WO2009018953A2

WO2009018953A2 - Verfahren und vorrichtung zur ermittlung von zustandsbedingungen eines zu untersuchenden objektes und zur fluoreszenzmessung am auge

Info

Publication number: WO2009018953A2
Application number: PCT/EP2008/006286
Authority: WO
Inventors: Andreas Brodschelm; Thomas Mohr; Daniel Bublitz
Original assignee: Carl Zeiss Meditec Ag
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2009-02-12
Also published as: WO2009018953A3; DE102007053074A1

Abstract

Ein Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen pι(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), umfasst die Schritte Bereitstellung einer Vielzahl von Messgrößen aus Messungen am Objekt (1), wobei die Messgrößen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort S(pι,λ) des Objektes (1) und von spektralen Messbedingungen Lr(λ) der Messungen darstellbar sind, wobei die Objektantwort S(pι, λ) die Zustandsbedingungen pi, als Parameter enthält, und Berechnung der Zustandsbedingungen pι(x) aus den Messgrößen, wobei die Berechnung der Zustandsbedingungen pi(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(pi,λ) derart umfasst, dass die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden. Es wird auch eine Messeinrichtung (100) zur Ermittlung von Zustandsbedingungen pι(x) eines zu untersuchenden Objektes (1) beschrieben. Ein Verfahren zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) umfasst die Schritte Beleuchtung des Auges (1) mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich (λex), Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (S1) in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,1) ' Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S2) in ei- nem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,2) ι und Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (S1, S2). Es wird auch eine Messeinrichtung (100) beschrieben, die zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) eingerichtet ist und eine Beleuchtungseinrichtung (10) und eine Detektoreinrichtung (20) umfasst.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Ermittlung von

Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes und zur Fluoreszenzmessung am Auge

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes, insbesondere zur Ermittlung von physiologischen Eigenschaften eines biologischen Objektes. Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Messeinrichtung, die zur Durchführung des genannten Verfahrens eingerichtet ist, und Geräte, die mit einer derartigen Messeinrichtung ausgestattet sind. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren und eine Messeinrichtung zur Mes- sung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge, insbesondere zur Messung der Autofluoreszenz von einem physiologischen Pigment, wie z. B. von Lipofuszin, im Augenhintergrund. Das Verfahren und die Fluoreszenzmesseinrichtung liefern ein Autofluoreszenzsignal, dass vorzugsweise einer Verarbeitung mit dem o. g. Verfahren zur Ermittlung der physiologischen Eigenschaften am Auge unterzogen wird.

Es ist allgemein bekannt, Eigenschaften eines zu untersuchenden Objektes durch spektroskopische Messungen zu erfassen. So können Bestandteile einer Probe auf der Grundlage einer charakteristischen spektralen Antwortfunktion dieser Bestandteile detektiert werden (z. B. Messung von Transmission, Reflek- tion oder Fluoreszenz) . Die Detektion vereinfacht sich, wenn die Bestandteile spektroskopisch deutlich verschiedene Eigen- Schäften aufweisen, so dass durch die Wahl verschiedener spektraler Messbedingungen jeder der Bestandteile spezifisch erfasst werden kann. Für einen derart vereinfachten Fall wird in US 6 142 629 vorgeschlagen, das Objekt mit verschiedenen spektralen Verteilungen zu beleuchten und für jede spektrale Verteilung ein Reflexionsspektrum des Objektes aufzunehmen. Die interessie- renden Merkmale des Objektes werden aus den Reflexionsspektren abgeleitet. Nachteilig ist, dass bei dem beschriebenen Verfahren nur Spektren ausgewertet werden können, die im wesentlichen von einem einzigen Objektmerkmal abhängen. Spektren, die von mehr als einem Parameter oder Merkmal abhängen, können nicht ausgewertet werden.

In der Praxis sind jedoch oft Bedingungen gegeben, bei denen sich die spektroskopischen Eigenschaften verschiedener Bestandteile in bestimmten Spektralbereichen überlappen. Die Eigenschaften können durch die Auswahl der spektralen Messbedingungen nicht mehr ohne weiteres getrennt werden. In diesem Fall ist eine komplexe Analyse der unter verschiedenen spektralen Messbedingungen ermittelten Messsignale erforderlich. Besondere Anforderungen bestehen an die Analyse, wenn mit der spektroskopischen Messung nicht nur das Vorhandensein eines Bestandteils in der Probe, sondern ein anderer Probenparameter ermittelt werden soll, der sich auf die spektroskopischen Eigenschaften der Probe auswirkt, wie zum Beispiel eine Dimension, eine Konzentration, histologische Parameter oder dgl..

In der Publikation „Quantitative analysis of multispectral fundus images" von I. B. Styles et al . („School of Computer Science Research Report-University of Birmingham CSR, 2005, issue 8") wird ein Verfahren zur Ermittlung von histologi- schen Parametern aus Bildern des Augenfundus beschrieben, die unter verschiedenen spektralen Messbedingungen aufgenommen wurden. Die Bilder umfassen Reflexionsbilder des Augenfundus, die mit einer Funduskamera aufgenommen werden. Die spektralen Messbedingungen werden durch den detektorseitigen Einsatz von verschiedenen spektralen Filtern vor dem Kamerateil der Funduskamera eingestellt. Von I. B. Styles et al. wird eine Systemfunktion vorgeschlagen, welche die Messsignale in Abhän- gigkeit von den histologischen Parametern repräsentiert. Zur Ermittlung der histologischen Parametern aus den Messsignalen wird aus der Systemfunktion mit einem neuronalen Netzwerk eine Umkehrfunktion ermittelt, die auf die Messsignale angewendet wird. Um entscheiden zu können, ob die histologischen Pa- rameter eindeutig aus den Messsignalen ermittelbar sind, wird von I. B. Styles et al . geprüft, ob die Determinante einer Funktionalmatrix, deren Elemente partielle Ableitungen von der Messsignale nach den histologischen Parametern umfassen, ungleich Null ist

Die Technik von I. B. Styles et al . hat eine Reihe von Nachteilen, die sich aus der Messtechnik und aus der Prozedur zur Ermittlung der histologischen Parameter ergeben. So ergeben sich Nachteile aus der detektorseitigen Filter-Einstel- lung der spektralen Messbedingungen, da für alle Messbedingungen eine relativ starke Weißlichtbeleuchtung des Auges erforderlich ist. Eine starke Reizung des Auges kann zu unerwünschten Änderungen der Messbedingungen, z. B. durch ein Schließen der Pupille oder eine Bewegung des Auges führen. Ferner können für die Reflexionsmessung im grünen oder blauen Spektralbereich nur schwache Messsignale erfasst werden. Die schwachen Messsignale ergeben ein verschlechtertes Signal- Rausch-Verhältnis. Dies kann zwar durch eine verstärkte Beleuchtung kompensiert werden, was aber auch mit einer stärke- ren Reizung des Auges verbunden wäre. Somit können durch die detektorseitige Filter-Einstellung die ermittelten histologischen Parameter verfälscht werden. Ein weiterer Nachteil ist die komplizierte Ermittlung der histologischen Parameter durch die Konstruktion der Umkehrfunktion der Modellfunktion. Die Konstruktion der Umkehrfunktion stellt einen erheblichen Verarbeitungs- und Zeitaufwand dar. Des weiteren sind Funktionen, die das optische System bei I. B. Styles et al . beschreiben, im allgemeinen nicht umkehrbar, so dass die Umkehrfunktion oft nicht ausführbar ist. Nachteilig bei dem Verfahren von I. B. Styles et al . ist ferner, dass die Auswertung der Messsignale unter der unrealis- tischen Bedingung erfolgt, dass die unter den verschiedenen spektralen Messbedingungen verwendeten Lichtintensitäten miteinander vergleichbar sind, d.h. dass die von dem Detektor erfassten Signale im Falle eines Objektes mit idealer Remission (100 %) gleich sind. Dies ist in der Praxis jedoch häu- fig nicht der Fall. Schließlich ergibt die Evaluierung der

Determinante der Funktionalmatrix eine Beschränkung auf Messungen, bei denen die Anzahl der Messsignale gleich der Anzahl der gesuchten Parameter ist. Für eine Verbesserung des SNR besteht jedoch ein Interesse, die Anzahl der Messsignale möglichst hoch zu wählen.

Nachteilig ist auch, dass sich bei bestimmten Messaufgaben der Einfluss verschiedener Parameter auf die spektrale Antwortfunktion in einen oder mehreren Spektralbereichen aufhe- ben kann. Ein derartiger Fall ist zum Beispiel bei der Bestimmung der SauerstoffSättigung in einem retinalen Blutgefäß gegeben. Im roten Spektralbereich, zum Beispiel von 600 nm bis 690 nm sinkt die Reflektivität sowohl mit der Abnahme des Gefäßdurchmessers als auch mit der Abnahme der Sauerstoffsät- tigung. Mit dem von I. B. Styles et al . beschriebenen Verfahren ist eine zuverlässige Trennung der Parametergefäßdurchmesser und Sauerstoffsättigung nur beschränkt möglich. Die genannten Probleme bei der Auswertung spektroskopischer Messgrößen an zu untersuchenden Objekten treten nicht nur bei Messungen am Augenhintergrund, sondern auch bei anderen Untersuchungsgegenständen, insbesondere bei biologischen Gewe- ben, wie zum Beispiel Nervengeweben (Gehirn) , oder bei nichtbiologischen Untersuchungsgegenständen auf.

Insbesondere in Zusammenhang mit den Messungen am Augenhintergrund ist bekannt, dass das Pigment Lipofuszin als Abbau- produkt im physiologischen Stoffwechsel gebildet und in biologischen Zellen gespeichert wird. Mit fortschreitender Alterung eines Individuums erfolgt die Akkumulation von Lipofuszin insbesondere im menschlichen retinalen Pigmentepithel (RPE) . Es ist bekannt, dass Lipofuszin eine potentielle Quel- Ie oxidativen Stresses darstellt und daher zur Alterung von Zellen beiträgt. Es spielt insbesondere eine wichtige Rolle bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) .

Es besteht in der Ophtalmologie ein Interesse, die Akkumula- tion von Lipofuszin in der Retina zu erfassen, wobei insbesondere für die Diagnose der AMD örtliche Anhäufungen von Lipofuszin in der Retina erfasst werden sollen. Bekannte Verfahren zur Erfassung von Lipofuszin in der Retina basieren auf der Messung der Autofluoreszenz von Lipofuszin, d. h. auf der Messung der Fluoreszenz, die Lipofuszin bei Bestrahlung mit Anregungslicht emittiert. Bei Bestrahlung des Augenhintergrundes, z. B. mit einer Beleuchtungseinrichtung einer Funduskamera, tritt jedoch das Problem auf, dass in den okularen Medien weitere fluoreszierende Substanzen enthalten sind. Hierzu zählen z. B. Pigmente oder Fluophore, die in der Linse des Auges enthalten sind und insbesondere bei Individuen mit Katarakt relativ stark fluoreszieren. Die Autofluoreszenz von Lipofuszin wird somit durch die Autofluoreszenz der weiteren Substanzen überlagert. Zur Erfassung von Lipofuszin ist es daher erforderlich, dass Autofluoreszenzsignal von Lipofuszin von Autofluoreszenzsignalen anderer Fluorophore zu separieren. Dabei sind die fol- genden Besonderheiten der Fluoreszenzmessung am Auge zu beachten. Erstens ist das Auge ein Gegenstand mit einer komplexen Zusammensetzung fluoreszierender Substanzen. Im Unterschied zur Fluoreszenzmessung an biochemischen Assays mit definierten Fluoreszenzmarkern sind im Auge zahlreiche fluores- zierende Substanzen enthalten, deren Auftreten und Konzentration individuell stark schwanken kann. Zweitens stellt das Auge ein komplexes optisches System dar, bei dem im Unterschied zu in vitro-Untersuchungen z. B. in einer Küvette der Strahlengang des Anregungslichts und der Fluoreszenzemission durch verschiedene transmittierende und streuende Medien verläuft, die zur Fluoreszenz beitragen können. Schließlich ist zu beachten, dass die Signalbeiträge verschiedener Fluorophore aus verschiedenen Teilen des Auges, insbesondere aus verschiedenen Bereichen außerhalb einer Fokalebene geliefert werden können. Aufgrund dieser Besonderheiten wurden bekannte Techniken der in vitro-Untersuchung biologischer Proben mittels Fluoreszenzmessung auf die Untersuchung am Auge bisher nicht angewendet.

Zu den bekannten Verfahren der Fluoreszenzmessung an biologischen Proben, die Zusammensetzungen verschiedener Fluorophore enthalten, zählt bspw. das Verfahren mit einer spektralen Entmischung von Fluoreszenzsignalen (sog. "Spectral Unmi- xing"-Verfahren) . Dieses Verfahren wird z. B. von T. Zimmer- mann et al. ("FEBS Letters", Band 546, 2003, S. 87), R. Neher et al. ("Journal of Microscopy", Band 213, 2004, S. 46) und in DE 10 2005 054 184 Al beschrieben. Die Trennung der Fluoreszenzsignale von drei oder mehr Flurophoren erfordert für die spektrale Entmischung mindestens drei Fluoreszenzmessun- gen, die z. B. bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen, Emissionswellenlängen oder Kombinationen daraus erfolgen. Die Auswertung der Fluoreszenzsignale und die Ermittlung der quantitativen Anteile der verschiedenen Fluorophore erfolgt durch eine analytische Lösung eines Gleichungssystems, in das die Messbedingungen und Fluoreszenzsignale der Fluoreszenzmessungen eingehen.

Eine Anwendung der spektralen Entmischung in der Ophtalmolo- gie wurde bisher nicht realisiert. Es konnten insbesondere die herkömmlichen Auswertungsverfahren für Zusammensetzungen mit mindestens drei Fluorophoren nicht auf die komplexen optischen Bedingungen im Auge mit einer größeren und individuell verschiedenen Anzahl fluoreszierender Substanzen übertra- gen werden. Ein Problem stellt insbesondere die Beweglichkeit des Auges dar, durch die Messungen verfälscht werden können. Es wurde daher versucht, die Autofluoreszenz insbesondere von Lipofuszin von anderen Fluoreszenzen mit einem der folgenden Verfahren durch optische Mittel zu trennen.

Von R. F. Spaide ( "Opthalmology" , Bd. 110, 2003, S. 392) wird vorgeschlagen, den Augenhintergrund mit Anregungslicht in einen Anregungs-Wellenlängenbereich zu bestrahlen, in dem nahezu ausschließlich das gesuchte Lipofuszin, nicht jedoch ande- re fluoreszierende Substanzen absorbieren. Von R. F. Spaide wird insbesondere der Anregungs-Wellenlängenbereich im Wellenlängenintervall von 500 nm bis 610 nm vorgeschlagen. Die Fluoreszenzmessung erfolgt in einem Emissions-Wellenlängen- bereich, in dem nahezu ausschließlich Lipofuszin emittiert, wobei hierfür das Wellenlängenintervall von 665 nm bis 775 nm vorgeschlagen wurde. Das Verfahren von R. F. Spaide hat die folgenden Nachteile. Erstens ist die Genauigkeit der Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin wegen der individuellen Variabilität der Beiträge fluoreszierender Substanzen zum Gesamtsignal beschränkt. Dies ist insbesondere wegen der verminderten Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung für Langzeituntersuchungen der AMD von Nachteil. Des Weiteren zeichnen sich die vorgeschlagenen Anregungs- und Emissions- Wellenlängenbereiche durch eine geringe Quantenausbeute aus. Es wird ein schwaches Signal mit einem hohen Rauschanteil gemessen, wodurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung weiter beschränkt wird. Eine Verbesserung des Signalanteils könnte durch eine Erhöhung der Intensität des Anregungslichts erzielt werden, wodurch jedoch die Belastung und Reizung des Auges während der Messung zunimmt.

In US 2006/0134004 wird ein konfokales Ophtalmoskop vorgeschlagen, mit dem für jeden untersuchten Punkt auf der Retina jeweils zwei Messungen der Autofluoreszenz durchgeführt werden. Die Messungen unterscheiden sich in den Anregungswellenlängen des Anregungslichts, die z. B. bei 488 nm und 532 nm gewählt werden. Durch die Anregung bei verschiedenen Anregungswellenlängen werden verschiedene Anteile von Lipofuszin und anderen fluoreszierenden Substanzen angeregt. Aus dem

Verhältnis der emittierten Autofluoreszenz kann für den gemessenen Punkt der Anteil von Lipofuszin ermittelt werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist der erhöhte gerätetechnische Aufwand bei der Erzeugung und Einstellung des Anregungs- lichts. So sind zwei Laser mit Emissionen bei den verschiedenen Anregungswellenlängen und ein Scanner-Mechanismus für die konfokale Messung erforderlich.

Die genannten Probleme der herkömmlichen opthalmologischen Techniken sind nicht nur bei der Erfassung von Lipofuszin gegeben. Entsprechende Probleme treten auf, wenn andere Pigmente, die z. B. für pathologische Veränderungen am Auge charakteristisch sind, selektiv durch Fluoreszenzmessungen erfasst werden sollen. Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Erfassung von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, mit dem Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden können. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine verbesserte Messeinrichtung zur Umsetzung eines derartigen Verfahrens bereitzustellen. Es ist ferner eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Fluoreszenzmessung am Auge bereitzustellen, mit dem die Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine verbesserte Messeinrichtung zur Fluoreszenzmessung am Auge bereitzustellen, mit der die Nachteile der herkömmlichen Techniken überwunden werden. Die Fluoreszenzmessung soll insbesondere einen ver- einfachten Ablauf aufweisen und die Erfassung der Autofluoreszenz eines einzelnen Pigmentes mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Diese Aufgaben werden durch Verfahren und/oder Messeinrichtungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Verfahrensbezogen wird die genannte Aufgabe gemäß einem ers- ten Gesichtspunkt der Erfindung durch die allgemeine technische Lehre gelöst, ein Verfahren zur Ermittlungen von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, das die folgenden Schritte umfasst. Zuerst erfolgt eine Bereitstellung von Messgrößen, die durch eine vorbe- stimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort des Objektes darstellbar sind, wobei die Objektantwort von spektralen Messbedingungen der Messungen und den gesuchten Zustandsbedingungen abhängig ist. Die Objektantwort enthält die Zustandsbedingungen als variable Parameter. In einem zweiten Schritt erfolgt die Berechnung der Zustandsbedingun- gen aus den Messgrößen, wobei eine Anpassung (Variation) der variablen Parameter der Objektantwort vorgesehen ist, bis die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden.

Die erfindungsgemäße Berechnung der Zustandbedingungen durch eine Parameteranpassung hat den Vorteil, dass die Beschränkungen und Fehler der herkömmlichen Verwendung einer Umkehrfunktion vermieden werden können. Des weiteren kann die Para- meteranpassung mit einem geringeren Rechenaufwand realisiert werden, so dass die gesuchten Zustandsbedingungen schneller als bei den herkömmlichen Verfahren berechenbar sind.

Vorrichtungsbezogen wird die genannte Aufgabe gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung durch die allgemeine technische Lehre gelöst, eine Messeinrichtung zur Ermittlungen von Zustandsbedingungen des zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, die eine Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung des Objektes, eine Kameraeinrichtung zur Messung einer Vielzahl von Messsignalen unter verschiedenen spektralen Messbedingungen, wobei die Messsignale durch die Objektantwort des Objektes bestimmt werden, und eine Auswertungseinrichtung zur Berechnung der Zustandsbedingungen aus den Messgrößen umfasst. Erfindungsgemäß enthält die Auswertungs- einrichtung eine Anpassungseinheit, mit der die Zustandsbedingungen durch eine Anpassung der Parameter der Objektantwort derart berechenbar sind, dass die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden. Die erfindungsgemäße Messeinrichtung hat den Vorteil eines kompakten Aufbaus. Die erfindungsgemäße Anpassungseinheit kann problemlos in eine Recheneinheit eines Messgerätes integriert werden.

Vorteilhafterweise besitzt die Erfindung einen im Vergleich zur herkömmlichen Technik erheblich erweiterten Anwendungsbe- reich. So wird mit dem Begriff "Objekt" ein Untersuchungsgegenstand bezeichnet, der bei Wechselwirkung mit Licht eine charakteristische Objektantwort aufweist. Der Untersuchungsgegenstand kann ein biologisches Objekt, wie zum Beispiel ein biologisches Gewebe, oder ein nicht-biologisches Objekt, wie zum Beispiel eine Probenanordnung chemischer Substanzen (As- say) umfassen.

Die "Objektantwort" (Response, Spektrum) ist die spektrale Antwortfunktion des Objektes, die beispielsweise spektroskopische Eigenschaften, insbesondere Reflektions-, Transmissions- oder Fluoreszenzeigenschaften, eine Polarisationsantwort, eine Phasenantwortfunktion oder eine Kombination aus diesen, wie zum Beispiel eine weilenlängen- und polarisati- onsabhängige Phasenantwortfunktion umfasst. Neben den Zu- standsbedingungen kann die Objektantwort als variablen Parameter einen Inhomogenitätsfaktor enthalten, der von Abbil- dungs- und Beleuchtungseigenschaften bei der Messung abhängig ist. Die Objektantwort kann z. B. durch eine Interpolation aus spektroskopischen Messergebnissen an einem Modellobjekt ermittelt werden.

Mit dem Begriff "Zustandsbedingungen" (Objekteigenschaften) werden Parameter des untersuchten Objektes bezeichnet, von denen die Objektantwort abhängig ist. Die Zustandsbedingungen umfassen insbesondere Parameter der chemischen Zusammensetzung (z. B. Vorhandensein und/oder quantitativer Anteil einer chemischen Verbindung), geometrische Parameter (z. B. Dimensionen von Strukturen des Objektes) und/oder physikalische Parameter (z. B. Aggregatbildung im Objekt) . Die Zustandsbedingungen sind allgemein im Objekt ortsabhängig, so dass die Objektantwort vom Messort abhängt. Mit dem Begriff "Systemfunktion" wird eine theoretische Funktion bezeichnet, mit der die Messgrößen in Abhängigkeit von der Objektantwort darstellbar sind. Die Systemfunktion ist eine vorbestimmte theoretische Funktion, die analytisch nach einer Modellierung der Lichtausbreitung bei der Messung am Objekt oder numerisch auf der Grundlage von Tabellenwerten vorliegt. Die konkrete Form der Systemfunktion wird in Abhängigkeit von der Konstruktion der erfindungsgemäß verwendeten Messgrößen gewählt.

Die erfindungsgemäß ausgewerteten Messgrößen basieren auf Messungen am Objekt. Sie werden vorzugsweise aus Messsignalen, die am Objekt erfasst wurden, gebildet. Vorteilhafterweise kann in diesem Fall eine aus den Gesetzen der Lichtaus- breitung bei der Messung konstruierte Abbildungsfunktion als Systemfunktion verwendet werden. Die Messsignale A_r können durch die Abbildungsfunktion F mit A_r = F (S(pi,K),L_r(k)) gemäß

A_r(p(x')) = K(x') x (D

—00 dargestellt werden, wobei S die Objektantwort, L_r die Messbe- dingungen, K(x') ein von Abbildungseigenschaften bei der Messung und insbesondere vom Messort abhängiger Inhomogenitätsfaktor, λ die Wellenlänge, p die Zustandsbedingungen des Objektes, Λ: die Ortskoordinate (Messort) auf dem Objekt und x' die Ortskoordinate auf dem Detektor umfassen.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung beruht auf der Variabilität bei der Konstruktion der Messgrößen aus den Messsignalen. Die Messgrößen können in Abhängigkeit von globalen optischen Eigenschaften des Objektes und/oder der Messeinrichtung ge- wählt werden. So kann gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Objektantwort den Inhomogenitätsfaktor als variablen Parameter enthalten. Dies ist z. B. der Fall, wenn die spektralen Merkmale des Objektes, welche von den zu erfassenden Zustandbedingungen abhängig sind, durch andere spektrale Abbildungs- oder Beleuchtungsbedingungen überlagert sind. Diese Bedingung tritt bei ophtalmologischen Messungen beispielsweise auf, wenn die Objektantwort von retinalen Blutgefäßen durch die Remission des hinter dem betrachteten Blutgefäß liegenden Fundus überlagert ist.

Wenn die Objektantwort den ortsabhängigen Inhomogenitätsfaktor als variablen Parameter enthält, wird die Abbildungsfunk- tion gemäß Gleichung (1) komplizierter. Von Vorteil ist jedoch, dass in diesem Fall die Messgrößen unmittelbar durch die Messsignale der Messungen am Objekt bereitgestellt werden. Jede Messgröße umfasst ein Messsignal. In diesem Fall umfasst die Berechnung der Zustandsbedingungen eine Anpassung aller Parameter der Objektantwort, welche die Zustandsbedingungen und den Inhomogenitätsfaktor umfassen, derart, dass die Messsignale A_r durch die oben genannte Abbildungsfunktion F (Sφi, K), L_n(K)) repräsentiert werden.

Erfindungsgemäß kann der Inhomogenitätsfaktor mit verschiedenen Ansätzen ermittelt werden. Erstens ist eine Iteration möglich, bei der ausgehend von vorbestimmten Startwerten des Inhomogenitätsfaktors und der Zustandsbedingungen eine wiederholte Anpassung der Parameter in Gleichung (1) erfolgt. Zweitens kann die Ermittlung des Inhomogenitätsfaktors in die Anpassung der Parameter der Objektantwort integriert werden. Drittens kann der Inhomogenitätsfaktor, falls ausreichende Informationen über das Messsystem vorliegen, aus einer vorbestimmten Modellfunktion ermittelt werden. Jede der Varianten kann in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit der Anpassung und/oder die Rechenzeit haben.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Objektantwort vom Inhomogenitätsfaktor unabhängig sein. Diese Unabhängigkeit ist z. B. bei der Bestimmung der SauerstoffSättigung in einem Blutgefäß mit einem großen Durchmesser (> 300 μm) gegeben. In diesem Fall wird die erfindungsgemäße Ermittlung der Zustandsbedingungen vorteilhafterweise erheblich vereinfacht. Jede Messgröße umfasst einen Signalquotienten q_nm = A„/A_m aus zwei Messsignalen A_n, A_m, die verschiedenen spektralen Messbedingungen zugeordnet sind, wobei die Systemfunktion durch den Quotienten der Abbildungs- funktionen F (S(pι), L_n(K))IF (S(pt), L_m(k)) gegeben ist. Die Berechnung der Zustandsbedingungen umfasst eine Anpassung der Parameter der Objektantwort derart, dass die Signalquotienten durch den Quotienten der Abbildungsfunktionen repräsentiert werden. Durch die Quotientenbildung ist die Systemfunktion nicht mehr vom Inhomogenitätsfaktor abhängig. Auf die obigen Ansätze zur Ermittlung des Inhomogenitätsfaktors kann verzichtet werden.

Die spektralen Messbedingungen L_r der Messungen, auf denen die Messgrößen basieren, können in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung gewählt werden. Gemäß bevorzugten Varianten der Erfindung umfassen die Messbedingungen Beleuchtungsbedingungen, Detektionsbedingungen oder Kombinationen aus diesen. Die Beleuchtungsbedingungen umfassen eine Beleuchtung des Objektes mit Licht mit vorbestimmten Wellenlängenverteilungen. Die Detektionsbedingungen umfassen eine Detektion des Lichts, das nach der Wechselwirkung mit dem Objekt entsprechend der Objektantwort verändert ist, durch Filter mit vorbestimmten Wellenlängenverteilungen. Die Messung mit verschiedenen Beleuchtungsbedingungen hat zwei Vorteile. Erstens kann die Belastung des Objektes durch die Beleuchtung, insbesondere bei ophthalmologischen Untersuchungen eine übermäßige Reizung des Auges vermindert werden. Zweitens kann die Intensität der Beleuchtung in verschiedenen Spektralbereichen in Abhängigkeit von der erwarteten Objektantwort gewählt werden. Somit kann der Empfindlichkeitsbereich der verwendeten Kameraeinrichtung besser ausgenutzt werden. Die Messung mit verschiedenen Detektionsbedingungen hingegen kann durch eine Vereinfachung der Messtechnik bei bestimmten Untersuchungsgegenständen von Vorteil sein.

Die spektrale Empfindlichkeit der Kameraeinrichtung kann bei der erfindungsgemäßen Ermittlung von Zustandsbedingungen des Objekts problemlos berücksichtigt werden, indem die spektrale Empfindlichkeit als Beitrag zu den spektralen Messbedingungen L_r betrachtet wird und somit in die Auswertung der Messgrößen eingeht.

Wenn die spektralen Wellenlängenverteilungen (Emissionsspektrum einer Beleuchtungseinrichtung und/oder Transmissionsspektrum eines Filters) mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm gewählt werden, ergeben sich insbesondere Vorteile für die Ermittlung von Zustandsbedingungen, die sich breitbandig auf die Objektfunktion auswirken. Vorzugsweise werden die Wellenlängenverteilungen im Wellenlängenbereich von 200 nm bis 1,5 μm gewählt. Besonders bevorzugt ist der Wellenlängenbereich von 420 nm bis 920 nm, in dem biologisches Gewebe charakteristische spektroskopische Eigen- schaften aufweist.

Da biologische Objekte in der Regel eine komplexe chemische und physikalische Struktur aufweisen, zeichnen sie sich durch eine komplexe Objektantwort aus, die mit herkömmlichen Proze- duren nicht zuverlässig analysiert werden kann. Dies gilt besonders für lebende biologische Objekte, die einer in vivo- Messung unterzogen werden. Daher ist gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung der Untersuchungsgegenstand ein bio- logisches Objekt, insbesondere ein biologischer Organismus oder ein Teil von diesem. Des Weiteren fehlt es bei biologischen Objekten oft an der Möglichkeit, das Objekt für die Messung zu modifizieren, z. B. durch den Zusatz einer Markersubstanz oder durch eine Temperierung. Dies gilt z. B. für das Auge oder anderes biologisches Gewebe, wie z. B. Nervengewebe oder Gehirngewebe, oder ein Teil von diesen, wie z. B. Blutgefäße (mit dem enthaltenen Blut) , insbesondere retinale Blutgefäße (Arterien, Arteriolen, Venen, Venolen) . So umfassen die Zustandsbedingungen gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung mindestens eine der Durchblutungseigenschaften Sauerstoffgehalt des Blutes, Hämatokrit und Durchmesser von Blutgefäßen. In diesen Fällen ergeben sich besondere Vorteile, da mit der Erfindung schnell und reproduzierbar, ggf. während einer Untersuchung oder einer Operation Daten über Zustandsbedingungen des Objektes verfügbar gemacht werden können, auf deren Grundlage anschließend eine diagnostische Bewertung oder eine Entscheidung über den weiteren Verlauf der Untersuchung oder Operation erfolgen kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine hohe Flexibilität in Bezug auf den Zeitpunkt der Ermittlung der Zustandsbedingungen aus den Messgrößen aus. So kann gemäß einer Variante der Erfindung die Bereitstellung der Messgrößen unmittelbar durch die Messungen am Objekt, d. h. durch die Ausgabe der Messsignale, Rohsignale oder ggf. bearbeitete

Rohsignale, aus der Kameraeinrichtung erfolgen. Die Messsignale sind Bildsignale, die mit der Kameraeinrichtung aufgenommen werden. Die Aufnahme unter verschiedenen Messbedingungen kann zeitlich aufeinander (sequentiell) oder gleichzeitig (parallel) erfolgen. Die Ermittlung der Zustandsbedingungen erfolgt on-line während der Messung.

Gemäß einer abgewandelten Variante der Erfindung kann die Be- reitstellung der Messgrößen durch eine Ausgabe aus einem Datenspeicher, z. B. aus einer Datenbank erfolgen. Die bei den Messungen unter verschiedenen Messbedingungen aufgenommenen Messsignale können zunächst in der Datenbank abgelegt worden sein. Die Bereitstellung der Messgrößen erfolgt dann über ein Computernetzwerk, wie z. B. über das Internet, an eine Auswertungseinrichtung, mit der die gesuchten Zustandsbedingungen ermittelt werden.

Bei der Gestaltung der Messeinrichtung und/oder vor der Be- reitstellung der Messgrößen durch die Messungen ist eine Auswahl der spektralen Messbedingungen mit einer Optimierungsprozedur vorgesehen. Die Optimierungsprozedur umfasst eine Maximierung einer Determinante, die aus einer Funktionalmatrix J (Jacobi-Matrix) berechnet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der theoretischen Objektantwort nach den Zustandsbedingungen enthalten. Die Maximierung der Determinante hat den Vorteil, dass ein echtes Maß für die Fehlerminimie- rung und die Trennbarkeit der Einflüsse der verschiedenen Zustandsbedingungen bereitgestellt wird. Die Optimierungsproze- dur kann alternativ auch bei der o. g. Ausführungsform der Erfindung vorgesehen sein, bei der die Bereitstellung der Messgrößen aus einem Datenspeicher erfolgt.

Die Maximierung der Determinante kann bei der Gestaltung der Messeinrichtung (z. B. Design der Beleuchtungseinrichtung) durch die partielle Differenzierung der Objektantwort ohne Kenntnis der Zustandsbedingungen eines untersuchten Objekts erfolgen. Alternativ kann die Optimierung der spektralen Messbedingungen unmittelbar vor der Messung vorgesehen sein. Gemäß einer weiteren Alternative können die zuerst bei der Gestaltung der Messeinrichtung ausgewählten spektralen Messbedingungen unmittelbar vor der Messung weiter optimiert werden, wobei ggf. spezifische Eigenschaften des Objekts, wie eine am Objekt gemessene Remission von Gewebe neben Blutgefäßen, berücksichtigt werden.

Erfindungsgemäß kann unmittelbar die Determinante der Funktionalmatrix maximiert werden. Für den allgemeinen Fall, in dem die Anzahl der Messgrößen größer als die Anzahl der gesuchten Zustandsbedingungen ist, die Funktionalmatrix J also nicht quadratisch wäre, ist besonders bevorzugt ist eine Maximie- rung der Größe τJdet(J J) vorgesehen. Das Produkt der Funktionalmatrix J mit ihrer transponierten Matrix f ergibt eine Quadratform. Vorteilhafterweise können somit im Vergleich zur herkömmlichen Technik mehr Messgrößen ausgewertet werden, so dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Ermittlung von Zustandsbedingungen verbessert wird.

Wenn gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bei der Maximierung der Größe -^det(J J) mindestens ein vorbestimmter Bereich im Parameterraum der Zustandsbedingungen fest vorgegeben wird, kann die Optimierungsprozedur vorteil- hafterweise beschleunigt werden. Beispielsweise können rea- listische Intervalle der SauerstoffSättigung, des Hämatokrit und/oder der Blutgefäßdimensionen vorgegeben werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Beleuchtungseinrichtung der Messeinrichtung Leuchtdioden, die verschiedene spektrale Emissionen aufweisen. Es können zum Beispiel drei Leuchtdioden mit Emissionsmaxima im Roten (R) , Grünen (G) und Blauen (B) Spektralbereich oder Gruppen von Leuchtdioden mit Emissionen in den R-, G- und B-Bereichen vorgesehen sein. Die konkret gewünschten Beleuchtungsbedingungen können durch die Betriebsparameter der Leuchtdioden eingestellt werden. Die Leuchtdioden haben den besonderen Vorteil, dass sie eine kompakte Lichtquelle darstellen und leicht steuerbar sind. Es können Leuchtdioden auf der Basis von organischen oder anorganischen Halbleitermaterialien verwendet werden. Alternativ kann die Beleuchtungseinrichtung mit mindestens einem Laser ausgestattet sein. Es kann zum Beispiel ein durchstimmbarer Laser oder eine Gruppe von meh- reren Lasern (z.B. Laserdioden) vorgesehen sein. Die Verwendung von Lasern kann Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit und Stabilität der Wellenlängeneinstellung und der Beleuchtungsintensität haben. Gemäß einer weiteren Variante kann die Beleuchtungseinrichtung mindestens eine Blitzlampe in Kombi- nation mit mindestens einem Filter umfassen. Es kann beispielsweise eine einzige Blitzlampe mit mehreren Filtern zur Einstellung der spektralen Beleuchtungsbedingungen oder alternativ eine Gruppe von Blitzlampen mit verschiedenen Filtern vorgesehen sein. Blitzlampen können Vorteile in Bezug auf die erreichbaren Beleuchtungsintensitäten und die Verfügbarkeit an vorhandenen Messgeräten haben. Gemäß einer weiteren Variante kann eine Kombination der genannten Lichtquellen als Beleuchtungseinrichtung vorgesehen sein.

Die Beleuchtungseinrichtung kann für die Einstellung der oben genannten Beleuchtungsbedingungen, insbesondere die genannten Wellenlängenbereiche eingerichtet sein. Gemäß einer Variante der Erfindung kann es von Vorteil sein, wenn die genannten Lichtquellen, insbesondere die Leuchtdioden oder die Laser mit mindestens einem Filter kombiniert werden. In diesem Fall kann die Wellenlängenverteilung des zur Beleuchtung verwendeten Lichts mit erhöhter Genauigkeit an das zu untersuchende Objekt angepasst und optimiert werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Kameraeinrichtung der Messeinrichtung einen CCD-Sensor. CCD-Sensoren haben den Vorteil, dass die Messsignale der Kameraeinrichtung unmittelbar der erfindungsgemäßen Ermittlung der Zustandsbedingungen unterzogen werden können, ohne das eine Zwischenbearbeitung der Signale erforderlich ist. Des Weiteren kann die spektrale Empfindlichkeit der CCD- Sensoren problemlos als Beitrag zu den spektralen Messbedingungen in die Auswertung der Messsignale integriert werden.

Wenn die Messsignale mit dem CCD-Sensor paarweise unmittelbar vor Beginn und nach Beendigung einer Zwischenspeicher-Phase des CCD-Sensors erfasst werden, in der Ladungszustände von CCD-Elementen des CCD-Sensors in Zwischenspeichern gespei- chert werden, können vorteilhafterweise Fehler vermindert werden, die sich aus einer Bewegung des Objektes zwischen zwei Messungen mit verschiedenen Messbedingungen ergeben würden. Um diesen Vorteil auch bei Messungen zu erhalten, bei denen mehr als zwei verschiedene spektrale Messbedingungen eingestellt werden, ist für die paarweise Erfassung der Messsignale A_r bei aufeinander folgenden Zwischenspeicher-Phasen eine Permutation der spektralen Messbedingungen vorgesehen.

Wegen der bevorzugten Untersuchung biologischer Objekte ist die Messeinrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in ein medizinisches Gerät integriert. Vorzugsweise sind somit die Beleuchtungseinrichtung und die Kameraeinrichtung Teile des medizinischen Messgeräts. Besonders bevorzugt sind die Beleuchtungseinrichtung und die Kameraein- richtung Teile einer Funduskamera, die für ophthalmologische Untersuchungen vorgesehen ist, oder eines Mikroskops, insbesondere eines Operationsmikroskops, das für die Beobachtung während einer mikrochirurgischen Operation eingerichtet ist. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Messeinrichtung in der Funduskamera oder dem Mikroskop, insbesondere dem Operationsmikroskop, die Funduskamera und das Mikroskop stellen eigenständige Gegenstände der Erfindung dar.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Computer-Programmprodukt, das sich auf einem Computer-lesbaren Speichermedium befindet, mit einem Programmcode zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine Vorrichtung, die ein Computer-lesbares Speichermedium umfasst, das Programmanwei- sungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält.

Die Erfindung basiert gemäß einem dritten Gesichtspunkt auf der allgemeinen technischen Lehre, ein in vi vo-Messverfahren, das am Auge durchgeführt wird, mit einer Beleuchtung des Auges mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs- Wellenlängenbereich und mit einer Fluoreszenzmessung in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich dahingehend weiterzuentwickeln, dass eine weitere Fluoreszenzmessung in einem zwei- ten Emissions-Wellenlängenbereich erfolgt, der vom ersten

Emissions-Wellenlängenbereich abweicht, und dass ein Autofluoreszenzsignal eines bestimmten Pigments im Auge aus Signalen der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen ermittelt wird. Die Fluoreszenzmessungen umfassen die Messungen von ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen entsprechend in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen, wobei beide Messungen mit dem selben Anregungs-Wellenbereich des Anregungslichtes erfolgen. Das Autofluoreszenzsignal wird vorzugsweise mit dem Verfahren gemäß dem o. g. ersten Gesichtspunkt der Erfindung zur Ermittlungen von physiologischen Zustandsbedin- gungen des Auges analysiert.

Der Begriff "Anregungs-Wellenlängenbereich" bezieht sich auf ein Wellenlängenintervall, das eine Vielzahl von Wellenlän- gen, z. B. aus dem Emissionsspektrum einer Leuchtdiode, oder eine Breite entsprechend einer einzelnen Emissionslinie, z. B. einer Laserdiode oder eines Lasers umfasst. Der Begriff "Emissions-Wellenlängenbereich" bezieht sich auf ein Wellen- längenintervall, das mindestens einen Teilbereich des Fluoreszenzspektrums des Pigments abdeckt. Die Emissions- Wellenlängenbereiche der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen unterscheiden sich voneinander, wobei disjunkte oder teilweise überlappende Intervalle vorgesehen sein können.

Die Erfinder haben festgestellt, dass die Autofluoreszenz eines einzelnen Pigments, z. B. Lipofuszin im Augenhintergrund, von den Emissionen weiterer fluoreszierender Substanzen im Auge zuverlässig und mit hoher Genauigkeit mit nur zwei Fluo- reszenzmessungen erfasst werden kann. Es wurde festgestellt, dass durch eine geeignete Auswahl des Anregungs-Wellenlängen- bereiches die Autofluoreszenz des gesuchten Pigments mit hoher Quantenausbeute angeregt werden kann. Überraschenderweise ist es bei der Fluoreszenzmessung nicht zwingend erforder- lieh, die Fluoreszenzanteile jeder einzelnen fluoreszierenden Substanz separat zu bestimmen. Die Lösung komplexer Gleichungssysteme wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vermieden .

Die Erfindung basiert gemäß einem vierten Gesichtspunkt auf der allgemeinen technischen Lehre, eine Messeinrichtung bereitzustellen, die eine Beleuchtungseinrichtung, die zur Erzeugung des Anregungslichtes und zur Bestrahlung des Auges, insbesondere des Augenhintergrundes eingerichtet ist, und ei- ne Detektoreinrichtung aufweist, die zur spektral aufgelösten Detektion von Fluoreszenzemissionen und zur Bereitstellung von Fluoreszenzsignalen eingerichtet ist. Die Messeinrichtung ist so konfiguriert, dass das Verfahren gemäß dem o. g. dritten Gesichtspunkt der Erfindung ausgeführt werden kann. Vor- zugsweise fallen ein Anregungs-Strahlengang des Anregungslichtes und ein Emissions-Strahlengang der Fluoreszenzemissionen zumindest abschnittsweise zusammen. Die Detektoreinrichtung ist ferner vorzugsweise mit einem Filterwechsler ausges- tattet, der so konfiguriert ist, dass zwischen zwei Fluoreszenzmessungen Emissions-Filter im Emissions-Strahlengang gewechselt werden können.

Mit der Beleuchtungseinrichtung ist der vorbestimmte Anre- gungs-Wellenlängenbereich einstellbar. Die Beleuchtungseinrichtung umfasst z. B. eine Lichtquelle mit einer Emission im Anregungs-Wellenlängenbereich oder eine Kombination aus einer Lichtquelle und einem Anregungs-Filter, der Anregungslicht im Anregungs-Wellenlängenbereich durchlässt. Besonders bevorzugt umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine einzige Lichtquelle, z. B. eine einzige Leuchtdiodenanordnung mit einer einzelnen oder mehreren Leuchtdioden. Der Anregungsfilter ist auch zur Unterdrückung langwelliger Restemissionen der Lichtquelle vorgesehen, die in die Emissions-Wellenlängenbereiche der Fluorophore fallen würden. Die Detektoreinrichtung weist mindestens einen Detektor auf, der mit einem spektral selektiven Element, wie z. B. einem Monochromator oder einem Emissions- Filter ausgestattet ist. Vorzugsweise ist der Detektor für eine ortsaufgelöste Detektion ausgelegt. Hierzu umfasst der Detektor z. B. eine Detektorkamera.

Wenn die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung spektral integrierte Fluoreszenzintensitäten der in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen detektierten Fluoreszenzemissionen umfassen, wird vorteilhafterweise das Nutzsignal relativ zum Hintergrundrauschen verbessert, so dass die Genauigkeit der Fluoreszenzmessung erhöht werden kann. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Autofluoreszenzsignal des zu erfassenden Pigments durch eine Näherungsfunktion (Approximation) ermittelt, die von den Fluoreszenzsignalen der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen und von den spektralen Messbedingungen während der Fluoreszenzmessungen abhängt. Im Unterschied zu den herkömmlichen Verfahren mit der spektralen Entmischung erfolgt nicht die analytische Lösung eines Gleichungssystems, sondern vorzugsweise die näherungsweise Ermittlung der Appro- ximation. Die Erfinder haben festgestellt, dass für die Fluoreszenzmessung am Auge Näherungsfunktionen verfügbar sind, die überraschenderweise Werte der Autofluoreszenz mit einer extrem hohen Genauigkeit, insbesondere im Vo-Bereich liefern.

Besonders vereinfacht wird die Erfassung des Autofluoreszenzsignals bei der Messung von Lipofuszin, da in diesem Fall die Näherungsfunktion gemäß S = (S2 - l/D ' Si) ' Io ' C gebildet ist. Die Autofluoreszenz S ist insbesondere von den Fluoreszenzsignalen Si und S2 und einem spektralen Mischungsparame- ter D abhängig. Der spektrale Mischungsparameter D ist ein Korrekturfaktor, der einen Näherungswert für den Anteil der Beiträge von nicht interessierenden Fluorophoren im Gesamtsignal der Fluoreszenz darstellt. Der spektrale Mischungsparameter kann aus Referenzmessungen abgeschätzt werden. Typi- scherweise ist der spektrale Mischungsparameter D im Bereich von 2 bis 4, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5, z. B. von 2,9 bis 3,1 gewählt. Die Autofluoreszenz S ist ferner von weiteren Parametern der Messeinrichtung, insbesondere einer Normierungsintensität Io und einer Konstante C abhängig, welche die spektralen Messbedingungen, wie z. B. die Einstellung der Detektorkamera relativ zum Auge und Streueigenschaften der Medien im Auge, repräsentiert. Die weiteren Parametern Io und C müssen nicht unbedingt ermittelt werden, da für viele Anwendungen relative Werte der Autofluoreszenz S ausreichend sind. Die genannte Näherungsfunktion hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie in Abhängigkeit von dem zu erfassenden Pigment und dessen spektralen Eigenschaften leicht an die Bedingungen der konkreten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ange- passt werden kann.

Vorzugsweise wird der Anregungs-Wellenlängenbereich an die Absorption des Pigments angepasst, dessen Autofluoreszenz er- fasst werden soll. Vorteilhafterweise kann damit eine hohe

Quantenausbeute der Fluoreszenzmessung erzielt werden. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der neben der Absorption des Pigments auch die Absorption okularer Medien des menschlichen Auges berücksichtigt wird. Die okularen Medien umfassen die Substanzen, die entlang des Strahlengangs von der Beleuchtungseinrichtung zum Augenhintergrund angeordnet sind. Die Absorption der okularen Medien hat eine Filterwirkung, die sich mit der Wellenlängenverteilung des von der Beleuchtungseinrichtung erzeugten Lichtes überlagert. Durch die Berücksichtigung der effektiven Absorption kann der Anregungs-Wellenlängenbereich vorteilhafterweise optimal an die Absorption des Pigments angepasst werden. Im Ergebnis kann die Quantenausbeute der Fluoreszenzanregung erhöht werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass sich die Wellenlängenintervalle einerseits des Anregungs-Wellenlängenbereiches und andererseits der Emissions-Wellenlängenbereiche nicht überlappen. Vorteil- hafterweise wird dadurch vermieden, dass Licht detektiert wird, dass durch einfache Remission in die Detektoreinrichtung gelangen könnte. Eine unerwünschte Überlagerung der Autofluoreszenz durch die Remission wird vermieden. Besonders bevorzugt wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Autofluoreszenz des Pigments Lipofuszin erfasst. Es hat sich herausgestellt, dass die Trennung der Lipofuszin-Auto- fluoreszenz von Fluoreszenzemissionen anderer Fluorophore mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einer besonders hohen Genauigkeit möglich ist. Hierzu wird als Anregungs-Wellen- längenbereich vorzugsweise ein Wellenlängenintervall gewählt, dass sich von 400 nm bis 490 nm, besonders bevorzugt von 420 nm bis 480 nm, insbesondere 427 nm bis 477 nm erstreckt. Der erste Emissions-Wellenlängenbereich wird vorzugsweise im Wellenlängenintervall von 495 nm bis 560, besonders bevorzugt 500 nm bis 550, insbesondere 510 nm bis 540 nm gewählt, während der zweite Emissions-Wellenlängenbereich vorzugsweise Wellenlängen oberhalb von 565 nm, besonders bevorzugt ober- halb von 570 nm, insbesondere oberhalb von 590 nm umfasst. Eine Obergrenze des zweiten Emissions-Wellenlängenbereiches kann mit der Empfindlichkeitsgrenze der Detektoreinrichtung im roten oder infraroten Spektralbereich gegeben sein und z . B. 750 nm oder 800 nm betragen.

Für ophtalmologische Untersuchungen ist von besonderem Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Messung der Autofluoreszenz ortsaufgelöst erfolgt. Das Autofluoreszenzsignal wird mit Ortsauflösung erfasst. Hierzu umfasst die Detektoreinrichtung vorzugsweise mindestens eine Detektorkamera.

Ein weiteren Vorteil der Erfindung ergibt sich aus der Variabilität des Zeitschemas der Fluoreszenzmessungen. So können gemäß einer ersten Variante der Erfindung die Fluoreszenzmes- sungen zeitlich aufeinanderfolgend vorgesehen sein. Vorteilhafterweise kann hierzu ein einziger Detektor im Kombination mit verschiedenen Emissionsfiltern zur Einstellung der Emissionswellenlängenbereiche vorgesehen sein. Wenn der Zeitabstand zwischen den Fluoreszenzmessungen geringer als 500 ms, vorzugsweise geringer als 200 ms, z. B. im Bereich von 80 bis 150 ms ist, werden vorteilhafterweise eventuelle Einflüsse auf die gemessenen Fluoreszenzsignale durch Veränderungen des Auges ausgeschlossen. Gemäß einer zweiten Variante können die Fluoreszenzmessungen in den ersten und zweiten Wellenlängenbereichen gleichzeitig erfolgen, wobei in diesem Fall zwei Detektoren vorgesehen sind, welche Fluoreszenzemissionen vom Auge auf zwei getrennten Strahlengängen erfassen. Bei der zweiten Variante ergibt sich vorteilhafterweise eine verrain- derte Reizung des Auges und eine Verkürzung der Messzeit.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann eine Ermittlung einer Konzentration des Pigments aus dem Autofluoreszenzsignal vorgesehen sein. Die Erfinder haben festgestellt, dass das Autofluoreszenzsignal für eine quantitative Auswertung geeignet ist, bei der die Pigmentkonzentration, insbesondere die Lipofuszin-Konzentration im Augenhintergrund bereitgestellt werden kann. Der ermittelte Konzentrationswert dient als Grundlage für eine sich an- schließende Diagnose, z. B. durch einen Ophtalmologen .

Weitere Vorteile für die Anwendung in der Ophtalmologie ergeben sich, wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung ein Bild des Augenhintergrundes erzeugt wird, in dem das Autofluoreszenzsignal oder die Konzentration des Pigments quantitativ, z. B. durch eine Grauwert- oder Falschfarbendarstellung repräsentiert wird. Es können insbesondere Bereiche, in denen das Autofluoreszenzsignal oder die Konzentration des Pigments vorbestimmte Grenzen überschreiten, eine Markierung des Bildes des Augenhintergrundes vorgesehen sein. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Figur 1: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens illustriert;

Figur 2: eine schematische Blockdarstellung einer Ausfüh- rungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung;

Figur 3: eine schematische Illustration einer bevorzugten Anwendung der Erfindung;

Figur 4: eine Kurvendarstellung zur Illustration der Konstruktion einer Objektantwortfunktion;

Figur 5: ein Flussdiagramm zur Illustration der Optimierung von spektralen Messbedingungen;

Figur 6: eine schematische Illustration einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung;

Figur 7: ein Flussdiagramm mit einer Illustration wichtiger Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Figur 8: eine graphische Darstellung von unter Berücksichtigung der Transmission okularer Medien im Auge gebildeten Absorptionsspektren verschiedener fluores- zierender Substanzen im Auge; und

Figur 9: eine graphische Darstellung mit Fluoreszenzspektren verschiedener fluoreszierender Substanzen im Auge. Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die ortsaufgelöste Analyse von Zustandsbedingungen eines biologischen Objektes, insbesondere die Ermittlung der SauerstoffSättigung von retinalen Blutgefäßen des Augenhintergrun- des beschrieben. Die Umsetzung der Erfindung ist nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern entsprechend auch mit anderen biologischen oder nicht-biologischen Objekten möglich. Es sind insbesondere in vivo- oder in vitro-Anwendungen an biologischen Objekten möglich. Alternativ zu der Ermittlung von Zustandsbedingungen des Augenhintergrundes kann erfindungsgemäß beispielsweise die Bestimmung der SauerstoffSättigung und ggf. weiterer Parameter in optisch zugänglichen Gefäßen oder Kapillargebieten in biologischem Gewebe, die Bestimmung der Trübung und ggf. weiterer Parameter der Augen- linse, die Bestimmung physiologischer Parameter der Hornhaut (Cornea) und/oder die Erkennung von verschiedenen Gewebetypen (Ermittlung von Zustandsbedingungen von gesundem Gewebe oder erkranktem Gewebe, insbesondere Tumorgewebe) vorgesehen sein. Beispiele für die Ermittlung von Zustandsbedingungen nicht- biologischer Objekte sind beispielsweise mit der Messung an Halbleiterstrukturen gegeben, bei denen z. B. die Kristallqualität oder die Ladungsträgerkonzentration als Zustandsbedingungen ermittelt werden.

1. Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens

In Figur 1 sind die Hauptschritte bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch illustriert. Einzelheiten, mathematische Grundlagen und die praktische Um- Setzung dieser Schritte werden unten unter Bezug auf die Figuren 2 bis 4 beschrieben.

In einem ersten Schritt Sl ist eine Bereitstellung von Messgrößen vorgesehen, die aus Messsignalen von spektroskopischen Messungen gebildet sind. Gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können die Messgrößen durch die Messsignale als solche oder durch Quotienten von Messsignalen gebildet werden. Die Bereitstellung der Messgrößen erfolgt unmittelbar durch Messungen am Objekt (Schritt S0.1) oder nach einer Ausgabe der Messsignale von in der Vergangenheit erfolgten Messungen aus einem Datenspeicher (Schritt SO.2) . Die Schritte S0.1 und SO.2 sind nicht zwingende Merkmale der Erfindung, sie werden jedoch bei bevorzugten Anwendungen der Erfindung in Verbindung mit den Schritten Sl und S2 ausgeführt.

Die Messungen umfassen zum Beispiel die Aufnahme von mindestens zwei Objektbildern, insbesondere Reflexionsbildern, unter verschiedenen spektralen Beleuchtungsbedingungen. Jedes Messsignal ist ein Bildsignal mit einer Vielzahl von Bilddaten, die den einzelnen Messorten des auf der Kameraeinrichtung abgebildeten Gebietes zugeordnet sind.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es wichtig, dass alle Messsignale (Bildsignale) den selben Bildausschnitt des Objektes abbilden. Falls dies nicht der Fall ist, werden die Teilbilder relativ zueinander ausgerichtet (übereinander gelegt) . Dies kann durch eine paarweise Korrelation der Bildsignale realisiert werden. Hierzu werden an sich bekannte Korrelationsverfahren verwendet, wie zum Beispiel die von W. H. Press et al . in "Numerical Recipes in C++" (Cambridge Uni- versity Press, 2003) beschriebenen Verfahren.

Bei Schritt S2 erfolgt die Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes aus den Messgrößen. In einer Darstellung der Messgrößen als Werte einer Systemfunktion, die von der Objektantwort abhängt, werden variable Parameter der Objektantwort variiert, bis die Werte der Systemfunktion eine Approximation der Messgrößen darstellen. Die Approximation der Mess- großen durch die Systemfunktion mit den angepassten Parametern der Objektantwort stellt eine Näherung der Werte der Systemfunktion an die Messgrößen dar, die im Rahmen der bei der konkreten Anwendung der Erfindung geforderten Toleranz ausreichend ist. Die angepassten Parameter sind die gesuchten Zustandsbedingungen des Objektes.

Schließlich folgt bei Schritt S3 eine weitere Datenverarbeitung der ermittelten Zustandsbedingungen. Die Datenverarbei- tung kann zum Beispiel mindestens eines von einer Ausgabe, einer Speicherung und einer Visualisierung (Anzeige) der Zustandsbedingungen umfassen. Im Ergebnis werden zum Beispiel gedruckte Daten, gespeicherte Daten oder visuell angezeigte Daten bereitgestellt, welche die Zustandsbedingungen reprä- sentieren. Schritt S3 stellt kein zwingendes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, er wird jedoch gemäß bevorzugten Anwendungen der Erfindung in Kombination mit den Schritten Sl und S2 realisiert. Schritt S3 liefert keine diagnostische Information über das untersuchte Objekt, sondern vielmehr Daten, die anschließend, ggf. nach einer weiteren Datenverarbeitung, zur Ermittlung einer Diagnose unterzogen werden können. Eine diagnostische Datenverarbeitung kann zum Beispiel einen Vergleich mit Referenzdaten und die Ausgabe einer physiologischen Information im Ergebnis des Vergleichs mit den Referenzdaten umfassen.

Die Anzeige der Zustandsbedingungen kann bei ophtalmologi- schen Anwendungen der Erfindung insbesondere die folgenden

Teilschritte umfassen. Auf einem Anzeigegerät, z. B. einem Bildschirm oder einem Drucker der Messeinrichtung wird ein

Fundusbild des Augenhintergrundes dargestellt. Das Fundusbild wird mit einem Parameterbild der ermittelten Zustandsbedingungen überlagert. Es kann eine vollständige Überlagerung des gesamten Fundusbildes mit dem gesamten Parameterbild vorgese- hen sein. Für praktische Anforderungen genügt jedoch in der Regel eine Teilüberlagerung, bei der das Parameterbild auf einen interessierenden Bereich im Fundusbild, z. B. auf bestimmte Blutgefäße, beschränkt wird. Das Parameterbild um- fasst z. B. eine Falschfarbendarstellung der ermittelten Zu- standsbedingungen . Beispielsweise wird ein Blutgefäß mit einer Falschfarbendarstellung der SauerstoffSättigung im betreffenden Abschnitt des Blutgefäßes überlagert.

2. Ausfϋhrungsformen der Messeinrichtung

Figur 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung 100 mit einer Beleuchtungseinrichtung 10, einer Kameraeinrichtung 20, einer Auswertungs- einrichtung 30 und einer optional vorgesehenen Ausgabeeinrichtung 40. Die Beleuchtungseinrichtung 10 umfasst mindestens eine Lichtquelle, wie zum Beispiel eine Vielzahl von Leuchtdioden, mit der das Objekt 1 mit einer vorbestimmten spektralen Wellenlängenverteilung beleuchtet werden kann. Die Kameraeinrichtung 20 enthält einen CCD-Sensor 21 zur Aufnahme der Messsignale vom Objekt 1. Die Auswertungseinrichtung enthält die erfindungsgemäß vorgesehene Anpassungseinheit 31, mit der die Zustandsbedingungen durch die Anpassung der Parameter der Objektantwort berechenbar sind. Die Ausgabeeinrich- tung umfasst zum Beispiel einen Drucker, einen Datenspeicher und/oder einer Anzeige. Die Teile 10 und 20 können Teil eines Messgerätes sein, wie dies in Figur 3 mit weiteren Einzelheiten gezeigt ist. Die Teile 30 und 40 können Teile einer Steuereinrichtung (Rechner) sein, die in das Messgerät integriert ist.

Gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung umfasst das Messgerät eine ophthalmologische Funduskamera 200, die schematisch in Figur 3 gezeigt ist. Die Messeinrichtung 100 mit der Beleuchtungseinrichtung 10, der Kameraeinrichtung 20 und der Auswertungseinrichtung 30 ist Bestandteil der Funduskamera 200. Die optional vorgesehene Ausgabeeinrichtung 40 kann ebenfalls in die Funduskamera 200 integriert oder wie darge- stellt eine separate Komponente sein.

Die Funduskamera 200 ist zum Beispiel so aufgebaut, wie ein Ringlicht-Ophthalmoskop, das in DE 10 2004 050 807 Al beschrieben ist. So umfasst die Beleuchtungseinrichtung 10 eine ringförmige Lichtquelle 11 mit einer Vielzahl von Leuchtdioden, die in verschiedenen Spektralbereichen emittieren und eine Ophthalmoskoplinse 12, mit der Beleuchtungslicht auf das Auge 1, insbesondere auf den Augenhintergrund 2 gerichtet wird. Die Leuchtdioden haben z. B. die Zentralwellenlängen 463 nm, 521 nm, 624 nm, 642 nm und 815 nm. Die Ophthalmoskoplinse 12 erzeugt ein Bild (Reflexionsbild) des beleuchteten Augenhintergrunds 2, das mit dem Objektiv 22 auf den CCD-Sensor 21 der Kameraeinrichtung 20 abgebildet wird.

Die Auswertungseinrichtung 30 enthält eine Steuereinheit 32, die mit der Anpassungseinheit 31, der Beleuchtungseinrichtung 10 und der Kameraeinrichtung 20 verbunden ist. Die Steuereinheit 32 dient der Auswahl der gewünschten Operationsparameter der Beleuchtungseinrichtung 10, insbesondere der Intensitä- ten, der spektralen Wellenlängenverteilungen und/oder eines Schalttaktes, und der Steuerung der Kameraeinrichtung 20, insbesondere eines Auslestaktes des CCD-Sensors 21. Die Kameraeinrichtung 20 umfasst zum Beispiel eine Schwarz/Weiß- Digitalkamera mit einer Farbtiefe von 12 bit und etwa 10⁶ CCD-Elementen 23 (z. B 1392 * 1040 Pixel), zum Beispiel vom Typ AVT Dolphin 145B (Hersteller Allied Vision Technologies GmbH, Deutschland, Stadtroda) . Die Auswahl des Schalttakts der Lichtquelle 11 und des Auslesetakts des CCD-Sensors 21 erfolgt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf der Grundlage der folgenden Überlegungen. Wenn für die Aufnahme der Bilder des Objektes (zum Beispiel der Reflexionsbilder des Augenhintergrunds 2) mit verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen wie dargestellt ein einziger Detektor verwendet wird, muss die Aufnahme der Bilder sequentiell erfolgen. Dabei kann es zu Fehlern durch Bewegungen des Objektes (z. B. durch Augenbewe- gungen) zwischen den einzelnen Bildaufnahmen kommen. Um diese Fehler zu minimieren, werden der Schalttakt und der Auslesetakt synchronisiert.

Bei der Bildaufnahme sind abwechselnd Messphasen, in denen CCD-Elemente 23 der CCD-Sensoren 21 lichtsensitiv geschaltet sind, und Zwischenspeicherphasen vorgesehen, in denen die durch den Lichteinfall in den CCD-Elementen 23 erzeugten Ladungsträger in einen Zwischenspeicher verschoben werden (zum Beispiel so genannter "Interline Transfer") . Nach der Zwi- schenspeicherphase wird der CCD-Sensor wieder in die Messphase umgeschaltet, während derer der Zwischenspeicher ausgelesen und gelöscht wird. Typischerweise ist die Dauer der Verschiebung der Ladungsträger in den Zwischenspeicher (z.B. 1 ms) sehr viel kürzer als die Dauer der Messphase (z.B. 60 ms) . Erfindungsgemäß kann die Beleuchtung des Objektes nun so erfolgen, dass am Ende einer ersten Messphase eine Beleuchtung mit einer ersten spektralen Wellenlängenverteilung (z.B. R-Verteilung) und zum Beginn einer nächsten (zweiten) Messphase die Beleuchtung mit einer zweiten spektralen Wellenlän- genverteilung (z.B. G-Verteilung) erfolgt. Die Belichtungszeiten (z.B. 1 ms bis 20 ms) sind erheblich kürzer als die Messphasen . Durch diese Technik kann der zeitliche Abstand der Aufnahmen der beiden Bilder mit den verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen wesentlich kürzer als die Bildwiederholperiode der Kamera sein. Vorteilhafterweise werden in der Praxis Bildaufnahmen mit einem zeitlichen Abstand von wenigen Millisekunden bis zu wenigen 10 Millisekunden, insbesondere im Bereich von 1 ms bis 60 ms erreicht. Vorteilhafterweise können damit zwei vergleichbare Bilder sogar für bewegte Objekte gewonnen werden, wenn deren Geschwindigkeit ausreichend gering in Bezug auf die Zeitskala des zeitlichen Abstandes der aufgenommenen Bilder ist.

In der Praxis besteht das Interesse, mehr als zwei Bilder unter vergleichbaren Abbildungsbedingungen aufzunehmen. Hierzu wird vorzugsweise die folgende Messung mit einer Permutation der spektralen Beleuchtungsbedingungen realisiert. Die genannte paarweise Erfassung von Bildsignalen (Aufnahme von Doppelbildern) wird mehrfach wiederholt, wobei für jeweils ein Paar von Doppelbildern jeweils eine der beiden verwende- ten spektralen Wellenlängenverteilungen in beiden Doppelbildern verwendet wird. Somit kann ein eventuell auftretender Unterschied in der Abbildung anhand der doppelt verwendeten spektralen Wellenlängenverteilung normiert und kompensiert werden .

Bei der Messung der SauerstoffSättigung in retinalen Blutgefäßen wird diese Permutation mit drei spektralen Verteilungen (R, G, B) wie folgt realisiert. Es wird davon ausgegangen, dass zwei Doppelbilder mit der folgenden Kombination spektra- ler Wellenlängenverteilung aufgenommen wurden: (R, G) und (R, B) . Dabei ergeben sich in Abhängigkeit der auf abhängigen Parameter SauerstoffSättigung, Hämatokrit und Gefäßdurchmesser (s, hund d) die Signale A_r,(s,h,d) , A_gi(s,h,d) (erstes Doppelbild) und A_r2(s,h,d), A_b2(s,h,d) (zweites Doppelbild) . Die Teilbilder der Doppelbilder werden relativ zueinander durch eine paarweise Korrelation der Bildsignale ausgerichtet (übereinander gelegt) . Die Signale werden dann als Messgrößen für die erfindungsgemäße Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes wie folgt bereitgestellt:

A_r(s,h,d) =A_rl(s,h,d) A_g(s,h,d) = A_gi(s,h,d)

Aλ_b(/s,hu,dA)\ = -^Är\(^s'^h—'^d)-AA_b2(/s,hL,dJ)V

A_r2(s,h,d)

Vorteilhafterweise ist es möglich, eine entsprechende Normierung oder Kompensation der Objektbewegung für jede Anzahl von spektralen Wellenlängenverteilungen analog zu realisieren.

Es ist noch anzumerken, dass für die Bildaufnahme im infraroten Spektralbereich (Zentralwellenlänge z. B. 815 nm) eine Doppelbildaufnahme nicht erforderlich ist, da in diesem Spektralbereich keine störende Reizung des Auges vorliegt.

3. Weitere Einzelheiten der Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes

Die ortsaufgelöste Ermittlung der Zustandsbedingungen durch eine Anpassung der Parameter der Objektantwort basiert auf der folgenden Darstellung der Messgrößen mit einer Systemfunktion .

Das zu untersuchende Objekt 1 hat eine spektrale Antwortfunktion, die hier als Spektrum oder Objektantwort S bezeichnet wird. Die Objektantwort kann zum Beispiel als Reflexionsbild oder als Transmissionsbild vorliegen. Die Objektantwort S(p(x),λ) hängt von n Parametern, der Wellenlänge λ und dem Ort x auf dem Objekt ab. Die n Parameter, welche die gesuchten Zustandsbedingungen /?, darstellen, werden als Komponenten eines Vektors

zusammengefasst . Alle Parameter im Vektor p können eine Ab- hängigkeit vom Ort x auf dem Objekt aufweisen.

Für die Ermittlung von Zustandsbedingungen biologischen Gewebes kann die Objektantwort in Abhängigkeit von der konkreten Zusammensetzung des Gewebes gebildet werden. Die Objektant- wort wird z. B. auf der Grundlage der Transmission von Hämoglobin gemäß

S = exp{- (sr_o(λ) + (1 -s) T₀(X) ) hd)

gebildet, wobei Fo (λ) der Absorptionskoeffizient von nicht oxygeniertem Hämoglobin, Fi (λ) der Absorptionskoeffizient von oxygeniertem Hämoglobin, s die SauerstoffSättigung, h der Hämatokrit und d die Schichtdicke sind. Die Größen s und hd bilden die zu ermittelnden Zustandsbedingungen des untersuch- ten Objekts. Die Größen F₀ (λ) und Fi (λ) sind beispielhaft in Figur 4 dargestellt.

Alternativ ist möglich, dass die Objektantwort mit Hilfe der aufgenommenen Bildsignale erst generiert wird. So spielt ins- besondere bei retinalen Blutgefäßen mit sehr kleinen Gefäßdurchmesser die Reflektivität des Fundusgewebes auf der Rückseite des Blutgefäßes eine wichtige Rolle. Diese Remission kann nach Anwendung einer Bildverarbeitung aus der Remission in der Umgebung des betrachteten Gefäßabschnitts abgeschätzt und in der Konstruktion der Objektantwort berücksichtigt werden.

Es ist möglich, dass die Objektantwort nur bei einem Teil des abgebildeten Objektes relevant ist. So hat zum Beispiel ein Modell für die Reflexion oder Transmission von Blut in Abhängigkeit von der SauerstoffSättigung, dem Hämatokrit und der Gefäßdicke bei einer Fundusaufnahme nur dort eine Bedeutung, wo sich tatsächlich Blutgefäße auf der Retina befinden.

Die mit der Kameraeinrichtung registrierten Intensitäten (Messsignale) hängen von den spektralen Messbedingungen (insbesondere Beleuchtung- und/oder Detektionsbedingungen) L_r(x), die ihrerseits eine Ortsabhängigkeit aufweisen, und der Ob- jektantwort ab. Ein Gebiet F auf dem Objekt wird mit der Kameraeinrichtung auf ein Gebiet F' auf dem CCD-Sensor abgebildet. Ein Punkt x auf dem Objekt wird dem Punkt x' auf dem CCD-Sensor zugeordnet. Ein Vektor p(x') wird verwendet, um die Parameter des auf den Punkt x' auf dem CCD-Sensor abgebilde- ten Gebiets F auf dem Objekt zu beschreiben. Dies kann unter der vereinfachenden Annahme erfolgen, dass die Parameter über F im Wesentlichen konstant sind.

Die gesuchten Zustandsbedingungen p_t(x) (konkrete Objekteigen- Schäften) sind als Parameter in der Objektantwort enthalten. Zur Ermittlung der Zustandsbedingungen werden eine Vielzahl von M Bildern des Objektes mit paarweise verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen aufgenommen. Die spektralen Wellenlängenverteilungen bilden verschiedene spektrale Messbedingungen, welche durch die Funktionen L_r (λ), r = 0... M - 1beschrieben werden. Die spektralen Messbedingungen können durch verschiedenartige Beleuchtungsbedingungen (z. B. Leuchtdioden mit verschiedenen spektralen Emissionen) , durch verschiedene Filter vor einer breitbandigen Beleuchtung, durch verschiedene Filter vor der Kameraeinrichtung oder eine Kombination von diesen eingestellt werden.

Wenn M Bilder des Objektes mit den spektralen Verteilungen L_r(λ) aufgenommen werden, so werden M Messsignale A_r(p(x')) in jedem Punkt x' des auf den CCD-Sensor abgebildeten Objektes bereitgestellt. Für eine gegebene Messbedingung L_r(λ) existiert somit für jeden Punkt x'eine Funktion, die den Parame- tervektor p(x) auf A_r(p(x')) abbildet . Unter der Annahme, dass ein Punkt x auf dem Objekt bei der Bildaufnahme mit der Messbedingung L_r (λ) im Gebiet F anteilmäßig mit einer Funktion I(x) auf den Punkt x' auf dem CCD-Sensor abgebildet wird und das sich die Objektantwort S(p(x), λ) im auf x' abgebildeten Gebiet F nur geringfügig ändert, d.h. überF hinweg kann der Parametervektor p innerhalb der Messunsicherheit als konstant angenommen werden, berechnet sich A_r(p(x')) gemäß der oben genannten Gleichung (1) :

A_r(p(x')) = \l(x)dx x =≡ da)

-OO

wobei J/ (x)dx den oben genannten Inhomogenitätsfaktor K dar- F stellt. Gleichung (Ia) zeigt den Funktionszusammenhang zwischen dem Messsignal A_r(p(x')) und der Objektantwort S sowie den Messbedingungen L_r(λ) gemäß A_r = F(S(p_t, A)Lr(A)), wobei F als Ab- bildungsfunktion bezeichnet wird.

Während Gleichung (Ia) den funktionalen Zusammenhang speziell zwischen den Messsignalen und der Objektantwort sowie den Messbedingungen mit der Abbildungsfunktion darstellt, können allgemein Messgrößen, die aus Messsignalen berechnet sind, durch eine Systemfunktion dargestellt werden, die aus der Abbildungsfunktion F konstruiert ist. Die Konstruktion der Messgrößen aus den Messsignalen und der Systemfunktion aus der Abbildungsfunktion stellt zwar zunächst einen Zusatzaufwand dar. Sie kann jedoch bei der Ermittlung der Zustandsbe- dingungen des Objektes zu einer erheblichen Vereinfachung führen, wie unten erläutert wird.

In jedem Fall basiert die erfindungsgemäße Ermittlung der Zu- standsbedingungen auf einer Anpassung, insbesondere eine iterative Variation oder eine numerische Approximation, der in der Abbildungsfunktion F oder allgemein einer daraus kon- struierten Systemfunktion enthaltenen Komponenten des Parametervektors, bis die Messsignale (oder allgemein Messgrößen) durch die Abbildungsfunktion oder Systemfunktion angenähert werden .

Im folgenden werden zwei unterschiedliche Fälle behandelt, die bei der praktischen Umsetzung der Erfindung bevorzugt realisiert werden. Die beiden Fälle unterscheiden sich darin, ob die Objektantwort selbst vom Inhomogenitätsfaktor K =

J/ (x)dx abhängt oder von diesem im Wesentlichen unabhängig F ist.

Im ersten Fall (S(p(x), λ, K)) werden die gesuchten Zustandsbedin- gungen (Komponenten des Parametervektors) unmittelbar durch die Anpassung in Gleichung (Ia) ermittelt, wie im Folgenden dargestellt wird. Die Objektantwort S kann neben den Parametern ptfx) auch von weiteren, zunächst unbekannten Größen abhängen (R(A)) abhängen. Oft sind diese Größen aber durch die Messung bestimmbar. So hängt die Objektantwort von Vollblut in retinalen Blutge- fäßen nicht nur von den Parametern SauerstoffSättigung (s) , Gefäßdurchmesser (d) und Hämatokrit (A) , sondern auch von der Remission (Rb_g(λ)) des Gewebes ein, das sich hinter den Blutgefäßen befindet. Diese Remission ist individuell verschieden und somit zum Zeitpunkt der Messung unbekannt. Eine Messung von R_bg(λ) kann aber neben dem betrachteten Gefäß erfolgen, da R_bg(λ) eine geringe Ortsabhängigkeit (im Verhältnis zum Gefäßdurchmesser) aufweist. Das neben dem Gefäß messbare Signal ist aber nicht R_bg (λ) sondern

OO

-OO

Der hier auftretende Term \I (x)dxkann im allgemeinen nicht

F durch eine einfache Quotientenbildung wie in Gleichung (Ia) eliminiert werden (siehe unten) . Vielmehr muss der Term

\I

einen der folgenden Lösungsansätze ermittelt F werden .

Gemäß einem ersten Lösungsansatz ist zur Ermittlung des Terms

\I (x)dx eine Schätzung von \I (x)dxvorgesehen, die auf Ein- F F gangswerten für die Parameter pι(x) beruht. Mit dem geschätzten Wert für 17 (x)dx können dann die Parame-

F ter bestimmt werden. Mit diesen neuen bestimmten Parametern

wird dann 17 (x)dxneu festgelegt. Dieses Verfahren wird ite- F

riert, bis der für J/ (x)dxgefundene Wert konvergiert (d. h.

F eine vorbestimmte absolute oder relative Toleranz wird erreicht) .

Oft ist es möglich, wie Messung unter anderem in einem Spekt- ralbereich durchzuführen, in dem sich die Objektantwort vereinfachen lässt. Führt diese Vereinfachung auf eine lineare

Abhängigkeit von R, kann der Term J/ (x)dx durch diese Messung

F bestimmt und für die Berechnungen der Objektantwort in dem anderen Spektralbereich verwendet werden. Auch diese Methode beruht wie oben beschriebenen auf Eingangswerten für die Parameter p_t(x) .

Gemäß einem zweiten Lösungsansatz wird die Größe 17 (x)dxals

F weiterer Parameter in die Anpassungsaufgabe zur Ermittlung der Zustandsbedingungen integriert. Der Ausgangswert für die numerische Bestimmung kann durch eine einfache (eindimensionale, z. B. Standard least square-Verfahren) Bestimmung des

besten 17 (x)dxfür: die Startparameter pι(x) (noch ohne F

J/ (x)dx festgelegt werden. F Lässt sich die Objektantwort der Größen R_bg(λ) durch eine Modellfunktion beschreiben, kann gemäß einem dritten Lösungsan¬

satz J/ (x)dxühez die Verwendung dieser Modellfunktion und F der neben dem Gefäß gemessenen Werte berechnet werden. Eine Variante dieses Lösungsansatzes beinhaltet eine Iteration

(ähnlich der iterativen Anpassung von J/ (x)dxim ersten Lö-

F sungsansatz) zur Anpassung von Parametern, welche die Modellfunktion der Größen R_bg(λ) beschreiben.

Wenn im zweiten Fall die Objektantwort S vom Inhomogenitätsfaktor unabhängig ist, vereinfacht sich die Ermittlung der Zustandsbedingungen . Bei dieser Ausführungsform der Erfindung werden als Messgrößen Quotienten q_nm(p(x')) der Messsignale A_r(p(x')) gebildet:

In diesem Fall wird die Systemfunktion durch die Quotienten der oben genannten Abbildungsfunktion für die verschiedenen Messungen n, m gebildet. Vorteilhafterweise kürzt sich der

Term \I(x)dx in diesem Fall aus der Funktionsdarstellung der F

Messgrößen heraus. Dies gilt insbesondere unter der Voraussetzung, dass die Beleuchtungsunterschiede an jedem Punkt x des Objektes für alle Messbedingungen L_r(λ) gleich sind und das Inhomogenitäten in der Abbildung für alle verwendeten spektralen Messbedingungen ebenfalls als gleich angenommen werden können. Da in der Realität Identität praktisch nicht erreichbar ist, wird hier unter Gleichheit eine im Rahmen der Messgenauigkeit oder der gewünschten Genauigkeit für die Be- rechnung der Zustandsbedingungen ausreichende Übereinstimmung verstanden.

Unter der Voraussetzung, dass die Signale A_r(p(x')) für alle re- levanten Werte für p(x') linear unabhängig sind, lassen sich M-I linear unabhängige Signalquotienten q_nm finden. In der Praxis können häufig Einschränkungen für p(x') auf realistische Parameterbereiche angegeben werden. Die genannte Voraussetzung für die relevanten Werte soll somit für alle p(x') gelten, die innerhalb dieser Einschränkung liegen. So kann beispielsweise die SauerstoffSättigung des Bluts nie größer als 1 werden. Es können auch mehrere relevante Bereiche für p(x') angegeben werden, die sich überschneiden können.

Zur Ermittlung der gesuchten Zustandsbedingungen werden die

Parameter in Gleichung (3) variiert, bis die Signalquotienten q_nm durch die dargestellte Systemfunktion repräsentiert werden .

Die Anpassung der Parameter in der Objektantwort gemäß den oben genannten Ausführungsformen, d.h. in der Abbildungsfunktion oder in dem Quotienten der Abbildungsfunktionen erfolgt mit an sich bekannten numerischen Verfahren, wie zum Beispiel durch das Newton-Rhapson-Verfahren, das Powell-Verfahren, den Levenberg-Marquard-Algorithmus oder die Methode der konjugierten Gradienten (siehe z. B. obige Publikation von W. H. Press et al. ) .

Es werden zum Beispiel numerische Verfahren zur mehrdimensio- nalen Nullstellenbestimmung verwendet. In Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung kann eine Optimierung der numerischen Standardverfahren vorgesehen sein. Dies kann in Verbindung mit der Auswertung der Bildsignale bei mehrdimensionaler Abbildung (z.B. 2D-BiId) erfolgen. So kann zum Beispiel bei RGB-Aufnahmen des Augenhintergrundes durch eine Bilderkennung, vorzugsweise an einer Aufnahme im grünen Spektralbereich, zunächst die Lage der Gefäße und die Gefäßdicke festgestellt werden. Im Anschluss kann dann die Gefäß- dicke als Startwert für die erfindungsgemäße spektrale Auswertung verwendet werden. Nachfolgend kann man weitere Startwerte für die SauerstoffSättigung und den Hämatokrit festlegen. Durch eine stückweise Linearisierung der Objektantwort und eine anschließende Anpassung der Parameter lassen sich in wenigen Iterationsschritten die lokal gültigen Werte für die Sauerstoffsättigung, die Gefäßdimension und den Hämatokrit ermitteln .

4. Optimierung der spektralen Messbedingungen

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Optimierung der spektralen Messbedingungen vorgesehen, um die gesuchten Zustandsbedingungen des Objektes mit möglichst hoher Sicherheit zu bestimmen. Hierzu wird vor der Messung am Objekt (Schritt 0.1 in Figur 1), insbesondere beim Design der Messeinrichtung, nach dem folgenden Verfahren eine Determinante maximiert, die von einer Funktionalmatrix abgeleitet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der theoretischen Objektantwort nach den Zustandsbedingungen um- fassen. Dieses Verfahren wird im Folgenden unter beispielhaften Bezug auf die Rechnung mit Quotienten q*ι ( J SL_rdλ/ \SL„dλ ) auf der Basis der theoretischen Objektantwort für paarweise verschiedene Messbedingungen L_r,_g beschrieben.

Es wird die Abbildung P : (p(x'))→(q*i,ie{0,...,k-l}) betrachtet. Die

Quotienten q*_t sind aus der Menge der Quotienten q*_nm so auszuwählen, dass sie linear unabhängig sind (es gilt: k<_M) . Mit der bekannten Objektantwort S kann die Funktionalmatrix (Jakobimatrix) J der Abbildung P unter Verwendung der Gleichungen (Ia) und (3) berechnet werden:

Die Elemente von p£t',) können nur dann berechnet werden, wenn die Gesamtzahl k der ausgewählten Quotienten q*ι größer oder gleich der Anzahl N der zu ermittelnden Zustandsbedingungen und kleiner oder gleich der Anzahl M der aufgenommenen Bilder ist (N<k< M) . Für den Spezialfall N = k ist die Matrix J quadratisch. In diesem Fall werden die spektralen Messbedingungen L_r so gewählt, dass die Determinante der Funktionalmatrix J maximal wird. Für den in der Praxis häufiger auftretenden Fall N≠k ist die Funktionalmatrix J nicht quadratisch. In diesem Fall wird der Ausdruck -_\]det(J J) in den Punkten der oben beschriebenen relevanten Gebiete im Raum der Elemente von p(x') durch die geeignete Wahl der spektralen Wellenlängenverteilungen maximiert, die für die Messungen verwendet werden. In diesem Fall ist die Bestimmung der Komponenten von p(x') aus den aufgenommenen Bildern in der Umgebung des jeweils betrachteten Punktes mit maximaler Genauigkeit möglich. Dabei ist ^det(J J) ein Maß für die Eindeutigkeit der Bestimmung der Komponenten von p(x') . In Figur 5 ist ein Verfahren zur Maximierung von -^det(J J)

für den Fall N ≠ k dargestellt (Maximierung von ydet(J J) ) . Für N = k wird die Größe \det(J)\ maximiert.

Für die Maximierung von

werden zuerst die Objektantwort S (Schritt SOl) und n spektrale Verteilungen L_r (Schritt S02) bereitgestellt. Auf der Grundlage der Objekt- dq*i antwort S werden die partiellen Ableitungen berechnet dp_j

(Schritt S03) und in Bezug auf die Wellenlänge integriert, wobei eine Wichtung mit den aktuellen spektralen Verteilungen L_r vorgesehen ist (Schritt S04) . Die Berechnung der partiellen Ableitungen bei Schritt S03 kann analytisch oder numerisch erfolgen. Es ist bevorzugt, dass die verwendete Modellfunktion in den relevanten Parameterbereichen einfach diffe- renzierbar ist. Alternativ kann eine numerische Differentiation (z. B. bei tabellarischen oder interpolierten Werten) vorgesehen sein.

Anschließend werden die Funktionalmatrix J (Schritt S05) und die Größe

(Schritt S06) berechnet. Bei Schritt S07

wird abgefragt, ob die Größe ^det(J J) ein Maximum erreicht hat. Falls dies nicht der Fall ist, werden die spektralen Verteilungen L_r variiert und für eine wiederholte Abarbeitung der Schritte S04 bis S06 bereitgestellt. Falls die Größe tjdetfj J) ein Maximum erreicht hat, werden die aktuellen spektralen Verteilungen gespeichert und zur Ansteuerung der Messeinrichtung 100 (siehe zum Beispiel Figur 3), insbesondere zur Ansteuerung der Lichtquelle 11 verwendet. Falls N < k gilt, so sind die Zeilen der Funktionalmatrix nicht voneinander unabhängig. In diesem Fall ist es möglich, k— N Größen, die nicht unmittelbar mit dem Problem zusammenhängen, in die Optimierung der spektralen Verteilungen einzu- beziehen. Derartige Größen sind zum Beispiel weitere Eigenschaften des optischen Aufbaus, sowie der Preis der zur Erzeugung der spektralen Verteilung benötigten Komponenten (Lichtquellen, Optiken und dergleichen) .

In der Praxis kann sich das Maximum von

für jeden

Ort (repräsentiert durch p) im Parameterraum unterscheiden. In diesem Fall wird aus den unterschiedlichen Werten für

■ydet(J J) ein Mittelwert gebildet, der dann maximiert werden kann. Diese Mittelwertbildung kann gewichtet erfolgen, um be- sonders relevante Punkte im Rahmen der Komponenten von p besonders zu berücksichtigen oder um Bereiche von verminderter Bedeutung wenig oder nicht zu berücksichtigen. In einem Gebiet im Raum der Komponenten von p ist deren Bestimmung aus den aufgenommenen Bildern dann eindeutig möglich, wenn das Vorzeichen von det(J^τJ) im gesamten betrachteten Bereich gleich ist.

5. Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin im Augenhintergrund

Ausführungsformen der dritten und vierten Gesichtspunkte der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin im Augenhintergrund beschrieben. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern entsprechend zur Erfassung der Autofluoreszenz anderer Pigmente im Auge oder anderen biologischen Proben, insbesondere in vivo-Proben möglich. Einzelheiten der Anregung des Pigments und der Fluo- reszenzmessung werden im Folgenden nicht beschrieben, soweit diese Techniken bereits von den herkömmlichen spektroskopischen Messverfahren bekannt sind.

Figur 6 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Messeinrichtung 100, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist und eine Beleuchtungseinrichtung 10, eine Detektoreinrichtung 20 und eine Steuereinrichtung 30 um- fasst. Für die bevorzugte Anwendung der Erfindung bei der Er- fassung von Lipofuszin im Augenhintergrund ist die Messeinrichtung 100 vorzugsweise auf der Basis einer an sich bekannten Funduskamera gebildet, die mit einer angepassten Lichtquelle ausgestattet und für einen Filterwechsel konfiguriert ist (siehe unten) .

Die Beleuchtungseinrichtung 10 umfasst eine Lichtquelle 11 und einen Anregungs-Filter 12. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere für die Erfassung von Lipofuszin, umfasst die Lichtquelle 11 eine einzige Leucht- diode, insbesondere eine einzige im blauen Spektralbereich emittierende Leuchtdiode (z. B. Leuchtdiode "OSRAM Ostar blue" vom Typ "LE B A2A"), z. B. mit einer maximalen Emission λ_max im Bereich von 455 nm bis 465 nm. Der Anregungsfilter 12 ist zur Anpassung des Anregungs-Wellenlängenbereiches, insbe- sondere zur Unterdrückung langwelliger Restemissionen der Lichtquelle, die in die Emissions-Wellenlängenbereiche der Fluorophore fallen würden, vorgesehen. Die langwelligen Emissionen werden vorzugsweise auf einen Wert unterhalb von 1 % relativ zur maximalen Emission der Leuchtdiode unterdrückt.

Die Lichtquelle 11 kann alternativ z. B. eine Breitband- Weißlichtquelle umfassen. In diesem Fall ist der Anregungs- Filter 12 dazu eingerichtet, Anregungslicht mit einem Spektrum im gewünschten Anregungs-Wellenlängenbereich aus dem Breitbandspektrum der Weißlichtquelle auszuschneiden. Alternativ kann die Lichtquelle 11 eine Anordnung von Leuchtdioden oder Laserdioden umfassen, welche in gleichen oder verschiedenen Spektralbereichen emittieren. Es können z. B. zwei oder mehr im blauen Spektralbereich oder in verschiedenen Spektralbereichen emittierende Leuchtdioden vorgesehen sein. Die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts kann durch die Ansteuerung der Leuchtdioden oder Laserdioden gebildet werden, wobei der Anregungs-Filter 12 für eine Feinanpassung des Spektrums des Anregungslichts an die Absorption des zu erfassenden Pigments vorgesehen sein kann. Wenn die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts durch die Ansteuerung schmalbandiger Leuchtdioden oder Laserdioden gebildet wird, könnte der Anregungsfilter 12 weggelassen werden.

Das Anregungslicht wird von der Lichtquelle 11, ggf. mit dem Anregungs-Filter 12 über einen Strahlteilerspiegel 13 auf dem Anregungs-Strahlengang 14 zum Auge 1, insbesondere zum Augenhintergrund 2 gelenkt. Der Anregungs-Filter 12 umfasst z. B. einen Filter vom Typ Semrock FF01-457/50. Zur Ausleuchtung können auf dem Anregungs-Strahlengang 14 weitere optische Komponenten, z. B. eine Abbildungsoptik vorgesehen sein (nicht dargestellt) .

Die Detektoreinrichtung 20 umfasst eine Detektorkamera 21 und zwei Emissions-Filter 22, die abwechselnd mit einem Filterwechsler 23 mit der Detektorkamera 21 kombinierbar sind. Die Detektorkamera 21 umfasst vorzugsweise eine CCD-Kamera. Es kann z. B. eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera, wie eine "Dolphin 145 B", Hersteller: Allied Vision Technologies (AVT), vorgesehen sein, um Fluoreszenzemissionen aus dem Auge ortsaufgelöst zu erfassen. Alternativ kann eine Farb-CCD-Kamera vorgesehen sein. Ein Emissions-Strahlengang 24 verläuft vom Auge 1, insbesondere vom Augenhintergrund 2 über den Strahlteiler- Spiegel 13 und einen der Emissions-Filter 22 zur Detektorkamera 21.

Die Emissionsfilter 22 sind so gewählt, dass Fluoreszenzlicht in den gewünschten Emissions-Wellenlängenbereichen zum Detektor 21 durchgelassen wird. Die Emissions-Filter 22 umfassen z. B. optische Standardfilter (Typ: Semrock FF01525/50 und Schott OG570) . Der Filterwechsler 23 umfasst bspw. ein Filterrad oder einen Filterschlitten.

Die Steuereinrichtung 30 umfasst einen elektronischen Schaltkreis, z. B. einen Steuerungscomputer, der zur Verarbeitung von Signalen (Betriebszustands-Signale, Messsignale) der Komponenten 10, 20 und zur Bereitstellung von Steuersignalen eingerichtet ist. Die Steuereinrichtung 30 ist insbesondere mit der Lichtquelle 11, dem Detektor 21 und dem Filterwechsler 23 verbunden. Die Steuereinrichtung 30 enthält auch einen Rechnerkreis, mit dem die Autofluoreszenz aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten berechnet werden kann. Des Weiteren ist die Steuereinrichtung 30 mit einer Anzeigeeinrichtung, z. B. einem Anzeigebildschirm, einer Ausgabeeinrichtung, wie z. B. einem Drucker, und einer Nutzerschnittstelle, wie z. B. einer Tastatur, verbunden (nicht dargestellt) .

Das erfindungsgemäße Verfahren, das vorzugsweise mit der Messeinrichtung 100 gemäß Figur 6 durchgeführt wird, ist schematisch in Figur 7 illustriert.

Bei einem ersten Schritt Sl wird die Beleuchtung des Auges 1 aktiviert. Bei der Beleuchtung wird Anregungslicht, das einen vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich λ_ex aufweist, auf dem Anregungs-Strahlengang 14 zum Auge 1 gelenkt (Figur 6) . Die Aktivierung der Lichtquelle 11 bedeutet, dass die Lichtquelle 11 für die folgenden Schritte S2 und S3 für einen Pulsbetrieb vorbereitet oder für einen permanenten Betrieb eingeschaltet wird.

Vorzugsweise ist der Pulsbetrieb vorgesehen, bei dem die Lichtquelle 11 bei den Schritten S2 und S3 pulsförmig betätigt wird. In diesem Fall wird die Reizung des Auges minimiert. Die pulsförmige Betätigung der Lichtquelle 11 erfolgt mit einem vorbestimmten Zeitabstand, in dem sich die Messbedingungen nicht oder möglichst wenig ändern.

Bei Schritt S2 erfolgt eine erste Fluoreszenzmessung in einem ersten Emission-Wellenlängenbereich λ_em,i. Hierzu wird das durch die z. B. pulsförmige Betätigung der Lichtquelle 11 angeregte Fluoreszenzlicht vom Augenhintergrund 2 auf dem Emis- sions-Strahlengang 24 zur Detektorkamera 21 gelenkt.

Anschließend folgt bei Schritt S3 eine zweite Fluoreszenzmessung mit einem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich λ_em,_2/ der vom ersten Emissions-Wellenlängenbereich λ_em,i abweicht. Die Einstellung des zweiten Emissions-Wellenlängenbereiches λ_em,₂ erfolgt durch Einsetzen des zweiten Filters 22 mit dem Filterwechsler 23 in den Emissions-Strahlengang 24. Der Filterwechsler 23 wird mit einem Schrittmotor betätigt, welcher einen Filterwechsel innerhalb des gewünschten Zeitabstandes zwischen den Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Die Wellenlängenbereiche sind so gewählt, dass eine Überlappung des Anre- gungs-Wellenlängenbereiches λ_ex mit einem der Emissions- Wellenlängenbereiches λ_em, i und λ_em,2 vermieden wird.

Bei den ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen werden von den einzelnen Pixeln der Detektorkamera 21 spektral integrierte Fluoreszenzintensitäten aufgenommen, die charakteristisch für die Fluoreszenzemissionen in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen sind. Die integrierten Fluoreszenzintensitäten bilden Fluoreszenzsignale Si, S₂, auf deren Grundlage bei Schritte S4 in der Steuereinrichtung 30 für jedes Pixel ein Autofluoreszenzsignal S berechnet wird.

Anschließend folgt bei Schritt S5 einer der Teilschritte einer Datenverarbeitung der ermittelten Autofluoreszenz, einer Datenspeicherung, z. B. in der Steuereinrichtung 30 und einer Anzeige eines Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes, z. B. durch eine Grauwert- oder Falschfarbendarstellung.

Die Figuren 8 und 9 illustrieren spektroskopische Eigenschaften von Lipofuszin und weiteren Pigmenten im Augenhintergrund, auf deren Grundlage die Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin erfolgt (siehe D. Schweitzer et al . "Towards Metabolie Mapping Retina" in "Microscopy Research And Tech- nique" Bd. 70, 2007, S. 410 - 419) . Figur 8 zeigt die Spektren der Absorption A (willkürliche Einheiten) von Lipofuszin (A2E) und der Pigmente AGE (so genannte "Advanced Glycitation End Products", die z. B. Carboxy-Methyllysin (CML), Carboxy- Ethyllysin (CEL) und Argpyrimidine umfassen) und FAD (so genanntes "Flavindinucleotid" ) , jeweils multipliziert mit der Transmission der okularen Medien im Auge (T_Om) • Der erfindungsgemäß bevorzugte Anregungs-Wellenlängenbereich λ_ex, der sich z. B. von 427 nm bis 477 nm erstreckt, ist in Figur 8 mit einem Balken markiert. Vorteilhafterweise stimmt der Anregungs-Wellenlängenbereich im Wesentlichen mit dem Absorptionsmaximum des zu untersuchenden Pigments Lipofuszin überein .

Figur 9 zeigt die normierten Intensitäten I der Fluoreszenz- Emissionen von Lipofuszin (A2E) und den Pigmenten AGE und FAD in Abhängigkeit von der Wellenlänge λ. Die bevorzugt realisierten Emissions-Wellenlängenbereiche λ_em, 1 und λ_em,₂ sind ebenfalls in Figur 9 illustriert. Sie erstrecken sich entsprechend in den Wellenlängenintervallen von 500 nm und 550 nm und oberhalb von 570 nm. Die Figuren 8 und 9 illustrieren als wichtiges Merkmal, das insbesondere für die näherungswei- se Erfassung der Autofluoreszenz eines interessierenden Pigments ausgenutzt wird, eine relativ gute Übereinstimmung der Anregungs- und Emissions-Spektren der übrigen Pigmente (hier z. B. AGE, FAD), die nicht das interessierende Pigment darstellen (hier z. B. A2E) .

Mit der Messung der Fluoreszenzsignale Si im ersten Emissi- ons-Wellenlängenbereich λ_em,i und S2 im zweiten Emissions- Wellenlängenbereich λ_em,2 wird das Autofluoreszenzsignal S von Lipofuszin gemäß S(x) = (S₂(X) - l/D Si(X)) - Io ' C mit dem spektralen Mischungsfaktor D « 3 berechnet.

Dabei ist Io die bei einer Einzelmessung eingestrahlte Lichtintensität. Falls bei den ersten und zweiten Fluoreszenzmes- sungen verschiedene Lichtintensitäten verwendet werden, wird auf eine gemeinsame Lichtintensität normiert. C ist eine Konstante, die insbesondere von den eingesetzten Filtern (12, 22) und dem Spektrum der Lichtquelle 11 abhängt. Die Konstante C kann durch Kalibrierungsmessungen ermittelt oder als theoretischer Normierungswert eingeführt werden, x ist allgemein eine zweidimensionale Ortskoordinate des Bildes vom Augenhintergrund. Bei der Anzeige des Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes kann die Grauwert- oder Falschfarbendarstellung von Relativwerten der Autofluoreszenzsignale vorge- sehen sein, so dass die Werte I₀ und C nicht ermittelt werden müssen .

Praktische Anwendungen der Erfindung ergaben eine Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin mit einem Resteinfluss der Pigmente AGE und FAD in der Größenordnung von 1 V». Die Messung erfolgte mit einer Quantenausbeute, die um den Faktor 12 gegenüber der von R. J. Spaide vorgeschlagenen Methode größer ist.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

ANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen p,(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), mit den Schritten:

- Bereitstellung einer Vielzahl von Messgrößen aus Messungen am Objekt (1) , wobei die Messgroßen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort S(p„λ) des Objektes (1) und von spektralen Messbedingungen L_r(k) der Messungen darstellbar sind, wobei die Objektantwort S(p,, λ) die Zustandsbedingungen p, als Parameter enthält, und

- Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) aus den Messgroßen, wobei - die Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p_tλ) derart umfasst, dass die Messgrόßen durch die Systemfunktion repräsentiert werden,

- die Messgrόßen aus Messsignalen A_r aus den Messungen am Objekt (1) gebildet sind, - die Messsignale A_r durch eine Abbildungsfunktion A_r= F (S(p,, λ) , L_r(k)) darstellbar sind gemäß

OO A_r(p(x')) = K(x')x

-CO wobei K(x) ein von Abbildungseigenschaften bei den Messungen abhangiger Inhomogenitätsfaktor ist, und - jede Messgroße ein Messsignal A_r umfasst und die Systemfunktion durch die Abbildungsfunktion f(S(p_hλ), L_r(k)) gegeben ist, dadurch gekennzeichnet:, dass - die Objektantwort S(p„X) den Inhomogenitatsfaktor K(x') als weiteren Parameter enthalt, und

- die Berechnung der Zustandsbedingungen p, eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) derart umfasst, dass die Messsignale A_r durch die Abbildungsfunktion F(S(p,X), L_r(k)) repräsentiert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem

- der Inhomogenitatsfaktor K durch eine Iteration, bei der von vorbestimmten Startwerten K', p_t' ausgegangen wird, bei der

Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) oder aus einer vorbestimmten Modellfunktion ermittelt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem - die Objektantwort S(P₁₁X) vom Inhomogenitatsfaktor K(x') unabhängig ist,

- jede Messgroße einen Signalquotienten q_nm=A„/A_m aus zwei Messsignalen A_n, A_n, umfasst, die verschiedenen spektralen Messbedingungen L_n(K), L_n, (K) zugeordnet sind, und die Systemfunk- tion durch den Quotienten der Abbildungsfunktionen F (S(p_t,K), L_n(K))ZF (S(p_t, λ),L_m(λ)) gegeben ist, und

- die Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) derart umfasst, dass die Signalquotienten q_nm durch den Quotienten der Abbildungs- funktionen repräsentiert werden.

4. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die spektralen Messbedingungen L_r(K) umfassen : - Beleuchtungsbedingungen mit vorbestimmten spektralen WeI- lenlangenverteilungen, und/oder

- Detektionsbedingungen mit vorbestimmten spektralen Wellen- langenverteilungen .

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem

- die spektralen Wellenlängenverteilungen mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm im Wellenlängenbe- reich von 200 nm bis 1,5 μm gewählt sind.

6. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- das Objekt (1) ein biologischer Organismus oder ein Teil von diesem ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem

- das Objekt (1) ein Auge oder ein biologisches Gewebe oder ein Teil von diesen, insbesondere der Augenhintergrund (2) ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem

- das Objekt (1) retinale Blutgefäße umfasst.

9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem

- die Zustandsbedingungen /?,-fo) mindestens eine der Größen Sau- erstoffgehalt von Blut, Hämatokrit von Blut und Durchmesser eines Blutgefäßes umfassen.

10. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Bereitstellung der Messgrößen unmittelbar durch die Messungen am Objekt (1) oder durch eine Ausgabe aus einem Da- tenspeicher erfolgt.

11. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, mit dem Schritt:

- Auswahl der spektralen Messbedingungen L_r(k) mit einer Optimierungsprozedur, die eine Maximierung einer Determinante um- fasst, die von einer Funktionalmatrix J abgeleitet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der Objektantwort nach den Zu- standsbedingungen p_t(x) umfassen .

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem - die Auswahl der spektralen Messbedingungen L_r(λ) eine Maximierung der Größe yjdetfJ J) umfasst.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem

- bei der Maximierung der Größe

mindestens ein vor- bestimmter Bereich im Parameterraum der Zustandsbedingungen

Pi(x) fest vorgegeben wird.

14. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Beleuchtungsbedingungen mit einer Beleuchtungseinrichtung (10) eingestellt werden, die Leuchtdioden (11), Laser- Quellen und/oder eine Blitzlampe umfasst.

15. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem

- die Messungen am Objekt (1) mit einer Funduskamera (20) oder einem Mikroskop erfolgen.

16. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem

- die Messsignale A_r mit einem CCD-Sensor (21) erfasst werden.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem

- die Messsignale A_r mit dem CCD-Sensor (21) paarweise unmittelbar vor Beginn und nach Beendigung einer Zwischenspeicher- Phase des CCD-Sensors (21) erfasst werden, in der Ladungszu- stände von CCD-Elementen (23) des CCD-Sensors (21) in Zwischenspeichern gespeichert werden.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem

- für die paarweise Erfassung der Messsignale A_r bei aufein- ander folgenden Zwischenspeicher-Phasen eine Permutation der spektralen Messbedingungen L_r(k) vorgesehen ist.

19. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - eine ortsausgelöste Visualisierung der Zustandsbedingungen pι(x) vorgesehen ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem

- die Visualisierung der Zustandsbedingungen pt(x) eine mindes- tens teilweise Überlagerung eines Bildes des Objektes mit einem Parameterbild umfasst, das die Visualisierung der Zustandsbedingungen p_t(x) enthält .

21. Messeinrichtung (100) zur Ermittlung von Zustandsbedin- gungen p_t(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), die umfasst:

- eine Beleuchtungseinrichtung (10), die zur Beleuchtung des Objektes (1) unter verschiedenen spektralen Messbedingungen L_r(λ) eingerichtet ist, und

- eine Kameraeinrichtung (20) , die zur Messung einer Vielzahl von Messsignalen A_r unter den spektralen Messbedingungen L_r(λ) eingerichtet ist, wobei die Messsignale A_r durch eine Objektantwort

bestimmt werden, welche die Zustandsbedingungen Pi als Parameter enthält, wobei - die Messsignale A_r als Messgroßen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von der Objektantwort S(p„λ) und von den spektralen Messbedingungen L_r(k) darstellbar sind, und - eine Auswertungseinrichtung (30) , die zur Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) aus den Messgroßen eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet dass die Auswertungseinrichtung (30) eine Anpassungseinheit (31) enthalt, mit der die Zustandsbedingungen p,(x) durch eine An- passung der Parameter der Objektantwort S(p,,λ) derart berechenbar sind, dass die Messgroßen durch die Systemfunktion repräsentiert werden.

22. Messeinrichtung gemäß Anspruch 21, bei der - die Beleuchtungseinrichtung (10) für eine Beleuchtung des Objekts (1) mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm im Wellenlängenbereich von 200 nm bis 1,5 μm eingerichtet ist.

23. Messeinrichtung gemäß Anspruch 21 oder 22, bei der

- die Beleuchtungseinrichtung (10) und die Kameraeinrichtung (20) Teile einer Funduskamera (30) oder eines Mikroskops sind.

24. Messeinrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 23, bei der

- die Beleuchtungseinrichtung (10) Leuchtdioden (11), Laser- Quellen und/oder eine Blitzlampe umfasst.

25. Messeinrichtung gemäß Anspruch 24, bei der

- die Beleuchtungseinrichtung (10) mit mindestens einem Filter ausgestattet ist.

26. Funduskamera (200), die eine Messeinrichtung (100) gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 25 aufweist.

27. Operationsmikroskop, das eine Messeinrichtung (100) ge- maß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 26 aufweist.

28. Computer-Programmprodukt, das sich auf einem Computerlesbaren Speichermedium befindet, mit einem Programmcode zur Ausführung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprü- che 1 bis 20.

29. Vorrichtung, die ein Computer-lesbares Speichermedium um- fasst, das Programmanweisungen zur Ausführung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20 enthält.

30. Verfahren zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1), mit den Schritten:

- Beleuchtung des Auges (1) mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich (λ_ex) , und - Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (S_x) in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich (λ_em,i) , gekennzeichnet: durch die weiteren Schritte:

- Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S2) in einem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich (λ_em,2) , und - Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (Si, S₂) .

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, bei dem

- die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale spektral integ- rierte Fluoreszenzintensitäten (Si, S₂) entsprechend in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen (λ_em,i, λ_era,2) umfassen.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 31, bei dem

- die Erfassung des Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments eine Approximation S = S (Si, S₂, C) in Abhängigkeit von den Fluoreszenzsignalen (Si, S₂) und von spektralen Messbedingun- gen der Beleuchtung und Fluoreszenzmessungen umfasst.

33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32, bei dem

- der Anregungs-Wellenlängenbereich (λ_ex) so gewählt ist, dass eine Anregung des Pigments in dessen Maximum der effektiven Absorption erfolgt, wobei die effektive Absorption sich aus der Absorption des Pigments unter Berücksichtigung der Absorption okularer Medien ergibt.

34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 33, bei dem - die Wellenlängenbereiche so gewählt sind, dass sich der Anregungs-Wellenlängenbereich (λ_ex) mit keinem von den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen (λ_em, i/ λ_em,2) überlappt .

35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 34, bei dem

- das Pigment Lipofuszin umfasst, wobei

- der Anregungs-Wellenlängenbereich (λ_ex) im Wellenlängenintervall von 400 nm bis 490 nm,

- der erste Emissions-Wellenlängenbereich (λ_em/i) im Wellen- längenintervall von 495 nm bis 560 nm, und

- der zweite Emissions-Wellenlängenbereich (λ_em,2) im Wellenlängenintervall oberhalb von 570 nm gewählt sind.

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, bei dem - die Erfassung des Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments gemäß S = (S₂ - l/D ^• Si) " I₀ - C erfolgt, wobei D ein spektraler Mischungsparameter, I₀ eine Normierungsintensität und C eine Konstante umfassen, welche die spektralen Messbedingungen repräsentiert.

37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 36, bei dem - die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S₂) ortsaufgelöst erfolgen.

38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 37, bei dem

- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S₂) zeitlich aufeinander folgend vorgesehen ist.

39. Verfahren gemäß Anspruch 38, bei dem

- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S₂) mit einem Zeitabstand erfolgen, der geringer als 500 ms ist.

40. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 38, bei dem

- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S₂) gleichzeitig erfolgen, wobei

- eine Trennung von Fluoreszenzlicht des Augenhintergrundes auf zwei Detektoren vorgesehen ist.

41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 40, bei dem - die ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereiche

(λ_em,i, λ_em,2) mit optischen Filtern eingestellt werden.

42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 41, mit dem Schritt - Ermittlung einer Konzentration des Pigments aus dem Autofluoreszenzsignal (S) .

43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 42, mit dem Schritt

- Anzeige eines Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes (2) .

44. Verfahren gemäß Anspruch 43, bei dem

- im Bild des Augenhintergrundes (2) Bereiche des Augenhintergrundes (2) , in denen das Autofluoreszenzsignal (S) oder die Konzentration des Pigments eine vorbestimmte Grenze über- schreitet, markiert sind.

45. Messeinrichtung (100), die zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) eingerichtet ist, umfassend:

- eine Beleuchtungseinrichtung (10), die zur Erzeugung von Anregungslichtes in einem vorbestimmten Anregungs-Wellen- längenbereich (λ_ex) und zur Bestrahlung des Auges (1) eingerichtet ist, und

- eine Detektoreinrichtung (20) , die zur Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (Si) in einem ersten Emissions-Wellen- längenbereich (λ_em,i) eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet:, dass

- die Detektoreinrichtung (20) zur Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S₂) in einem zweiten Emissions-Wellenlängen- bereich (λ_em,2) eingerichtet ist, und - die Messeinrichtung zur Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (Si, S₂) eingerichtet ist.

46. Messeinrichtung gemäß Anspruch 45, bei der - ein Anregungs-Strahlengang (14) des Anregungslichtes und ein Emissions-Strahlengang (24) der Fluoreszenzemissionen zumindest abschnittsweise übereinstimmen.

47. Messeinrichtung gemäß Anspruch 45 oder 46, bei der

- die Detektoreinrichtung einen Filterwechsler (23) aufweist, der so konfiguriert ist, dass zwischen zwei Fluoreszenzmessungen Emissions-Filter (22) im Emissions-Strahlengang (24) gewechselt werden können.

48. Messeinrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 47, bei der

- die Beleuchtungseinrichtung (10) eine einzige Leuchtdioden- anordnung mit einer einzelnen oder mehreren Leuchtdioden (11) umfasst .

49. Messeinrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 48, die Teil einer ophtalmologischen Funduskamera ist.