung eines Netzwerkes zusammen mit dem Indikator befähigt Dies läßt sich einerseits durch die chemischen Eigenschaften von Träger- und vernetzungsfähigem Material beweisen und andererseits experimentell durch Ausschlußverfahren bestätigen: Es werden z. B. zwei Cellophanfolien mit Hexamethylendiamin getränkt und eine Folie mit verdünnter Säure gewaschen und mehrere Stunden gewässert Beide Folien werden anschließend mit Acetoxypyrentrisulfonsäurechlorid behandelt Während die nicht ausgewaschene Folie eine schöne Fluoreszenz zeigt, nimmt die ausgewaschene keinen Indikator auf.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung eines derartigen Sensorelementes besteht darin, daß die Trägermembran in eine Lösung eines zusammen mit dem Indikatormaterial vernetzungsfähigen Materials eingebracht und dadurch die Trägermembran vom vernetzungsfähigen Material durchsetzt wird, daß anschließend die Trägermembran zusammen mit dem vernetzungsfähigen Material mit Indikatormaterial versetzt wird, wobei das vernetzungsfähige Material durch kovalente Bindung mit dem Indikatormaterial vernetzt, und ein, die Trägermembran durchsetzendes, unabhängiges, indikatorhältiges Netzwerk gebildet wird, und daß zwischen den einzelnen Verfahrensschritten gegebenenfalls Wasch- und/oder Trockenvorgänge durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung eines Sensorelementes kann in weiterer Ausgestaltung auch vorsehen, daß als vernetzungsfähiges Material eine Hexamethylendiaminlösung verwendet wird, aber auch, daß als vernetzungsfähiges Material eine Polyäthyleniminlösung verwendet wird.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung kann auch vorgesehen sein, daß die für die Vernetzung des die Trägermembran durchsetzenden, vernetzungsfähigen Materials verwendeten Indikatormaterialien mindestens zwei im Sinne einer Vernetzungsreaktion reaktive Gruppen tragen bzw. daß als die im Sinne einer Vernetzungsreaktion reaktiven Gruppen am Indikatormolekül Sulfonsäurechloridgruppen verwendet werden. Dieses Sensorelement kann insbesondere zur fluoreszenzoptischen pH-Wert-Messung bzw. zur Blutgasanalyse eingesetzt werden.

Anhand zweier Beispiele soll die Erfindung näher veranschaulicht werden.

1) Bereitung eines Netzwerkes in Cellulose

Eine ΙΟμίπ dicke Folie (Cuprophan-Dialysierfolie, 5x5 cm) wird zwei Tage in einer Hexamethylendiaminlösung (8 g pro 10 ml Wasser) oder in einer Polyäthylenimin-Lösung (40%ig) liegen gelassen. Nach zwei Tagen haben sich genügend viele Diaminketten in das Netzwerk der Cellulosemembran eingelagert Danach wird eine Minute lang in Wasser geschwemmt. Die Folien werden auf ein Uhrglas gelegt und mit ca. 2 nil einer Lösung von 4 mg l-Acetoxypyren-SAS-trisulfochlorid in Dioxan Obergossen. Dazu wird noch 1 ml einer 5%igen Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben und die Membran hin und her bewegt Man spült mit Wasser und legt die Membranen dann 5 Minuten lang in eine 20%ige Natriumcarbonatlösung, um die Acetatschutzgruppe abzuspalten. Danach wird die Behandlung mit der Dioxan- und Natriumhydrogencarbonatlösung wiederholt Die Membran fluoresziert zuerst blau, nach dem Behandeln mit der Natriumcarbonatlösung kräftig grün. Die Membranen werden ein bis zwei Tage lang in destilliertem Wasser liegen gelassen, das Wasser mehrmals erneuert

2) Fluorescein immobilisiert in vernetzter

Polyacrylamidfolie

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ist ein selektives Gruppenreagens für Amine und reagiert aus diesem Grunde nur mit vernetzungsfähigen Substanzen vom Typ R3 _ „NHj, wobei π = 1 und 2.

Die vernetzte Polyacrylamid-Folie wird 4 Tage in eine 5%ige wäßrige Polyethyleniminlösung gelegt, anschließend mit fließendem Wasser gründlich gewaschen und bei 40° C getrocknet.

FITC wird bis zur Sättigung in Wasser gelöst. In diese Lösung taucht man die getrocknete, polyethyleniminhältige Folie 10 Minuten lang.

Nach gründlichem Waschen mit einer Pufferlösung (pH = 8,0) ist das Sensorelement gebrauchsfertig.

Die Anregungswellenlänge beträgt in diesem Falle 480 nm, das Fluoreszenzmaximum liegt bei 530 nm. Verwendbar ist dieses Sensorelement im pH-Bereich zwischen 4,0 und 7,0.

Dadurch entsteht in der Netzstruktur der Cellulosemembran ein von dieser unabhängiges Netzwerk, das mit der Membran keinerlei chemische Bindung eingeht, wodurch keine Reaktion, die zur Brüchigkeit des Sensorelementes führt, entsteht. Es entstehen zwar Berührungspunkte durch Umschlingungen und durch das Durchsetzen der einzelnen Netzteile untereinander, jedoch gibt es keine kovalente Bindung bzw. Knüpfung zwischen den Netzen. Eine chemische Bindung besteht allerdings zwischen dem Indikator und seinem Trägernetz, das wiederum wie bereits gesagt, ohne kovalente Bindung im Netz der Cellulosemembran gelagert ist. Der Indikator läßt sich, einmal an die Membran in solcher Weise gebunden, nicht mehr auswaschen, wobei nochmals gesagt sei, daß er in nicht kovalenter Weise an die Cellulose gebunden vorliegt. Die Immobilisierung erfolgt hier im Sinne eines penetrierenden Netzwerkes.

Claims

Patentansprüche:

1. Sensorelement für fluoreszenzoptische pH-Messungen, bestehend aus einer Trägermembran mit daran immobilis'crtem, fluoreszenzoptischen Indikatormaterial, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermembran von einer aus Indikatormaterial und mit diesem vernetzungsfähigen Material bestehenden, unabhängigen Netzstruktur durchdrungen ist

2. Sensorelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermembran aus Cellulose besteht und daß das die Trägermembran durchdringende Netzwerk aus Indikatormaterial und Aminogruppen aufweisendem Material aufgebaut ist

3. Verfahren zur Herstellung eines Sensorelementes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermembran in eine Lösung eines zusammen mit dem Indikatormaterial vernetzungsfähigen Materials eingebracht und dadurch die Trägermembran vom vernetzungsfähigen Material durchsetzt wird, daß anschließend die Trägermembran zusammen mit dem vernetzungsfähigen Material mit Indikatormaterial versetzt wird, wobei das vernetzungsfähige Material durch kovalente Bindung mit dem Indikatormaterial vernetzt, und ein, die Trägermembran durchsetzendes, unabhängiges, indikatorhaltiges Netzwerk gebildet wird, und daß zwischen den einzelnen Verfahrensschritten gegebenenfalls Wasch- und/oder Trockenvorgänge durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als vernetzungsfähiges Material eine Hexamethylendiaminlösung verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als vernetzungsfähiges Material eine Polyäthyleniminlösung verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Vernetzung des die Trägermembran durchsetzenden, vernetzungsfähigen Materials verwendeten Indikatormaterialien mindestens zwei im Sinne einer Vernetzungsreaktion reaktive Gruppen tragen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als die im Sinne einer Vernetzungsreaktion reaktiven Gruppen am Indikatormolekül SuI-fonsäurechloridgruppen verwendet werden.