WO2003098174A1 - Verfahren und vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden messung von fluoreszenzlicht - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden messung von fluoreszenzlicht Download PDF

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Erwin Neher
Richard Neher
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    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel

Definitions

  • the invention relates to a method for spectrally differentiating, imaging measurement of fluorescent light of the type mentioned in the preamble of claim 1.
  • the invention further relates to a device for spectrally differentiating, imaging measurement of fluorescent light of the type mentioned in the preamble of claim 22.
  • fluorescence probes have been developed especially for fluorescence microscopy. These are suitable, for example, for the specific labeling of antibodies, certain DNA sequences or other biological structures. They also include fusion constructs of certain proteins with fluorescent proteins, such as GFP (Green Fluorescent Protein) or YFP (Yellow Fluorescent Protein) etc. Furthermore, they include special indicator dyes, the fluorescence with regard to their intensity and / or their emission spectrum with the concentration certain ions, for example calcium, is correlated.
  • Modern biology tries to adapt the complexity of its measurement methods to the complexity of the samples examined and is therefore often interested in the largest possible number of different localize markings in a sample and spatially resolve them against each other.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Another current problem is the separation of the fluorescence of an indicator dye into the portions of the bound and free form of the fluorophore for the purpose of forming the ratio and then calculating the activity of a ligand.
  • autofluorescence i.e. the nonspecific background fluorescence that shows many structures such as cells and substrate supports.
  • organic fluorophores generally used have relatively broad excitation and emission spectra, which is due to the large number of phononic sub-levels involved in these organic molecules. This makes it comparatively difficult to specifically excite or specifically detect individual species of fluorophores contained in the sample. Rather, a complex composition of contributions from different species is usually obtained as a signal.
  • excitation channel is the sum of the properties of the fluorescent exciter To understand light. This includes in particular the spectral properties, to which the intensity of the respective spectral components is also included in the context of this description. However, other properties, such as the excitation time and / or the excitation duration, summarized as the excitation time, can also be used to define an excitation channel.
  • detection channel is understood here as the sum of the properties of the elements that conduct, filter and detect the fluorescent light emitted by the sample.
  • this includes the spectral properties, including the respective sensitivities for individual spectral components, and, on the other hand, the detection time, which can include the detection time and duration.
  • Special combinations of one excitation channel and one detection channel are collectively referred to below as measuring channels.
  • the frequency ranges of the individual measurement channels can be selected so that each channel corresponds to a fluorophore.
  • a disadvantage of these techniques is that a certain amount of crosstalk between the channels is usually unavoidable. This is particularly true when a large number of different fluorophores are used in a sample, the spectra of which overlap due to the limited bandwidth of the usable wavelengths. This can be counteracted by sharply limiting the spectral limits of the individual detection channels, for example using narrow bandpass filters. However, this has the consequence that a large part of the emitted fluorescence photons do not contribute to the signaling, which has a negative effect on the quality of the detected signal.
  • the problems mentioned can be greatly reduced if broad measurement channels are selected, the crosstalk of which is deliberately accepted, and the recorded data are subjected to considerable arithmetical postprocessing or evaluation.
  • the recorded signals are converted into digital data in the detectors or downstream conversion units and stored in a storage unit of a digital data processing system.
  • LSM laser scanning microscopy
  • the digitization and post-processing of the data is even an essential part of the technology.
  • the previously mentioned evaluation of the data usually takes place by means of a digital accounting unit
  • Linear unmixing method achieved. This method is based on setting up and solving an inhomogeneous, linear
  • Measurement channels establish a connection between the measured
  • Vector B represents the different species of fluorophores in their relative concentration in a given pixel. Let the number of different fluorophore species be p. The vector B p thus has components B. The vector y represents that in everyone
  • Measuring channel detected signal The number of measuring channels is q.
  • the vector 7 represents the excitation intensity used for each measurement channel and thus has q components /,.
  • the matrix A is the coefficient matrix that the chemical composition B of fluorophores over the excitation intensities I r
  • Excitation channels and the other properties a ⁇ r of the measurement channels are linked to the result signal y.
  • the matrix A thus has pq elements I ⁇ ⁇ ,.
  • the vector b with q components b, after all, is a correction quantity that contains the scattered light or another background light in each Reproduces measurement channel.
  • the sizes B ⁇ are usually to be understood as location-dependent, while the other sizes on the right-hand side of equations (1) and (2) each represent parameters that are normally the same for all pixels.
  • Autofluorescence of the measurement object can be treated either as fluorescence from an additional fluorophore B ⁇ or as background light b (if location-independent). at
  • a FRET pair can be regarded as an independent chromophore, the concentration of which is given by one of the sizes B ⁇ .
  • the method of “linear unmixing” offers a tried and tested means of evaluating data when the properties of the measuring channels used are known, but the disadvantage is that the selection of suitable measuring channels, ie the setting of all parameters such as excitation wavelength, intensity, time and detection wavelengths and time, is still subject to the intuition of the user However, if the intuition is based on clear rules that suggest that the user still assign a measurement channel to a fluorophore species, the possibilities offered by complex data analysis are usually not exploited.
  • the object of the present invention is to develop a generic method in such a way that the quality of the data obtained is improved in a simple manner.
  • a further object of the present invention is to develop a generic device in such a way that the results obtained with it are improved in a simple manner.
  • the invention is based on a generic method in that the properties of a plurality of measuring channels are set automatically before the measurement is carried out or the user is given appropriate instructions for manual setting.
  • the automatic settings or instructions take place in accordance with the result of a mathematical optimization process carried out by a calculation unit of the digital data processing system.
  • the fluorescence characteristics of at least some of the fluorophores contained in the sample are taken into account.
  • Such a mathematical optimization procedure must be strictly separated from the automatic control of certain standard settings, which can be programmed in the factory or are based on a setting library set up by the user. Rather, the user of the data processing system enters which fluorophores he suspects in the sample and their characteristics.
  • This information is then used as the basis for the mathematical optimization process that the for the special needs of the user calculated optimal settings of the measuring channels.
  • a segmentation of the entire fluorescence spectrum that is largely contrary to intuition, but particularly favorable in terms of a mathematical evaluation of the recorded data, can be carried out instead of cutting out narrow bands with filters and unnecessarily reducing the number of photons contributing to the signal and thus the signal quality.
  • the characteristics of a multiplicity of fluorophores are advantageously stored in one or more libraries in a storage unit of the digital data processing system, so that it is sufficient for the user to identify the fluorophores suspected in the sample without having to enter their complete characteristics.
  • the optimization method is advantageously designed so flexibly that it is not only optimized for the solvability or uniqueness of the solution of the system of equations, but also additional conditions selected by the user are taken into account. Examples of such constraints will be explained below.
  • the optimization method advantageously comprises the optimization of a condition number of a matrix expression which contains the matrix which is formed by the coefficients of the aforementioned linear system of equations.
  • this is to be understood such that the algorithmic implementation of the method according to the invention can be represented mathematically as an optimization of a condition number of the matrix expression mentioned.
  • it may be possible to dispense with the explicit definition of a matrix or an array in the context of a computer program.
  • the matrix expression which is used as the basis for the calculation of the condition number, is particularly preferably formed as the left-sided matrix product of matrix A with its transposed A, that is to say AA. This is based on the consideration that the expressions of equations 1 and 2 can be converted into A by ⁇ on the left-hand side
  • a matrix weighted with the measurement errors expected by the user can be used, which can be viewed as minimizing the quantity ⁇ 2 (chi square) known from the statistics.
  • condition number to be optimized can essentially be the determinant of the
  • condition numbers can be used as an optimization criterion, which also contain track N of the matrix expression.
  • the size is the condition number to be optimized
  • the ratio of the smallest to the largest eigenvalue of the matrix expression is used as the condition number. It has been shown that the optimization of each of these condition numbers by varying the matrix elements 1 0 ⁇ to a choice of
  • Measurement channel properties lead, which in many cases strongly oppose intuition, but deliver excellent results with regard to data evaluation downstream of the measurement, in particular by means of the “linear unmixing” method.
  • the implementation of the calculated optimization result in the realization of physical properties of the measuring channels can be carried out in many ways.
  • frequency or frequency band selection in the excitation and / or detection beam path through adjustable filters such as AOTFs (Acusto Optic Tunable Filters) or LCTFs (Liquid Crystal Tunable Filters).
  • Fixed edge filters, bandpass filters and / or beam splitters, which are arranged, for example, on motor-driven filter slides or wheels, can also be used.
  • Another possibility for automatically influencing the measurement channel characteristics is to vary the excitation intensities, for example by introducing so-called gray wedges into the excitation beam path.
  • the temporal characteristics of the measuring channels can also be varied in the implementation of the optimization method according to the invention.
  • the excitation duration can vary or temporal detection windows can be defined for the separation of fluorescence components with a short and long lifespan.
  • a multitude of implementation options is known to the person skilled in the art.
  • Condition numbers of matrices essentially provide estimates of maximum errors, which, however, can often be well below in practice. This is especially true if known structures of a given problem are taken into account.
  • the possibility of further optimization is therefore provided, in which the special properties of the experimental sources of interference in fluorescence measurements are formulated.
  • a second optimization step is advantageously provided, in which the noise of the signal to be expected is optimized by varying the coefficients describing the properties of the measuring channels.
  • (B) denotes the expected value of the solution B, which takes into account that the vector y - l - b with an experimental
  • Fluctuation ⁇ is affected.
  • the vector ⁇ is to be understood as a component-wise square root of the expressions ⁇ f , which are each to be understood as expected values of the variance of the measured value v. These are composed of two components, namely the photon noise, the variance of which is proportional to the signal level, and the statistically independent, constant detector noise, which is composed of dark current and readout noise from the respective detector.
  • s is a proportionality constant (a suitably calculated single photon contribution) and ⁇ 0 2 _, the sum of all constant contributions to
  • the fluctuation ⁇ of the component B ⁇ of the vector B can be described as
  • Equation 5 is a linear system of equations and I - b is not of y r
  • the quantities ⁇ ) contain the measured values y r , so that for the minimization of information about the size of the expected signals must be provided by the user.
  • Variation of the coefficients describing the measuring channels is optimized.
  • the noise of the signal to be expected . is optimized taking into account one or more secondary conditions that can be introduced by the user.
  • One of these constraints which is also part of the first optimization step described above. Can be used can be an upper limit for the bleaching of one or more fluorophores in an advantageous embodiment of the method according to the invention. As the bleaching progresses the signal decreases while If certain parts of the noise are time-independent, the optimization may take place in relation to the duration or intensity of the lighting.
  • the minimization of the noise of a signal of a certain intensity can advantageously be used as a further possible secondary condition. This secondary condition is particularly useful when the expected signal is so low that the total noise of the measuring channel is dominated by dark current and read noise from the detector.
  • the maximum spectral resolution of different fluorophores in a specific area of a previously recorded test image can be used in an advantageous embodiment of the method according to the invention. This is particularly important where one or more different fluorophores are to be resolved against the background of a general, non-specific autofluorescence of the sample or if a certain image area is of particular interest to the user.
  • the minimization of the relative error of the measurement channels is used as a secondary condition.
  • This form of secondary condition is preferably introduced when ratio measurements, such as FRET measurements, are to be carried out.
  • the optimization method according to the invention is carried out as part of an iterative, dialog-controlled process for defining the secondary conditions, which allows the user to enter further information after carrying out a preliminary optimization step and one or more new ones
  • a device such as a laser scanning microscope, is provided according to the invention, the digital data processing system of which is programmed such that the above-described optimization method according to the invention can be carried out. and which has the technical facilities for automatically setting the measurement channel properties mentioned above.
  • Fig. 1 shows the schematic structure of a laser scanning microscope set up according to the invention.
  • the system essentially consists of three parts, namely a data processing system 10, a user interface 20 and an optical / electronic structure 30.
  • the data processing system comprises a calculation unit 11 in which the optimization method according to the invention and preferably the one required for evaluating the recorded data are carried out Calculations are carried out.
  • a storage unit 12 is included in which, on the one hand, recorded data can be stored or temporarily stored, but on the other hand, the program instructions necessary for carrying out the method according to the invention and libraries are also stored in which the data required for the calculations according to the invention are stored.
  • the data processing system 10 further comprises a data interface 13, via which the recorded measurement data and user inputs can be fed into the data processing system 10 via the user interface 20 and control commands to adjustable components of the optical / electronic structure 30 of the device and information can be output to the user interface 20.
  • the aforementioned elements of the data processing system 10 can be implemented in a variety of ways known to the person skilled in the art and their technical details can be adapted to the specific configuration in question.
  • the measurement channels are defined as specific combinations of special excitation and detection channels. In the exemplary embodiment shown in FIG. 1, the excitation channels are comparatively simple.
  • They essentially consist of two laser sources 31 a and 31 b which transmit the sample 40 via motor-controlled collimators 32a, 32b, deflection mirrors 33a, 33b, 33c, a motor-controlled beam splitter wheel 34a, a scanning mirror 35 and a scanning lens 36 through microscope objective 39 illuminate.
  • the properties of the excitation light with respect to wavelength and intensity are controlled by the laser 3 1 a, 31 b, the collimators 32 a, 32 b and the beam splitter wheel 34 a via the control lines 131 a, 131 b and 134 a adjustable.
  • the control of the scanning mirror 35 via the control line 135 takes place in a conventional manner.
  • the fluorescent light which is shown schematically in FIG. 1 as a dashed line, runs from the sample 40 through the microscope objective 39, deflecting mirror 33 c, scanning lens 36 and scanning mirror 35 to the motor-controlled beam splitter wheel 34 a.
  • the essential portion of the fluorescent light passes the set beam splitter, while light is reflected in the region of the excitation wavelength.
  • the detection channels are set via the setting of this beam splitter wheel 34a and via the settings of further beam splitter wheels 34b and 34c, which are set via the control lines 134b and 134c in accordance with the parameters determined by the optimization method according to the invention.
  • a further channel specification takes place via the setting of the filter wheels 36a and 36b, which are set via the control lines 136a and 136b according to the parameters determined by the optimization method according to the invention.
  • the preselected fluorescent light falls on different ones
  • Detectors 37a, 37b and 37c the data of which are fed into the data processing system 10 via the input lines 137a, 137b and 137c. Depending on the special structure, the data is already in the data
  • the data recorded in this way and stored in the storage unit 12 of the digital processing system 10 are known by the calculation unit 11
  • Linear unmixing method is used.
  • the setting or definition of the measuring channels according to the invention in the exemplary embodiment shown relates both to the spectral sectioning of the fluorescent light and to the number of measuring channels used, ie the number of combinations of excitation and detection channels used.
  • the number and type of the detectors is as variable as that of the light sources.
  • detectors can be used which are controlled, for example, with regard to their detection time, ie detection duration and / or time of detection, according to calculated optimization parameters.
  • FIG. 1 merely represents an exemplary illustration of a particularly advantageous variant. In the area of the present invention, however, many variations are conceivable.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, bei dem eine Fluorophore verschiedener Spezies enthaltende Probe mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften und/oder die Anregungszeit definierten Anregungskanals bestrahlt wird und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht von wenigstens einem durch seine spektrale Detektionscharakteristik und/oder die Detektionszeit definierten Detektionskanal empfangen und in ein digitales Signal umgewandelt wird, wobei das digitale Signal zur weiteren Verarbeitung in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Eigenschaften mehrerer als spezifische Kombinationen jeweils eines Anregungs- und eines Detektionskanals definierter Messkanäle vor Durchführung der Messung gemäss dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens, das die Fluoreszenzcharakteristiken wenigstens einiger der vom Benutzer in der Probe vermuteten Fluorophore berücksichtigt, automatisch eingestellt oder entsprechende Anweisungen zur manuellen Einstellung durch den Benutzer gegeben werden. Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur spektral differenzierenden, Bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht der im Oberbegriff von Anspruch 1 genannten Art.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vorrichtung zur spektral differenzierenden, Bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht der im Oberbegriff von Anspruch 22 genannten Art.
Derartige Verfahren und Vorrichtungen finden insbesondere in der modernen Biologie heute vielfach Anwendung. Insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Vielzahl spezifischer Fluoreszenzsonden entwickelt worden. Diese eignen sich beispielsweise zur spezifischen Markierung von Antikörpern, bestimmten DNA-Sequenzen oder anderen biologischen Strukturen. Sie umfassen weiter Fusionskonstrukte bestimmter Proteine mit fluoreszierenden Proteinen, wie etwa GFP (Green Fluorescent Protein) oder YFP (Yellow Fluorescent Protein) etc. Weiter sind besondere Indikatorfarbstoffe von ihnen umfasst, dem Fluoreszenz im Hinblick auf ihre Intensität und/oder ihr Emissionsspektrum mit der Konzentration bestimmter Ionen, beispielsweise Calcium, korreliert ist.
Die moderne Biologie versucht, die Komplexität ihrer Messmethoden an die Komplexität der untersuchten Proben anzupassen und ist somit vielfach daran interessiert, eine möglichst große Zahl von unterschiedli- chen Markierungen in einer Probe zu lokalisieren und räumlich gegeneinander aufzulösen.
Ein anderes, besonders aktuelles Problem ist die quantitative Erfassung von Fluorophoren, die miteinander durch fluoreszenzlose Energieüber- tragung FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in Wechselwirkung treten. Solche FRET-Paare, bestehend aus Donor und Akzeptor, sind im optischen Mikroskop räumlich nicht gegeneinander auflösbar. Vielmehr wird die Überlagerung der Donor- und Akzeptor-Spektren bzw. ihr Verhältnis zueinander gemessen.
Ein weiteres, aktuelles Problem ist die Auftrennung der Fluoreszenz eines Indikatorfarbstoffs in die Anteile der gebundenen und freien Form des Fluorophors zum Zwecke der Verhältnisbildung und anschließenden Berechnung der Aktivität eines Liganden.
Ein weiteres Problem, das bei nahezu allen bildgebenden Fluoreszenz- verfahren in der Biologie zum Tragen kommt, ist die Berücksichtigung der sog. Autofluoreszenz, d.h. der unspezifischen Hintergrundfluoreszenz, die viele Strukturen, wie etwa Zellen und Substratträger zeigen.
Eine wesentliche, prinzipielle Einschränkung dieser Verfahren liegt darin, dass die in der Regel verwendeten organischen Fluorophore relativ breite Exitations- und Emissionsspektren aufweisen, was auf die Vielzahl der in diesen organischen Molekülen beteiligten phononischen Subni- veaus zurückzuführen ist. Damit wird es vergleichsweise schwer, einzelne, in der Probe enthaltene Spezies von Fluorophoren spezifisch anzuregen oder spezifisch zu detektieren. Vielmehr erhält man in der Regel als Signal eine komplexe Zusammensetzung von Beiträgen der unterschiedlichen Spezies.
Konventionell behilft man sich damit, möglichst weit auseinander liegende Anregungskanäle und möglichst enge Detekt skanäle zu verwenden. Der Begriff des Anregungskanals ist in diesem Zusammen- hang als die Summe der Eigenschaften des die Fluoreszenz anregenden Lichtes zu verstehen. Dies umfasst insbesondere die spektralen Eigenschaften, zu denen im Rahmen dieser Beschreibung auch die Intensität der jeweiligen spektralen Komponenten gerechnet wird. Allerdings können auch andere Eigenschaften, wie etwa der Anregungs- Zeitpunkt und/oder die Anregungsdauer, zusammengefasst als Anregungszeit, mit zur Definition eines Anregungskanals verwendet werden. In analoger Weise wird hier der Begriff des Detektionskanals als die Summe der Eigenschaften der das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht leitenden, filternden und detektierenden Elemente verstanden. Dies umfasst wiederum einerseits die spektralen Eigenschaften, einschl. der jeweiligen Empfindlichkeiten für einzelne spektrale Komponenten, sowie andererseits die Detektionszeit, die Detektionszeitpunkt und Detektions- dauer umfassen kann. Spezielle Kombinationen von je einem Anregungskanal und einem Detektionskanal werden im Folgenden zusammenfassend als Messkanäle bezeichnet.
In der gängigen Praxis sind verschiedene Methoden bekannt, die auf die optimale spektrale Auflösung der unterschiedlichen Fluophorenarten gegeneinander abzielt und von den Eigenschaften der Fluorophore und ihrer Kombination abhängen. So ist es beispielsweise möglich, bei einem gegebenen Detektionskanal mehrere Aufnahmen nacheinander mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen durchzuführen, wobei die Anregungswellenlängen jeweils so gewählt sind, dass das Absorptionsmaximum j eweils einer Fluorophorenspezies möglichst genau getroffen wird, In diesem Fall wird j e Messung ein Messkanal benutzt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Probe bei einer Exitationswellenlänge anzuregen, die im Bereich der Anregungsspektren mehrerer Fluorophorenspezies liegt, und das Emissionslicht durch Filtersätze oder Kaskaden von Strahlteilern in spektrale Bereiche aufzuteilen und diese Teile getrennten Photosensoren zuzuführen. Bei diesem Verfahren werden also mehrere Messkanäle gleichzeitig benutzt. Sind die Emissions- bzw. Exitationsbanden der interessierenden Fluorophore genügend weit voneinander getrennt, lassen sich die Frequenzbereiche der einzelnen Messkanäle so wählen, dass jeder Kanal einem Fluorophor entspricht. Nachteilig bei diesen Techniken ist, dass meist ein gewisses Übersprechen zwischen den Kanälen nicht vermeidbar ist. Dies trifft insbesondere zu, wenn eine Vielzahl unterschiedlicher Fluorophore in einer Probe verwendet wird, wobei sich deren Spektren aufgrund der begrenzten Bandbreite der nutzbaren Wellenlängen überlappen. Dem kann zwar dadurch entgegengewirkt werden, dass die spektralen Begrenzungen der einzelnen Detektionskanäle, beispielsweise durch enge Bandpassfilter, scharf begrenzt werden. Dies hat allerdings zur Folge, dass ein großer Teil der emittierten Fluoreszenzphotonen nicht zur Signalgebung beiträgt, was sich negativ auf die Qualität des detektierten Signals auswirkt. Insbesondere ist dies unerwünscht, da wegen Bleichprozessen der Fluorophore in der Probe die Gesamtzahl der von einem gegebenen Präparat emittierbaren Photonen begrenzt ist, andererseits aber aufgrund des Photonenrauschens die Qualität und Auflösung einer Messung umso besser ist, je mehr Photonen zur Messung beitragen. Nahezu alle Fluoreszenzphotonen können zwar dadurch nutzbar gemacht werden, dass das emittierte Fluoreszenzlicht spektral zerlegt und das Spektrum mittels einer großen Vielzahl spektraler Kanäle weiterbehandelt wird. Das relative Rauschen in j edem einzelnen, extrem engen Kanal wächst dabei j edoch erheblich an, da für j eden einzelnen Kanal nur vergleichsweise wenige Photonen zur Verfügung stehen, so dass sich dieses Verfahren nur in besonders lichtstarken Anwendungsfällen eignet.
Die angesprochenen Probleme lassen sich stark reduzieren, wenn breite Messkanäle gewählt werden, deren Übersprechen bewusst in Kauf genommen wird, und die aufgenommenen Daten einer erheblichen, rechnerischen Nachbearbeitung bzw. Auswertung unterzogen werden. Hierzu werden die aufgenommenen Signale in den Detektoren oder nachgeschalteten Umwandlungseinheiten in digitale Daten konvertiert und in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert. Bei vielen Anwendungen, wie z.B. der Laser-Scanning- Mikroskopie (LSM) ist die Digitalisierung und Nachbearbeitung der Daten sogar ein wesentlicher Bestandteil der Technik. Die zuvor angesprochene Auswertung der Daten geschieht üblicherweise vermittels einer Verrechnungseinheit der digitalen
Datenverarbeitungsanlage. Besonders gute Ergebnisse hat man mit der
Methode des sog. „Linear Unmixing" erzielt. Diese Methode beruht auf der Aufstellung und Lösung eines inhomogenen, linearen
Gleichungssystems, das über die bekannten Eigenschaften der
Messkanäle einen Zusammenhang herstellt zwischen dem gemessenen
Signal und der Fluorophorenzusammensetzung in der Probe. Dieses
Gleichungssystem lässt sich mathematisch in Matrixschreibweise darstellen als _- _-. _ y = AB + I - b ( 1 )
oder in Komponentenschreibweise p yr = ΣIraμrBμ + Irbr (2)
Diese Formeln sind folgendermaßen zu verstehen: Der Vektor B repräsentiert die unterschiedlichen Spezies von Fluorophoren in ihrer relativen Konzentration in einem gegebenen Bildpunkt. Die Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies sei p. Damit weist der Vektor B p Komponenten B auf. Der Vektor y repräsentiert das in jedem
Messkanal detektierte Signal. Die Anzahl der Messkanäle sei q. Damit weist der Vektor y q Komponenten yr auf. Wurden für die Messung beispielweise vier unterschiedliche Anregungswellenlängen und vier unterschiedliche spektrale Detektionsfenster verwendet, ist die Anzahl der Messkanäle q = 16, Der Vektor 7 stellt die für j eden Messkanal verwendete Anregungsintensität dar und weist somit q Komponenten /, auf. Die Matrix A ist die Koeffizientenmatrix die die chemische Komposition B von Fluorophoren über die Anregungsintensitäten Ir der
Anregungskanäle und die übrigen Eigenschaften aμr der Messkanäle mit dem Ergebnissignal y verknüpft. Die Matrix A hat also pq Elemente I^μ, . Der Vektor b mit q Komponenten b, schließlich ist eine Korrekturgröße, die das Streulicht oder ein anderes Hintergrundlicht in j edem Messkanal wiedergibt. Die Größen Bμ sind in der Regel als ortsabhängig aufzufassen, während die übrigen Größen auf der j eweils rechten Seite der Gleichungen (1 ) und (2) Parameter darstellen, die für normalerweise für alle Pixel gleich sind. Autofluoreszenz des Messobj ektes kann entweder als Fluoreszenz eines zusätzlichen Fluorophors Bμ oder aber als Hintergrundlicht b, (falls ortsunabhängig) behandelt werden. Bei
Vorliegen von FRET kann ein FRET-Paar als eigenständiger Chromophor aufgefasst werden, dessen Konzentration durch eine der Größen Bμ gegeben ist.
Ziel des „Linear Unmixing" ist es, die Lösung B des vorstehenden linearen Gleichungssystems zu finden, was mathematisch durch einfache Inversion der Koeffizientenmatrix A möglich ist, sofern die Zahl der Gleichungen q größer oder gleich der Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies p ist. Für die algorithmische Umsetzung dieser mathematischen Operation sind dem Fachmann eine Reihe numerischer Verfahren bekannt. Eine Erläuterung dieser Technik ist in Farkas et al. : „ Non-invasive Image acquisition and advanced processing in optical bio-imaging ", Computeri∑ed Medical Imaging and Graphics, 22 (1998), S. 89-102 oder Dickinson et al. : „ Multi- spectral imaging and linear unmixing at whole new dimension to laser scanning fluorescent microscopy ", BioTechnics, 31, Nr. 6 (2001), S. 1272-1278 sowie Boardman: „ Inversion of imaging spectroscopy data using singular value decomposition ", Proc. IGARSS, 89, Nr. 4 (1989), S. 2069-2072 offenbart. Eine Implementierung dieses Auswerteverfahrens in einer LSM-Vorrichtung wurde von der Firma Carl Zeiß, Jena, Deutschland, in deren Laser-Scanning-Mikroskop LSM 510 meta realisiert.
Wie erläutet, bietet das Verfahren des „Linear Unmixing" ein probates Mittel der Datenauswertung bei Kenntnis der Eigenschaften der verwendeten Messkanäle, Nachteilig ist jedoch, dass die Auswahl der geeigneten Messkanäle, d.h. die Einstellung sämtlicher Parameter wie Anregungswellenlänge, -Intensität, -zeit und Detektionswellenlängen und -zeit, nach wie vor der Intuition des Benutzers unterworfen ist. Da sich die Intuition jedoch nach anschaulichen Regeln richtet, die es dem Benutzer nahe legen, nach wie vor möglichst j e einen Messkanal einer Fluorophorenspezies zuzuordnen, werden die Möglichkeiten, die die komplexe Datenanalyse bietet, in der Regel nicht ausgenutzt.
A u f g a b e der vorliegenden Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren derart weiterzubilden, dass auf einfache Weise die Qualität der erhaltenen Daten verbessert wird.
Eine weitere A u f g a b e der vorliegenden Erfindung ist es, eine gattungsgemäße Vorrichtung derart weiterzubilden, dass die damit erhaltenen Ergebnisse auf einfache Weise verbessert werden.
Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche.
Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Erfindung baut auf einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch auf, dass die Eigenschaften mehrerer Messkanäle vor der Durchführung der Messung automatisch eingestellt werden oder dem Benutzer entsprechende Anweisungen zur manuellen Einstellung gegeben werden. Die automatischen Einstellungen oder Anweisungen erfolgen gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens. Dabei werden die Fluoreszenzcharakteristiken wenigstens einiger der in der Probe enthaltenen Fluorophore berücksichtigt. Ein solches mathematisches Optimierungsverfahren ist streng zu trennen von der automati- sehen Ansteuerung bestimmter Standardeinstellungen, die ab Werk programmiert sein können oder sich an einer vom Benutzer selbst eingerichteten Einstellungsbibliothek orientieren. Vielmehr gibt der Benutzer der Datenverarbeitungsanlage ein, welche Fluorophore er in der Probe vermutet bzw. deren Charakteristiken. Diese Angaben werden dann dem mathematischen Optimierungsverfahren zugrunde gelegt, das die für die speziellen Belange des Benutzers optimalen Einstellungen der Messkanäle errechnet. Damit kann insbesondere eine sich der Intuition weitgehend widersetzende, im Hinblick auf eine mathematische Auswertung der aufgenommenen Daten aber besonders günstige Segmentierung des gesamten Fluoreszenzspektrums vorgenommen werden anstatt mit Filtern enge Bänder auszuschneiden und die Anzahl der zum Signal beitragenden Photonen und damit die Signalqualität unnötig zu reduzieren.
Vorteilhafterweise sind die Charakteristiken einer Vielzahl von Fluorophoren in einer oder mehreren Bibliotheken in einer Speichereinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert, so dass es genügt, wenn der Benutzer die von ihm in der Probe vermuteten Fluorophore identifiziert, ohne deren vollständige Charakteristiken eingeben zu müssen.
Besonders günstig ist es, wenn im Rahmen des mathematischen Optimierungsverfahrens ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, das den Zusammenhang zwischen einer vom Benutzer vermuteten, chemischen Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Eigenschaften der Messkanäle resultierenden Signal beschreibt. Dieses Merkmal greift die mathematische Grundlage des „Linear Unmixing" auf. Allerdings wendet es diese Grundidee in genau entgegengesetzter Weise als beim Stand der Technik an. Während nämlich beim „Linear Unmixing" bei bekannten Komponenten yr und bekannten, die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten aμr die relativen Konzentrationen Bμ der einzelnen Fluorophorenspezies gesucht sind, zielt das erfindungsgemäße Verfahren vielmehr darauf ab, durch Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten β eine
Optimierung des Systems in dem Sinne herbeizuführen, dass die Lösung des Gleichungssystems möglichst eindeutig erfolgen kann. Die Optimie- rung ist also auf die Lösbarkeit des Gleichungssystems ausgerichtet, insbesondere auf deren Eindeutigkeit. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass ein sich an die Messung anschließendes Auswertever- fahren, das auf der Methode des „Linear Unmixing" basiert, nicht etwa deshalb scheitert, weil die die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten im speziellen Fall so gewählt waren, dass die Zahl der linear unabhängigen Gleichungen des Systems die Zahl der vorhandenen Fluoropho- renspezies unterschreitet und das Gleichungssystem somit nicht mehr eindeutig lösbar ist.
Vorteilhafterweise ist das Optimierungsverfahren jedoch so flexibel gestaltet, dass nicht ausschließlich auf die Lösbarkeit bzw. Eindeutigkeit der Lösung des Gleichungssystems hin optimiert wird, sondern zusätz- lieh vom Benutzer gewählte Nebenbedingungen berücksichtigt werden. Beispiele für derartige Nebenbedingungen sollen weiter unten erläutert werden.
Vorteilhafterweise umfasst das Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines Matrixausdrucks, der diej enige Matrix enthält, die von den Koeffizienten des vorgenannten linearen Gleichungssystems gebildet wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist dies so zu verstehen, dass sich die algorithmische Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens mathematisch als Optimierung einer Konditionszahl des genannten Matrixausdrucks darstellen lässt. Je nach konkreter Umsetzung kann es möglich sein, auf die explizite Definition einer Matrix oder eines Arrays im Rahmen eines Computerprogramms zu verzichten.
Besonders bevorzugter Weise wird der Matrixausdruck, der der Berechnung der Konditionszahl zugrunde gelegt wird, als linksseitiges Matrixprodukt der Matrix A mit ihrer Transponierten A , also A A , gebildet. Dem liegt die Überlegung zugrunde, dass die Ausdrücke der Gleichungen 1 und 2 durch linksseitige Multiplikation mit Aτ überführt werden können in
Aτ(y - 7 - b) =AτAB (3) Bekanntermaßen führt die linksseitige Multiplikation mit der Transponierten einer Matrix zur Symmetrisierung des sich ergebenden Matrixausdrucks, was einer Ausgleichsrechnung im Sinne der Gauss' schen Minimierung der Fehlerquadratsumme entspricht.
Bei expliziter Berücksichtigung des Rauschens der Messkanäle kann eine mit den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtete Matrix herangezogen werden, was als Minimierung der aus der Statistik bekannten Größe χ2 (Chi Quadrat) betrachtet werden kann.
So kann beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform die zu optimierende Konditionszahl im Wesentlichen der Determinante des
Matrixausdrucks, insbesondere des Ausdrucks ATA entsprechen.
Alternativ können als Optimierungskriterium Konditionszahlen verwendet werden, die auch die Spur N des Matrixausdrucks enthalten.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als zu optimierende Konditionszahl die Größe
Figure imgf000012_0001
verwendet, wobei det die Determinante, N die Spur und n die Dimension des Matrixausdrucks ist. Bei einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Konditionszahl das Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrixausdrucks benutzt. Es hat sich gezeigt, dass die Optimierung j eder dieser Konditionszahlen durch Variation der Matrixelemente 1 0^ zu einer Wahl von
Messkanaleigenschaften führen, die sich zwar der Intuition in vielen Fällen stark widersetzen, jedoch im Hinblick auf eine der Messung nachgeschaltete Datenauswertung, insbesondere vermittels der Methode des „Linear Unmixing" hervorragende Ergebnisse liefern.
Dabei führt die Optimierung verschiedener Konditionszahlen in verschiedenen Fallkonstellationen zu unterschiedlich guten Ergebnissen. Es ist daher besonders vorteilhaft, das erfindungsgemäße Verfahren dahingehend weiterzubilden, dass dem Benutzer die Möglichkeit gegeben wird, eine globale Charakteristik des erwarteten Messergebnisses, beispielsweise sehr schwache Fluoreszenz, besonders große Anzahl unterschiedlicher Fluorophore, spektral besonders nah benachbarte Fluorophore etc., anzugeben und damit oder direkt die zu optimierende
Konditionszahl festzulegen.
Die Umsetzung des berechneten Optimierungsergebnisses in die Realisierung physikalischer Eigenschaften der Messkanäle kann auf vielfache Weise durchgeführt werden. So bietet sich beispielsweise eine Frequenz- oder Frequenzbandwahl im Anregungs- und/oder Detekti- onsstrahlengang durch einstellbare Filter wie etwa AOTFs (Acusto Optic Tunable Filters) oder LCTFs (Liquid Crystal Tunable Filters) an. Ebenso können feste Kanten-, Bandpassfilter und/oder Strahlteiler, die beispielsweise auf motorisch angetriebenen Filterschiebern oder -rädern angeordnet sind, zum Einsatz kommen. Eine weitere Möglichkeit der automatischen Beeinflussung der Messkanalcharakteristiken besteht in der Variation der Anregungsintensitäten, beispielsweise durch Einbringen sog. Graukeile in den Anregungsstrahlengang. Auch die zeitlichen Charakteristika der Messkanäle lassen sich in Umsetzung des erfin- dungsgemäßen Optimierungsverfahrens variieren, Beispielsweise kann die Anregungsdauer variiert oder es können zur Trennung von Fluoreszenzkomponenten mit kurzer und langer Lebensdauer zeitliche Detekti- onsfenster definiert werden. Hierzu ist dem Fachmann eine Vielzahl von Umsetzungsmöglichkeiten bekannt.
Konditionszahlen von Matrizen, wie oben erwähnt, liefern im Wesentlichen Abschätzungen maximaler Fehler, die j edoch in der Praxis oft weit unterschritten werden können. Dies trifft insbesondere zu, wenn bekannte Strukturen eines gegebenen Problems berücksichtigt werden. In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Möglichkeit einer weitergehenden Optimierung vorgesehen, bei der die speziellen Eigenschaften der experimentellen Störquellen bei Fluoreszenzmessungen formuliert werden. Insbesondere ist vorteilhafterweise ein zweiter Optimierungsschritt vorgesehen, in dem durch Variation der die Eigenschaften der Messkanäle beschreibenden Koeffizienten das Rauschen des zu erwartenden Signals optimiert wird.
Dieser erfinderischen Idee liegt die folgende Erkenntnis zugrunde. Sind die Koeffizienten der Matrix A bzw. des Matrixausdrucks A rA bestimmt, vorzugsweise durch Anwendung des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschrittes optimiert, lautet die Lösung des linearen Gleichungssystems
B) ^ {AτAYAτ{y-l -b) (5)
Dabei bezeichnet (B) den Erwartungswert der Lösung B , womit berücksichtigt wird, dass der Vektor y - l - b mit einer experimentellen
Schwankung σ behaftet ist. Der Vektor σ ist zu verstehen als komponentenweise Quadratwurzel der Ausdrücke σf , die jeweils als Erwar- tungswerte der Varianz des Messwertes v, zu verstehen sind. Diese setzten sich aus zwei Komponenten zusammen, nämlich dem Photonenrauschen, dessen Varianz proportional zum Signalniveau ist, und dem davon statistisch unabhängigen, konstanten Detektorrauschen, das sich aus Dunkelstrom und Ausleserauschen des j eweiligen Detektors zusammensetzt.
Figure imgf000014_0001
Dabei ist s eine Proportionalitätskonstante (ein geeignet berechneter Einzelphotonenbeitrag) und σ0 2_, die Summe aller konstanten Beiträge zur
Varianz des Signals im Kanal r.
Nach der Methode der Gaußschen Fehlerfortpflanzung lässt sich die Schwankung σ der Komponente Bμ des Vektors B beschreiben als
Figure imgf000015_0001
Da Gleichung 5 ein lineares Gleichungssystem ist und I - b nicht von yr
abhängt, ist wobei cur das Element der r-ten Zeile und w-ten
Figure imgf000015_0002
Spalte der Matrix C = {ATA) Aτ ist. Daher ist
Figure imgf000015_0003
Dieser Ausdruck oder auch die Summe aller Abweichungsquadrate
Figure imgf000015_0004
lässt sich im Raum aller Messkanalparameter minimieren. Allerdings enthalten laut Gleichung (6) die Größen σ) die Messwerte yr, sodass für die Minimierung von
Figure imgf000015_0005
vom Benutzer Angaben über die Größe der erwarteten Signale gemacht werden müssen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es im Wesentlichen diese Größe
Figure imgf000015_0006
, die durch
Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten optimiert wird.
Dabei ist vorzugsweise vorgesehen, dass das Rauschen des zu erwartenden Signals . unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird. Eine dieser Nebenbedingungen, die auch im Rahmen des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschritts . Anwendung finden können, kann bei einer vorteilhaften Ausbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Höchstgrenze für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore sein. Da bei - fortschreitender Bleichung das Signal abnimmt, während bestimmte Anteile des Rauschens zeitunabhängig sind, kann die Optimierung unter Umständen in Bezug auf Beleuchtungsdauer bzw. -intensität erfolgen. Als weitere mögliche Nebenbedingung kann mit Vorteil die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten, vorzugsweise vom Benutzer vorgegebenen, Intensität genutzt werden. Diese Nebenbedingung bietet sich insbesondere an, wenn das erwartete Signal so niedrig ist, dass das Gesamtrauschen des Messkanals durch Dunkelstrom und Ausleserauschen des Detektors dominiert wird.
Als weitere, mögliche Nebenbedingung kann in einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die maximale spektrale Auflösung verschiedener Fluorophore in einem bestimmten Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes genutzt werden. Dies kommt insbesondere dort zum Tragen, wo ein oder mehrere verschiedene Fluorophore vor dem Hintergrund einer allgemeinen, unspezifischen Autofluoreszenz der Probe aufgelöst werden sollen oder falls ein bestimmter Bildbereich für den Benutzer von besonderem Interesse ist.
Bei einer weiteren, günstigen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, als Nebenbedingung die Minimierung des relativen Fehlers der Messkanäle zu nutzen. Diese Form der Nebenbe- dingung wird vorzugsweise dann eingeführt, wenn Verhältnismessungen, wie etwa bei FRET-Messungen, durchgeführt werden sollen.
Besonders günstig kann es sein, wenn der Benutzer die Möglichkeit erhält, zusätzlich zu einer oder mehreren Nebenbedingungen oder an ihrer statt Informationen zu einem vermuteten Modell des Rauschens, beispielsweise poisonbasiert, eingeben kann.
In besonders bevorzugter Weise wird das erfindungsgemäße Optimierungsverfahren im Rahmen eines iterativen, dialoggesteuerten Prozesses zur Definition der Nebenbedingungen durchgeführt, der es dem Benutzer erlaubt, nach Durchführung eines vorläufigen Optimierungsschrittes weitere Informationen einzugeben und einen oder mehrere erneute
Optimierungsschritte anzufügen. Um die Vorteile und Besonderheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise umsetzen zu können, ist erfindungsgemäß eine Vorrichtung, wie beispielweise ein Laser-Scanning-Mikroskop, vorgesehen, dessen digitale Datenverarbeitungsanlage derart program- iert ist, dass das vorbeschriebene, erfindungsgemäße Optimierungsverfahren durchführbar ist, und die über die weiter oben erwähnten technischen Einrichtungen zur automatischen Einstellung der Messkanaleigenschaften verfügt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Systems wird nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnung erläutert. Es zeigt die einzige
Fig. 1 den schematischen Aufbau eines erfindungsgemäß eingerichteten Laser- Scanning-Mikroskops.
In dem in Fig. 1 gezeigten, besonders vorteilhaften Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist diese als Laser-Scanning- Mikroskop realisiert. Das System besteht im Wesentlichen aus drei Teilen, nämlich einer Datenverarbeitungsanlage 10, einer Benutzerschnittstelle 20 sowie einem optisch/elektronischen Aufbau 30. Die Datenverarbeitungsanlage umfasst eine Berechnungseinheit 1 1 , in der die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Optimierungsverfahrens sowie vorzugsweise die zur Auswertung der aufgenommenen Daten notwendigen Rechnungen durchgeführt werden. Weiter ist eine Speichereinheit 12 umfasst, in der einerseits aufgenommene Daten gespeichert oder zwischengespeichert werden können, andererseits aber auch die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Programmbefehle sowie Bibliotheken gespeichert sind, in denen die für die erfindungsgemäßen Berechnungen erforderlichen Daten gespeichert sind. Diese sind etwa Anregungs-, Fluoreszenzspektren sowie Fluoreszenzlebensdauern einer Vielzahl von Fluorophoren, spektrale Charakteristiken einer Vielzahl von Filtern oder Farbteilern sowie die Empfindlichkeitscharakteristiken verschiedener Detektoren. Auch die spektralen und elektronischen Merkmale verschiedener Lichtquellen, insbesondere Laser, können in der Speichereinheit 12 der Datenverarbeitungsanlage 10 gespeichert sein.
Weiter umfasst die Datenverarbeitungsanlage 10 eine Datenschnittstelle 13, über die die aufgenommenen Messdaten sowie Benutzereingaben über die Benutzerschnittstelle 20 in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist und Steuerbefehle an einstellbare Komponenten des optisch/elektronischen Aufbaus 30 der Vorrichtung sowie Informationen an die Benutzerschnittstelle 20 ausgegeben werden können.
Die genannten Elemente der Datenverarbeitungsanlage 10 können auf vielfache, dem Fachmann bekannte Weise realisiert und in ihren technischen Einzelheiten der speziellen jeweiligen Konfiguration angepasst werden.
Zur Messung einer Fluoreszenzprobe 40 wird diese unter dem Mikroskopobjektiv 39 platziert. Über die Benutzerschnittstelle 20 kann der Benutzer verschiedene Daten in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingeben, die die vermutete chemische Fluorophorenzusammensetzung, voraussichtliche Intensitäten und/oder Optimierungsnebenbedingungen, wie beispielsweise Bleichgrenzen, eingeben. Aufgrund dieser Vorgaben berechnet die Berechnungseinheit 1 1 der Datenverarbeitungsanlage 10 gemäß dem erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren diejenigen Werte, entsprechend denen der optisch/elektronische Aufbau 30 einzustellen ist. Hierdurch werden die Messkanäle als spezifische Kombinationen spezieller Anregungs- und Detektionskanäle definiert. In dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die Anregungskanäle vergleichswei- se einfach ausgeführt. Sie bestehen im Wesentlichen aus zwei Laserquellen 31 a und 31 b, die über motorisch ansteuerbare Kollimatoren 32a, 32b, Umlenkspiegel 33a, 33b, 33c, ein motorisch ansteuerbares Strahlteilerrad 34a, einen Scanningspiegel 35 und eine Scanninglinse 36 durch das Mikroskopobj ektiv 39 die Probe 40 beleuchten. Die Eigenschaften des Anregungslichtes in Bezug auf Wellenlänge und Intensität sind durch Ansteuerung der Laser 3 1 a, 31b, der Kollimatoren 32a, 32b sowie des Strahlteilerrades 34a über die Steuerleitungen 131 a, 131 b und 134a einstellbar. Selbstverständlich liegt es im Bereich der Erfindung, Lichtquellen anderer Art und/oder anderer Zahl zu verwenden oder die Einstellung der Eigenschaften des Anregungslichtes durch andere oder weitere ansteuerbare Komponenten, wie etwa Neutralgrau- Filterschiebern, zu realisieren.
Die Ansteuerung des Scanningspiegels 35 über die Steuerleitung 135 geschieht auf herkömmliche Weise.
Das Fluoreszenzlicht, das in Fig. 1 schematisch als gestrichelte Linie dargestellt ist, läuft von der Probe 40 durch das Mikroskopobj ektiv 39, Umlenkspiegel 33 c, Scanninglinse 36 und Scanningspiegel 35 auf das motorisch ansteuerbare Strahlteilerrad 34a zu. Bei geeigneter Einstellung des Rades 34a passiert der wesentliche Anteil des Fluoreszenzlichtes den eingestellten Strahlteiler, während Licht im Bereich der Anregungswellenlänge reflektiert wird. Die Einstellung der Detektionskanäle erfolgt über die Einstellung dieses Strahlteilerrades 34a sowie über die Einstellungen weiterer Strahlteilerräder 34b und 34c, die über die Steuerleitungen 134b und 134c entsprechend den von dem erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden. Eine weitere Kanalspezifizierung erfolgt über die Einstellung der Filterräder 36a und 36b, die über die Steuerleitungen 136a und 136b gemäß den von dem erfindungsgemäßen Optimierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden.
Das so vorselektionierte Fluoreszenzlicht fällt auf verschiedene
Detektoren 37a, 37b und 37c, deren Daten über die Eingangsleitun- gen 137a, 137b und 137c in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist werden. Je nach speziellem Aufbau werden die Daten bereits in den
Detektoren 37a, 37b, 37c oder erst in der Datenschnittstelle 13 der ' Datenverarbeitungsanlage 10 digitalisiert. Die so aufgenommenen und in der Speichereinheit 12 der digitalen Verarbeitungsanlage 10 gespeicher- ten Daten werden von der Berechnungseinheit 1 1 von bekannten
Datenauswertungsprogrammen ausgewertet, wobei vorzugsweise die
Methode des „Linear Unmixing" Anwendung findet. Die erfindungsgemäße Einstellung bzw. Definition der Messkanäle bezieht sich in dem gezeigten Ausführungsbeispiel sowohl auf die spektrale Sektionierung des Fluoreszenzlichtes als auch auf die Anzahl der verwendeten Messkanäle, d.h. die Anzahl der verwendeten Kombina- tionen von Anregungs- und Detektionskanälen, Dabei sind die Anzahl und Art der Detektoren ebenso variabel wie die der Lichtquellen, Insbesondere können, in Fig. 1 nicht gezeigt, Detektoren verwendet werden, die beispielsweise bzgl. ihrer Detektionszeit, d.h. Detektions- dauer und/oder Detektionszeitpunkt, gemäß errechneten Optimierungspa- rametern angesteuert werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die für den LSM-Aufbau erforderlichen Pinholes 38a-c ansteuerbar zu gestalten und ihren Durchmesser in die Reihe der Optimierungsparameter aufzunehmen.
Natürlich stellt die beschriebene und in Fig. 1 gezeigte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung lediglich eine beispielhafte Illustration einer besonders vorteilhaften Variante dar. Im Bereich der vorliegenden Erfindung sind jedoch vielfältige Variationen denkbar.
Bezugszeichenliste
digitale 38a-c Pinhole Datenverarbeitungsanlage 39 Mikroskopobjektiv Berechnungseinheit von 10 Speichereinheit von 10 40 Fluoreszenzprobe Datenschnittstelle von 10 0 Steuerleitung 1 a,b Steuerleitung 4a-c Steuerleitung 5 Steuerleitung 6a,b Steuerleitung 7a-c Steuerleitung
Benutzerschnittstelle
optisch/elektronischer
Aufbau a,b Laser a,b Kollimator a-c Umlenkspiegel a-c Strahlteilerrad
Scanningspiegel
Scanninglinse a-c Detektor

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, bei dem eine Fluorophore verschiedener Spezies enthaltende Probe mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften und/oder die Anregungszeit definierten Anregungskanals bestrahlt wird und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht von wenigstens einem durch seine spektrale Detektionscharakteristik und/oder die Detektionszeit definierten Detektionskanal empfangen und in ein digitales Signal umgewandelt wird, wobei das digitale Signal zur weiteren Verarbeitung in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Eigenschaften mehrerer als spezifische Kombinationen j eweils eines Anregungs- und eines Detektionskanals definierter Messkanäle vor Durchführung der Messung gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens, das die Fluoreszenzcharakteristiken wenigstens einiger der vom Benutzer in der Probe vermuteten Fluorophore berücksichtigt, automatisch eingestellt oder entsprechende Anweisungen zur manuellen Einstellung durch den Benutzer gegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zu berücksichtigenden Fluoreszenzcharakteristiken aus einer Speichereinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage abgerufen werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen des mathematische Optimierungsverfahrens ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, das den Zusammenhang zwischen einer vom Benutzer vermuteten, chemischen Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Eigenschaften der Messkanäle resultierenden Signal beschreibt, wobei seine Koeffizienten die Eigenschaften der Messkanäle beschreiben.
4. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren einen ersten Optimierungsschritt enthält, in dem durch Variation von die Eigenschaften der Messkanäle beschreibenden Koeffizienten die Eindeutigkeit der Lösung des linearen Gleichungssystems optimiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Eindeutigkeit der Lösung des linearen Gleichungssystems unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines die von den Koeffizienten des linearen Gleichungssystems gebildete Matrix enthaltenden Matrix-Ausdrucks umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixelemente des Matrix-Ausdrucks zur Minimierung der Größe χ2 entsprechend den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der die Koeffizientenmatrix enthaltende Matrix- Ausdruck im Wesentlichen das linksseitige Matrixprodukt der Koeffizientenmatrix mit Ihrer Transponierten ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Determinante des Matrix-Ausdrucks enthält.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Spur des Matrix-Ausdrucks enthält.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen der Größe
entspricht, wobei det die Determinante, N die Spur
Figure imgf000024_0001
und n die Dimension des Matrix-Ausdrucks ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen das Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrix- Ausdrucks enthält.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer wählbar ist.
H. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer dadurch gewählt wird, dass eine globale Charakterisierung des zu erwartenden Signals in die digitale Datenverarbeitungsanlage eingegeben und die Konditionszahl automatisch ermittelt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren einen zweiten Optimierungsschritt enthält, in dem durch Variation von Koeffizienten, welche die Eigenschaften der Messkanäle beschreibend, das Rauschen des zu erwartenden Signals optimiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Rauschen des zu erwartenden Signals unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung eine Höchstgrenze oder das Optimum für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore genutzt wird.
1 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten Intensität genutzt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die maximale spektrale Auflösung verschiedener, Fluorophore in einem Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes genutzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung eines relativen Fehlers genutzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Optimierungsverfahren einen iterativen, dialoggesteuerten Prozess zur Definition der Nebenbedingungen umfasst.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die automatische Einstellung der Messkanaleigenschaften durch Ansteuerung und/oder motorische Bewegung von AOTFs, LCTFs, Kanten-, Bandpass-, Neutralgraufiltern und/oder Strahlteilern erfolgt.
23. Vorrichtung zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, wobei eine Fluorophore verschiedener Spezies enthaltende Probe mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften und/oder die Anregungszeit definierten
Anregungskanals bestrahlbar ist und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht von wenigstens einem durch seine spektrale Detektionscharakteristik und/oder die Detektionszeit definierten Detektionskanal detektierbar und in ein digitales Signal umwandelbar ist, wobei das digitale Signal zur weiteren Verarbeitung in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage speicherbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Eigenschaften mehrerer als spezifische Kombinationen jeweils eines Anregungs- und eines Detektionskanals definierter Messkanäle vor Durchführung der Messung gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens, das die Fluoreszenzcharakteristiken wenigstens einiger der von der Probe enthaltenen Fluorophore berücksichtigt, automatisch einstellbar oder entsprechende Anweisungen zur manuellen Einstellung durch den Benutzer für diesen darstellbar sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zu berücksichtigenden Fluoreszenzcharakteristiken aus einer
Speichereinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage abgerufen werden.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen des mathematische Optimierungsverfahrens ein lineares Gleichungssystem aufstellbar ist, das den Zusammenhang zwischen einer vom Benutzer vermuteten chemischen, Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Eigenschaften der Messkanäle resultierenden Signal beschreibt.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren einen ersten Optimierungsschritt enthält, in dem durch Variation von die Eigenschaften der Messkanäle beschreibenden Koeffizienten die Eindeutigkeit der Lösung des linearen Gleichungssystems optimierbar ist.
27. Vorrichtung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Eindeutigkeit der Lösung des linearen Gleichungssystems unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimierbar ist.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines die von den Koeffizienten
. des linearen Gleichungssystems gebildete Matrix enthaltenden Matrix-Ausdrucks umfasst.
29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixelemente des Matrix-Ausdrucks zur Minimierung der Größe χ2 entsprechend den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtet werden können.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass der die Koeffizientenmatrix enthaltende Matrix- Ausdruck im Wesentlichen das linksseitige Matrixprodukt der Koeffizientenmatrix mit Ihrer Transponierten ist.
3 1. Vorrichtung nach einem , der Ansprüche 28 . bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Determinante des Matrix-Ausdrucks enthält.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Spur des Matrix-Ausdrucks enthält.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen der Größe
entspricht, wobei det die Determinante, N die Spur
Figure imgf000029_0001
und n die Dimension des Matrix-Ausdrucks ist.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch . gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen das
Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrix- Ausdrucks enthält.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer wählbar ist.
36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer dadurch wählbar ist, dass eine globale Charakterisierung des zu erwartenden Signals in die digitale Datenverarbeitungsanlage eingegeben und die Konditionszahl automatisch ermittelt wird.
37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren einen zweiten Optimierungsschritt enthält, in dem durch Variation von Koeffizienten, welche die Eigenschaften der Messkanäle beschreibend, das Rauschen des zu erwartenden Signals optimierbar ist.
38. Vorrichtung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Rauschen des zu erwartenden Signals unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimierbar ist.
39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung eine Höchstgrenze oder das Optimum für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore nutzbar ist.
40. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten Intensität nutzbar ist.
41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass , als Nebenbedingung die maximale spektrale Auflösung verschiedener, Fluorophore in einem Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes nutzbar ist.
42. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung eines relativen Fehlers nutzbar ist.
43. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Optimierungsverfahren einen iterativen, dialoggesteuerten Prozess zur Definition der Nebenbedingungen umfasst.
44. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die automatische Einstellung der Messkanaleigenschaften durch Ansteuerung und/oder motorische Bewegung von AOTFs, LCTFs, Kanten-, Bandpass-, Neutralgraufiltern und/oder Strahlteilern erfolgen kann.
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