DE4328279C2 - Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Derartige freie Ionen tragen zur Steuerung von Zellfunktionen bei.
Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe, wie Fura-2 und Indo-1, werden zur Bestimmung der Konzentration freier Ionen, wie Calciumionen, verwendet, die in lebenden Zellen zugegen sind. Verfahren zur Synthese dieser Farbstoffe und charakteristische Eigenschaften dieser Farbstoffe sind in den folgenden Druckschriften beschrieben: "The Journal of Biological Chemistry (1985), Band 260, Seiten 3340 bis 3450" und "Biophysical Journal, Band 54 (1988), Seiten 1089 bis 1104". Diese Sondenfarbstoffe haben die Eigenschaft, daß sich ihre charakteristischen Fluoreszenz-Eigenschaften in Abhängigkeit von Bindungsvorgängen und Dissoziationsvorgängen spezifischer Ionen verändern. Zur Messung der Ionenkonzentrationen innerhalb der Zelle unter Verwendung dieser Eigenschaft werden die Sondenfarbstoffe in Zellen eingeführt, und es wird die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Anregungslicht bestimmter Wellenlängen erzeugt wird, gemessen.
Jedoch kann die Messung auf der Grundlage von Anregungslicht nur einer Wellenlänge und einer Fluoreszenzstrahlung nur einer Wellenlänge keine exakten Meßwerte ergeben, wenn die Konzentration des Sondenfarbstoffs in der Zelle unbekannt ist oder die Verteilung des Sondenfarbstoffs in der Zelle uneinheitlich ist. Es besteht auch die Gefahr, daß Änderungen der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die nicht von Ionenkonzentrationen abhängig sind, sondern durch einen Rückgang der Fluoreszenzstrahlung hervorgerufen werden, ebenfalls gemessen werden.
Im Rahmen eines Verfahrens zur Beseitigung dieser Gefahr werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung für Anregungslicht zweier unterschiedlicher Wellenlängen und Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung zweier Wellenlängen für eine Art Anregungslicht jeweils gemessen, und ihre jeweiligen Verhältnisse werden gemessen. Dieses Verfahren ist in allen Einzelheiten beschrieben von Atsuo Miyakawa et al. in "Bunseki Kagaku, Band 38 (1989), Nummer 11, Seiten 642 bis 649" und in "Photomedicine und Photobiology, Band 13 (1991), Seiten 15 bis 18".
In DE 40 26 564 A1 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung eines zweidimensionalen Konzentrationsverteilungsbildes von zu untersuchenden Ionen in einer lebenden Zelle auf der Grundlage der Variation im Fluoreszenzspektrum oder im Anregungsspektrum einer Fluoreszenzprobe beschrieben. Dabei wird eine biologische Zelle mit einem Farbstoff, der sein Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit der Konzentration des zu untersuchenden Ions ändert, eingefärbt, mit Anregungslicht einer oder zweier Wellenlängen bestrahlt und das von der biologischen Zelle abgegebene Fluoreszenzlicht bei zwei oder einer Wellenlänge erfaßt, wodurch ein Fluoreszenzintensitätsverteilungsbild der Zelle erhalten wird. Nach einer Bildverarbeitung unter Berücksichtigung eines optischen Bildes der Zelle und der Hintergrundfluoreszenz wird ein zweidimensionales Konzentrationsverteilungsbild erhalten.
Die oben beschriebenen, unter Verwendung zweier Wellenlängen erfolgenden Fluoreszenz-Meßverfahren sind verwendbar bei Systemen nur in bezug auf ein bestimmtes Ion, mit dem der Sondenfarbstoff reagiert. Es ist jedoch in Betracht zu ziehen, daß die Sondenfarbstoffe Bindungen mit Proteinen und Diaphragma-Komponenten, die keine Ionen sind und in hohen Konzentrationen in Zellen zugegen sind, eingehen. Folglich werden die Fluoreszenz- Emissionsspektren und Chelat-Konstanten nachteilig verändert. Diese auf der Verwendung zweier Wellenlängen basierenden Fluoreszenz-Meßverfahren können keine Fehler, die aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen und anderen Komponenten als Ionen auftreten, korrigieren. Exakte Ionenkonzentrationen können nicht bestimmt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung der Konzentration von freien Ionen innerhalb der Zelle bereitzustellen, das die Arbeit zur Herstellung von Proben und zur Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung verringern kann und eine höhere Meßgenauigkeit bietet.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, einschließlich des Einführens des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs in die Zelle und Messung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • (i) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Lösungen des Fluoreszenz- Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit verschiedenen Konzentrationen mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird;
  • (ii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Lösungen
    • a) einer Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, Bindungen mit dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und so die Intensität der Fluoreszenzstrahlung ändert, und
    • b) des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs
  • mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Lösungen der Biosubstanz, des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iv) a) Festsetzen von Anfangswerten für drei Arten von Gleichgewichtskonstanten, die sich aus den Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion und der Biosubstanz in der Zelle zu Komplexen ergeben,
  • b) Festsetzen von Anfangswerten der zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die aus den Schritten (i) bis (iii) erhältlich sind; und
  • c) Abschätzen der Unterschiede zwischen der auf der Grundlage der Anfangswerte berechneten Intensität der Fluoreszenzstrahlung und der in den Schritten (i) bis (iii) gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung und sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Unterschiede zwischen den Anfangswerten und den gemessenen Werten der Intensität der Fluoreszenzstrahlung in einen erlaubten Bereich fallen; und
    nach erfolgter Kalibrierung in den Schritten (i) bis (iv)
  • (v) Messung der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht dreier verschiedener Wellenlängen erzeugten Fluoreszenzstrahlung und Lösen der Gleichungen zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, in die die gemessene Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt ist, und der Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen zum Erhalt der Konzentration des freien Ions.
Erfindungsgemäß wird außerdem ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, einschließlich des Einführens des Floureszenz-Sondenfarbstoffs in die Zelle und Messung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • (i) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit verschiedenen Konzentrationen mit Anregungslicht einer Wellenlänge erzeugt wird;
  • (ii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei den drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Lösungen von
    • a) einer Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, Bindungen mit dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und so die Intensität der Fluoreszenzstrahlung ändert, und
    • b) des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs
  • mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei den drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Lösungen der Biosubstanz, des Fluoreszenz- Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht einer Wellenlänge erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iv) a) Festsetzen von Anfangswerten für drei Arten von Gleichgewichtskonstanten, die sich aus den Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion und der Biosubstanz in der Zelle zu Komplexen ergeben,
  • b) Festsetzen von Anfangswerten der zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die aus den Schritten (i) bis (iii) erhältlich sind; und
  • c) Abschätzen der Unterschiede zwischen der auf der Grundlage der Anfangswerte berechneten Intensität der Fluoreszenzstrahlung und der in den Schritten (i) bis (iii) gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung und sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Unterschiede zwischen den Anfangswerten und den gemessenen Werten der Intensität der Fluoreszenzstrahlung in einen erlaubten Bereich fallen; und
    nach erfolgter Kalibrierung in den Schritten (i) bis (iv)
  • (v) Messung der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugten Fluoreszenzstrahlung und Lösen der Gleichungen zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, in die die gemessene Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt ist, und der Gleichgewichts-Reaktionsgleichung zum Erhalt der Konzentration des freien Ions.
Das Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung dient zur Messung einer Ionenkonzentration innerhalb der Zelle durch Einführen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, z. B. Fura-2 oder Indo-1, in die Zelle und Angabe der Konzentration des freien Ions, z. B. Ca2+ oder Mg2+, auf der Grundlage der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch anregende Bestrahlung der Zelle mit Licht erzeugt wird.
Die Biosubstanz ist beispielsweise ein Protein.
Vorzugsweise ist in Schritt (i) die erste Zahl der Lösungen größer oder gleich vier, in Schritt (ii) die zweite Zahl der Lösungen größer oder gleich drei und in Schritt (iii) die dritte Zahl der Lösungen größer oder gleich drei.
In Schritt (iv) werden vorzugsweise sechzehn Sätze der Anfangswerte der drei Arten der Gleichgewichtskonstanten und sechzehn Sätze der Anfangswerte der zwölf Arten der Fluoreszenzkoeffizienten unter Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens festgesetzt.
Wenn der verwendete Fluoreszenz- Sondenfarbstoff Fura-2 ist, ist es bevorzugt, daß die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch die Bestrahlung mit anregendem Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, gemessen wird. Wenn der verwendete Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist, ist es bevorzugt, daß die Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch die Bestrahlung mit anregendem Licht einer Wellenlänge erzeugt wird, gemessen wird.
Das Verfahren zur Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung bei anregendem Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen, wie es oben in Schritt (v) beschrieben wurde, und das Verfahren zur Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung dreier unterschiedlicher Wellenlängen bei anregendem Licht einer Wellenlänge (nachfolgend bezeichnet als "Drei-Wellenlängen- Fluoreszenz-Meßverfahren") sind beschrieben in der nachveröffentlichten DE 42 39 016 A1 mit der Bezeichnung "Verfahren zum Messen der intrazellulären Ionenkonzentration unter Verwendung von Fluoreszenzindikatorfarbstoffen".
Dieses Drei-Wellenlängen-Fluoreszenz-Meßverfahren wird nachfolgend anhand eines Beispiels erläutert, in dem die Konzentration an Ca2+ unter Verwendung von Fura-2 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff gemessen wird. In diesem Beispiel ist die Biosubstanz ein Protein.
Fig. 1 zeigt eine näherungsweise Ansicht der Wechselwirkungen zwischen Fura-2 und einem Calciumion (Ca2+) oder einem Protein in einer Zelle. Fig. 1 zeigt einen Fall, in dem die Konzentration an Ca2+ unter Verwendung von Fura-2 gemessen wird; jedoch kann näherungsweise in gleicher Weise auch ein Fall wiedergegeben werden, in dem Ca2+ unter Verwendung von beispielsweise Indo-1 gemessen wird. In einer Zelle geht Fura-2 mit Ca2+ eine Bindung ein, wobei die Dissoziationskonstante der entsprechenden Reaktionsgleichung K(FC) ist. Ebenfalls geht Fura-2 eine Bindung mit einem Protein ein, wobei die Dissoziationskonstante der entsprechenden Reaktionsgleichung K(PF) ist. Außerdem können auch drei Komponenten, nämlich Fura-2, Ca2+ und ein Protein eine Bindung miteinander eingehen, wobei die Dissoziationskonstante K(PFC) oder K′(PFC) ist. Für die Gleichgewichte zwischen den drei eine Bindung miteinander eingehenden Komponenten gelten dementsprechend die folgenden Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen (1) bis (4):
K(FC)=[F] [C]/[FC] (1)
K(PF)=[P] [F]/[PF] (2)
K(PFC)=[P] [FC]/[PFC] (3)
K′(PFC)=[PF] [C]/[PFC] (4)
worin F für Fura-2 steht, C für Ca2+ und P für ein Protein steht und [  ] die Konzentration der jeweiligen Komponenten angibt.
Die oben beschriebenen Proben werden dann mit anregendem Licht bestrahlt, und die emittierten Fluoreszenzspektren werden gemessen. Es wird anregendes Licht einer Wellenlänge von 340 nm, 360 nm und 380 nm verwendet. Da in einer Zelle vier Komponenten zugegen sind, nämlich freies Fura-2, ein Fura-2-Calciumion-Komplex, ein Fura-2-Protein-Komplex und ein Fura-2-Calciumion-Protein-Komplex, sind die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der Zelle bei den jeweiligen Wellenlängen die Gesamtsummen der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der jeweiligen Komponenten bei der jeweiligen Wellenlänge. Dementsprechend gelten die folgenden Gleichungen 5 bis 7:
I₃₄₀=[F]I(F)₃₄₀+[PF]I(PF)₃₄₀+[FC]I(FC)₃₄₀+[PFC]I(PFC)₃₄₀ (5)
I₃₆₀=[F]I(F)₃₆₀+[PF]I(PF)₃₆₀+[FC]I(FC)₃₆₀+[PFC]I(PFC)₃₆₀ (6)
I₃₈₀=[F]I(F)₃₈₀+[PF]I(PF)₃₈₀+[FC]I(FC)₃₈₀+[PFC]I(PFC)₃₈₀ (7)
In diesen Gleichungen sind folgende Werte bekannte Werte: die Dissoziationskonstante K(FC) der Gleichung der Reaktion zwischen Fura-2 und Ca2+; die Dissoziationskonstante K(PF) der Gleichung der Reaktion zwischen Fura-2 und einem Protein; die Dissoziationskonstante K(PFC) der Gleichung der Reaktion zwischen dem Fura-2-Calciumion-Komplex und einem Protein; die Dissoziationskonstante K′(PFC) der Gleichung der Reaktion zwischen dem Fura-2-Protein-Komplex und dem Calciumion; die Intensität der Fluoreszenzstrahlung (F) von freiem Fura-2 bei den Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm; die Intensität der Fluoreszenzstrahlung I(FC) des Fura-2-Calciumion-Komplexes; die Intensität der Fluoreszenzstrahlung I(PF) des Fura-2-Protein- Komplexes und die Intensität der Fluoreszenzstrahlung I(PFC) des Fura-2-Calciumion-Protein-Komplexes.
Es werden also die jeweiligen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung I₃₄₀, I₃₆₀ und I₃₈₀ einer Zelle, in die Fura-2 eingeführt wurde, bei einer Anregung bei den Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm gemessen. Gleichzeitig werden die Gleichungen 1 bis 7 gelöst. Daraus ergibt sich die Konzentration an freiem Ca2+ in der Zelle.
In dem oben beschriebenen Verfahren ist es zur Berechnung eine Ionenkonzentration erforderlich, daß die folgenden fünfzehn Konstanten vorher festgesetzt werden:
  • - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei unterschiedlichen Wellenlängen, die zur Messung eines Sondenfarbstoffs herangezogen werden sollen;
  • - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei den drei unterschiedlichen Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes eines Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion verwendet werden sollen;
  • - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes der Biosubstanz mit dem Sondenfarbstoff herangezogen werden sollen;
  • - Lichtabsorptions-Koeffizienten oder Fluoreszenzkoeffizienten (drei Konstanten) bei drei verschiedenen Wellenlängen, die bei der Messung des Komplexes der Biosubstanz mit dem Sondenfarbstoff und dem freien Ion verwendet werden sollen;
  • - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen dem Sondenfarbstoff und dem freien Ion;
  • - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen der Biosubstanz und dem Sondenfarbstoff; und
  • - Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen der Biosubstanz und dem Komplex aus Sondenfarbstoff und freiem Ion oder Gleichgewichtskonstante (eine Konstante) des Gleichgewichts der Reaktion zwischen dem Komplex aus Biosubstanz und Sondenfarbstoff und dem freien Ion (solange eine der Konstanten gegeben ist, kann die andere berechnet werden; erfahrungsgemäß ist die erstgenannte bequem erhältlich).
Diese fünfzehn Konstanten sind Ergebnis der Messungen der oben beschriebenen Schritte (i) bis (iv). Diese Konstanten ergeben sich aus dem modifizierten Simplex-Verfahren und werden sukzessiv asymptotisch angenähert. Dieses modifizierte Simplex-Verfahren ist in allen Einzelheiten beschrieben im Artikel "Optimization by Simplex Method" von H. Kawaguchi, erschienen in Analysis, Juni 1988, Seiten 397 bis 403, im Artikel "A simplex method for function minimization" von J. A. Nelder und R. Mead, veröffentlicht in Computer J. 7 (1965), Seiten 308-313, und in "Analytical Chemistry", Vol. 45, No. 3, 1973, Seiten 278 A bis 283 A.
Die Vorgehensweise bei dem Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle, das die oben beschriebenen Schritte (i) bis (v) umfaßt, wird nachfolgend im einzelnen erläutert.
Zuerst werden vier oder mehr Lösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit unterschiedlichen Konzentrationen, drei oder mehr Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und einer Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen und drei oder mehr Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions und der Biosubstanz mit verschiedenen Konzentrationen hergestellt.
Als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff werden Fura-2, Indo-1 oder andere Farbstoffe verwendet. Das freie Ion ist Ca2+, Mg2+ oder ein anderes Ion. Die Biosubstanz ist beispielsweise ein Protein.
Fig. 2 zeigt die Beziehungen zwischen Konzentrationen von Lösungen von Fura-2 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, Ca2+ als freiem Ion und einem Protein als Biosubstanz, sowie die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung. Im Teil (a) von Fig. 2 werden die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei der Gehalt an Protein in den Lösungen aus Fura-2 und Protein verändert wird. In Teil (b) von Fig. 2 werden die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei die Inhaltsmengen an Ca2+ in den Lösungen aus Fura-2 und Ca2+ verändert werden. In Teil (c) von Fig. 2 werden die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den jeweiligen Anregungswellenlängen gemessen, wobei die Inhaltsmengen an Protein in den Lösungen aus Komplexen von Fura-2, Ca2+ und dem Protein geändert werden.
In Teil (b) von Fig. 2 stimmen die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den jeweiligen Wellenlängen des anregenden Lichts theoretisch miteinander überein, d. h. die den jeweiligen Anregungslicht- Wellenlängen entsprechenden Linien schneiden einander an einem bestimmten Punkt bei einer speziellen Ca2+-Konzentration. An diesem Punkt stimmt der Konzentrationswert des Ca2+ mit der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2 und dem Ca2+ überein. In gleicher Weise schneiden sich in Teil (a) von Fig. 2 die den jeweiligen Anregungslicht-Wellenlängen entsprechenden Linien an einem Punkt, an dem der Protein- Konzentrationswert mit der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2 und dem Protein übereinstimmt. Außerdem schneiden sich in Teil (c) von Fig. 2 die den jeweiligen Anregungslicht-Wellenlängen entsprechenden Linien an einem Punkt, an dem der Protein-Konzentrationswert mit der Gleichgewichtskonstanten der Reaktion zwischen Fura-2, dem Ca2+ und dem Protein übereinstimmt.
Es werden Lösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion mit vier oder mehr unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (b) von Fig. 2 gezeigt ist - Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung an insgesamt vier Punkten gemessen werden, an denen die Konzentration an freiem Ion (Ca2+) jeweils niedriger und höher ist, und an zwei Punkten zwischen den niedrigeren und höheren Punkten. Dadurch kann mit dem Verfahren eine Gleichgewichtskonstante angegeben werden. Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer Biosubstanz mit drei oder mehr verschiedenen Konzentrationen werden verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (a) von Fig. 2 gezeigt ist - ein oberer Punkt, an dem die Biosubstanz (Protein) in einer höheren Konzentration vorliegt, denselben Wert aufweist wie ein unterer Punkt, in dem die Konzentration an freiem Ion (Ca2+) in Teil (b) von Fig. 2 niedriger ist und drei Lösungen verwendet werden können. Es werden Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, des freien Ions und der Biosubstanz mit drei oder mehr unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Dies geschieht deswegen, weil - wie in Teil (c) von Fig. 2 gezeigt - ein unterer Punkt, an dem die Biosubstanz (Protein) eine niedrigere Konzentration aufweist, denselben Wert hat wie an einem höheren Punkt, an dem die Konzentration an freiem Ion (Ca2+) in Teil (b) von Fig. 2 höher ist und drei Lösungen verwendet werden können.
Danach werden die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei drei Wellenlängen an diesen Lösungen mit dem Drei-Wellenlängen-Fluoreszenz-Meßverfahren gemessen. Wenn in dem vorliegenden Verfahren der verwendete Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist, wird Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen auf die jeweiligen Lösungen zur Messung der jeweiligen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung eingestrahlt (nachfolgend bezeichnet als "Meßverfahren bei Anregung bei drei Wellenlängen und Fluoreszenzstrahlung bei einer Wellenlänge"). Wenn der verwendete Fluoreszenz- Sondenfarbstoff Indo-1 ist, wird Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Lösungen zur Messung der jeweiligen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei drei Wellenlängen eingestrahlt (nachfolgend bezeichnet als "Meßverfahren bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge und Fluoreszenzstrahlung bei drei Wellenlängen").
Im nächsten Schritt werden sechzehn Sätze von Anfangswerten von fünfzehn Konstanten, die zur Messung der Konzentration des freien Ions in der Zelle erforderlich sind, festgesetzt. Dies geschieht deswegen, weil dann, wenn k Konstanten durch das modifizierte Simplex- Verfahren vorgegeben sind, (k+1) Sätze von Anfangswerten festgesetzt werden. Eine Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird in jedem der Sätze berechnet. Ein Unterschied zwischen diesen Werten und gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung wird angegeben, um zu beurteilen, ob es Sätze von Werten gibt, deren Unterschiede innerhalb eines erlaubten Bereiches liegen. Wenn es solche gibt wird einer dieser Sätze, dessen Unterschied am kleinsten ist, als optimaler Satz der Konstanten bewertet. Wenn es keinen derartigen Satz gibt, wird durch das modifizierte Simplex-Verfahren ein neuer Satz von Konstanten berechnet, der auf dem Satz mit dem größten Unterschied, dem Satz mit dem nächstgrößeren Unterschied und dem Satz mit dem kleinsten Unterschied basiert. Dieser neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Unterschied und erzeugt so sechzehn neue Sätze von Konstanten. Unter Verwendung dieser sechzehn neuen Sätze von Konstanten wird derselbe Verfahrensweg durchgeführt, bis ein Satz gefunden ist, dessen Unterschied innerhalb des erlaubten Bereichs liegt.
Auf diesem Wege werden fünfzehn optimiert, so daß sich daraus in hohem Maße verläßliche Konstanten ergeben. Danach werden die gegebenen Konstanten in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt.
Im nächsten Schritt wird ein Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt. Die Zelle wird danach mit anregendem Licht bestrahlt, und die Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird gemessen. In dem Fall, in dem Fura-2 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff darstellt, wird das Meßverfahren mit drei Wellenlängen bei der Anregung und einer Wellenlänge bei der Fluoreszenzstrahlung herangezogen. In dem Fall, in dem Indo-1 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff darstellt, wird das Meßverfahren mit einer Anregungswellenlänge und drei Fluoreszenzwellenlängen herangezogen. Danach werden die gemessenen Werte für die Intensität der Fluoreszenzstrahlung in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und in die Formeln zur gleichzeitigen Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt. Daraus ergibt sich die Konzentration des freien Ions in der Zelle.
In dem Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle werden also die Konstanten nicht durch analytisches Lösen einer Gleichung höherer Ordnung gegeben, sondern werden durch die sukzessive asymptotische Annäherung durch das modifizierte Simplex-Verfahren angegeben, dessen Rechnung leicht programmiert werden kann. Die Verwendung eines Computers kann die Effizienz einer Bestimmung der Konstanten verbessern. Was außerdem zur Bestimmung der Konstanten zu tun ist, ist die Herstellung von zehn Proben und die Messung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung. Dies kann drastisch die Arbeit zur Herstellung von Proben und die Messung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung herabsetzen. Da außerdem die Ionenkonzentration in der Zelle auf der Grundlage von verläßlich angegebenen Konstanten angegeben wird, kann die resultierende Ionenkonzentration genauer sein.
Die Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle die in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet wird, wird nachfolgend erklärt.
Die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird verwendet für das Meßverfahren mit drei Wellenlängen bei der Anregung und einer Wellenlänge bei der Flureszenzstrahlung. Die Vorrichtung umfaßt
  • - einen Behälter 3 für das Meßobjekt;
  • - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 1 zur Erzeugung von Anregungslicht mit drei unterschiedlichen Wellenlängen und zur Einstrahlung des Anregungslichts auf das Meßobjekt in dem Behälter 3;
  • - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, die durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugt wird;
  • - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2, zur Speicherung des Ausgangssignals, zum Festsetzen der Anfangswerte für die drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und der Anfangswerte der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten, zum Abschätzen des Unterschieds zwischen den Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und den Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 stammen, zum sukzessiven Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modischen Simplex-Verfahren, bis der Unterschied der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten von den mit der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 erhaltenen in einen erlaubten Bereich fällt, und zur Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichgewichtskonstanten; und ferner
  • - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.
Der Behälter 3 für das Meßobjekt enthält eine der Proben eines Meßobjekts, d. h. eine Zelle mit darin eingeführtem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff und eine Vielzahl von Lösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, der zur quantitativen Erfassung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle verwendet werden soll, mit dem freien Ion, mit einer Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist und eine Bindung mit dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff und dem freien Ion unter Änderung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingeht, und deren Komplexe, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen.
In einer Ausführungsform umfaßt die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 1 drei Lichtquellen 11 zur Emission von Anregungslicht der drei unterschiedlichen Wellenlängen.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 1 eine Lichtquelle 11 zur Emission von Licht bestimmter Wellenlängenbereiche, einschließlich der drei Wellenlängen des Anregungslichts, und drei Filter (131, 132, 133) zum Durchtritt von Licht jeweils nur einer Wellenlänge der drei unterschiedlichen Wellenlängen des Anregungslichts.
Die erste Bearbeitungseinrichtung empfängt Ausgangssignale der Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung speichert die Ausgangssignale, setzt Anfangswerte, die auf den Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung von den Lösungen basieren, drei Gleichgewichtskonstanten, die in drei unabhängigen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen über die Konzentrationen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion, der Biosubstanz und den Komplexen des freien Ions und der Biosubstanz, die in der Zelle vorkommen, verwendet werden sollen, und Anfangswerte von zwölf Fluoreszenzkoeffizienten fest, die in Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die Beziehungen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion, der Biosubstanz und den Komplexen von freiem Ion und Biosubstanz ausdrücken, verwendet werden sollen, bewertet Unterschiede zwischen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die auf den Anfangswerten basieren, und Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die als Ausgangssignale von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 abgegeben werden, wiederholt sukzessive asymptotische Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex-Verfahren, bis die Unterschiede der Anfangswerte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 in einen erlaubten Bereich fallen, und bestimmt die zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und die drei Gleichgewichtskonstanten.
Die zweite Bearbeitungseinrichtung bestimmt die Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Basis der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, wenn der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in die Zelle eingeführt wurde, indem gleichzeitig die Gleichungen der Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung in die die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt wurden, und die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen gelöst werden, um die Konzentration des freien Ions in der Zelle zu bestimmen.
Es ist bevorzugt, daß der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist. Freie Ionen sind z. B. Ca2+ oder Mg2+. Die Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.
Die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird für das oben beschriebene Meßverfahren bei einer Wellenlänge für die Einstrahlung und drei Wellenlängen für die Fluoreszenzstrahlung verwendet und umfaßt
  • - einen Behälter (3) für das Meßobjekt;
  • - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 5 zur Erzeugung von Anregungslicht mit einer Wellenlänge und zur Einstrahlung des Anregungslichts auf das Meßobjekt in dem Behälter 3;
  • - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 zum Nachweis der Fluoreszenzintensitäten bei drei Wellenlängen, die durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugt werden;
  • - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6, zur Speicherung des Ausgangssignals, zum Festsetzen der Anfangswerte für die drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und der Anfangswerte der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten, zum Abschätzen des Unterschieds zwischen den Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und den Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 stammen, zum sukzessiven Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex- Verfahren, bis der Unterschied der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten von den mit der Fluoreszenzintensitäts- Nachweiseinrichtung 2 erhaltenen in einen erlaubten Bereich fällt, und zur Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichgewichtskonstanten; und ferner
  • - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.
Der Behälter für das Meßobjekt, die erste Bearbeitungseinrichtung und die zweite Bearbeitungseinrichtung sind dieselben wie diejenen bei der ersten Ausführungsform. Nachfolgend werden die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht und die Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung erläutert, die verschieden von denen der ersten Ausführungsform sind.
In einer Ausführungsform umfaßt die Anregunglicht-Bestrahlungseinrichtung 5 eine Lichtquelle 51 zur Emission der Wellenlänge des Anregungslichts.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 5 eine Lichtquelle 51 zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich der Wellenlänge des Anregungslichts und einen Filter 53 zum Durchtritt der Wellenlänge des Anregungslichts.
Es ist bevorzugt, daß die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 drei Filter 631, 632, 633 zum Durchtritt von Fluoreszenzlicht der drei unterschiedlichen Wellenlängen umfaßt.
Es ist bevorzugt, daß in dieser Vorrichtung Indo-1 als Fluoreszenz- Sondenfarbstoff verwendet wird. Das freie Ion ist beispielsweise Ca2+ oder Mg2+. Die Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.
Es wird nachfolgend der Vorgang zum Messen der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle mit der Vorrichtung gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutert.
Zuerst werden vier oder mehr Lösungen eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion als der zu messenden Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Drei oder mehr Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit einer davon verschiedenen Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Drei oder mehr Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs mit dem freien Ion und der davon verschiedenen Biosubstanz mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff ist Fura-2, und die zu messende Biosubstanz ist Ca2+ oder Mg2+. Die davon verschiedene Biosubstanz ist typischerweise ein Protein.
Danach ist eine der Lösungen in dem Behälter für das Meßobjekt enthalten. Die Vorrichtung zur Bestrahluung mit Anregungslicht wird unter Bestrahlen mit dem Anregungslicht einer der drei Wellenlängen betrieben. Die Intensität der durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung wird durch die Einrichtung zum Nachweis der Fluoreszenzstrahlung gemessen. Ein Meßwert der gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung dient als Ausgangssignal der Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung an die erste Bearbeitungseinrichtung. Die erste Bearbeitungseinrichtung empfängt und speichert das Ausgangssignal. Das Anregungslicht der beiden anderen Wellenlängen wird nachfolgend ebenfalls auf die Lösung in dem Behälter zum Nachweis von Intensitäten der erzeugten Fluoreszenzstrahlung eingestrahlt. Danach werden die restlichen Lösungen aufeinanderfolgend in dem Behälter zum Nachweis der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung entsprechend dem Anregungslicht der beiden Wellenlängen angeordnet. Alle Werte der gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden an die erste Bearbeitungseinrichtung geleitet und dort gespeichert.
Im Anschluß an den Nachweis der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung aller Lösungen führt die erste Bearbeitungseinrichtung die folgende Verfahrensfolge auf der Grundlage der gespeicherten Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung durch:
Zuerst werden sechzehn Sätze der Anfangswerte von fünfzehn Konstanten festgesetzt, die zur Messung der Ionenkonzentration in der Zelle erforderlich sind. Eine Intensität der Fluoreszenzstrahlung jedes Satzes wird angegeben, und ein Unterschied zwischen dem Wert und einer gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird angegeben. Es wird beurteilt, ob es Sätze gibt, deren Unterschiede innerhalb einer Bandbreite der erlaubten Unterschiede liegen. Wenn es diese gibt, wird ein derartiger Satz, der den kleinsten Unterschied aufweist, als optimaler Satz von Konstanten angesehen. Wenn es keinen solchen Satz gibt, wird ein neuer Satz der Konstanten auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Unterschied des Satzes mit dem nächstgrößten Unterschied und des Satzes mit dem kleinsten Unterschied mit dem modifizierten Simplex-Verfahren berechnet, und der neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Unterschied unter Schaffung von sechzehn neuen Sätzen von Konstanten. Derselbe Verfahrensschritt wird an den sechzehn Sätzen von Konstanten wiederholt, bis ein Satz gefunden wurde, dessen Unterschied innerhalb des erlaubten Bereichs liegt.
Die erste Bearbeitungseinrichtung führt die oben beschriebene Verfahrensweise zur Optimierung der fünfzehn Konstanten durch. Es können so in hohem Maße verläßliche Konstanten erhalten werden. Die gegebenen fünfzehn Konstanten werden in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt, und die mit den neuen Werten versehenen Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und Formeln zur Berechnung der Intensitäten der Fluorenszenzstrahlung werden in der ersten Bearbeitungseinrichtung gespeichert.
Danach wird der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter für das Meßobjekt gegeben. Danach wird die Einrichtung zur Bestrahlung mit Anregungslicht unter Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht einer der drei Wellenlängen betrieben. Die Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung mißt die Intensität der Fluoreszenzstrahlung der Zelle, und der Wert der Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird als Ausgangssignal an die zweite Bearbeitungseinrichtung abgegeben. Danach wird das Anregungslicht der beiden anderen Wellenlängen schrittweise eingestrahlt und so Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung entsprechend dem Anregungslicht gemessen. Alle Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die für die jeweiligen Wellenlängen gemessen werden, werden in der zweiten Bearbeitungseinrichtung gespeichert.
Danach setzt die zweite Bearbeitungseinrichtung die Werte der Fluoreszenzstrahlung in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung ein und löst gleichzeitig die Gleichungen unter Erhalt des Wertes für die Ionenkonzentration in der Zelle.
Nachfolgend wird die Verfahrensweise der Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle durch die Vorrichtung entsprechend der zweiten Ausführungsform erläutert.
Es werden dieselben Lösungen wie bei der ersten Ausführungsform hergestellt. Indo-1 oder andere Verbindungen dienen als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff.
Im nächsten Schritt wird eine der Lösungen in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet. Die Einrichtung für die Anregungsbestrahlung wird unter Einstrahlen des Anregungslichts einer Wellenlänge betrieben. Danach werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die in den drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, mit der Einrichtung zum Nachweis der Intensität gemessen. Werte der gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung sind Ausgangssignale der Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, und die Ausgangssignale werden zu der ersten Bearbeitungseinrichtung weitergeleitet. Die erste Bearbeitungseinrichtung nimmt die Ausgangssignale auf und speichert sie. Danach werden die restlichen Lösungen nacheinander in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet, und Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der Lösungen in den drei Wellenlängenbereichen werden gemessen. Alle Werte der gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden als Eingangssignale der ersten Bearbeitungseinrichtung zugeführt und dort gespeichert.
Im Anschluß an den Nachweis der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung aller Lösungen wird dieselbe erste Verfahrensweise wie in der ersten Ausführungsform auf der Grundlage der gespeicherten Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung durchgeführt, und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und drei Gleichgewichtskonstanten werden bestimmt.
Danach wird der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in dem Behälter für die Meßobjekte angeordnet. Danach wird die Einrichtung zur Anregungsstrahlung unter Bestrahlung mit Anregungslicht einer Wellenlänge betrieben.
Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die durch die Zelle in den drei Wellenlängenbereichen erzeugt wurden, werden durch die Einrichtung zum Nachweis der Intensität der Fluoreszenzstrahlung gemessen, und die Meßwerte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden als Ausgangssignale der zweiten Bearbeitungseinrichtung zugeführt. Alle Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die in den jeweiligen Wellenlängenbereichen gemessen wurden, werden durch die zweite Bearbeitungseinrichtung gespeichert.
Im nächsten Schritt setzt die zweite Bearbeitungseinrichtung die Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung ein. Gleichzeitig werden die Gleichungen gelöst, und es wird die Konzentration des Ions in der Zelle angegeben.
So werden in der Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle Konstanten durch asymptotische sukzessive Annäherung unter Verwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens ermittelt. Dementsprechend sind die gegebenen Konstanten in hohem Maße zuverlässig. Werte der Konzentrationen von freien Ionen in einer Zelle, die auf der Basis von in derart hohem Maße zuverlässigen Konstanten gemessen werden, können exakt sein.
Die vorliegende Erfindung läßt sich noch besser aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Figuren verstehen, die zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben werden.
Fig. 1 ist eine Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Fura-2, einem freien Ion (z. B. Ca2+) und einem Protein.
Fig. 2 ist eine Darstellung der Beziehungen zwischen den Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung und Konzentrationen von Fura-2, Protein und Ca2+, sowie ihren Komplexen.
Fig. 3 ist ein Fließbild des Verfahrens zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei Fura-2 verwendet wird.
Fig. 4 ist ein Fließbild des Verfahrens zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der Indo-1 verwendet wird.
Fig. 5 ist eine Ansicht der Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 6 ist eine Ansicht der Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert.
Im Verfahren und in der Vorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform ist der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2, und Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen wird eingestrahlt, um die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung unter Erhalt eines Wertes der Ca2+-Konzentration zu messen.
Zuerst wird das Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform erläutert. Fig. 3 zeigt das Fließbild des Verfahrens gemäß der ersten Ausführungsform.
Es werden fünf Lösungen von Fura-2 und Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der fünf Lösungen werden nach Anregung bei drei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen, nämlich λ₁=340 nm, λ₂=360 nm und λ₃=380 nm (Schritt 100 in Fig. 3). Danach werden vier Lösungen von Fura-2 und Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt, und die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der vier Lösungen werden nach Anregung bei den drei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen (Schritt 110 in Fig. 3). Vier Lösungen von Fura-2, Protein und Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt, und die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der vier Lösungen werden nach Anregung bei den drei Wellenlängen gemessen (Schritt 120 in Fig. 3).
Danach werden sechzehn Sätze von Anfangswerten beliebig gewählter Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angefertigt (Schritt 200 in Fig. 3). Die Anfangswerte der jeweiligen Konstanten werden so gewählt, daß physikalisch bedeutungslose Lösungen nicht gewählt werden, da die jeweiligen Konstanten synthetische Konstanten von Lösungen kubischer Gleichungen sind. Auf der Grundlage von Streubreiten gemessener Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der jeweiligen Sätze von Anfangswerten, die in den Formeln zur Berechnung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung verwendet werden sollen, werden Unterschiede angegeben, und es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Unterschiede in einem erlaubten Bereich liegen (Schritt 210 in Fig. 3). Wenn es solche Sätze gibt, wird einer dieser Sätze, der den kleinsten Unterschied aufweist, als optimaler Satz der Konstanten beurteilt (Schritt 230 in Fig. 3). Wenn es keinen derartigen Satz gibt, ersetzt ein neuer Satz, der durch das modifizierte Simplex-Verfahren auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Unterschied, des Satzes mit dem nächstgrößten Unterschied und des Satzes mit dem kleinsten Unterschied berechnet wird, den Satz mit dem größten Unterschied unter Erzeugung neuer sechzehn Sätze der Konstanten (Schritt 220 in Fig. 3). Es folgt danach Schritt 210, und die Schritte 210 und 220 werden wiederholt, bis ein Satz mit einem Unterschied innerhalb des erlaubten Bereichs gefunden ist.
So werden fünfzehn Arten von Konstanten unter Bestimmung der jeweils höchst zuverlässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten optimiert (Schritt 230 in Fig. 3).
Danach wird Fura-2 in eine Zelle eingeführt (Schritt 240 in Fig. 3). Es werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung mit anregendem Licht bei den drei oben genannten Wellenlängen erzeugt werden, gemessen (Schritt 250 in Fig. 3). Diese gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden in die Gleichgewichts-Konstantengleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung unter Lösung dieser gleichzeitigen Gleichungen eingesetzt (Schritt 260 in Fig. 3). So ergibt sich ein Wert der Ca2+-Konzentration (Schritt 270 in Fig. 3).
Auf diesem Wege kann die Ionenkonzentration in der Zelle mit hoher Zuverlässigkeit gemessen werden.
In der ersten Ausführungsform stellt Fura-2 den Fluoreszenz-Sondenfarbstoff dar. Wenn jedoch andere Sondenfarbstoffe wie beispielsweise Indo-1 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoffe verwendet werden, ist es wegen der Fluoreszenzcharakteristika von Indo-1 bevorzugt, daß eine Messung unter Anregung bei einer Wellenlänge und Fluoreszenzstrahlung bei drei Wellenlängen durchgeführt wird.
Fig. 4 ist ein Fließband des Verfahrens zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist.
Fünf Lösungen von Indo-1 und Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Die Intensitäten von Fluoreszenzstrahlung, die bei drei Fluoreszenz-Wellenlängen erzeugt wird, und zwar bei λ₄=400 nm, λ₅=440 nm und λ₆=480 nm, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge λ=335 nm auf die Lösungen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 300 in Fig. 4). Vier Lösungen von Indo-1 mit einem Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt, und die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die bei den oben beschriebenen drei Wellenlängen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Lösungnen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 310 in Fig. 4). Vier Lösungen von Indo-1, Protein und Ca2+ werden hergestellt, und die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die bei den oben beschriebenen drei Wellenlängen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Lösungen eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 320 in Fig. 4).
Danach werden sechzehn Sätze von Anfangswerten beliebig gewählter Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angefertigt (Schritt 330 in Fig. 4). Auf der Grundlage der Streubreiten der gemessenen Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung der jeweiligen Sätze von Anfangswerten, die in den Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung verwendet werden sollen, werden Unterschiede angegeben. Es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Unterschiede in einem erlaubten Bereich liegen (Schritt 340 in Fig. 4). Wenn es solche Sätze gibt, wird ein derartiger Satz, der den kleinsten Unterschied aufweist, als optimaler Satz der Konstanten bewertet (Schritt 360 in Fig. 4). Wenn es solche Sätze nicht gibt, ersetzt ein neuer Satz, der mit dem modifizierten Simplex-Verfahren auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Unterschied, des Satzes mit dem nächstgrößten Unterschied und des Satzes mit dem kleinsten Unterschied berechnet wird, den Satz mit dem größten Unterschied unter Erzeugung neuer sechzehn Sätze der Konstanten (Schritt 350 in Fig. 4). Danach folgt Schritt 340, und die Schritte 340 und 350 werden wiederholt, bis ein Satz mit einem Unterschied innerhalb des erlaubten Bereichs gefunden wurde.
So werden fünfzehn Arten von Konstanten unter Bestimmung der jeweiligen höchstzuverlässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten optimiert (Schritt 360 in Fig. 4).
Danach wird Indo-1 in eine Zelle eingeführt (Schritt 370 in Fig. 4). Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die bei den oben angegebenen drei Wellenlängen erzeugt wurden, wenn Anregungslicht einer Wellenlänge auf die Zelle eingestrahlt wird, werden gemessen (Schritt 380 in Fig. 4). Die gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden in die Gleichgewichts-Konstantengleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung unter Lösung dieser gleichzeitigen Gleichungen eingesetzt (Schritt 390 in Fig. 4). Hieraus ergibt sich der Wert der Ca2+-Konzentration (Schritt 400 in Fig. 4).
Auf diesem Wege kann die Ionenkonzentration in der Zelle mit hoher Zuverlässigkeit gemessen werden.
Nachfolgend wird nun die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle, die in dem Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, näher erläutert.
Die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß der dritten Ausführungsform der Erfindung wird verwendet bei der Durchführung des Verfahrens zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung. Sie wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Fig. 5 erläutert. Die Vorrichtung gemäß dieser Ausführungsform ist geeignet zur Durchführung des Meßverfahrens bei Anregung mit drei Wellenlängen und Fluoreszenzstrahlung bei einer Wellenlänge. Der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff zur Messung der Ca2+-Konzentration in der Zelle ist Fura-2. Die Biosubstanz ist typischerweise ein Protein. Das Anregungslicht der drei Wellenlängen hat die Wellenlängen 340 nm, 360 nm und 380 nm.
Die in Fig. 5 gezeigte Vorrichtung umfaßt einen Behälter 3 für das Meßobjekt, der die Probe enthält, nämlich eine der Lösungen, die in dem Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform verwendet werden, und eine Zelle mit darin eingeführtem Fura-2, eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 1 zur Bestrahlung der Probe in dem Behälter 3 mit dem erforderlichen Anregungslicht, eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 zum Nachweis von Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die von der Probe emittiert werden, erste und zweite Bearbeitungseinrichtungen zur Aufnahme von Werten der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2. Die erste und die zweite Bearbeitungseinrichtung sind in eine Bearbeitungseinheit 4 eingebaut.
Die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 1 schließt eine Lichtquelle 11 zur Emission von Licht bestimmter Wellenlängenbereiche einschließlich der drei Wellenlängen des Anregungslichts, eine Bündelungslinse 12 zum Bündeln der Lichtstrahlung aus der Lichtquelle 11 und eine Filtereinheit 13 zum Durchtritt von Anregungslicht der erforderlichen Wellenlänge ein. Die Filtereinheit 13 schließt drei Filter 131, 132 und 133 ein, die entsprechend der erforderlichen Wellenlängen des Anregungslichts geschaltet werden können. Die Filter 131, 132 bzw. 133 lassen Licht der Wellenlängen nahe 340 nm, 360 nm und 380 nm durchtreten.
Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 schließt eine Bündelungslinse 22 zur Bündelung der Lichtstrahlung, die den Filter 23 durchlaufen hat, und eine Fluoreszenzintensitäts- Nachweiseinrichtung 21 zum Nachweis der Fluoreszenzintensität ein, die durch die Bündelungslinse 22 hindurchgetreten ist.
Der Meßvorgang mit Hilfe dieser Vorrichtung verläuft wie folgt: Fünf Lösungen von Fura-2 mit Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen werden hergestellt. Eine der Lösungen ist in dem Behälter 3 enthalten. Die Filtereinheit 13 wird eingeschaltet, um den Filter 131 zu betreiben. Die Lichtquelle 11 wird betrieben, um durch den Filter 131 Anregungslicht einer Wellenlänge nahe 340 nm hindurchzuschicken und dieses auf die Lösung in dem Behälter 3 einzustrahlen.
Fluoreszenzlicht von der Lösung, die mit dem Anregungslicht bestrahlt wurde, tritt durch einen Filter 23 hindurch und wird als Eingangssignal an die Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 21 durch die Bündelungslinse 22 geleitet. Die Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 21 mißt die Intensität der Eingangsfluoreszenzstrahlung und sendet einen Wert der gemessenen Intensität an die Bearbeitungseinheit 4 als Ausgangssignal. Die Bearbeitungseinheit 4 speichert den Wert.
Danach wird die Filtereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht einer Wellenlänge nahe 360 nm durch den Filter 132 hindurchtreten zu lassen und dieses Licht auf die Lösung in dem Behälter 3 einzustrahlen. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird durch die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 21 gemessen. Im nächsten Schritt wird die Filtereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht einer Wellenlänge nahe 380 nm durch den Filter 133 hindurchtreten zu lassen und dieses auf die Lösung einzustrahlen. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung wird gemessen. Danach wird dieselbe Verfahrensweise an den restlichen vier Lösungen durchgeführt, und Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die durch das Anregungslicht der oben beschriebenen drei Wellenlängen erzeugt wurden, werden gemessen.
Im nächsten Schritt werden vier Lösungen von Fura-2 mit Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Auf dieselbe Weise, wie sie oben beschrieben wurde, werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei Anregungslicht der oben genannten drei Wellenlängen gemessen. Danach werden vier Lösungen von Fura-2 mit Protein und Ca2+ hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben beschrieben wurde, werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den oben beschriebenen drei Wellenlängen gemessen.
Alle Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung dieser dreizehn Lösungen werden in der Bearbeitungseinheit 4 gespeichert.
Im Anschluß an die Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung der dreizehn Lösungen führt die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaute erste Bearbeitungseinrichtung die folgende Verfahrensweise durch: Als erstes werden sechzehn Sätze von Anfangswerten der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und drei Gleichgewichtskonstanten, die im Zusammenhang mit den Ausführungsformen des Verfahrens beschrieben wurden, festgesetzt. Die Anfangswerte werden so gewählt, daß die jeweiligen Konstanten, die analytische Konstanten von Lösungen von kubischen Gleichungen sind, nicht physikalisch unsinnig sind.
Danach werden Unterschiede der gemessenen Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung gegenüber berechneten Werten, die auf der Grundlage der Anfangswerte mit Hilfe der Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung angegeben werden, angegeben, und es wird abgeschätzt, ob es Sätze gibt, deren Unterschiede im erlaubten Bereich liegen. Wenn es solche Sätze gibt, wird der Satz dieser Sätze mit dem kleinsten Unterschied als Optimalsatz der Konstanten bewertet. Wenn es einen solchen Satz nicht gibt, wird ein neuer Satz auf der Grundlage des Satzes mit dem größten Unterschied, des Satzes mit dem nächstgrößten Unterschied und des Satzes mit dem kleinsten Unterschied mit Hilfe des modifizierten Simplex- Verfahrens berechnet, und der neue Satz ersetzt den Satz mit dem größten Unterschied unter Bildung neuer sechzehn Sätze von Konstanten.
Danach wird dieselbe Verfahrensweise wiederholt, bis ein Satz gefunden wird, dessen Unterschied innerhalb des erlaubten Bereichs liegt, so daß optimale drei Gleichgewichtskonstanten und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten gebildet werden. Die so bestimmten drei Gleichgewichtskonstanten und zwölf Fluoreszenzkoeffizienten werden in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung unter Speicherung in der Bearbeitungseinheit 4 eingesetzt.
Danach wird Fura-2 in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter 3 für das Meßobjekt gegeben. Die Filtereinheit 13 wird umgeschaltet, um nacheinander Anregungslicht einer Wellenlänge von 340 nm, 360 nm und 380 nm durchtreten und auf die Zelle einstrahlen zu lassen. Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die in der Zelle erzeugt werden, werden nacheinander mit der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 2 gemessen. Werte der gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden zu der Bearbeitungseinheit 4 geleitet, und alle Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung für das Anregungslicht der drei Wellenlängen werden gespeichert.
Die zweite Bearbeitungseinrichtung, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, setzt die gespeicherten Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und Formeln zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung unter gleichzeitigem Lösen der Gleichungen ein. So wird der Wert der Konzentration an Ca2+ ermittelt.
Auf dem genannten Weg wird in der vorliegenden Vorrichtung ein Konzentrationswert für Ca2+ auf der Basis von in hohem Maße zuverlässigen Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angegeben. Die erhaltenen Werte sind daher in hohem Maße zuverlässig.
In der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform, die in dem Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform eingesetzt wird, wird die Filtereinheit 13 umgeschaltet, um Anregungslicht einer erforderlichen Wellenlänge einzustrahlen. Es ist jedoch auch möglich, daß die Lichtquelle 11 drei Lichtquellen zum Einstrahlen von Anregungslicht der jeweiligen Wellenlängen einschließt und daß eine der drei Lichtquellen entsprechend der erforderlichen Wellenlänge des Anregungslichts gewählt wird, damit Anregungslicht der erforderlichen Wellenlänge von der gewählten Lichtquelle emittiert wird.
Nachfolgend wird unter Bezugnahme auf Fig. 6 die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in dem Verfahren gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, erläutert. Die Vorrichtung gemäß dieser Ausführungsform wird für das Meßverfahren bei Anregung durch Licht einer Wellenlänge und Emission von Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung dreier Wellenlängen verwendet. Zur Messung der Ca2+-Konzentration dient Indo-1 als Fluoreszenz-Sondenfarbstoff. Die Biosubstanz ist typischerweise ein Protein. Die drei Fluoreszenz-Wellenlängen, die gemessen werden sollen, liegen bei 400 nm, 440 nm und 480 nm.
Die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle, die in dem Verfahren gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, schließt einen Behälter 3 für das Meßobjekt zum Enthalten einer Probe, nämlich einer der Lösungen und einer Zelle mit darin eingeführtem Indo-1, eine Anregungslicht- Bestrahlungseinrichtung 5 zum Abstrahlen von Anregungslicht einer erforderlichen Wellenlänge an die Probe in dem Behälter 3, eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 zur Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung der Probe und erste und zweite Bearbeitungseinrichtungen zum Aufnehmen, Speichern und Verarbeiten von Werten der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung ein, die als Ausgangssignale von der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 stammen. Die erste und die zweite Bearbeitungseinrichtung sind in eine Bearbeitungseinheit 4 eingebaut.
Die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 5 schließt eine Lichtquelle 51 zur Emission von Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches einschließlich der Wellenlänge des Anregungslichts und eine Bündelungslinse 52 zum Bündeln von Lichtstrahlen aus der Lichtquelle 51 sowie einen Filter 53 zum Durchtretenlassen von Anregungslicht der festgesetzten Wellenlänge ein.
Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung 6 schließt eine Filtereinheit 63 zum Durchtretenlassen von Fluoreszenzstrahlung bestimmter Wellenlängen, eine Bündelungslinse 62 zum Bündeln von Licht, das durch ein Filter der Filtereinheit 63 hindurchtritt, und eine Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung 61 zur Aufnahme von Licht durch die Bündelungslinse 62 und Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung ein. Die Filtereinheit 63 schließt drei Filter 631, 632 und 633 ein, die jeweils Fluoreszenzstrahlung von Wellenlängen nahe 400 nm, 440 nm und 480 nm passieren lassen.
Die Arbeitsweise der Vorrichtung zum Messen der Konzentration des freien Ions in der Zelle ist wie folgt: Zuerst werden fünf Lösungen von Indo-1 mit Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Eine der Lösungen wird in dem Behälter 3 für das Meßobjekt angeordnet. Die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 5 wird unter Bestrahlen der Lösung in dem Behälter 3 mit Anregungslicht betrieben. Danach wird die Filtereinheit 63 eingeschaltet, um durch den Filter 631 Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge von 400 nm aus der Lösung hindurchtreten zu lassen, die mit Anregungslicht bestrahlt wurde. Die Fluoreszenzstrahlung wird durch die Bündelungslinse 62 an die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 61 geleitet. Die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 61 mißt die Intensität der Fluoreszenzstrahlung und gibt als Ausgangswert einen Wert der Intensität an die Bearbeitungseinheit 4 ab. Die Bearbeitungseinheit 4 speichert diesen Wert. Danach wird die Filtereinheit 63 der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinheit 6 umgeschaltet, um durch den Filter 632 Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge nahe 440 nm hindurchtreten zu lassen, und die Nachweiseinheit mißt die Intensität der Fluoreszenzstrahlung. Danach wird die Filtereinheit 63 umgeschaltet, um durch den Filter 633 Fluoreszenzstrahlung einer Wellenlänge nahe 480 nm hindurchtreten zu lassen, und die Nachweiseinheit mißt die Intensität der Fluoreszenzstrahlung. Danach wird diese Verfahrensweise an den verbleibenden vier Lösungen durchgeführt, und die Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden bei den drei Wellenlängen gemessen.
Danach werden vier Lösungen von Indo-1 mit Protein mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben angegeben wurde, werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den drei Wellenlängen gemessen. Als nächstes werden vier Lösungen von Indo-1 mit Protein und Ca2+ mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. In derselben Weise, wie dies oben beschrieben wurde, werden Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den drei Wellenlängen gemessen.
Alle Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung, die an den dreizehn Lösungen gemessen wurden, werden durch die Bearbeitungseinheit 4 gespeichert.
Im Anschluß an die Messung an den dreizehn Lösungen wird dasselbe Verfahren wie das, was in der ersten Bearbeitungseinrichtung in der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform durchgeführt wurde, mit der ersten Bearbeitungseinrichtung durchgeführt, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, und es werden zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und drei Gleichgewichtskonstanten bestimmt.
Als nächstes wird Indo-1 in eine Zelle eingeführt, und die Zelle wird in den Behälter 3 für das Meßobjekt gegeben. Die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung 5 wird unter Bestrahlen der Zelle in dem Behälter 3 mit dem Anregungslicht betrieben. Die Filtereinheit 63 wird so geschaltet, daß die Fluoreszenzstrahlung der drei Wellenlängen, die von der Zelle durch Bestrahlen mit dem Anregungslicht erzeugt werden, die jeweiligen Filter 631, 632 und 633 durchläuft, und die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung 61 mißt die jeweiligen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei den jeweiligen Wellenlängen. Die Werte der gemessenen Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung werden als Eingangssignal an die Bearbeitungseinheit 4 geleitet, und die Bearbeitungseinheit 4 speichert die Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung bei allen drei Wellenlängen.
Die zweite Bearbeitungseinrichtung, die in die Bearbeitungseinheit 4 eingebaut ist, setzt die gespeicherten Werte der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung in die Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen und die Formeln zur Berechnung der Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung unter gleichzeitiger Lösung der Gleichungen ein. So wird der Wert der Ca2+-Konzentration erhalten.
Auf diesem Weg werden in der Vorrichtung gemäß der vierten Ausführungsform Werte für die Konzentration des Ca2+ auf der Basis hochzuverlässiger Fluoreszenzkoeffizienten und Gleichgewichtskonstanten angegeben. Die Werte sind dementsprechend sehr zuverlässig.
In der Vorrichtung gemäß der dritten Ausführungsform emittiert die Lichtquelle 51 Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich der erforderlichen Wellenlänge. Es kann jedoch auch eine Lichtquelle verwendet werden, die Anregungslicht der erforderlichen Wellenlänge emittiert.
In den Vorrichtungen zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle gemäß der dritten und vierten Ausführungsform der Erfindung können die Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtungen Spektofluoreszenz-Meßgeräte (Spektrofluoreszenz-Meter) sein. Der Fluoreszenzkoeffizient ändert sich in Abhängigkeit von der Dicke einer Probe eines Meßobjekts, d. h. der optischen Weglänge. Es ist also erforderlich, die optischen Weglängen der Proben zu vereinheitlichen. In den Spektrofluoreszenz-Meßgeräten der dritten und vierten Ausführungsform ist die Dicke einer der Messung zu unterwerfenden Zelle die optische Weglänge, und der Wert der optischen Weglänge kann immer konstant sein. Die Fluoreszenzintensitäts- Nachweisvorrichtung kann mit Fluoreszenz-Mikroskopen mit Photometern versehen sein. Zur Messung mit diesen Fluoreszenz-Mikroskopen ist es erforderlich, konische fokale optische Systeme einzubauen, mit denen sich Teilbilder einer bestimmten Dicke erzeugen lassen.
Durch das Verfahren und die Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle kann z. B. die Konzentration des freien Ions Mg2+ gemessen werden. Für diese Messung kann der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff ein Farbstoff sein, der zur Messung der Konzentration von Mg2+ geeignet ist.

Claims (21)

1. Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, einschließlich des Einführens des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs in die Zelle und Messung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • (i) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Lösungen des Fluoreszenz- Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit verschiedenen Konzentrationen mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird;
  • (ii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Lösungen
    • a) einer Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, Bindungen mit dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und so die Intensität der Fluoreszenzstrahlung ändert, und
    • b) des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs
  • mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Lösungen der Biosubstanz, des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht dreier unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iv) a) Festsetzen von Anfangswerten für drei Arten von Gleichgewichtskonstanten, die sich aus den Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion und der Biosubstanz in der Zelle zu Komplexen ergeben;
  • b) Festsetzen von Anfangswerten der zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die aus den Schritten (i) bis (iii) erhältlich sind; und
  • c) Abschätzen der Unterschiede zwischen der auf der Grundlage der Anfangswerte, berechneten Intensität der Fluoreszenzstrahlung und der in den Schritten (i) bis (iii) gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung und sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Unterschiede zwischen den Anfangswerten und den gemessenen Werten der Intensität der Fluoreszenzstrahlung in einen erlaubten Bereich fallen; und
    nach erfolgter Kalibrierung in den Schritten (i) bis (iv)
  • (v) Messung der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht dreier verschiedener Wellenlängen erzeugten Fluoreszenzstrahlung und Lösen der Gleichungen zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, in die die gemessene Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt ist, und der Gleichgewichts-Reaktionsgleichungen zum Erhalt der Konzentration des freien Ions.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) die erste Zahl der Lösungen größer oder gleich vier ist, in Schritt (ii) die zweite Zahl der Lösungen größer oder gleich drei ist und in Schritt (iii) die dritte Zahl der Lösungen größer oder gleich drei ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (iv) sechzehn Sätze der Anfangswerte der drei Arten der Gleichgewichtskonstanten und sechzehn Sätze der Anfangswerte der zwölf Arten der Fluoreszenzkoeffizienten unter Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens festgesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Fura-2 ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das freie Ion Ca2+ ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das freie Ion Mg2+ ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Biosubstanz ein Protein ist.
8. Verfahren zur Messung der Konzentration eines freien Ions in einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs, einschließlich des Einführens des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs in die Zelle und Messung der Konzentration des freien Ions in der Zelle auf der Grundlage der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
  • (i) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer ersten Zahl von Lösungen des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit verschiedenen Konzentrationen mit Anregungslicht einer Wellenlänge erzeugt wird;
  • (ii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei den drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer zweiten Zahl von Lösungen von
    • a) einer Biosubstanz, die eine von dem freien Ion verschiedene Substanz ist, Bindungen mit dem Fluoreszenz- Sondenfarbstoff und dem freien Ion eingeht und so die Intensität der Fluoreszenzstrahlung ändert, und
    • b) des Fluoreszenz-Sondenfarbstoffs
  • mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iii) Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, die bei den drei Fluoreszenz-Wellenlängen durch Bestrahlung einer dritten Zahl von Lösungen der Biosubstanz, des Fluoreszenz- Sondenfarbstoffs und des freien Ions mit Anregungslicht einer Wellenlänge erzeugt wird, wobei die Lösungen unterschiedliche Konzentrationen aufweisen;
  • (iv) a) Festsetzen von Anfangswerten für drei Arten von Gleichgewichtskonstanten, die sich aus den Reaktionen zwischen dem Fluoreszenz-Sondenfarbstoff, dem freien Ion und der Biosubstanz in der Zelle zu Komplexen ergeben;
  • b) Festsetzen von Anfangswerten der zwölf Arten von Fluoreszenzkoeffizienten, die aus den Schritten (i) bis (III) erhältlich sind; und
  • c) Abschätzen der Unterschiede zwischen der auf der Grundlage der Anfangswerte berechneten Intensität der Fluoreszenzstrahlung und in der in den Schritten (i) bis (iii) gemessenen Intensität der Fluoreszenzstrahlung und sukzessives Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mittels des modifizierten Simplex-Verfahrens, bis die Unterschiede zwischen den Anfangswerten und den gemessenen Werten der Intensität der Fluoreszenzstrahlung in einen erlaubten Bereich fallen; und
    nach erfolgter Kalibrierung in den Schritten (i) bis (iv).
  • (v) Messung der Intensität der durch Bestrahlung der Zelle mit Anregungslicht der einen Wellenlänge erzeugten Fluoreszenzstrahlung und Lösen der Gleichungen zur Berechnung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung, in die die gemessene Intensität der Fluoreszenzstrahlung eingesetzt ist, und der Gleichgewichts-Reaktionsgleichung zum Erhalt der Konzentration des freien Ions.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenz-Sondenfarbstoff Indo-1 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) die erste Zahl der Lösungen größer oder gleich vier ist, in Schritt (ii) die zweite Zahl der Lösungen größer oder gleich drei ist in Schritt (iii) die dritte Zahl der Lösungen größer oder gleich drei ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (iv) sechzehn Sätze der Anfangswerte der drei Arten der Gleichgewichtskonstanten und sechzehn Sätze der Anfangswerte der zwölf Arten der Fluoreszenzkoeffizienten unter Anwendung des modifizierten Simplex-Verfahrens festgesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das freie Ion Ca2+ ist.
13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das freie Ion Mg2+ ist.
14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Biosubstanz ein Protein ist.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend
  • - einen Behälter (3 ) für das Meßobjekt;
  • - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (1) zur Erzeugung von Anregungslicht mit drei unterschiedlichen Wellenlängen und zur Einstrahlung des Anregungslichts auf das Meßobjekt in dem Behälter (3);
  • - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (2) zum Nachweis der Fluoreszenzintensität, die durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugt wird;
  • - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (2), zur Speicherung des Ausgangssignals, zum Festsetzen der Anfangswerte für die drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und der Anfangswerte der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten, zum Abschätzen des Unterschieds zwischen den Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und den Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (2) stammen, zum sukzessiven Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex-Verfahren, bis der Unterschied der Anfangswerte der Fluoreszenzintensitäten von den mit der Fluoreszenzintensitäts-Nachweisvorrichtung (2) erhaltenen in einen erlaubten Bereich fällt, und zur Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichgewichtskonstanten; und ferner umfassend
  • - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (1) eine Lichtquelle (11) zur Emission von Licht bestimmter Wellenlängenbereiche, einschließlich der drei Wellenlängen des Anregungslichts, und drei Filter (131, 132, 133) zum Durchtritt von Licht jeweils nur einer Wellenlänge der drei unterschiedlichen Wellenlängen des Anregungslichts umfaßt.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (1) drei Lichtquellen (11) zur Emission von Anregungslicht der drei unterschiedlichen Wellenlängen umfaßt.
18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 14, umfassend
  • - einen Behälter (3) für das Meßobjekt;
  • - eine Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (5) zur Erzeugung von Anregungslicht mit einer Wellenlänge und zur Einstrahlung des Anregungslichts auf das Meßobjekt in dem Behälter (3);
  • - eine Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (6) zum Nachweis der Fluoreszenzintensitäten bei drei Wellenlängen; die durch Einstrahlung des Anregungslichts erzeugt werden;
  • - eine erste Bearbeitungseinrichtung zur Aufnahme eines Ausgangssignals der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (6), zur Speicherung des Ausgangssignals, zum Festsetzen der Anfangswerte für die drei Arten von Gleichgewichtskonstanten und der Anfangswerte der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten, zum Abschätzen des Unterschieds zwischen den Fluoreszenzintensitäten auf der Grundlage der Anfangswerte und den Fluoreszenzintensitäten, die als Ausgangssignale aus der Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (6) stammen, zum sukzessiven Wiederholen asymptotischer Korrekturen der Anfangswerte mit dem modifizierten Simplex- Verfahren, bis der Unterschied der Anfangswerte des Fluoreszenzintensitäten von den mit der Fluoreszenzintensitäts- Nachweiseinrichtung (2) erhaltenen in einen erlaubten Bereich fällt, und zur Bestimmung der zwölf Fluoreszenzkoeffizienten und der drei Gleichgewichtskonstanten; und ferner umfassend
  • - eine zweite Bearbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration des freien Ions in der Zelle.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (5) eine Lichtquelle (51) zur Emission von Licht eines Wellenlängenbereichs einschließlich der Wellenlänge des Anregungslichts und einen Filter (53) zum Durchtritt der Wellenlänge des Anregungslichts umfaßt.
20. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslicht-Bestrahlungseinrichtung (5) eine Lichtquelle (51) zur Emisson der Wellenlänge des Anregungslichts umfaßt.
21. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzintensitäts-Nachweiseinrichtung (6) drei Filter (631, 632, 633) zum Durchtritt von Fluoreszenzlicht der drei unterschiedlichen Wellenlängen umfaßt.
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