WO2009018953A2 - Verfahren und vorrichtung zur ermittlung von zustandsbedingungen eines zu untersuchenden objektes und zur fluoreszenzmessung am auge - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for determining state conditions of an object to be examined, in particular for determining physiological properties of a biological object.
- the invention further relates to a measuring device, which is set up for carrying out said method, and devices which are equipped with such a measuring device.
- the invention further relates to a method and a measuring device for measuring the fluorescence of a pigment in the eye, in particular for measuring the autofluorescence of a physiological pigment, such. B. lipofuscin, in the fundus.
- the method and the fluorescence measuring device deliver an autofluorescence signal, which is preferably processed with the o.
- G. Method for determining the physiological properties of the eye is subjected.
- the spectroscopic properties of different components in certain spectral ranges overlap.
- the properties can no longer be easily separated by selecting the spectral measurement conditions.
- a complex analysis of the measurement signals determined under different spectral measurement conditions is required.
- the spectroscopic measurement is to determine not only the presence of a constituent in the sample, but another sample parameter that affects the spectroscopic properties of the sample, such as one dimension, one concentration, histological Parameters or the like
- an inverse function is determined from the system function with a neural network, which is applied to the measurement signals.
- IB Styles et al It checks whether the determinant of a functional matrix whose elements comprise partial derivatives of the measurement signals according to the histological parameters is non-zero
- the technique of IB Styles et al. has a number of disadvantages resulting from the measurement technique and histological parameter determination procedure.
- disadvantages result from the detector-side filter setting of the spectral measurement conditions, since a relatively strong white light illumination of the eye is required for all measurement conditions. Strong irritation of the eye can lead to unwanted changes in measurement conditions, eg. B. lead by closing the pupil or movement of the eye.
- only weak measurement signals can be detected for the reflection measurement in the green or blue spectral range. The weak measurement signals result in a deteriorated signal-to-noise ratio. Although this can be compensated by increased illumination, this would also be associated with a greater irritation of the eye.
- the detected histological parameters can be falsified by the detector-side filter setting.
- Another disadvantage is the complicated determination of the histological parameters by the construction of the inverse function of the model function.
- the construction of the inverse function represents a considerable processing and time expenditure.
- functions that the optical system of IB Styles et al. generally irreversible, so that the inverse function is often not feasible.
- a disadvantage of the method of IB Styles et al. is further that the evaluation of the measurement signals takes place under the unrealistic condition that the light intensities used under the different spectral measurement conditions are comparable, ie that the signals detected by the detector are the same in the case of an object with ideal remission (100%) , However, this is often not the case in practice.
- the evaluation of the measurement signals takes place under the unrealistic condition that the light intensities used under the different spectral measurement conditions are comparable, ie that the signals detected by the detector are the same in the case of an object with ideal remission (100%) , However, this is often not the case in practice.
- Another disadvantage is that for certain measurement tasks, the influence of various parameters on the spectral response function can be eliminated in one or more spectral ranges.
- a case is given, for example, in the determination of oxygen saturation in a retinal blood vessel.
- the red spectral range for example from 600 nm to 690 nm
- the reflectivity decreases both with the decrease in the vessel diameter and with the decrease in the oxygen saturation.
- IB Styles et al. described method is a reliable separation of the parameter vessel diameter and oxygen saturation only limited possible.
- the problems mentioned in the evaluation of spectroscopic measured variables on objects to be examined occur not only in measurements on the ocular fundus, but also in other subjects of examination, in particular in biological tissues, such as nerve tissues (brain), or in non-biological examination subjects.
- the pigment lipofuscin is formed as a degradation product in the physiological metabolism and stored in biological cells.
- the accumulation of lipofuscin occurs particularly in the human retinal pigment epithelium (RPE).
- RPE retinal pigment epithelium
- lipofuscin represents a potential source of oxidative stress and therefore contributes to the aging of cells. In particular, it plays an important role in age-related macular degeneration (AMD).
- Known methods for detecting lipofuscin in the retina are based on the measurement of autofluorescence of lipofuscin, ie on the measurement of the fluorescence that lipofuscin emits when irradiated with excitation light.
- z. B. with a lighting device of a fundus camera, however, the problem arises that in the ocular media further fluorescent substances are included. These include z.
- pigments or fluorophores which are contained in the lens of the eye and in particular in individuals with cataract relatively strong fluorescence.
- the autofluorescence of lipofuscin is thus superimposed by the autofluorescence of the other substances.
- For detection of lipofuscin it is therefore necessary to separate the autofluorescence signal from lipofuscin from autofluorescence signals from other fluorophores.
- the following peculiarities of fluorescence measurement on the eye must be taken into account.
- the eye is an object with a complex composition of fluorescent substances. In contrast to measuring fluorescence in biochemical assays with defined fluorescent markers, numerous fluorescent substances are contained in the eye, the occurrence and concentration of which can vary greatly individually.
- the eye is a complex optical system in which, in contrast to in vitro studies z. B.
- the method with a spectral segregation of fluorescence signals is one of the known methods of fluorescence measurement on biological samples containing compositions of different fluorophores.
- This method is z. B. Zimmermann et al. ("FEBS Letters," Vol. 546, 2003, p. 87), R. Neher et al. ("Journal of Microscopy", Vol. 213, 2004, p. 46) and described in DE 10 2005 054 184 A1.
- Separation of fluorescence signals from three or more fluorophores requires at least three fluorescence measurements for spectral segregation. conditions that z. B. at three different excitation wavelengths, emission wavelengths or combinations thereof.
- the evaluation of the fluorescence signals and the determination of the quantitative proportions of the various fluorophores is carried out by an analytical solution of a system of equations, in which the measurement conditions and fluorescence signals of the fluorescence measurements are received.
- RF Spaide (“Opthalmology", Vol. 110, 2003, p. 392) proposes irradiating the ocular fundus with excitation light in an excitation wavelength range in which almost exclusively the desired lipofuscin, but not other fluorescent substances, absorb.
- RF Spaide in particular proposes the excitation wavelength range in the wavelength interval of 500 nm to 610 nm. The fluorescence measurement takes place in an emission wavelength range in which almost exclusively lipofuscin emits, for which purpose the wavelength interval of 665 nm to 775 nm has been proposed.
- the procedure of RF Spaide has the following disadvantages. First, the accuracy of detecting autofluorescence of lipofuscin is due to the individual variability of the contributions of fluorescent substances limited to the overall signal.
- the proposed excitation and emission wavelength ranges are characterized by a low quantum efficiency.
- a weak signal with a high noise component is measured, which further limits the accuracy and reproducibility of the fluorescence measurement.
- An improvement in the signal component could be achieved by increasing the intensity of the excitation light, which, however, increases the load and irritation of the eye during the measurement.
- Ratio of emitted autofluorescence can be determined for the measured point of the proportion of lipofuscin.
- a disadvantage of this method is the increased equipment complexity in the generation and adjustment of the excitation light. Thus, two lasers with emissions at the different excitation wavelengths and a scanner mechanism for the confocal measurement are required.
- the mentioned problems of the conventional ophthalmological techniques are not limited to the detection of lipofuscin. Corresponding problems occur when other pigments, the z. B. characteristic of pathological changes in the eye are to be selectively detected by fluorescence measurements.
- the object of the invention is to provide an improved method for detecting state conditions of an object to be examined, with which disadvantages of the conventional methods can be overcome.
- the object of the invention is also to provide an improved measuring device for implementing such a method. It is a further object of the invention to provide an improved method of fluorescence measurement on the eye which overcomes the disadvantages of the conventional methods.
- the object of the invention is also to provide an improved measuring device for fluorescence measurement on the eye, with which the disadvantages of the conventional techniques are overcome.
- the fluorescence measurement should have a simplified sequence and enable the detection of the autofluorescence of a single pigment with high accuracy and reproducibility.
- the stated object is achieved according to a first aspect of the invention by the general technical teaching to provide a method for determining state conditions of an object to be examined, which comprises the following steps.
- First of all there is a provision of measured variables which can be represented by a predetermined system function as a function of an object response of the object, the object response being dependent on spectral measurement conditions of the measurements and the desired state conditions.
- the object response contains the condition conditions as variable parameters.
- the second step involves the calculation of the state conditions from the measured variables, with an adaptation (variation) of the variable parameters of the object response being provided until the measured variables are represented by the system function.
- the inventive calculation of the state conditions by a parameter adjustment has the advantage that the limitations and errors of the conventional use of an inverse function can be avoided. Furthermore, the parameter adaptation can be realized with a lower computational effort, so that the sought state conditions can be calculated faster than with the conventional methods.
- the stated object according to a second aspect of the invention is achieved by the general technical teaching to provide a measuring device for determining state conditions of the object to be examined, comprising a lighting device for illuminating the object, a camera device for measuring a multiplicity of measuring signals under different spectral measuring conditions , wherein the measurement signals are determined by the object response of the object, and an evaluation device for calculating the state conditions from the measured variables comprises.
- the evaluation device contains an adaptation unit with which the state conditions can be calculated by adapting the parameters of the object response in such a way that the measured variables are represented by the system function.
- the measuring device according to the invention has the advantage of a compact construction.
- the adjustment unit according to the invention can be easily integrated into a computing unit of a measuring device.
- the invention has a considerably extended application in comparison to the conventional technique. rich.
- object refers to a subject of investigation that has a characteristic object response when interacting with light.
- the subject of investigation may comprise a biological object, such as a biological tissue, or a non-biological object, such as a sample array of chemical substances (Assay).
- the "object response" is the spectral response function of the object, for example, spectroscopic properties, in particular reflection, transmission or fluorescence properties, a polarization response, a phase response function or a combination of these, such as a wavelength and polarization properties.
- onstube phase response function includes.
- the object response may contain as a variable parameter an inhomogeneity factor, which depends on the imaging and illumination properties during the measurement.
- the object response may, for. Example, be determined by an interpolation of spectroscopic measurement results on a model object.
- condition conditions refers to parameters of the examined object on which the object response depends.
- the state conditions include in particular parameters of the chemical composition (eg presence and / or quantitative proportion of a chemical compound), geometric parameters (eg dimensions of structures of the object) and / or physical parameters (eg aggregate formation in the object ).
- the state conditions are generally location-dependent in the object, so that the object response depends on the measurement location.
- system function denotes a theoretical function with which the measured variables can be represented as a function of the object response.
- the system function is a predetermined theoretical function that is analytically available after modeling the propagation of light when measuring on the object or numerically based on tabulated values.
- the concrete form of the system function is chosen as a function of the construction of the measured variables used according to the invention.
- the measured variables evaluated according to the invention are based on measurements on the object. They are preferably formed from measurement signals acquired at the object.
- an imaging function constructed from the laws of light propagation during the measurement can be used as a system function.
- K (x ') is an inhomogeneity factor which depends on imaging properties during the measurement and in particular on the measurement location
- ⁇ the wavelength
- p the state conditions of the object
- ⁇ the spatial coordinate ( Location) on the object
- x ' include the location coordinate on the detector.
- the object response may include the inhomogeneity factor as a variable parameter. This is z.
- the spectral features of the object which are dependent on the state conditions to be detected, are superimposed by other spectral imaging or illumination conditions. This condition occurs in ophthalmological measurements, for example, when the object response of retinal blood vessels is superimposed by the remission of the underlying behind the blood vessel considered fundus.
- the mapping function becomes more complicated according to equation (1). It is advantageous, however, that in this case the measured variables are provided directly by the measurement signals of the measurements on the object.
- Each measurand includes a measurement signal.
- the computation of the state conditions includes an adjustment of all parameters of the object response, which include the status conditions and the Inhomogenticiansmine, such that the measurement signals A r by the aforementioned mapping function F (S ⁇ i, K), L n (K)) are represented ,
- the inhomogeneity factor can be determined with different approaches. Firstly, an iteration is possible in which, on the basis of predetermined starting values of the inhomogeneity factor and the state conditions, a repeated adaptation of the parameters takes place in equation (1). Second, the determination of the inhomogeneity factor can be integrated into the adaptation of the parameters of the object response. Third, if there is sufficient information about the measuring system, the inhomogeneity factor can be determined from a predetermined model function. Each of the variants may have advantages in terms of the accuracy of the adaptation and / or the computing time depending on the specific application of the invention.
- the object response may be independent of the inhomogeneity factor.
- This independence is z.
- the determination of the state conditions according to the invention is advantageously considerably simplified.
- the calculation of the state conditions comprises an adaptation of the parameters of the object response such that the signal quotients are represented by the quotient of the mapping functions. Due to the quotient formation, the system function is no longer dependent on the inhomogeneity factor. The above approaches for determining the inhomogeneity factor can be dispensed with.
- the spectral measurement conditions L r of the measurements on which the measured variables are based can be selected depending on the specific application of the invention.
- the measurement conditions include illumination conditions, detection conditions or combinations thereof.
- the lighting conditions include illuminating the object with light having predetermined wavelength distributions.
- the detection conditions include detection of the light changed after interaction with the object in accordance with the object response by filters having predetermined wavelength distributions.
- the measurement with different lighting conditions has two advantages. First, the exposure of the subject to illumination can be reduced, especially in ophthalmologic examinations, for excessive eye irritation. Second, the intensity of illumination in different spectral regions can be chosen depending on the expected object response. Thus, the sensitivity range of the camera device used can be better utilized.
- the measurement with different detection conditions can be advantageous by simplifying the measurement technique for certain subjects under investigation.
- the spectral sensitivity of the camera device can be taken into account in the inventive determination of state conditions of the object easily by the spectral sensitivity is considered as a contribution to the spectral measurement conditions L r and thus enters into the evaluation of the variables.
- the spectral wavelength distributions (emission spectrum of a lighting device and / or transmission spectrum of a filter) having a spectral width in the range from 10 nm to 70 nm are selected, there are advantages in particular for the determination of state conditions which have a broadband effect on the object function.
- the wavelength distributions are preferably selected in the wavelength range from 200 nm to 1.5 ⁇ m. Particularly preferred is the wavelength range from 420 nm to 920 nm, in which biological tissue has characteristic spectroscopic properties.
- the object to be examined is a biological object, in particular a biological organism or a part thereof.
- biological objects often lack the ability to modify the object for measurement, e.g. B. by the addition of a marker substance or by a temperature. This applies z. B. for the eye or other biological tissue, such.
- nerve tissue or brain tissue or a part of these, such as.
- the state conditions according to a preferred embodiment of the invention comprise at least one of the blood perfusion properties oxygen content of the blood, hematocrit and diameter of blood vessels.
- the inventive method is characterized by a high degree of flexibility with respect to the time of determination of the state conditions from the measured variables.
- the provision of the measured quantities can be made directly by the measurements on the object, i. H. by the output of the measuring signals, raw signals or possibly processed
- Raw signals done from the camera device.
- the measuring signals are image signals recorded with the camera device.
- the recording under different measuring conditions can be sequential (sequential) or simultaneous (parallel).
- the state conditions are determined on-line during the measurement.
- the provision of the measured variables by an output from a data memory, for. B. from a database.
- the measurement signals recorded during the measurements under different measurement conditions may initially have been stored in the database.
- the provision of the measured variables then takes place via a computer network, such. B. over the Internet, to an evaluation device with which the sought state conditions are determined.
- a selection of the spectral measuring conditions is provided with an optimization procedure.
- the optimization procedure involves maximizing a determinant calculated from a functional matrix J (Jacobi matrix) whose elements contain partial derivatives of the theoretical object response according to the state conditions.
- J functional matrix
- the maximization of the determinant has the advantage of providing a true measure of the error minimization and separability of the influences of the various state conditions.
- the optimization procedure can alternatively also be used in the case of the o. G.
- Embodiment of the invention may be provided, in which the provision of the measured variables takes place from a data memory.
- the maximization of the determinant can take place during the design of the measuring device (eg design of the illumination device) by the partial differentiation of the object response without knowledge of the state conditions of an examined object.
- the optimization of the spectral measurement conditions can be provided immediately before the measurement.
- the spectral measurement conditions first selected in the design of the measuring device can be further optimized immediately before the measurement, possibly taking into account specific properties of the object, such as a remission of tissue in addition to blood vessels measured on the object.
- the determinant of the functional matrix can be maximized immediately.
- the functional matrix J would therefore not be square, it is particularly preferable to maximize the size ⁇ Jdet (J J).
- the product of the functional matrix J with its transposed matrix f gives a square shape.
- more measured variables can thus be evaluated in comparison to the conventional technique, so that the accuracy and reproducibility of the determination of state conditions according to the invention is improved.
- At least one predetermined region in the parameter space of the state conditions is fixedly specified during the maximization of the variable - det (J J)
- the optimization procedure can advantageously be accelerated. For example, realistic intervals of oxygen saturation, hematocrit and / or blood vessel dimensions can be specified.
- the illumination device of the measuring device comprises light-emitting diodes which have different spectral emissions.
- the illumination device of the measuring device comprises light-emitting diodes which have different spectral emissions.
- the concretely desired lighting conditions can be set by the operating parameters of the LEDs.
- the LEDs have the particular advantage that they represent a compact light source and are easy to control. It is possible to use light-emitting diodes based on organic or inorganic semiconductor materials.
- the illumination device can be equipped with at least one laser.
- a tunable laser or a group of multiple lasers may be provided.
- the use of lasers can have advantages in terms of accuracy and stability of wavelength adjustment and illumination intensity.
- the illumination device may comprise at least one flashlamp in combination with at least one filter.
- a single flashlamp with multiple filters for adjusting the spectral illumination conditions or, alternatively, a group of flashlamps with different filters may be provided. Flash lamps can have advantages in terms of the achievable illumination intensities and the availability of existing measuring devices.
- a combination of said light sources may be provided as a lighting device.
- the illumination device can be set up for setting the abovementioned illumination conditions, in particular the wavelength ranges mentioned.
- the said light sources in particular the light-emitting diodes or the lasers, are combined with at least one filter.
- the wavelength distribution of the light used for the illumination can be adapted and optimized with increased accuracy to the object to be examined.
- the camera device of the measuring device comprises a CCD sensor.
- CCD sensors have the advantage that the measurement signals of the camera device can be subjected directly to the determination of the state conditions according to the invention without the need for intermediate processing of the signals.
- the spectral sensitivity of the CCD sensors can easily be integrated into the evaluation of the measurement signals as a contribution to the spectral measurement conditions.
- the measurement signals are recorded with the CCD sensor in pairs immediately before and after the completion of a buffer phase of the CCD sensor, in which charge states of CCD elements of the CCD sensor are stored in latches, errors can advantageously be reduced, which would result from a movement of the object between two measurements with different measurement conditions.
- a permutation of the spectral measurement conditions is provided for the pairwise detection of the measurement signals A r in successive buffer phases.
- the measuring device is integrated into a medical device.
- the illumination device and the camera device are thus preferably parts of the medical measuring device.
- the illumination device and the camera device are particularly preferably parts of a fundus camera intended for ophthalmological examinations, or a microscope, in particular a surgical microscope, which is set up for observation during a microsurgical operation.
- the use of the measuring device according to the invention in the Fundus camera or the microscope, in particular the surgical microscope, the fundus camera and the microscope represent independent objects of the invention.
- the invention is based, in a third aspect, on the general technical teaching, an in vivo measurement method performed on the eye, with illumination of the eye with excitation light in a predetermined excitation wavelength range and with fluorescence measurement in a first emission wavelength range to that effect develop further that a further fluorescence measurement takes place in a second emission wavelength range, that of the first
- Emission wavelength range deviates, and that an autofluorescence signal of a particular pigment in the eye from signals of the first and second fluorescence measurements is determined.
- the fluorescence measurements comprise the measurements of first and second fluorescence signals correspondingly in the first and second emission wavelength ranges, both measurements being made with the same excitation wavelength range of the excitation light.
- the autofluorescence signal is preferably obtained by the method according to the above-mentioned.
- excitation wavelength range refers to a wavelength interval that includes a plurality of wavelengths. gene, z. B. from the emission spectrum of a light emitting diode, or a width corresponding to a single emission line, z. B. a laser diode or a laser.
- emission wavelength range refers to a wavelength interval covering at least a portion of the fluorescence spectrum of the pigment. The emission wavelength ranges of the first and second fluorescence measurements are different from each other, whereby disjoint or partially overlapping intervals may be provided.
- the inventors have found that the autofluorescence of a single pigment, e.g. B. lipofuscin in the fundus, can be detected by the emissions of other fluorescent substances in the eye reliably and with high accuracy with only two fluorescence measurements. It has been found that by suitable selection of the excitation wavelength range, the autofluorescence of the sought-after pigment can be excited with high quantum efficiency. Surprisingly, it is not absolutely necessary in fluorescence measurement to separately determine the fluorescence components of each individual fluorescent substance. The solution of complex equation systems is avoided by the method according to the invention.
- the invention is based on the general technical teaching of providing a measuring device which has an illumination device which is set up for generating the excitation light and for irradiating the eye, in particular the fundus, and a detector device which is for spectrally resolved detection of fluorescence emissions and to provide fluorescence signals.
- the measuring device is configured so that the method according to the above-mentioned third aspect of the invention can be carried out.
- an excitation beam path of the excitation light and an emission beam path of the fluorescence emissions coincide at least in sections.
- the detector device is furthermore preferably equipped with a filter changer which is configured such that emission filters in the emission beam path can be exchanged between two fluorescence measurements.
- the predetermined excitation wavelength range is adjustable.
- the lighting device comprises z.
- the illumination device comprises a single light source, for. B. a single light emitting diode array with a single or multiple light emitting diodes.
- the excitation filter is also provided to suppress long wavelength residual emissions of the light source that would fall within the emission wavelength ranges of the fluorophores.
- the detector device has at least one detector which is connected to a spectrally selective element, such. B. a monochromator or an emission filter is equipped.
- the detector is designed for a spatially resolved detection.
- the detector comprises z. B. a detector camera.
- the first and second fluorescence signals comprise spectrally integrated fluorescence intensities of the fluorescence emissions detected in the first and second emission wavelength ranges, advantageously the useful signal is improved relative to the background noise, so that the accuracy of the fluorescence measurement can be increased.
- the autofluorescence signal of the pigment to be detected is determined by an approximation function, which depends on the fluorescence signals of the first and second fluorescence measurements and on the spectral measurement conditions during the fluorescence measurements.
- the spectral segregation is not the analytical solution of a system of equations, but preferably the approximate determination of the approximation.
- the inventors have found that proximity functions are available for fluorescence measurement on the eye, which surprisingly provide values of autofluorescence with an extremely high accuracy, in particular in the Vo range.
- the autofluorescence S is dependent in particular on the fluorescence signals Si and S2 and a spectral mixing parameter D.
- the spectral mixture parameter D is a correction factor which represents an approximate value for the proportion of contributions of non-interested fluorophores in the total signal of the fluorescence.
- the spectral mixing parameter can be estimated from reference measurements. Typically, the spectral mixing parameter D is in the range of 2 to 4, preferably 2.5 to 3.5, z. B. selected from 2.9 to 3.1.
- the autofluorescence S is further dependent on other parameters of the measuring device, in particular a normalization intensity Io and a constant C, which the spectral measurement conditions, such.
- a normalization intensity Io and a constant C which the spectral measurement conditions, such.
- the additional parameters Io and C do not necessarily have to be determined since relative values of the autofluorescence S are sufficient for many applications.
- the above-mentioned approximation function has the additional advantage that, depending on the pigment to be detected and its spectral properties, it can easily be adapted to the conditions of the specific application of the method according to the invention.
- the excitation wavelength range is adapted to the absorption of the pigment whose autofluorescence is to be detected.
- Quantum yield of the fluorescence measurement can be achieved.
- Particularly preferred is an embodiment of the invention, in which in addition to the absorption of the pigment and the absorption of ocular media of the human eye is taken into account.
- the ocular media comprise the substances which are arranged along the beam path from the illumination device to the ocular fundus.
- the absorption of the ocular media has a filtering effect which is superimposed on the wavelength distribution of the light generated by the illumination device.
- the wavelength intervals on the one hand of the excitation wavelength range and on the other hand of the emission wavelength ranges do not overlap.
- this avoids the fact that light is detected that could reach the detector device by simple remission.
- An unwanted superposition of the autofluorescence by the remission is avoided.
- the autofluorescence of the pigment lipofuscin is particularly preferably detected by the method according to the invention. It has been found that the separation of the lipofuscin autofluorescence from fluorescence emissions of other fluorophores is possible with the method according to the invention with a particularly high accuracy.
- the excitation wavelength range selected is preferably a wavelength interval which extends from 400 nm to 490 nm, more preferably from 420 nm to 480 nm, in particular from 427 nm to 477 nm.
- the first emission wavelength range is preferably selected in the wavelength interval from 495 nm to 560, particularly preferably 500 nm to 550, in particular 510 nm to 540 nm, while the second emission wavelength range preferably has wavelengths above 565 nm, particularly preferably above 570 nm nm, in particular above 590 nm.
- An upper limit of the second emission wavelength range may be given with the sensitivity limit of the detector device in the red or infrared spectral range and z. B. 750 nm or 800 nm.
- the measurement according to the invention of the autofluorescence takes place in a spatially resolved manner.
- the autofluorescence signal is detected with spatial resolution.
- the detector device preferably comprises at least one detector camera.
- the fluorescence measurements can be provided in chronological succession.
- a single detector may be provided for this purpose in combination with different emission filters for setting the emission wavelength ranges. If the time interval between fluorescence measurements is less than 500 ms, preferably less than 200 ms, z. B. in the range of 80 to 150 ms, are advantageously excluded any influences on the measured fluorescence signals by changes in the eye.
- the fluorescence measurements in the first and second wavelength ranges can take place simultaneously, in which case two detectors are provided which detect fluorescence emissions from the eye on two separate beam paths. In the second variant, it is advantageous to produce a verranged irritation of the eye and a shortening of the measuring time.
- a determination of a concentration of the pigment from the autofluorescence signal can be provided.
- the inventors have found that the autofluorescence signal is suitable for a quantitative evaluation in which the pigment concentration, in particular the lipofuscin concentration in the fundus can be provided.
- the determined concentration value serves as the basis for a subsequent diagnosis, eg. B. by an ophthalmologist.
- an image of the ocular fundus is produced in which the autofluorescence signal or the concentration of the pigment is quantified, e.g. B. represented by a grayscale or false color representation.
- regions in which the autofluorescence signal or the concentration of the pigment exceed predetermined limits may be provided with a marking of the image of the ocular fundus.
- FIG. 1 shows a flowchart which illustrates features of preferred embodiments of the method according to the invention
- FIG. 2 shows a schematic block diagram of an embodiment of the measuring device according to the invention
- FIG. 3 is a schematic illustration of a preferred application of the invention.
- Figure 4 is a graph illustrating the construction of an object response function
- FIG. 5 is a flow chart illustrating the optimization of spectral measurement conditions
- FIG. 6 shows a schematic illustration of an embodiment of the measuring device according to the invention.
- FIG. 7 shows a flow chart with an illustration of important steps of the method according to the invention.
- FIG. 8 shows a graphic representation of absorption spectra of various fluorescent substances in the eye, taking into account the transmission of ocular media in the eye.
- FIG. 9 a graphic representation with fluorescence spectra of various fluorescent substances in the eye.
- the invention will be described below by way of example with reference to the spatially resolved analysis of state conditions of a biological object, in particular the determination of the oxygen saturation of retinal blood vessels of the back of the eye.
- the implementation of the invention is not limited to this application, but also possible with other biological or non-biological objects. In particular, in vivo or in vitro applications to biological objects are possible.
- condition conditions of the ocular fundus for example, the determination of the oxygen saturation and possibly further parameters in optically accessible vessels or capillary areas in biological tissue, the determination of the turbidity and possibly further parameters of the ocular lens, the determination of physiological parameters of the cornea (Cornea) and / or the detection of different tissue types (determination of condition conditions of healthy tissue or diseased tissue, especially tumor tissue) may be provided.
- the determination of state conditions of non-biological objects are given, for example, with the measurement of semiconductor structures in which z. B. the crystal quality or the carrier concentration can be determined as state conditions.
- FIG. 1 schematically illustrates the main steps of preferred embodiments of the method according to the invention. Details, mathematical principles, and practical implementation of these steps will be described below with reference to Figs.
- a provision of measured variables which consists of measurement signals from spectroscopic Measurements are formed.
- the measured variables can be formed by the measurement signals as such or by quotients of measurement signals.
- the provision of the measured variables takes place directly by measurements on the object (step S0.1) or after an output of the measurement signals from measurements made in the past from a data memory (step SO.2).
- Steps S0.1 and SO.2 are not mandatory features of the invention, but they are carried out in preferred applications of the invention in connection with steps S1 and S2.
- the measurements include, for example, the acquisition of at least two object images, in particular reflection images, under different spectral illumination conditions.
- Each measurement signal is an image signal having a plurality of image data associated with the individual measurement locations of the area imaged on the camera device.
- step S2 the determination of the state conditions of the object from the measured variables.
- variable parameters of the object response are varied until the values of the system function represent an approximation of the measured variables.
- the approximation of the measuring large by the system function with the adjusted parameters of the object response represents an approximation of the values of the system function to the measured quantities, which is sufficient in the context of the required in the specific application of the invention tolerance.
- the adjusted parameters are the sought state conditions of the object.
- step S3 a further data processing of the determined condition conditions follows.
- the data processing may include, for example, at least one of output, storage and visualization (display) of the condition conditions.
- display display
- Step S3 is not a mandatory feature of the method of the invention, but it is realized in accordance with preferred applications of the invention in combination with steps S1 and S2.
- Step S3 does not provide any diagnostic information about the examined object, but rather data that can subsequently be subjected to a diagnosis, possibly after further data processing.
- diagnostic data processing may include comparison with reference data and output of physiological information as a result of comparison with the reference data.
- the indication of the state conditions may in ophthalmological applications of the invention in particular the following
- Sub-steps include. On a display device, eg. As a screen or a printer of the measuring device is a
- Fundus image of the ocular fundus shown.
- the fundus image is superimposed with a parameter image of the determined condition conditions.
- a complete superimposition of the entire fundus image with the entire parameter image can be provided. be.
- B. on certain blood vessels is limited.
- the parameter picture comprises z. B. a false color representation of the determined condition conditions. For example, a blood vessel with a false color representation is superimposed on the oxygen saturation in the relevant section of the blood vessel.
- FIG. 2 schematically shows an embodiment of the measuring device 100 according to the invention with an illumination device 10, a camera device 20, an evaluation device 30 and an optionally provided output device 40.
- the illumination device 10 comprises at least one light source, such as a plurality of light emitting diodes, with which the Object 1 can be illuminated with a predetermined spectral wavelength distribution.
- the camera device 20 contains a CCD sensor 21 for receiving the measurement signals from the object 1.
- the evaluation device contains the inventively provided adaptation unit 31, with which the state conditions can be calculated by the adaptation of the parameters of the object response.
- the output device comprises, for example, a printer, a data memory and / or a display.
- the parts 10 and 20 may be part of a measuring device, as shown in Figure 3 in more detail.
- the parts 30 and 40 may be parts of a control device (computer) which is integrated in the measuring device.
- the meter includes an ophthalmic fundus camera 200, shown schematically in FIG.
- the measuring device 100 with the illumination device 10, the camera device 20 and the evaluation device 30 is a component of the fundus camera 200.
- the optionally provided output device 40 can likewise be integrated into the fundus camera 200 or, as illustrated, be a separate component.
- the fundus camera 200 is constructed, for example, as a ring light ophthalmoscope described in DE 10 2004 050 807 A1.
- the illumination device 10 comprises an annular light source 11 with a plurality of light-emitting diodes which emit in different spectral ranges and an ophthalmoscope lens 12 with which illumination light is directed onto the eye 1, in particular onto the fundus 2.
- the LEDs have z.
- the ophthalmoscope lens 12 generates an image (reflection image) of the illuminated fundus 2 which is imaged with the objective 22 on the CCD sensor 21 of the camera device 20.
- the evaluation device 30 contains a control unit 32, which is connected to the adaptation unit 31, the illumination device 10 and the camera device 20.
- the control unit 32 serves to select the desired operating parameters of the illumination device 10, in particular the intensities, the spectral wavelength distributions and / or a switching cycle, and the control of the camera device 20, in particular a release clock of the CCD sensor 21.
- the camera device 20 comprises, for example a black and white digital camera with a color depth of 12 bits and about 10 6 CCD elements 23 (for example, 1392 * 1040 pixels), for example of the type AVT Dolphin 145B (manufacturer Allied Vision Technologies GmbH, Germany, Stadtroda).
- the selection of the switching clock of the light source 11 and the readout clock of the CCD sensor 21 is made according to a preferred embodiment of the invention based on the following considerations. If a single detector is used to capture the images of the object (eg, the reflection fundus of the fundus 2) with different spectral wavelength distributions as shown, the images must be captured sequentially. This can lead to errors due to movements of the object (eg due to eye movements) between the individual image recordings. To minimize these errors, the switching clock and the read-out clock are synchronized.
- the image recording are alternately measuring phases in which CCD elements 23 of the CCD sensors 21 are light-sensitively connected, and intermediate storage phases are provided, in which the charge carriers generated by the incidence of light in the CCD elements 23 are moved into a buffer (for example, so-called "Interline Transfer").
- the CCD sensor is switched back to the measuring phase during which the intermediate storage is read out and erased.
- the duration of the shift of the charge carriers into the buffer eg 1 ms
- the duration of the measurement phase eg 60 ms).
- the illumination of the object can now take place such that at the end of a first measurement phase illumination with a first spectral wavelength distribution (eg R distribution) and at the beginning of a next (second) measurement phase the illumination with a second spectral wavelength distribution (eg G Distribution).
- the exposure times eg 1 ms to 20 ms
- the temporal distance of the images of the two images with the different spectral wavelength distributions can be significantly shorter than the image repetition period of the camera.
- image recordings are achieved in practice with a time interval of a few milliseconds to a few 10 milliseconds, in particular in the range of 1 ms to 60 ms.
- two comparable images can thus be obtained even for moving objects if their speed is sufficiently low with respect to the time scale of the time interval of the recorded images.
- the following measurement is preferably realized with a permutation of the spectral illumination conditions.
- the said pairwise detection of image signals (recording of double images) is repeated several times, one of the two spectral wavelength distributions used being used in each case for each pair of double images.
- a possibly occurring difference in the image can be normalized and compensated by means of the double-use spectral wavelength distribution.
- a r (s, h, d) A rl (s, h, d)
- a g (s, h, d) A g i (s, h, d)
- double image recording is not required for image recording in the infrared spectral range (central wavelength eg 815 nm), since there is no disturbing irritation of the eye in this spectral range.
- the spatially resolved determination of the state conditions by an adaptation of the parameters of the object response is based on the following representation of the measured variables with a system function.
- the object 1 to be examined has a spectral response function, which is referred to here as spectrum or object response S.
- the object response can be present, for example, as a reflection image or as a transmission image.
- the object response S (p (x), ⁇ ) depends on n parameters, the wavelength ⁇ and the location x on the object.
- the n parameters that the searched State conditions / ?, represent, are considered components of a vector
- All parameters in vector p can have a dependence on location x on the object.
- the object response can be formed as a function of the specific composition of the tissue.
- the object answer is z.
- Fo ( ⁇ ) is the absorption coefficient of non-oxygenated hemoglobin
- Fi ( ⁇ ) is the absorption coefficient of oxygenated hemoglobin
- s oxygen saturation
- h hematocrit
- d is the layer thickness.
- the variables s and hd form the state conditions of the object to be determined.
- the quantities F 0 ( ⁇ ) and Fi ( ⁇ ) are shown by way of example in FIG.
- the object response is first generated with the aid of the recorded image signals.
- the reflectivity of the fundus tissue on the back of the blood vessel plays an important role. This remission can be estimated after application of image processing from the remission in the environment of the considered vessel section and be taken into account in the construction of the object response.
- the object response is relevant only to a part of the imaged object.
- a model for the reflection or transmission of blood as a function of oxygen saturation, hematocrit, and vascular thickness in a fundic uptake is important only where blood vessels are actually located on the retina.
- the intensities (measurement signals) registered with the camera device depend on the spectral measurement conditions (in particular illumination and / or detection conditions) L r (x), which in turn have a location dependency, and the object response.
- An area F on the object is imaged with the camera device on an area F 'on the CCD sensor.
- a point x on the object is assigned to the point x 'on the CCD sensor.
- a vector p (x ') is used to describe the parameters of the area F imaged on the point x' on the CCD sensor on the object. This can be done under the simplifying assumption that the parameters over F are substantially constant.
- the sought state conditions p t (x) (concrete object eigenstates) are included as parameters in the object response.
- a plurality of M images of the object are recorded with pairwise different spectral wavelength distributions.
- the spectral measurement conditions can be due to different lighting conditions (eg light emitting diodes with different spectral emissions), by different filters can be set before broadband illumination, through various filters in front of the camera device, or a combination of these.
- M measurement signals A r (p (x ')) are provided at each point x' of the object imaged on the CCD sensor.
- L r ( ⁇ ) there exists for every point x 'a function that maps the parameter vector p (x) to A r (p (x')).
- equation (Ia) shows the functional relationship between the measurement signals and the object response as well as the Measuring conditions with the mapping function
- measured variables which are calculated from measurement signals
- system function which is constructed from the mapping function F.
- the determination according to the invention of the state conditions is based on an adaptation, in particular an iterative variation or a numerical approximation, of the components of the parameter vector contained in the mapping function F or in general of a system function constructed therefrom, until the measurement signals (or general measured variables). be approximated by the mapping function or system function.
- the sought state conditions are determined directly by the adaptation in equation (Ia), as shown below.
- the object response S can also depend on further, initially unknown quantities (R (A)). Often, however, these variables can be determined by the measurement.
- R (A) oxygen saturation
- d vessel diameter
- A hematocrit
- Rb g ( ⁇ ) remission
- a measurement of R bg ( ⁇ ) can take place next to the considered vessel, since R b g ( ⁇ ) has a low spatial dependence (in relation to the vessel diameter).
- the signal measurable next to the vessel is not R bg ( ⁇ ) but
- ⁇ I (x) dx provides an estimate of ⁇ I (x) dx based on intervening values for the parameters p ⁇ (x). With the estimated value of 17 (x) dx, the parameters
- J / (x) dx can be determined by this measurement
- this method is also based on input values for the parameters p t (x).
- the initial value for the numerical determination can be determined by a simple (one-dimensional, eg standard least-square method) determination of the
- the system function is formed by the quotients of the above-mentioned mapping function for the different measurements n, m.
- the shortened mapping function for the different measurements n, m.
- MI linearly independent signal quotients q nm can be found.
- restrictions on p (x ') can often be specified for realistic parameter ranges. The stated condition for the relevant values should therefore apply to all p (x ') that fall within this restriction. For example, the oxygen saturation of the blood can never become greater than one. You can also specify several relevant ranges for p (x ') that can overlap.
- mapping function i. in the mapping function or in the quotient of the mapping functions
- adaptation of the parameters in the object response according to the above-mentioned embodiments, i. in the mapping function or in the quotient of the mapping functions is carried out using numerical methods known per se, for example by the Newton-Rhapson method, the Powell method, the Levenberg-Marquard algorithm or the conjugate gradient method (see, for example, US Pat above publication by WH Press et al.).
- numerical methods for multi-dimensional zero determination are used.
- an optimization of the standard numerical methods may be provided. This can be done in conjunction with the evaluation of the image signals in the case of multidimensional imaging (eg 2D imaging). So can to For example, in the case of RGB images of the ocular fundus by image recognition, preferably on a photograph in the green spectral region, the position of the vessels and the vessel thickness are first determined. The vascular thickness can then be used as the starting value for the spectral evaluation according to the invention. Below you can set other starting values for oxygen saturation and hematocrit. By a piecewise linearization of the object response and a subsequent adaptation of the parameters, the locally valid values for the oxygen saturation, the vascular dimension and the hematocrit can be determined in a few iteration steps.
- an optimization of the spectral measurement conditions is provided in order to determine the desired state conditions of the object with the highest possible reliability.
- a determinant is derived, which is derived from a functional matrix whose elements comprise partial derivatives of the theoretical object response according to the state conditions. This method is described below by reference to the calculation with quotients q * 1 (J SL r d ⁇ / ⁇ SL "d ⁇ ) on the basis of the theoretical object response for pairwise different measuring conditions L r , g .
- Quotients q * t are to be selected from the set of quotients q * nm so that they are linearly independent (k> _M).
- the functional matrix (Jacobian) J of Figure P are calculated using equations (Ia) and (3):
- the elements of p £ t ',) can only be calculated if the total number k of the selected quotients q * ⁇ is greater than or equal to the number N of state conditions to be determined and less than or equal to the number M of recorded images (N ⁇ k ⁇ M).
- N k the matrix J is square.
- the spectral measurement conditions L r are chosen so that the determinant of the functional matrix J becomes maximum.
- the functional matrix J is not square.
- the term - ⁇ ] det (JJ) in the points of the relevant regions described above is maximized in the space of the elements of p (x ') by the appropriate choice of the spectral wavelength distributions used for the measurements.
- ⁇ det (JJ) is a measure of the uniqueness of the determination of the components of p (x ').
- FIG. 5 shows a method for maximizing - ⁇ det (JJ)
- step SOl For the maximization of first the object response S (step SOl) and n spectral distributions L r (step S02) is provided. On the basis of the object dq * i answer S, the partial derivatives are calculated dp j
- Step S03 and integrated with respect to the wavelength, wherein a weighting with the current spectral distributions L r is provided (step S04).
- the calculation of the partial derivatives in step S03 can be done analytically or numerically. It is preferred that the model function used is easily differentiable in the relevant parameter ranges. Alternatively, a numerical differentiation (eg in the case of tabular or interpolated values) may be provided.
- step S05 the functional matrix J (step S05) and the size (Step S06).
- step S07 the functional matrix J (step S05) and the size (Step S06).
- a query is made as to whether the quantity ⁇ det (JJ) has reached a maximum. If this is not the case, the spectral distributions L r are varied and provided for a repeated processing of steps S04 to S06. If the variable tjdetfj J) has reached a maximum, the current spectral distributions are stored and used to control the measuring device 100 (see, for example, FIG. 3), in particular for driving the light source 11. If N ⁇ k, then the rows of the functional matrix are not independent of each other. In this case, it is possible to include k-N quantities that are not directly related to the problem in the optimization of the spectral distributions. Such quantities are, for example, further properties of the optical structure, as well as the price of the components required for generating the spectral distribution (light sources, optics and the like).
- ⁇ ydet (JJ) is an average, which can then be maximized. This averaging can be carried out in a weighted manner in order to take particular account of pertinent points in the context of the components of p, or to give little or no consideration to areas of diminished importance. In an area in the space of the components of p, their determination from the recorded images is clearly possible if the sign of det (J ⁇ J) is the same throughout the area considered.
- Embodiments of the third and fourth aspects of the invention are described below by way of example with reference to the detection of autofluorescence of lipofuscin in the ocular fundus.
- the implementation of the invention is not limited to this application, but according to the detection of autofluorescence of other pigments in the eye or other biological samples, in particular in vivo samples possible. Details of the excitation of the pigment and the fluorescent Measurement of the duration is not described below, as far as these techniques are already known from the conventional spectroscopic measuring methods.
- FIG. 6 schematically shows a measuring device 100 according to the invention, which is set up to carry out the method according to the invention and comprises an illumination device 10, a detector device 20 and a control device 30.
- the measuring device 100 is preferably formed on the basis of a known fundus camera, which is equipped with an adapted light source and configured for a filter change (see below).
- the illumination device 10 comprises a light source 11 and an excitation filter 12.
- the light source 11 comprises a single light-emitting diode, in particular a single light-emitting diode emitting in the blue spectral range (eg LED "OSRAM Ostar blue” type "LE B A2A"), eg. B. with a maximum emission ⁇ max in the range of 455 nm to 465 nm.
- the excitation filter 12 is for adjusting the excitation wavelength range, in particular for the suppression of long-wave residual emissions of the light source, which would fall into the emission wavelength ranges of the fluorophores provided ,
- the long-wave emissions are preferably suppressed to a value below 1% relative to the maximum emission of the light-emitting diode.
- the light source 11 may alternatively z. B. comprise a broadband white light source.
- the excitation filter 12 is configured to excite light having a spectrum in the desired excitation wavelength range from the Cut out the broadband spectrum of the white light source.
- the light source 11 may comprise an array of light-emitting diodes or laser diodes which emit in the same or different spectral ranges. It can z. B. two or more emitting in the blue spectral range or in different spectral light emitting diodes may be provided.
- the spectral composition of the excitation light can be formed by driving the LEDs or laser diodes, wherein the excitation filter 12 can be provided for a fine adjustment of the spectrum of the excitation light to the absorption of the pigment to be detected. If the spectral composition of the excitation light is formed by the driving of narrow-band light emitting diodes or laser diodes, the excitation filter 12 could be omitted.
- the excitation light is directed by the light source 11, possibly with the excitation filter 12 via a beam splitter mirror 13 on the excitation beam path 14 to the eye 1, in particular to the fundus 2.
- the excitation filter 12 includes z. B. a filter type Semrock FF01-457 / 50.
- the detector device 20 comprises a detector camera 21 and two emission filters 22, which can be alternately combined with a filter changer 23 with the detector camera 21.
- the detector camera 21 preferably comprises a CCD camera. It can, for. As a "black and white CCD camera, such as a" Dolphin 145 B ", manufacturer: Allied Vision Technologies (AVT), be provided to detect fluorescence emissions from the eye spatially resolved. Alternatively, a color CCD camera may be provided.
- An emission beam path 24 extends from the eye 1, in particular from the fundus 2 via the beam splitter. Mirror 13 and one of the emission filters 22 to the detector camera 21st
- the emission filters 22 are selected so that fluorescent light in the desired emission wavelength ranges is transmitted to the detector 21.
- the emission filters 22 include z. Eg standard optical filters (type: Semrock FF01525 / 50 and Schott OG570).
- the filter changer 23 includes, for example, a filter wheel or a filter carriage.
- the control device 30 comprises an electronic circuit, for. B. a control computer, which is adapted for processing signals (operating state signals, measurement signals) of the components 10, 20 and for providing control signals.
- the control device 30 is in particular connected to the light source 11, the detector 21 and the filter changer 23.
- the control device 30 also contains a computer circuit with which the autofluorescence can be calculated from the measured fluorescence intensities.
- the control device 30 with a display device, for. B. a display screen, an output device, such. As a printer, and a user interface such. As a keyboard, connected (not shown).
- the method according to the invention which is preferably carried out with the measuring device 100 according to FIG. 6, is illustrated schematically in FIG.
- a first step Sl the illumination of the eye 1 is activated.
- excitation light having a predetermined excitation wavelength range ⁇ ex is directed to the eye 1 on the excitation beam path 14 (FIG. 6).
- the activation of the light source 11 means that the light source 11 for the following steps S2 and S3 for a Pulse mode is prepared or switched on for permanent operation.
- the pulse operation is provided, in which the light source 11 is actuated in pulses in steps S2 and S3.
- the irritation of the eye is minimized.
- the pulse-shaped actuation of the light source 11 takes place with a predetermined time interval in which the measurement conditions do not change or as little as possible.
- step S2 a first fluorescence measurement takes place in a first emission wavelength range ⁇ em , i.
- the setting of the second emission wavelength range ⁇ em , 2 is effected by inserting the second filter 22 with the filter changer 23 into the emission beam path 24.
- the filter changer 23 is actuated by a stepper motor which enables a filter change within the desired time interval between the fluorescence measurements.
- the wavelength ranges are selected such that an overlap of the excitation wavelength range ⁇ ex with one of the emission wavelength ranges ⁇ em , i and ⁇ em , 2 is avoided.
- spectrally integrated fluorescence intensities are recorded by the individual pixels of the detector camera 21, which are characteristic of the fluorescence emissions in the first and second fluorescence emissions Emission wavelength ranges are.
- the integrated fluorescence intensities form fluorescence signals Si, S 2 , based on which an autofluorescence signal S is calculated for each pixel at steps S4 in the control device 30.
- step S5 one of the sub-steps of a data processing of the determined autofluorescence, a data storage, for. B. in the controller 30 and a display of an autofluorescence image of the fundus, z. B. by a grayscale or false color representation.
- FIGS. 8 and 9 illustrate spectroscopic properties of lipofuscin and other pigments in the ocular fundus, on the basis of which detection of the autofluorescence of lipofuscin takes place (see D. Schweitzer et al., "Towards Metabolic Mapping Retina” in “Microscopy Research And Technology” Vol 70, 2007, pp. 410-419).
- Figure 8 shows the spectra of absorbance A (arbitrary units) of lipofuscin (A2E) and the pigments AGE (so-called “Advanced Glycation End Products", which include, for example, carboxy-methyllysine (CML), carboxy-ethyllysine (CEL) and Argpyrimidines include) and FAD (so-called "flavin dinucleotide”), each multiplied by the transmission of ocular media in the eye (T O m) •
- the inventively preferred excitation wavelength range ⁇ ex the z. B. from 427 nm to 477 nm, is marked in Figure 8 with a bar.
- the excitation wavelength range substantially coincides with the absorption maximum of the pigment lipofuscin to be investigated.
- FIG. 9 shows the normalized intensities I of the fluorescence emissions of lipofuscin (A2E) and the pigments AGE and FAD as a function of the wavelength ⁇ .
- the preferably realized emission wavelength ranges ⁇ em , 1 and ⁇ em , 2 are also illustrated in FIG. They extend correspondingly in the wavelength intervals of 500 nm and 550 nm and above 570 nm.
- FIGS. 8 and 9 illustrate, as an important feature, which is utilized in particular for the approximate detection of the autofluorescence of a pigment of interest, a relatively good match Excitation and emission spectra of the other pigments (here eg AGE, FAD), which do not represent the pigment of interest (here eg A2E).
- Io is the incident light intensity in a single measurement. If different light intensities are used in the first and second fluorescence measurements, a normal light intensity is normalized.
- C is a constant that depends in particular on the filters used (12, 22) and the spectrum of the light source 11. The constant C can be determined by calibration measurements or introduced as a theoretical normalization value, x is generally a two-dimensional spatial coordinate of the image of the fundus.
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Abstract
Ein Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen pι(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), umfasst die Schritte Bereitstellung einer Vielzahl von Messgrößen aus Messungen am Objekt (1), wobei die Messgrößen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort S(pι,λ) des Objektes (1) und von spektralen Messbedingungen Lr(λ) der Messungen darstellbar sind, wobei die Objektantwort S(pι, λ) die Zustandsbedingungen pi, als Parameter enthält, und Berechnung der Zustandsbedingungen pι(x) aus den Messgrößen, wobei die Berechnung der Zustandsbedingungen pi(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(pi,λ) derart umfasst, dass die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden. Es wird auch eine Messeinrichtung (100) zur Ermittlung von Zustandsbedingungen pι(x) eines zu untersuchenden Objektes (1) beschrieben. Ein Verfahren zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) umfasst die Schritte Beleuchtung des Auges (1) mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich (λex), Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (S1) in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,1) ' Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S2) in ei- nem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,2) ι und Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (S1, S2). Es wird auch eine Messeinrichtung (100) beschrieben, die zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) eingerichtet ist und eine Beleuchtungseinrichtung (10) und eine Detektoreinrichtung (20) umfasst.
Description
Verfahren und Vorrichtung zur Ermittlung von
Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes und zur Fluoreszenzmessung am Auge
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes, insbesondere zur Ermittlung von physiologischen Eigenschaften eines biologischen Objektes. Die Erfindung betrifft des Weiteren eine Messeinrichtung, die zur Durchführung des genannten Verfahrens eingerichtet ist, und Geräte, die mit einer derartigen Messeinrichtung ausgestattet sind. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren und eine Messeinrichtung zur Mes- sung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge, insbesondere zur Messung der Autofluoreszenz von einem physiologischen Pigment, wie z. B. von Lipofuszin, im Augenhintergrund. Das Verfahren und die Fluoreszenzmesseinrichtung liefern ein Autofluoreszenzsignal, dass vorzugsweise einer Verarbeitung mit dem o. g. Verfahren zur Ermittlung der physiologischen Eigenschaften am Auge unterzogen wird.
Es ist allgemein bekannt, Eigenschaften eines zu untersuchenden Objektes durch spektroskopische Messungen zu erfassen. So können Bestandteile einer Probe auf der Grundlage einer charakteristischen spektralen Antwortfunktion dieser Bestandteile detektiert werden (z. B. Messung von Transmission, Reflek- tion oder Fluoreszenz) . Die Detektion vereinfacht sich, wenn die Bestandteile spektroskopisch deutlich verschiedene Eigen- Schäften aufweisen, so dass durch die Wahl verschiedener spektraler Messbedingungen jeder der Bestandteile spezifisch erfasst werden kann.
Für einen derart vereinfachten Fall wird in US 6 142 629 vorgeschlagen, das Objekt mit verschiedenen spektralen Verteilungen zu beleuchten und für jede spektrale Verteilung ein Reflexionsspektrum des Objektes aufzunehmen. Die interessie- renden Merkmale des Objektes werden aus den Reflexionsspektren abgeleitet. Nachteilig ist, dass bei dem beschriebenen Verfahren nur Spektren ausgewertet werden können, die im wesentlichen von einem einzigen Objektmerkmal abhängen. Spektren, die von mehr als einem Parameter oder Merkmal abhängen, können nicht ausgewertet werden.
In der Praxis sind jedoch oft Bedingungen gegeben, bei denen sich die spektroskopischen Eigenschaften verschiedener Bestandteile in bestimmten Spektralbereichen überlappen. Die Eigenschaften können durch die Auswahl der spektralen Messbedingungen nicht mehr ohne weiteres getrennt werden. In diesem Fall ist eine komplexe Analyse der unter verschiedenen spektralen Messbedingungen ermittelten Messsignale erforderlich. Besondere Anforderungen bestehen an die Analyse, wenn mit der spektroskopischen Messung nicht nur das Vorhandensein eines Bestandteils in der Probe, sondern ein anderer Probenparameter ermittelt werden soll, der sich auf die spektroskopischen Eigenschaften der Probe auswirkt, wie zum Beispiel eine Dimension, eine Konzentration, histologische Parameter oder dgl..
In der Publikation „Quantitative analysis of multispectral fundus images" von I. B. Styles et al . („School of Computer Science Research Report-University of Birmingham CSR, 2005, issue 8") wird ein Verfahren zur Ermittlung von histologi- schen Parametern aus Bildern des Augenfundus beschrieben, die unter verschiedenen spektralen Messbedingungen aufgenommen wurden. Die Bilder umfassen Reflexionsbilder des Augenfundus, die mit einer Funduskamera aufgenommen werden. Die spektralen
Messbedingungen werden durch den detektorseitigen Einsatz von verschiedenen spektralen Filtern vor dem Kamerateil der Funduskamera eingestellt. Von I. B. Styles et al. wird eine Systemfunktion vorgeschlagen, welche die Messsignale in Abhän- gigkeit von den histologischen Parametern repräsentiert. Zur Ermittlung der histologischen Parametern aus den Messsignalen wird aus der Systemfunktion mit einem neuronalen Netzwerk eine Umkehrfunktion ermittelt, die auf die Messsignale angewendet wird. Um entscheiden zu können, ob die histologischen Pa- rameter eindeutig aus den Messsignalen ermittelbar sind, wird von I. B. Styles et al . geprüft, ob die Determinante einer Funktionalmatrix, deren Elemente partielle Ableitungen von der Messsignale nach den histologischen Parametern umfassen, ungleich Null ist
Die Technik von I. B. Styles et al . hat eine Reihe von Nachteilen, die sich aus der Messtechnik und aus der Prozedur zur Ermittlung der histologischen Parameter ergeben. So ergeben sich Nachteile aus der detektorseitigen Filter-Einstel- lung der spektralen Messbedingungen, da für alle Messbedingungen eine relativ starke Weißlichtbeleuchtung des Auges erforderlich ist. Eine starke Reizung des Auges kann zu unerwünschten Änderungen der Messbedingungen, z. B. durch ein Schließen der Pupille oder eine Bewegung des Auges führen. Ferner können für die Reflexionsmessung im grünen oder blauen Spektralbereich nur schwache Messsignale erfasst werden. Die schwachen Messsignale ergeben ein verschlechtertes Signal- Rausch-Verhältnis. Dies kann zwar durch eine verstärkte Beleuchtung kompensiert werden, was aber auch mit einer stärke- ren Reizung des Auges verbunden wäre. Somit können durch die detektorseitige Filter-Einstellung die ermittelten histologischen Parameter verfälscht werden.
Ein weiterer Nachteil ist die komplizierte Ermittlung der histologischen Parameter durch die Konstruktion der Umkehrfunktion der Modellfunktion. Die Konstruktion der Umkehrfunktion stellt einen erheblichen Verarbeitungs- und Zeitaufwand dar. Des weiteren sind Funktionen, die das optische System bei I. B. Styles et al . beschreiben, im allgemeinen nicht umkehrbar, so dass die Umkehrfunktion oft nicht ausführbar ist. Nachteilig bei dem Verfahren von I. B. Styles et al . ist ferner, dass die Auswertung der Messsignale unter der unrealis- tischen Bedingung erfolgt, dass die unter den verschiedenen spektralen Messbedingungen verwendeten Lichtintensitäten miteinander vergleichbar sind, d.h. dass die von dem Detektor erfassten Signale im Falle eines Objektes mit idealer Remission (100 %) gleich sind. Dies ist in der Praxis jedoch häu- fig nicht der Fall. Schließlich ergibt die Evaluierung der
Determinante der Funktionalmatrix eine Beschränkung auf Messungen, bei denen die Anzahl der Messsignale gleich der Anzahl der gesuchten Parameter ist. Für eine Verbesserung des SNR besteht jedoch ein Interesse, die Anzahl der Messsignale möglichst hoch zu wählen.
Nachteilig ist auch, dass sich bei bestimmten Messaufgaben der Einfluss verschiedener Parameter auf die spektrale Antwortfunktion in einen oder mehreren Spektralbereichen aufhe- ben kann. Ein derartiger Fall ist zum Beispiel bei der Bestimmung der SauerstoffSättigung in einem retinalen Blutgefäß gegeben. Im roten Spektralbereich, zum Beispiel von 600 nm bis 690 nm sinkt die Reflektivität sowohl mit der Abnahme des Gefäßdurchmessers als auch mit der Abnahme der Sauerstoffsät- tigung. Mit dem von I. B. Styles et al . beschriebenen Verfahren ist eine zuverlässige Trennung der Parametergefäßdurchmesser und Sauerstoffsättigung nur beschränkt möglich.
Die genannten Probleme bei der Auswertung spektroskopischer Messgrößen an zu untersuchenden Objekten treten nicht nur bei Messungen am Augenhintergrund, sondern auch bei anderen Untersuchungsgegenständen, insbesondere bei biologischen Gewe- ben, wie zum Beispiel Nervengeweben (Gehirn) , oder bei nichtbiologischen Untersuchungsgegenständen auf.
Insbesondere in Zusammenhang mit den Messungen am Augenhintergrund ist bekannt, dass das Pigment Lipofuszin als Abbau- produkt im physiologischen Stoffwechsel gebildet und in biologischen Zellen gespeichert wird. Mit fortschreitender Alterung eines Individuums erfolgt die Akkumulation von Lipofuszin insbesondere im menschlichen retinalen Pigmentepithel (RPE) . Es ist bekannt, dass Lipofuszin eine potentielle Quel- Ie oxidativen Stresses darstellt und daher zur Alterung von Zellen beiträgt. Es spielt insbesondere eine wichtige Rolle bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) .
Es besteht in der Ophtalmologie ein Interesse, die Akkumula- tion von Lipofuszin in der Retina zu erfassen, wobei insbesondere für die Diagnose der AMD örtliche Anhäufungen von Lipofuszin in der Retina erfasst werden sollen. Bekannte Verfahren zur Erfassung von Lipofuszin in der Retina basieren auf der Messung der Autofluoreszenz von Lipofuszin, d. h. auf der Messung der Fluoreszenz, die Lipofuszin bei Bestrahlung mit Anregungslicht emittiert. Bei Bestrahlung des Augenhintergrundes, z. B. mit einer Beleuchtungseinrichtung einer Funduskamera, tritt jedoch das Problem auf, dass in den okularen Medien weitere fluoreszierende Substanzen enthalten sind. Hierzu zählen z. B. Pigmente oder Fluophore, die in der Linse des Auges enthalten sind und insbesondere bei Individuen mit Katarakt relativ stark fluoreszieren. Die Autofluoreszenz von Lipofuszin wird somit durch die Autofluoreszenz der weiteren Substanzen überlagert.
Zur Erfassung von Lipofuszin ist es daher erforderlich, dass Autofluoreszenzsignal von Lipofuszin von Autofluoreszenzsignalen anderer Fluorophore zu separieren. Dabei sind die fol- genden Besonderheiten der Fluoreszenzmessung am Auge zu beachten. Erstens ist das Auge ein Gegenstand mit einer komplexen Zusammensetzung fluoreszierender Substanzen. Im Unterschied zur Fluoreszenzmessung an biochemischen Assays mit definierten Fluoreszenzmarkern sind im Auge zahlreiche fluores- zierende Substanzen enthalten, deren Auftreten und Konzentration individuell stark schwanken kann. Zweitens stellt das Auge ein komplexes optisches System dar, bei dem im Unterschied zu in vitro-Untersuchungen z. B. in einer Küvette der Strahlengang des Anregungslichts und der Fluoreszenzemission durch verschiedene transmittierende und streuende Medien verläuft, die zur Fluoreszenz beitragen können. Schließlich ist zu beachten, dass die Signalbeiträge verschiedener Fluorophore aus verschiedenen Teilen des Auges, insbesondere aus verschiedenen Bereichen außerhalb einer Fokalebene geliefert werden können. Aufgrund dieser Besonderheiten wurden bekannte Techniken der in vitro-Untersuchung biologischer Proben mittels Fluoreszenzmessung auf die Untersuchung am Auge bisher nicht angewendet.
Zu den bekannten Verfahren der Fluoreszenzmessung an biologischen Proben, die Zusammensetzungen verschiedener Fluorophore enthalten, zählt bspw. das Verfahren mit einer spektralen Entmischung von Fluoreszenzsignalen (sog. "Spectral Unmi- xing"-Verfahren) . Dieses Verfahren wird z. B. von T. Zimmer- mann et al. ("FEBS Letters", Band 546, 2003, S. 87), R. Neher et al. ("Journal of Microscopy", Band 213, 2004, S. 46) und in DE 10 2005 054 184 Al beschrieben. Die Trennung der Fluoreszenzsignale von drei oder mehr Flurophoren erfordert für die spektrale Entmischung mindestens drei Fluoreszenzmessun-
gen, die z. B. bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen, Emissionswellenlängen oder Kombinationen daraus erfolgen. Die Auswertung der Fluoreszenzsignale und die Ermittlung der quantitativen Anteile der verschiedenen Fluorophore erfolgt durch eine analytische Lösung eines Gleichungssystems, in das die Messbedingungen und Fluoreszenzsignale der Fluoreszenzmessungen eingehen.
Eine Anwendung der spektralen Entmischung in der Ophtalmolo- gie wurde bisher nicht realisiert. Es konnten insbesondere die herkömmlichen Auswertungsverfahren für Zusammensetzungen mit mindestens drei Fluorophoren nicht auf die komplexen optischen Bedingungen im Auge mit einer größeren und individuell verschiedenen Anzahl fluoreszierender Substanzen übertra- gen werden. Ein Problem stellt insbesondere die Beweglichkeit des Auges dar, durch die Messungen verfälscht werden können. Es wurde daher versucht, die Autofluoreszenz insbesondere von Lipofuszin von anderen Fluoreszenzen mit einem der folgenden Verfahren durch optische Mittel zu trennen.
Von R. F. Spaide ( "Opthalmology" , Bd. 110, 2003, S. 392) wird vorgeschlagen, den Augenhintergrund mit Anregungslicht in einen Anregungs-Wellenlängenbereich zu bestrahlen, in dem nahezu ausschließlich das gesuchte Lipofuszin, nicht jedoch ande- re fluoreszierende Substanzen absorbieren. Von R. F. Spaide wird insbesondere der Anregungs-Wellenlängenbereich im Wellenlängenintervall von 500 nm bis 610 nm vorgeschlagen. Die Fluoreszenzmessung erfolgt in einem Emissions-Wellenlängen- bereich, in dem nahezu ausschließlich Lipofuszin emittiert, wobei hierfür das Wellenlängenintervall von 665 nm bis 775 nm vorgeschlagen wurde. Das Verfahren von R. F. Spaide hat die folgenden Nachteile. Erstens ist die Genauigkeit der Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin wegen der individuellen Variabilität der Beiträge fluoreszierender Substanzen
zum Gesamtsignal beschränkt. Dies ist insbesondere wegen der verminderten Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung für Langzeituntersuchungen der AMD von Nachteil. Des Weiteren zeichnen sich die vorgeschlagenen Anregungs- und Emissions- Wellenlängenbereiche durch eine geringe Quantenausbeute aus. Es wird ein schwaches Signal mit einem hohen Rauschanteil gemessen, wodurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung weiter beschränkt wird. Eine Verbesserung des Signalanteils könnte durch eine Erhöhung der Intensität des Anregungslichts erzielt werden, wodurch jedoch die Belastung und Reizung des Auges während der Messung zunimmt.
In US 2006/0134004 wird ein konfokales Ophtalmoskop vorgeschlagen, mit dem für jeden untersuchten Punkt auf der Retina jeweils zwei Messungen der Autofluoreszenz durchgeführt werden. Die Messungen unterscheiden sich in den Anregungswellenlängen des Anregungslichts, die z. B. bei 488 nm und 532 nm gewählt werden. Durch die Anregung bei verschiedenen Anregungswellenlängen werden verschiedene Anteile von Lipofuszin und anderen fluoreszierenden Substanzen angeregt. Aus dem
Verhältnis der emittierten Autofluoreszenz kann für den gemessenen Punkt der Anteil von Lipofuszin ermittelt werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist der erhöhte gerätetechnische Aufwand bei der Erzeugung und Einstellung des Anregungs- lichts. So sind zwei Laser mit Emissionen bei den verschiedenen Anregungswellenlängen und ein Scanner-Mechanismus für die konfokale Messung erforderlich.
Die genannten Probleme der herkömmlichen opthalmologischen Techniken sind nicht nur bei der Erfassung von Lipofuszin gegeben. Entsprechende Probleme treten auf, wenn andere Pigmente, die z. B. für pathologische Veränderungen am Auge charakteristisch sind, selektiv durch Fluoreszenzmessungen erfasst werden sollen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Erfassung von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, mit dem Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden können. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine verbesserte Messeinrichtung zur Umsetzung eines derartigen Verfahrens bereitzustellen. Es ist ferner eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Fluoreszenzmessung am Auge bereitzustellen, mit dem die Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine verbesserte Messeinrichtung zur Fluoreszenzmessung am Auge bereitzustellen, mit der die Nachteile der herkömmlichen Techniken überwunden werden. Die Fluoreszenzmessung soll insbesondere einen ver- einfachten Ablauf aufweisen und die Erfassung der Autofluoreszenz eines einzelnen Pigmentes mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ermöglichen.
Diese Aufgaben werden durch Verfahren und/oder Messeinrichtungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Verfahrensbezogen wird die genannte Aufgabe gemäß einem ers- ten Gesichtspunkt der Erfindung durch die allgemeine technische Lehre gelöst, ein Verfahren zur Ermittlungen von Zustandsbedingungen eines zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, das die folgenden Schritte umfasst. Zuerst erfolgt eine Bereitstellung von Messgrößen, die durch eine vorbe- stimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort des Objektes darstellbar sind, wobei die Objektantwort von spektralen Messbedingungen der Messungen und den gesuchten Zustandsbedingungen abhängig ist. Die Objektantwort enthält die Zustandsbedingungen als variable Parameter. In einem
zweiten Schritt erfolgt die Berechnung der Zustandsbedingun- gen aus den Messgrößen, wobei eine Anpassung (Variation) der variablen Parameter der Objektantwort vorgesehen ist, bis die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden.
Die erfindungsgemäße Berechnung der Zustandbedingungen durch eine Parameteranpassung hat den Vorteil, dass die Beschränkungen und Fehler der herkömmlichen Verwendung einer Umkehrfunktion vermieden werden können. Des weiteren kann die Para- meteranpassung mit einem geringeren Rechenaufwand realisiert werden, so dass die gesuchten Zustandsbedingungen schneller als bei den herkömmlichen Verfahren berechenbar sind.
Vorrichtungsbezogen wird die genannte Aufgabe gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung durch die allgemeine technische Lehre gelöst, eine Messeinrichtung zur Ermittlungen von Zustandsbedingungen des zu untersuchenden Objektes bereitzustellen, die eine Beleuchtungseinrichtung zur Beleuchtung des Objektes, eine Kameraeinrichtung zur Messung einer Vielzahl von Messsignalen unter verschiedenen spektralen Messbedingungen, wobei die Messsignale durch die Objektantwort des Objektes bestimmt werden, und eine Auswertungseinrichtung zur Berechnung der Zustandsbedingungen aus den Messgrößen umfasst. Erfindungsgemäß enthält die Auswertungs- einrichtung eine Anpassungseinheit, mit der die Zustandsbedingungen durch eine Anpassung der Parameter der Objektantwort derart berechenbar sind, dass die Messgrößen durch die Systemfunktion repräsentiert werden. Die erfindungsgemäße Messeinrichtung hat den Vorteil eines kompakten Aufbaus. Die erfindungsgemäße Anpassungseinheit kann problemlos in eine Recheneinheit eines Messgerätes integriert werden.
Vorteilhafterweise besitzt die Erfindung einen im Vergleich zur herkömmlichen Technik erheblich erweiterten Anwendungsbe-
reich. So wird mit dem Begriff "Objekt" ein Untersuchungsgegenstand bezeichnet, der bei Wechselwirkung mit Licht eine charakteristische Objektantwort aufweist. Der Untersuchungsgegenstand kann ein biologisches Objekt, wie zum Beispiel ein biologisches Gewebe, oder ein nicht-biologisches Objekt, wie zum Beispiel eine Probenanordnung chemischer Substanzen (As- say) umfassen.
Die "Objektantwort" (Response, Spektrum) ist die spektrale Antwortfunktion des Objektes, die beispielsweise spektroskopische Eigenschaften, insbesondere Reflektions-, Transmissions- oder Fluoreszenzeigenschaften, eine Polarisationsantwort, eine Phasenantwortfunktion oder eine Kombination aus diesen, wie zum Beispiel eine weilenlängen- und polarisati- onsabhängige Phasenantwortfunktion umfasst. Neben den Zu- standsbedingungen kann die Objektantwort als variablen Parameter einen Inhomogenitätsfaktor enthalten, der von Abbil- dungs- und Beleuchtungseigenschaften bei der Messung abhängig ist. Die Objektantwort kann z. B. durch eine Interpolation aus spektroskopischen Messergebnissen an einem Modellobjekt ermittelt werden.
Mit dem Begriff "Zustandsbedingungen" (Objekteigenschaften) werden Parameter des untersuchten Objektes bezeichnet, von denen die Objektantwort abhängig ist. Die Zustandsbedingungen umfassen insbesondere Parameter der chemischen Zusammensetzung (z. B. Vorhandensein und/oder quantitativer Anteil einer chemischen Verbindung), geometrische Parameter (z. B. Dimensionen von Strukturen des Objektes) und/oder physikalische Parameter (z. B. Aggregatbildung im Objekt) . Die Zustandsbedingungen sind allgemein im Objekt ortsabhängig, so dass die Objektantwort vom Messort abhängt.
Mit dem Begriff "Systemfunktion" wird eine theoretische Funktion bezeichnet, mit der die Messgrößen in Abhängigkeit von der Objektantwort darstellbar sind. Die Systemfunktion ist eine vorbestimmte theoretische Funktion, die analytisch nach einer Modellierung der Lichtausbreitung bei der Messung am Objekt oder numerisch auf der Grundlage von Tabellenwerten vorliegt. Die konkrete Form der Systemfunktion wird in Abhängigkeit von der Konstruktion der erfindungsgemäß verwendeten Messgrößen gewählt.
Die erfindungsgemäß ausgewerteten Messgrößen basieren auf Messungen am Objekt. Sie werden vorzugsweise aus Messsignalen, die am Objekt erfasst wurden, gebildet. Vorteilhafterweise kann in diesem Fall eine aus den Gesetzen der Lichtaus- breitung bei der Messung konstruierte Abbildungsfunktion als Systemfunktion verwendet werden. Die Messsignale Ar können durch die Abbildungsfunktion F mit Ar = F (S(pi,K),Lr(k)) gemäß
—00 dargestellt werden, wobei S die Objektantwort, Lr die Messbe- dingungen, K(x') ein von Abbildungseigenschaften bei der Messung und insbesondere vom Messort abhängiger Inhomogenitätsfaktor, λ die Wellenlänge, p die Zustandsbedingungen des Objektes, Λ: die Ortskoordinate (Messort) auf dem Objekt und x' die Ortskoordinate auf dem Detektor umfassen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung beruht auf der Variabilität bei der Konstruktion der Messgrößen aus den Messsignalen. Die Messgrößen können in Abhängigkeit von globalen optischen Eigenschaften des Objektes und/oder der Messeinrichtung ge- wählt werden.
So kann gemäß einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Objektantwort den Inhomogenitätsfaktor als variablen Parameter enthalten. Dies ist z. B. der Fall, wenn die spektralen Merkmale des Objektes, welche von den zu erfassenden Zustandbedingungen abhängig sind, durch andere spektrale Abbildungs- oder Beleuchtungsbedingungen überlagert sind. Diese Bedingung tritt bei ophtalmologischen Messungen beispielsweise auf, wenn die Objektantwort von retinalen Blutgefäßen durch die Remission des hinter dem betrachteten Blutgefäß liegenden Fundus überlagert ist.
Wenn die Objektantwort den ortsabhängigen Inhomogenitätsfaktor als variablen Parameter enthält, wird die Abbildungsfunk- tion gemäß Gleichung (1) komplizierter. Von Vorteil ist jedoch, dass in diesem Fall die Messgrößen unmittelbar durch die Messsignale der Messungen am Objekt bereitgestellt werden. Jede Messgröße umfasst ein Messsignal. In diesem Fall umfasst die Berechnung der Zustandsbedingungen eine Anpassung aller Parameter der Objektantwort, welche die Zustandsbedingungen und den Inhomogenitätsfaktor umfassen, derart, dass die Messsignale Ar durch die oben genannte Abbildungsfunktion F (Sφi, K), Ln(K)) repräsentiert werden.
Erfindungsgemäß kann der Inhomogenitätsfaktor mit verschiedenen Ansätzen ermittelt werden. Erstens ist eine Iteration möglich, bei der ausgehend von vorbestimmten Startwerten des Inhomogenitätsfaktors und der Zustandsbedingungen eine wiederholte Anpassung der Parameter in Gleichung (1) erfolgt. Zweitens kann die Ermittlung des Inhomogenitätsfaktors in die Anpassung der Parameter der Objektantwort integriert werden. Drittens kann der Inhomogenitätsfaktor, falls ausreichende Informationen über das Messsystem vorliegen, aus einer vorbestimmten Modellfunktion ermittelt werden. Jede der Varianten
kann in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit der Anpassung und/oder die Rechenzeit haben.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Objektantwort vom Inhomogenitätsfaktor unabhängig sein. Diese Unabhängigkeit ist z. B. bei der Bestimmung der SauerstoffSättigung in einem Blutgefäß mit einem großen Durchmesser (> 300 μm) gegeben. In diesem Fall wird die erfindungsgemäße Ermittlung der Zustandsbedingungen vorteilhafterweise erheblich vereinfacht. Jede Messgröße umfasst einen Signalquotienten qnm = A„/Am aus zwei Messsignalen An, Am, die verschiedenen spektralen Messbedingungen zugeordnet sind, wobei die Systemfunktion durch den Quotienten der Abbildungs- funktionen F (S(pι), Ln(K))IF (S(pt), Lm(k)) gegeben ist. Die Berechnung der Zustandsbedingungen umfasst eine Anpassung der Parameter der Objektantwort derart, dass die Signalquotienten durch den Quotienten der Abbildungsfunktionen repräsentiert werden. Durch die Quotientenbildung ist die Systemfunktion nicht mehr vom Inhomogenitätsfaktor abhängig. Auf die obigen Ansätze zur Ermittlung des Inhomogenitätsfaktors kann verzichtet werden.
Die spektralen Messbedingungen Lr der Messungen, auf denen die Messgrößen basieren, können in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung gewählt werden. Gemäß bevorzugten Varianten der Erfindung umfassen die Messbedingungen Beleuchtungsbedingungen, Detektionsbedingungen oder Kombinationen aus diesen. Die Beleuchtungsbedingungen umfassen eine Beleuchtung des Objektes mit Licht mit vorbestimmten Wellenlängenverteilungen. Die Detektionsbedingungen umfassen eine Detektion des Lichts, das nach der Wechselwirkung mit dem Objekt entsprechend der Objektantwort verändert ist, durch Filter mit vorbestimmten Wellenlängenverteilungen. Die Messung
mit verschiedenen Beleuchtungsbedingungen hat zwei Vorteile. Erstens kann die Belastung des Objektes durch die Beleuchtung, insbesondere bei ophthalmologischen Untersuchungen eine übermäßige Reizung des Auges vermindert werden. Zweitens kann die Intensität der Beleuchtung in verschiedenen Spektralbereichen in Abhängigkeit von der erwarteten Objektantwort gewählt werden. Somit kann der Empfindlichkeitsbereich der verwendeten Kameraeinrichtung besser ausgenutzt werden. Die Messung mit verschiedenen Detektionsbedingungen hingegen kann durch eine Vereinfachung der Messtechnik bei bestimmten Untersuchungsgegenständen von Vorteil sein.
Die spektrale Empfindlichkeit der Kameraeinrichtung kann bei der erfindungsgemäßen Ermittlung von Zustandsbedingungen des Objekts problemlos berücksichtigt werden, indem die spektrale Empfindlichkeit als Beitrag zu den spektralen Messbedingungen Lr betrachtet wird und somit in die Auswertung der Messgrößen eingeht.
Wenn die spektralen Wellenlängenverteilungen (Emissionsspektrum einer Beleuchtungseinrichtung und/oder Transmissionsspektrum eines Filters) mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm gewählt werden, ergeben sich insbesondere Vorteile für die Ermittlung von Zustandsbedingungen, die sich breitbandig auf die Objektfunktion auswirken. Vorzugsweise werden die Wellenlängenverteilungen im Wellenlängenbereich von 200 nm bis 1,5 μm gewählt. Besonders bevorzugt ist der Wellenlängenbereich von 420 nm bis 920 nm, in dem biologisches Gewebe charakteristische spektroskopische Eigen- schaften aufweist.
Da biologische Objekte in der Regel eine komplexe chemische und physikalische Struktur aufweisen, zeichnen sie sich durch eine komplexe Objektantwort aus, die mit herkömmlichen Proze-
duren nicht zuverlässig analysiert werden kann. Dies gilt besonders für lebende biologische Objekte, die einer in vivo- Messung unterzogen werden. Daher ist gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung der Untersuchungsgegenstand ein bio- logisches Objekt, insbesondere ein biologischer Organismus oder ein Teil von diesem. Des Weiteren fehlt es bei biologischen Objekten oft an der Möglichkeit, das Objekt für die Messung zu modifizieren, z. B. durch den Zusatz einer Markersubstanz oder durch eine Temperierung. Dies gilt z. B. für das Auge oder anderes biologisches Gewebe, wie z. B. Nervengewebe oder Gehirngewebe, oder ein Teil von diesen, wie z. B. Blutgefäße (mit dem enthaltenen Blut) , insbesondere retinale Blutgefäße (Arterien, Arteriolen, Venen, Venolen) . So umfassen die Zustandsbedingungen gemäß einer bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung mindestens eine der Durchblutungseigenschaften Sauerstoffgehalt des Blutes, Hämatokrit und Durchmesser von Blutgefäßen. In diesen Fällen ergeben sich besondere Vorteile, da mit der Erfindung schnell und reproduzierbar, ggf. während einer Untersuchung oder einer Operation Daten über Zustandsbedingungen des Objektes verfügbar gemacht werden können, auf deren Grundlage anschließend eine diagnostische Bewertung oder eine Entscheidung über den weiteren Verlauf der Untersuchung oder Operation erfolgen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine hohe Flexibilität in Bezug auf den Zeitpunkt der Ermittlung der Zustandsbedingungen aus den Messgrößen aus. So kann gemäß einer Variante der Erfindung die Bereitstellung der Messgrößen unmittelbar durch die Messungen am Objekt, d. h. durch die Ausgabe der Messsignale, Rohsignale oder ggf. bearbeitete
Rohsignale, aus der Kameraeinrichtung erfolgen. Die Messsignale sind Bildsignale, die mit der Kameraeinrichtung aufgenommen werden. Die Aufnahme unter verschiedenen Messbedingungen kann zeitlich aufeinander (sequentiell) oder gleichzeitig
(parallel) erfolgen. Die Ermittlung der Zustandsbedingungen erfolgt on-line während der Messung.
Gemäß einer abgewandelten Variante der Erfindung kann die Be- reitstellung der Messgrößen durch eine Ausgabe aus einem Datenspeicher, z. B. aus einer Datenbank erfolgen. Die bei den Messungen unter verschiedenen Messbedingungen aufgenommenen Messsignale können zunächst in der Datenbank abgelegt worden sein. Die Bereitstellung der Messgrößen erfolgt dann über ein Computernetzwerk, wie z. B. über das Internet, an eine Auswertungseinrichtung, mit der die gesuchten Zustandsbedingungen ermittelt werden.
Bei der Gestaltung der Messeinrichtung und/oder vor der Be- reitstellung der Messgrößen durch die Messungen ist eine Auswahl der spektralen Messbedingungen mit einer Optimierungsprozedur vorgesehen. Die Optimierungsprozedur umfasst eine Maximierung einer Determinante, die aus einer Funktionalmatrix J (Jacobi-Matrix) berechnet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der theoretischen Objektantwort nach den Zustandsbedingungen enthalten. Die Maximierung der Determinante hat den Vorteil, dass ein echtes Maß für die Fehlerminimie- rung und die Trennbarkeit der Einflüsse der verschiedenen Zustandsbedingungen bereitgestellt wird. Die Optimierungsproze- dur kann alternativ auch bei der o. g. Ausführungsform der Erfindung vorgesehen sein, bei der die Bereitstellung der Messgrößen aus einem Datenspeicher erfolgt.
Die Maximierung der Determinante kann bei der Gestaltung der Messeinrichtung (z. B. Design der Beleuchtungseinrichtung) durch die partielle Differenzierung der Objektantwort ohne Kenntnis der Zustandsbedingungen eines untersuchten Objekts erfolgen. Alternativ kann die Optimierung der spektralen Messbedingungen unmittelbar vor der Messung vorgesehen sein.
Gemäß einer weiteren Alternative können die zuerst bei der Gestaltung der Messeinrichtung ausgewählten spektralen Messbedingungen unmittelbar vor der Messung weiter optimiert werden, wobei ggf. spezifische Eigenschaften des Objekts, wie eine am Objekt gemessene Remission von Gewebe neben Blutgefäßen, berücksichtigt werden.
Erfindungsgemäß kann unmittelbar die Determinante der Funktionalmatrix maximiert werden. Für den allgemeinen Fall, in dem die Anzahl der Messgrößen größer als die Anzahl der gesuchten Zustandsbedingungen ist, die Funktionalmatrix J also nicht quadratisch wäre, ist besonders bevorzugt ist eine Maximie- rung der Größe τJdet(J J) vorgesehen. Das Produkt der Funktionalmatrix J mit ihrer transponierten Matrix f ergibt eine Quadratform. Vorteilhafterweise können somit im Vergleich zur herkömmlichen Technik mehr Messgrößen ausgewertet werden, so dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der erfindungsgemäßen Ermittlung von Zustandsbedingungen verbessert wird.
Wenn gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bei der Maximierung der Größe -^det(J J) mindestens ein vorbestimmter Bereich im Parameterraum der Zustandsbedingungen fest vorgegeben wird, kann die Optimierungsprozedur vorteil- hafterweise beschleunigt werden. Beispielsweise können rea- listische Intervalle der SauerstoffSättigung, des Hämatokrit und/oder der Blutgefäßdimensionen vorgegeben werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Beleuchtungseinrichtung der Messeinrichtung Leuchtdioden, die verschiedene spektrale Emissionen aufweisen. Es können zum Beispiel drei Leuchtdioden mit Emissionsmaxima im Roten (R) , Grünen (G) und Blauen (B) Spektralbereich oder Gruppen von Leuchtdioden mit Emissionen in den R-, G- und B-Bereichen
vorgesehen sein. Die konkret gewünschten Beleuchtungsbedingungen können durch die Betriebsparameter der Leuchtdioden eingestellt werden. Die Leuchtdioden haben den besonderen Vorteil, dass sie eine kompakte Lichtquelle darstellen und leicht steuerbar sind. Es können Leuchtdioden auf der Basis von organischen oder anorganischen Halbleitermaterialien verwendet werden. Alternativ kann die Beleuchtungseinrichtung mit mindestens einem Laser ausgestattet sein. Es kann zum Beispiel ein durchstimmbarer Laser oder eine Gruppe von meh- reren Lasern (z.B. Laserdioden) vorgesehen sein. Die Verwendung von Lasern kann Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit und Stabilität der Wellenlängeneinstellung und der Beleuchtungsintensität haben. Gemäß einer weiteren Variante kann die Beleuchtungseinrichtung mindestens eine Blitzlampe in Kombi- nation mit mindestens einem Filter umfassen. Es kann beispielsweise eine einzige Blitzlampe mit mehreren Filtern zur Einstellung der spektralen Beleuchtungsbedingungen oder alternativ eine Gruppe von Blitzlampen mit verschiedenen Filtern vorgesehen sein. Blitzlampen können Vorteile in Bezug auf die erreichbaren Beleuchtungsintensitäten und die Verfügbarkeit an vorhandenen Messgeräten haben. Gemäß einer weiteren Variante kann eine Kombination der genannten Lichtquellen als Beleuchtungseinrichtung vorgesehen sein.
Die Beleuchtungseinrichtung kann für die Einstellung der oben genannten Beleuchtungsbedingungen, insbesondere die genannten Wellenlängenbereiche eingerichtet sein. Gemäß einer Variante der Erfindung kann es von Vorteil sein, wenn die genannten Lichtquellen, insbesondere die Leuchtdioden oder die Laser mit mindestens einem Filter kombiniert werden. In diesem Fall kann die Wellenlängenverteilung des zur Beleuchtung verwendeten Lichts mit erhöhter Genauigkeit an das zu untersuchende Objekt angepasst und optimiert werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Kameraeinrichtung der Messeinrichtung einen CCD-Sensor. CCD-Sensoren haben den Vorteil, dass die Messsignale der Kameraeinrichtung unmittelbar der erfindungsgemäßen Ermittlung der Zustandsbedingungen unterzogen werden können, ohne das eine Zwischenbearbeitung der Signale erforderlich ist. Des Weiteren kann die spektrale Empfindlichkeit der CCD- Sensoren problemlos als Beitrag zu den spektralen Messbedingungen in die Auswertung der Messsignale integriert werden.
Wenn die Messsignale mit dem CCD-Sensor paarweise unmittelbar vor Beginn und nach Beendigung einer Zwischenspeicher-Phase des CCD-Sensors erfasst werden, in der Ladungszustände von CCD-Elementen des CCD-Sensors in Zwischenspeichern gespei- chert werden, können vorteilhafterweise Fehler vermindert werden, die sich aus einer Bewegung des Objektes zwischen zwei Messungen mit verschiedenen Messbedingungen ergeben würden. Um diesen Vorteil auch bei Messungen zu erhalten, bei denen mehr als zwei verschiedene spektrale Messbedingungen eingestellt werden, ist für die paarweise Erfassung der Messsignale Ar bei aufeinander folgenden Zwischenspeicher-Phasen eine Permutation der spektralen Messbedingungen vorgesehen.
Wegen der bevorzugten Untersuchung biologischer Objekte ist die Messeinrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in ein medizinisches Gerät integriert. Vorzugsweise sind somit die Beleuchtungseinrichtung und die Kameraeinrichtung Teile des medizinischen Messgeräts. Besonders bevorzugt sind die Beleuchtungseinrichtung und die Kameraein- richtung Teile einer Funduskamera, die für ophthalmologische Untersuchungen vorgesehen ist, oder eines Mikroskops, insbesondere eines Operationsmikroskops, das für die Beobachtung während einer mikrochirurgischen Operation eingerichtet ist. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Messeinrichtung in der
Funduskamera oder dem Mikroskop, insbesondere dem Operationsmikroskop, die Funduskamera und das Mikroskop stellen eigenständige Gegenstände der Erfindung dar.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Computer-Programmprodukt, das sich auf einem Computer-lesbaren Speichermedium befindet, mit einem Programmcode zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine Vorrichtung, die ein Computer-lesbares Speichermedium umfasst, das Programmanwei- sungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält.
Die Erfindung basiert gemäß einem dritten Gesichtspunkt auf der allgemeinen technischen Lehre, ein in vi vo-Messverfahren, das am Auge durchgeführt wird, mit einer Beleuchtung des Auges mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs- Wellenlängenbereich und mit einer Fluoreszenzmessung in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich dahingehend weiterzuentwickeln, dass eine weitere Fluoreszenzmessung in einem zwei- ten Emissions-Wellenlängenbereich erfolgt, der vom ersten
Emissions-Wellenlängenbereich abweicht, und dass ein Autofluoreszenzsignal eines bestimmten Pigments im Auge aus Signalen der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen ermittelt wird. Die Fluoreszenzmessungen umfassen die Messungen von ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen entsprechend in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen, wobei beide Messungen mit dem selben Anregungs-Wellenbereich des Anregungslichtes erfolgen. Das Autofluoreszenzsignal wird vorzugsweise mit dem Verfahren gemäß dem o. g. ersten Gesichtspunkt der Erfindung zur Ermittlungen von physiologischen Zustandsbedin- gungen des Auges analysiert.
Der Begriff "Anregungs-Wellenlängenbereich" bezieht sich auf ein Wellenlängenintervall, das eine Vielzahl von Wellenlän-
gen, z. B. aus dem Emissionsspektrum einer Leuchtdiode, oder eine Breite entsprechend einer einzelnen Emissionslinie, z. B. einer Laserdiode oder eines Lasers umfasst. Der Begriff "Emissions-Wellenlängenbereich" bezieht sich auf ein Wellen- längenintervall, das mindestens einen Teilbereich des Fluoreszenzspektrums des Pigments abdeckt. Die Emissions- Wellenlängenbereiche der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen unterscheiden sich voneinander, wobei disjunkte oder teilweise überlappende Intervalle vorgesehen sein können.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Autofluoreszenz eines einzelnen Pigments, z. B. Lipofuszin im Augenhintergrund, von den Emissionen weiterer fluoreszierender Substanzen im Auge zuverlässig und mit hoher Genauigkeit mit nur zwei Fluo- reszenzmessungen erfasst werden kann. Es wurde festgestellt, dass durch eine geeignete Auswahl des Anregungs-Wellenlängen- bereiches die Autofluoreszenz des gesuchten Pigments mit hoher Quantenausbeute angeregt werden kann. Überraschenderweise ist es bei der Fluoreszenzmessung nicht zwingend erforder- lieh, die Fluoreszenzanteile jeder einzelnen fluoreszierenden Substanz separat zu bestimmen. Die Lösung komplexer Gleichungssysteme wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vermieden .
Die Erfindung basiert gemäß einem vierten Gesichtspunkt auf der allgemeinen technischen Lehre, eine Messeinrichtung bereitzustellen, die eine Beleuchtungseinrichtung, die zur Erzeugung des Anregungslichtes und zur Bestrahlung des Auges, insbesondere des Augenhintergrundes eingerichtet ist, und ei- ne Detektoreinrichtung aufweist, die zur spektral aufgelösten Detektion von Fluoreszenzemissionen und zur Bereitstellung von Fluoreszenzsignalen eingerichtet ist. Die Messeinrichtung ist so konfiguriert, dass das Verfahren gemäß dem o. g. dritten Gesichtspunkt der Erfindung ausgeführt werden kann. Vor-
zugsweise fallen ein Anregungs-Strahlengang des Anregungslichtes und ein Emissions-Strahlengang der Fluoreszenzemissionen zumindest abschnittsweise zusammen. Die Detektoreinrichtung ist ferner vorzugsweise mit einem Filterwechsler ausges- tattet, der so konfiguriert ist, dass zwischen zwei Fluoreszenzmessungen Emissions-Filter im Emissions-Strahlengang gewechselt werden können.
Mit der Beleuchtungseinrichtung ist der vorbestimmte Anre- gungs-Wellenlängenbereich einstellbar. Die Beleuchtungseinrichtung umfasst z. B. eine Lichtquelle mit einer Emission im Anregungs-Wellenlängenbereich oder eine Kombination aus einer Lichtquelle und einem Anregungs-Filter, der Anregungslicht im Anregungs-Wellenlängenbereich durchlässt. Besonders bevorzugt umfasst die Beleuchtungseinrichtung eine einzige Lichtquelle, z. B. eine einzige Leuchtdiodenanordnung mit einer einzelnen oder mehreren Leuchtdioden. Der Anregungsfilter ist auch zur Unterdrückung langwelliger Restemissionen der Lichtquelle vorgesehen, die in die Emissions-Wellenlängenbereiche der Fluorophore fallen würden. Die Detektoreinrichtung weist mindestens einen Detektor auf, der mit einem spektral selektiven Element, wie z. B. einem Monochromator oder einem Emissions- Filter ausgestattet ist. Vorzugsweise ist der Detektor für eine ortsaufgelöste Detektion ausgelegt. Hierzu umfasst der Detektor z. B. eine Detektorkamera.
Wenn die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung spektral integrierte Fluoreszenzintensitäten der in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen detektierten Fluoreszenzemissionen umfassen, wird vorteilhafterweise das Nutzsignal relativ zum Hintergrundrauschen verbessert, so dass die Genauigkeit der Fluoreszenzmessung erhöht werden kann.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Autofluoreszenzsignal des zu erfassenden Pigments durch eine Näherungsfunktion (Approximation) ermittelt, die von den Fluoreszenzsignalen der ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen und von den spektralen Messbedingungen während der Fluoreszenzmessungen abhängt. Im Unterschied zu den herkömmlichen Verfahren mit der spektralen Entmischung erfolgt nicht die analytische Lösung eines Gleichungssystems, sondern vorzugsweise die näherungsweise Ermittlung der Appro- ximation. Die Erfinder haben festgestellt, dass für die Fluoreszenzmessung am Auge Näherungsfunktionen verfügbar sind, die überraschenderweise Werte der Autofluoreszenz mit einer extrem hohen Genauigkeit, insbesondere im Vo-Bereich liefern.
Besonders vereinfacht wird die Erfassung des Autofluoreszenzsignals bei der Messung von Lipofuszin, da in diesem Fall die Näherungsfunktion gemäß S = (S2 - l/D ' Si) ' Io ' C gebildet ist. Die Autofluoreszenz S ist insbesondere von den Fluoreszenzsignalen Si und S2 und einem spektralen Mischungsparame- ter D abhängig. Der spektrale Mischungsparameter D ist ein Korrekturfaktor, der einen Näherungswert für den Anteil der Beiträge von nicht interessierenden Fluorophoren im Gesamtsignal der Fluoreszenz darstellt. Der spektrale Mischungsparameter kann aus Referenzmessungen abgeschätzt werden. Typi- scherweise ist der spektrale Mischungsparameter D im Bereich von 2 bis 4, vorzugsweise von 2,5 bis 3,5, z. B. von 2,9 bis 3,1 gewählt. Die Autofluoreszenz S ist ferner von weiteren Parametern der Messeinrichtung, insbesondere einer Normierungsintensität Io und einer Konstante C abhängig, welche die spektralen Messbedingungen, wie z. B. die Einstellung der Detektorkamera relativ zum Auge und Streueigenschaften der Medien im Auge, repräsentiert. Die weiteren Parametern Io und C müssen nicht unbedingt ermittelt werden, da für viele Anwendungen relative Werte der Autofluoreszenz S ausreichend sind.
Die genannte Näherungsfunktion hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie in Abhängigkeit von dem zu erfassenden Pigment und dessen spektralen Eigenschaften leicht an die Bedingungen der konkreten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ange- passt werden kann.
Vorzugsweise wird der Anregungs-Wellenlängenbereich an die Absorption des Pigments angepasst, dessen Autofluoreszenz er- fasst werden soll. Vorteilhafterweise kann damit eine hohe
Quantenausbeute der Fluoreszenzmessung erzielt werden. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der neben der Absorption des Pigments auch die Absorption okularer Medien des menschlichen Auges berücksichtigt wird. Die okularen Medien umfassen die Substanzen, die entlang des Strahlengangs von der Beleuchtungseinrichtung zum Augenhintergrund angeordnet sind. Die Absorption der okularen Medien hat eine Filterwirkung, die sich mit der Wellenlängenverteilung des von der Beleuchtungseinrichtung erzeugten Lichtes überlagert. Durch die Berücksichtigung der effektiven Absorption kann der Anregungs-Wellenlängenbereich vorteilhafterweise optimal an die Absorption des Pigments angepasst werden. Im Ergebnis kann die Quantenausbeute der Fluoreszenzanregung erhöht werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass sich die Wellenlängenintervalle einerseits des Anregungs-Wellenlängenbereiches und andererseits der Emissions-Wellenlängenbereiche nicht überlappen. Vorteil- hafterweise wird dadurch vermieden, dass Licht detektiert wird, dass durch einfache Remission in die Detektoreinrichtung gelangen könnte. Eine unerwünschte Überlagerung der Autofluoreszenz durch die Remission wird vermieden.
Besonders bevorzugt wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Autofluoreszenz des Pigments Lipofuszin erfasst. Es hat sich herausgestellt, dass die Trennung der Lipofuszin-Auto- fluoreszenz von Fluoreszenzemissionen anderer Fluorophore mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einer besonders hohen Genauigkeit möglich ist. Hierzu wird als Anregungs-Wellen- längenbereich vorzugsweise ein Wellenlängenintervall gewählt, dass sich von 400 nm bis 490 nm, besonders bevorzugt von 420 nm bis 480 nm, insbesondere 427 nm bis 477 nm erstreckt. Der erste Emissions-Wellenlängenbereich wird vorzugsweise im Wellenlängenintervall von 495 nm bis 560, besonders bevorzugt 500 nm bis 550, insbesondere 510 nm bis 540 nm gewählt, während der zweite Emissions-Wellenlängenbereich vorzugsweise Wellenlängen oberhalb von 565 nm, besonders bevorzugt ober- halb von 570 nm, insbesondere oberhalb von 590 nm umfasst. Eine Obergrenze des zweiten Emissions-Wellenlängenbereiches kann mit der Empfindlichkeitsgrenze der Detektoreinrichtung im roten oder infraroten Spektralbereich gegeben sein und z . B. 750 nm oder 800 nm betragen.
Für ophtalmologische Untersuchungen ist von besonderem Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Messung der Autofluoreszenz ortsaufgelöst erfolgt. Das Autofluoreszenzsignal wird mit Ortsauflösung erfasst. Hierzu umfasst die Detektoreinrichtung vorzugsweise mindestens eine Detektorkamera.
Ein weiteren Vorteil der Erfindung ergibt sich aus der Variabilität des Zeitschemas der Fluoreszenzmessungen. So können gemäß einer ersten Variante der Erfindung die Fluoreszenzmes- sungen zeitlich aufeinanderfolgend vorgesehen sein. Vorteilhafterweise kann hierzu ein einziger Detektor im Kombination mit verschiedenen Emissionsfiltern zur Einstellung der Emissionswellenlängenbereiche vorgesehen sein. Wenn der Zeitabstand zwischen den Fluoreszenzmessungen geringer als 500 ms,
vorzugsweise geringer als 200 ms, z. B. im Bereich von 80 bis 150 ms ist, werden vorteilhafterweise eventuelle Einflüsse auf die gemessenen Fluoreszenzsignale durch Veränderungen des Auges ausgeschlossen. Gemäß einer zweiten Variante können die Fluoreszenzmessungen in den ersten und zweiten Wellenlängenbereichen gleichzeitig erfolgen, wobei in diesem Fall zwei Detektoren vorgesehen sind, welche Fluoreszenzemissionen vom Auge auf zwei getrennten Strahlengängen erfassen. Bei der zweiten Variante ergibt sich vorteilhafterweise eine verrain- derte Reizung des Auges und eine Verkürzung der Messzeit.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann eine Ermittlung einer Konzentration des Pigments aus dem Autofluoreszenzsignal vorgesehen sein. Die Erfinder haben festgestellt, dass das Autofluoreszenzsignal für eine quantitative Auswertung geeignet ist, bei der die Pigmentkonzentration, insbesondere die Lipofuszin-Konzentration im Augenhintergrund bereitgestellt werden kann. Der ermittelte Konzentrationswert dient als Grundlage für eine sich an- schließende Diagnose, z. B. durch einen Ophtalmologen .
Weitere Vorteile für die Anwendung in der Ophtalmologie ergeben sich, wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung ein Bild des Augenhintergrundes erzeugt wird, in dem das Autofluoreszenzsignal oder die Konzentration des Pigments quantitativ, z. B. durch eine Grauwert- oder Falschfarbendarstellung repräsentiert wird. Es können insbesondere Bereiche, in denen das Autofluoreszenzsignal oder die Konzentration des Pigments vorbestimmte Grenzen überschreiten, eine Markierung des Bildes des Augenhintergrundes vorgesehen sein.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
Figur 1: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens illustriert;
Figur 2: eine schematische Blockdarstellung einer Ausfüh- rungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung;
Figur 3: eine schematische Illustration einer bevorzugten Anwendung der Erfindung;
Figur 4: eine Kurvendarstellung zur Illustration der Konstruktion einer Objektantwortfunktion;
Figur 5: ein Flussdiagramm zur Illustration der Optimierung von spektralen Messbedingungen;
Figur 6: eine schematische Illustration einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung;
Figur 7: ein Flussdiagramm mit einer Illustration wichtiger Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Figur 8: eine graphische Darstellung von unter Berücksichtigung der Transmission okularer Medien im Auge gebildeten Absorptionsspektren verschiedener fluores- zierender Substanzen im Auge; und
Figur 9: eine graphische Darstellung mit Fluoreszenzspektren verschiedener fluoreszierender Substanzen im Auge.
Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die ortsaufgelöste Analyse von Zustandsbedingungen eines biologischen Objektes, insbesondere die Ermittlung der SauerstoffSättigung von retinalen Blutgefäßen des Augenhintergrun- des beschrieben. Die Umsetzung der Erfindung ist nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern entsprechend auch mit anderen biologischen oder nicht-biologischen Objekten möglich. Es sind insbesondere in vivo- oder in vitro-Anwendungen an biologischen Objekten möglich. Alternativ zu der Ermittlung von Zustandsbedingungen des Augenhintergrundes kann erfindungsgemäß beispielsweise die Bestimmung der SauerstoffSättigung und ggf. weiterer Parameter in optisch zugänglichen Gefäßen oder Kapillargebieten in biologischem Gewebe, die Bestimmung der Trübung und ggf. weiterer Parameter der Augen- linse, die Bestimmung physiologischer Parameter der Hornhaut (Cornea) und/oder die Erkennung von verschiedenen Gewebetypen (Ermittlung von Zustandsbedingungen von gesundem Gewebe oder erkranktem Gewebe, insbesondere Tumorgewebe) vorgesehen sein. Beispiele für die Ermittlung von Zustandsbedingungen nicht- biologischer Objekte sind beispielsweise mit der Messung an Halbleiterstrukturen gegeben, bei denen z. B. die Kristallqualität oder die Ladungsträgerkonzentration als Zustandsbedingungen ermittelt werden.
1. Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens
In Figur 1 sind die Hauptschritte bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch illustriert. Einzelheiten, mathematische Grundlagen und die praktische Um- Setzung dieser Schritte werden unten unter Bezug auf die Figuren 2 bis 4 beschrieben.
In einem ersten Schritt Sl ist eine Bereitstellung von Messgrößen vorgesehen, die aus Messsignalen von spektroskopischen
Messungen gebildet sind. Gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können die Messgrößen durch die Messsignale als solche oder durch Quotienten von Messsignalen gebildet werden. Die Bereitstellung der Messgrößen erfolgt unmittelbar durch Messungen am Objekt (Schritt S0.1) oder nach einer Ausgabe der Messsignale von in der Vergangenheit erfolgten Messungen aus einem Datenspeicher (Schritt SO.2) . Die Schritte S0.1 und SO.2 sind nicht zwingende Merkmale der Erfindung, sie werden jedoch bei bevorzugten Anwendungen der Erfindung in Verbindung mit den Schritten Sl und S2 ausgeführt.
Die Messungen umfassen zum Beispiel die Aufnahme von mindestens zwei Objektbildern, insbesondere Reflexionsbildern, unter verschiedenen spektralen Beleuchtungsbedingungen. Jedes Messsignal ist ein Bildsignal mit einer Vielzahl von Bilddaten, die den einzelnen Messorten des auf der Kameraeinrichtung abgebildeten Gebietes zugeordnet sind.
Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es wichtig, dass alle Messsignale (Bildsignale) den selben Bildausschnitt des Objektes abbilden. Falls dies nicht der Fall ist, werden die Teilbilder relativ zueinander ausgerichtet (übereinander gelegt) . Dies kann durch eine paarweise Korrelation der Bildsignale realisiert werden. Hierzu werden an sich bekannte Korrelationsverfahren verwendet, wie zum Beispiel die von W. H. Press et al . in "Numerical Recipes in C++" (Cambridge Uni- versity Press, 2003) beschriebenen Verfahren.
Bei Schritt S2 erfolgt die Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes aus den Messgrößen. In einer Darstellung der Messgrößen als Werte einer Systemfunktion, die von der Objektantwort abhängt, werden variable Parameter der Objektantwort variiert, bis die Werte der Systemfunktion eine Approximation der Messgrößen darstellen. Die Approximation der Mess-
großen durch die Systemfunktion mit den angepassten Parametern der Objektantwort stellt eine Näherung der Werte der Systemfunktion an die Messgrößen dar, die im Rahmen der bei der konkreten Anwendung der Erfindung geforderten Toleranz ausreichend ist. Die angepassten Parameter sind die gesuchten Zustandsbedingungen des Objektes.
Schließlich folgt bei Schritt S3 eine weitere Datenverarbeitung der ermittelten Zustandsbedingungen. Die Datenverarbei- tung kann zum Beispiel mindestens eines von einer Ausgabe, einer Speicherung und einer Visualisierung (Anzeige) der Zustandsbedingungen umfassen. Im Ergebnis werden zum Beispiel gedruckte Daten, gespeicherte Daten oder visuell angezeigte Daten bereitgestellt, welche die Zustandsbedingungen reprä- sentieren. Schritt S3 stellt kein zwingendes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, er wird jedoch gemäß bevorzugten Anwendungen der Erfindung in Kombination mit den Schritten Sl und S2 realisiert. Schritt S3 liefert keine diagnostische Information über das untersuchte Objekt, sondern vielmehr Daten, die anschließend, ggf. nach einer weiteren Datenverarbeitung, zur Ermittlung einer Diagnose unterzogen werden können. Eine diagnostische Datenverarbeitung kann zum Beispiel einen Vergleich mit Referenzdaten und die Ausgabe einer physiologischen Information im Ergebnis des Vergleichs mit den Referenzdaten umfassen.
Die Anzeige der Zustandsbedingungen kann bei ophtalmologi- schen Anwendungen der Erfindung insbesondere die folgenden
Teilschritte umfassen. Auf einem Anzeigegerät, z. B. einem Bildschirm oder einem Drucker der Messeinrichtung wird ein
Fundusbild des Augenhintergrundes dargestellt. Das Fundusbild wird mit einem Parameterbild der ermittelten Zustandsbedingungen überlagert. Es kann eine vollständige Überlagerung des gesamten Fundusbildes mit dem gesamten Parameterbild vorgese-
hen sein. Für praktische Anforderungen genügt jedoch in der Regel eine Teilüberlagerung, bei der das Parameterbild auf einen interessierenden Bereich im Fundusbild, z. B. auf bestimmte Blutgefäße, beschränkt wird. Das Parameterbild um- fasst z. B. eine Falschfarbendarstellung der ermittelten Zu- standsbedingungen . Beispielsweise wird ein Blutgefäß mit einer Falschfarbendarstellung der SauerstoffSättigung im betreffenden Abschnitt des Blutgefäßes überlagert.
2. Ausfϋhrungsformen der Messeinrichtung
Figur 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messeinrichtung 100 mit einer Beleuchtungseinrichtung 10, einer Kameraeinrichtung 20, einer Auswertungs- einrichtung 30 und einer optional vorgesehenen Ausgabeeinrichtung 40. Die Beleuchtungseinrichtung 10 umfasst mindestens eine Lichtquelle, wie zum Beispiel eine Vielzahl von Leuchtdioden, mit der das Objekt 1 mit einer vorbestimmten spektralen Wellenlängenverteilung beleuchtet werden kann. Die Kameraeinrichtung 20 enthält einen CCD-Sensor 21 zur Aufnahme der Messsignale vom Objekt 1. Die Auswertungseinrichtung enthält die erfindungsgemäß vorgesehene Anpassungseinheit 31, mit der die Zustandsbedingungen durch die Anpassung der Parameter der Objektantwort berechenbar sind. Die Ausgabeeinrich- tung umfasst zum Beispiel einen Drucker, einen Datenspeicher und/oder einer Anzeige. Die Teile 10 und 20 können Teil eines Messgerätes sein, wie dies in Figur 3 mit weiteren Einzelheiten gezeigt ist. Die Teile 30 und 40 können Teile einer Steuereinrichtung (Rechner) sein, die in das Messgerät integriert ist.
Gemäß einer bevorzugten Anwendung der Erfindung umfasst das Messgerät eine ophthalmologische Funduskamera 200, die schematisch in Figur 3 gezeigt ist. Die Messeinrichtung 100 mit
der Beleuchtungseinrichtung 10, der Kameraeinrichtung 20 und der Auswertungseinrichtung 30 ist Bestandteil der Funduskamera 200. Die optional vorgesehene Ausgabeeinrichtung 40 kann ebenfalls in die Funduskamera 200 integriert oder wie darge- stellt eine separate Komponente sein.
Die Funduskamera 200 ist zum Beispiel so aufgebaut, wie ein Ringlicht-Ophthalmoskop, das in DE 10 2004 050 807 Al beschrieben ist. So umfasst die Beleuchtungseinrichtung 10 eine ringförmige Lichtquelle 11 mit einer Vielzahl von Leuchtdioden, die in verschiedenen Spektralbereichen emittieren und eine Ophthalmoskoplinse 12, mit der Beleuchtungslicht auf das Auge 1, insbesondere auf den Augenhintergrund 2 gerichtet wird. Die Leuchtdioden haben z. B. die Zentralwellenlängen 463 nm, 521 nm, 624 nm, 642 nm und 815 nm. Die Ophthalmoskoplinse 12 erzeugt ein Bild (Reflexionsbild) des beleuchteten Augenhintergrunds 2, das mit dem Objektiv 22 auf den CCD-Sensor 21 der Kameraeinrichtung 20 abgebildet wird.
Die Auswertungseinrichtung 30 enthält eine Steuereinheit 32, die mit der Anpassungseinheit 31, der Beleuchtungseinrichtung 10 und der Kameraeinrichtung 20 verbunden ist. Die Steuereinheit 32 dient der Auswahl der gewünschten Operationsparameter der Beleuchtungseinrichtung 10, insbesondere der Intensitä- ten, der spektralen Wellenlängenverteilungen und/oder eines Schalttaktes, und der Steuerung der Kameraeinrichtung 20, insbesondere eines Auslestaktes des CCD-Sensors 21. Die Kameraeinrichtung 20 umfasst zum Beispiel eine Schwarz/Weiß- Digitalkamera mit einer Farbtiefe von 12 bit und etwa 106 CCD-Elementen 23 (z. B 1392 * 1040 Pixel), zum Beispiel vom Typ AVT Dolphin 145B (Hersteller Allied Vision Technologies GmbH, Deutschland, Stadtroda) .
Die Auswahl des Schalttakts der Lichtquelle 11 und des Auslesetakts des CCD-Sensors 21 erfolgt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf der Grundlage der folgenden Überlegungen. Wenn für die Aufnahme der Bilder des Objektes (zum Beispiel der Reflexionsbilder des Augenhintergrunds 2) mit verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen wie dargestellt ein einziger Detektor verwendet wird, muss die Aufnahme der Bilder sequentiell erfolgen. Dabei kann es zu Fehlern durch Bewegungen des Objektes (z. B. durch Augenbewe- gungen) zwischen den einzelnen Bildaufnahmen kommen. Um diese Fehler zu minimieren, werden der Schalttakt und der Auslesetakt synchronisiert.
Bei der Bildaufnahme sind abwechselnd Messphasen, in denen CCD-Elemente 23 der CCD-Sensoren 21 lichtsensitiv geschaltet sind, und Zwischenspeicherphasen vorgesehen, in denen die durch den Lichteinfall in den CCD-Elementen 23 erzeugten Ladungsträger in einen Zwischenspeicher verschoben werden (zum Beispiel so genannter "Interline Transfer") . Nach der Zwi- schenspeicherphase wird der CCD-Sensor wieder in die Messphase umgeschaltet, während derer der Zwischenspeicher ausgelesen und gelöscht wird. Typischerweise ist die Dauer der Verschiebung der Ladungsträger in den Zwischenspeicher (z.B. 1 ms) sehr viel kürzer als die Dauer der Messphase (z.B. 60 ms) . Erfindungsgemäß kann die Beleuchtung des Objektes nun so erfolgen, dass am Ende einer ersten Messphase eine Beleuchtung mit einer ersten spektralen Wellenlängenverteilung (z.B. R-Verteilung) und zum Beginn einer nächsten (zweiten) Messphase die Beleuchtung mit einer zweiten spektralen Wellenlän- genverteilung (z.B. G-Verteilung) erfolgt. Die Belichtungszeiten (z.B. 1 ms bis 20 ms) sind erheblich kürzer als die Messphasen .
Durch diese Technik kann der zeitliche Abstand der Aufnahmen der beiden Bilder mit den verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen wesentlich kürzer als die Bildwiederholperiode der Kamera sein. Vorteilhafterweise werden in der Praxis Bildaufnahmen mit einem zeitlichen Abstand von wenigen Millisekunden bis zu wenigen 10 Millisekunden, insbesondere im Bereich von 1 ms bis 60 ms erreicht. Vorteilhafterweise können damit zwei vergleichbare Bilder sogar für bewegte Objekte gewonnen werden, wenn deren Geschwindigkeit ausreichend gering in Bezug auf die Zeitskala des zeitlichen Abstandes der aufgenommenen Bilder ist.
In der Praxis besteht das Interesse, mehr als zwei Bilder unter vergleichbaren Abbildungsbedingungen aufzunehmen. Hierzu wird vorzugsweise die folgende Messung mit einer Permutation der spektralen Beleuchtungsbedingungen realisiert. Die genannte paarweise Erfassung von Bildsignalen (Aufnahme von Doppelbildern) wird mehrfach wiederholt, wobei für jeweils ein Paar von Doppelbildern jeweils eine der beiden verwende- ten spektralen Wellenlängenverteilungen in beiden Doppelbildern verwendet wird. Somit kann ein eventuell auftretender Unterschied in der Abbildung anhand der doppelt verwendeten spektralen Wellenlängenverteilung normiert und kompensiert werden .
Bei der Messung der SauerstoffSättigung in retinalen Blutgefäßen wird diese Permutation mit drei spektralen Verteilungen (R, G, B) wie folgt realisiert. Es wird davon ausgegangen, dass zwei Doppelbilder mit der folgenden Kombination spektra- ler Wellenlängenverteilung aufgenommen wurden: (R, G) und (R, B) . Dabei ergeben sich in Abhängigkeit der auf abhängigen Parameter SauerstoffSättigung, Hämatokrit und Gefäßdurchmesser (s, hund d) die Signale Ar,(s,h,d) , Agi(s,h,d) (erstes Doppelbild) und Ar2(s,h,d), Ab2(s,h,d) (zweites Doppelbild) . Die Teilbilder der
Doppelbilder werden relativ zueinander durch eine paarweise Korrelation der Bildsignale ausgerichtet (übereinander gelegt) . Die Signale werden dann als Messgrößen für die erfindungsgemäße Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes wie folgt bereitgestellt:
Ar(s,h,d) =Arl(s,h,d) Ag(s,h,d) = Agi(s,h,d)
Aλb(/s,hu,dA)\ = -Är\(s'h—'d)-AAb2(/s,hL,dJ)V
Ar2(s,h,d)
Vorteilhafterweise ist es möglich, eine entsprechende Normierung oder Kompensation der Objektbewegung für jede Anzahl von spektralen Wellenlängenverteilungen analog zu realisieren.
Es ist noch anzumerken, dass für die Bildaufnahme im infraroten Spektralbereich (Zentralwellenlänge z. B. 815 nm) eine Doppelbildaufnahme nicht erforderlich ist, da in diesem Spektralbereich keine störende Reizung des Auges vorliegt.
3. Weitere Einzelheiten der Ermittlung der Zustandsbedingungen des Objektes
Die ortsaufgelöste Ermittlung der Zustandsbedingungen durch eine Anpassung der Parameter der Objektantwort basiert auf der folgenden Darstellung der Messgrößen mit einer Systemfunktion .
Das zu untersuchende Objekt 1 hat eine spektrale Antwortfunktion, die hier als Spektrum oder Objektantwort S bezeichnet wird. Die Objektantwort kann zum Beispiel als Reflexionsbild oder als Transmissionsbild vorliegen. Die Objektantwort S(p(x),λ) hängt von n Parametern, der Wellenlänge λ und dem Ort x auf dem Objekt ab. Die n Parameter, welche die gesuchten
Zustandsbedingungen /?, darstellen, werden als Komponenten eines Vektors
zusammengefasst . Alle Parameter im Vektor p können eine Ab- hängigkeit vom Ort x auf dem Objekt aufweisen.
Für die Ermittlung von Zustandsbedingungen biologischen Gewebes kann die Objektantwort in Abhängigkeit von der konkreten Zusammensetzung des Gewebes gebildet werden. Die Objektant- wort wird z. B. auf der Grundlage der Transmission von Hämoglobin gemäß
S = exp{- (sro(λ) + (1 -s) T0(X) ) hd)
gebildet, wobei Fo (λ) der Absorptionskoeffizient von nicht oxygeniertem Hämoglobin, Fi (λ) der Absorptionskoeffizient von oxygeniertem Hämoglobin, s die SauerstoffSättigung, h der Hämatokrit und d die Schichtdicke sind. Die Größen s und hd bilden die zu ermittelnden Zustandsbedingungen des untersuch- ten Objekts. Die Größen F0 (λ) und Fi (λ) sind beispielhaft in Figur 4 dargestellt.
Alternativ ist möglich, dass die Objektantwort mit Hilfe der aufgenommenen Bildsignale erst generiert wird. So spielt ins- besondere bei retinalen Blutgefäßen mit sehr kleinen Gefäßdurchmesser die Reflektivität des Fundusgewebes auf der Rückseite des Blutgefäßes eine wichtige Rolle. Diese Remission kann nach Anwendung einer Bildverarbeitung aus der Remission in der Umgebung des betrachteten Gefäßabschnitts abgeschätzt
und in der Konstruktion der Objektantwort berücksichtigt werden.
Es ist möglich, dass die Objektantwort nur bei einem Teil des abgebildeten Objektes relevant ist. So hat zum Beispiel ein Modell für die Reflexion oder Transmission von Blut in Abhängigkeit von der SauerstoffSättigung, dem Hämatokrit und der Gefäßdicke bei einer Fundusaufnahme nur dort eine Bedeutung, wo sich tatsächlich Blutgefäße auf der Retina befinden.
Die mit der Kameraeinrichtung registrierten Intensitäten (Messsignale) hängen von den spektralen Messbedingungen (insbesondere Beleuchtung- und/oder Detektionsbedingungen) Lr(x), die ihrerseits eine Ortsabhängigkeit aufweisen, und der Ob- jektantwort ab. Ein Gebiet F auf dem Objekt wird mit der Kameraeinrichtung auf ein Gebiet F' auf dem CCD-Sensor abgebildet. Ein Punkt x auf dem Objekt wird dem Punkt x' auf dem CCD-Sensor zugeordnet. Ein Vektor p(x') wird verwendet, um die Parameter des auf den Punkt x' auf dem CCD-Sensor abgebilde- ten Gebiets F auf dem Objekt zu beschreiben. Dies kann unter der vereinfachenden Annahme erfolgen, dass die Parameter über F im Wesentlichen konstant sind.
Die gesuchten Zustandsbedingungen pt(x) (konkrete Objekteigen- Schäften) sind als Parameter in der Objektantwort enthalten. Zur Ermittlung der Zustandsbedingungen werden eine Vielzahl von M Bildern des Objektes mit paarweise verschiedenen spektralen Wellenlängenverteilungen aufgenommen. Die spektralen Wellenlängenverteilungen bilden verschiedene spektrale Messbedingungen, welche durch die Funktionen Lr (λ), r = 0... M - 1beschrieben werden. Die spektralen Messbedingungen können durch verschiedenartige Beleuchtungsbedingungen (z. B. Leuchtdioden mit verschiedenen spektralen Emissionen) , durch
verschiedene Filter vor einer breitbandigen Beleuchtung, durch verschiedene Filter vor der Kameraeinrichtung oder eine Kombination von diesen eingestellt werden.
Wenn M Bilder des Objektes mit den spektralen Verteilungen Lr(λ) aufgenommen werden, so werden M Messsignale Ar(p(x')) in jedem Punkt x' des auf den CCD-Sensor abgebildeten Objektes bereitgestellt. Für eine gegebene Messbedingung Lr(λ) existiert somit für jeden Punkt x'eine Funktion, die den Parame- tervektor p(x) auf Ar(p(x')) abbildet . Unter der Annahme, dass ein Punkt x auf dem Objekt bei der Bildaufnahme mit der Messbedingung Lr (λ) im Gebiet F anteilmäßig mit einer Funktion I(x) auf den Punkt x' auf dem CCD-Sensor abgebildet wird und das sich die Objektantwort S(p(x), λ) im auf x' abgebildeten Gebiet F nur geringfügig ändert, d.h. überF hinweg kann der Parametervektor p innerhalb der Messunsicherheit als konstant angenommen werden, berechnet sich Ar(p(x')) gemäß der oben genannten Gleichung (1) :
-OO
wobei J/ (x)dx den oben genannten Inhomogenitätsfaktor K dar- F stellt. Gleichung (Ia) zeigt den Funktionszusammenhang zwischen dem Messsignal Ar(p(x')) und der Objektantwort S sowie den Messbedingungen Lr(λ) gemäß Ar = F(S(pt, A)Lr(A)), wobei F als Ab- bildungsfunktion bezeichnet wird.
Während Gleichung (Ia) den funktionalen Zusammenhang speziell zwischen den Messsignalen und der Objektantwort sowie den
Messbedingungen mit der Abbildungsfunktion darstellt, können allgemein Messgrößen, die aus Messsignalen berechnet sind, durch eine Systemfunktion dargestellt werden, die aus der Abbildungsfunktion F konstruiert ist. Die Konstruktion der Messgrößen aus den Messsignalen und der Systemfunktion aus der Abbildungsfunktion stellt zwar zunächst einen Zusatzaufwand dar. Sie kann jedoch bei der Ermittlung der Zustandsbe- dingungen des Objektes zu einer erheblichen Vereinfachung führen, wie unten erläutert wird.
In jedem Fall basiert die erfindungsgemäße Ermittlung der Zu- standsbedingungen auf einer Anpassung, insbesondere eine iterative Variation oder eine numerische Approximation, der in der Abbildungsfunktion F oder allgemein einer daraus kon- struierten Systemfunktion enthaltenen Komponenten des Parametervektors, bis die Messsignale (oder allgemein Messgrößen) durch die Abbildungsfunktion oder Systemfunktion angenähert werden .
Im folgenden werden zwei unterschiedliche Fälle behandelt, die bei der praktischen Umsetzung der Erfindung bevorzugt realisiert werden. Die beiden Fälle unterscheiden sich darin, ob die Objektantwort selbst vom Inhomogenitätsfaktor K =
J/ (x)dx abhängt oder von diesem im Wesentlichen unabhängig F ist.
Im ersten Fall (S(p(x), λ, K)) werden die gesuchten Zustandsbedin- gungen (Komponenten des Parametervektors) unmittelbar durch die Anpassung in Gleichung (Ia) ermittelt, wie im Folgenden dargestellt wird.
Die Objektantwort S kann neben den Parametern ptfx) auch von weiteren, zunächst unbekannten Größen abhängen (R(A)) abhängen. Oft sind diese Größen aber durch die Messung bestimmbar. So hängt die Objektantwort von Vollblut in retinalen Blutge- fäßen nicht nur von den Parametern SauerstoffSättigung (s) , Gefäßdurchmesser (d) und Hämatokrit (A) , sondern auch von der Remission (Rbg(λ)) des Gewebes ein, das sich hinter den Blutgefäßen befindet. Diese Remission ist individuell verschieden und somit zum Zeitpunkt der Messung unbekannt. Eine Messung von Rbg(λ) kann aber neben dem betrachteten Gefäß erfolgen, da Rbg(λ) eine geringe Ortsabhängigkeit (im Verhältnis zum Gefäßdurchmesser) aufweist. Das neben dem Gefäß messbare Signal ist aber nicht Rbg (λ) sondern
-OO
Der hier auftretende Term \I (x)dxkann im allgemeinen nicht
F durch eine einfache Quotientenbildung wie in Gleichung (Ia) eliminiert werden (siehe unten) . Vielmehr muss der Term
Gemäß einem ersten Lösungsansatz ist zur Ermittlung des Terms
\I (x)dx eine Schätzung von \I (x)dxvorgesehen, die auf Ein- F F gangswerten für die Parameter pι(x) beruht.
Mit dem geschätzten Wert für 17 (x)dx können dann die Parame-
F ter bestimmt werden. Mit diesen neuen bestimmten Parametern
wird dann 17 (x)dxneu festgelegt. Dieses Verfahren wird ite- F
riert, bis der für J/ (x)dxgefundene Wert konvergiert (d. h.
F eine vorbestimmte absolute oder relative Toleranz wird erreicht) .
Oft ist es möglich, wie Messung unter anderem in einem Spekt- ralbereich durchzuführen, in dem sich die Objektantwort vereinfachen lässt. Führt diese Vereinfachung auf eine lineare
Abhängigkeit von R, kann der Term J/ (x)dx durch diese Messung
F bestimmt und für die Berechnungen der Objektantwort in dem anderen Spektralbereich verwendet werden. Auch diese Methode beruht wie oben beschriebenen auf Eingangswerten für die Parameter pt(x) .
Gemäß einem zweiten Lösungsansatz wird die Größe 17 (x)dxals
F weiterer Parameter in die Anpassungsaufgabe zur Ermittlung der Zustandsbedingungen integriert. Der Ausgangswert für die numerische Bestimmung kann durch eine einfache (eindimensionale, z. B. Standard least square-Verfahren) Bestimmung des
besten 17 (x)dxfür: die Startparameter pι(x) (noch ohne F
J/ (x)dx festgelegt werden. F
Lässt sich die Objektantwort der Größen Rbg(λ) durch eine Modellfunktion beschreiben, kann gemäß einem dritten Lösungsan¬
satz J/ (x)dxühez die Verwendung dieser Modellfunktion und F der neben dem Gefäß gemessenen Werte berechnet werden. Eine Variante dieses Lösungsansatzes beinhaltet eine Iteration
(ähnlich der iterativen Anpassung von J/ (x)dxim ersten Lö-
F sungsansatz) zur Anpassung von Parametern, welche die Modellfunktion der Größen Rbg(λ) beschreiben.
Wenn im zweiten Fall die Objektantwort S vom Inhomogenitätsfaktor unabhängig ist, vereinfacht sich die Ermittlung der Zustandsbedingungen . Bei dieser Ausführungsform der Erfindung werden als Messgrößen Quotienten qnm(p(x')) der Messsignale Ar(p(x')) gebildet:
In diesem Fall wird die Systemfunktion durch die Quotienten der oben genannten Abbildungsfunktion für die verschiedenen Messungen n, m gebildet. Vorteilhafterweise kürzt sich der
Term \I(x)dx in diesem Fall aus der Funktionsdarstellung der F
Messgrößen heraus. Dies gilt insbesondere unter der Voraussetzung, dass die Beleuchtungsunterschiede an jedem Punkt x des Objektes für alle Messbedingungen Lr(λ) gleich sind und das Inhomogenitäten in der Abbildung für alle verwendeten spektralen Messbedingungen ebenfalls als gleich angenommen werden können. Da in der Realität Identität praktisch nicht erreichbar ist, wird hier unter Gleichheit eine im Rahmen der Messgenauigkeit oder der gewünschten Genauigkeit für die Be-
rechnung der Zustandsbedingungen ausreichende Übereinstimmung verstanden.
Unter der Voraussetzung, dass die Signale Ar(p(x')) für alle re- levanten Werte für p(x') linear unabhängig sind, lassen sich M-I linear unabhängige Signalquotienten qnm finden. In der Praxis können häufig Einschränkungen für p(x') auf realistische Parameterbereiche angegeben werden. Die genannte Voraussetzung für die relevanten Werte soll somit für alle p(x') gelten, die innerhalb dieser Einschränkung liegen. So kann beispielsweise die SauerstoffSättigung des Bluts nie größer als 1 werden. Es können auch mehrere relevante Bereiche für p(x') angegeben werden, die sich überschneiden können.
Zur Ermittlung der gesuchten Zustandsbedingungen werden die
Parameter in Gleichung (3) variiert, bis die Signalquotienten qnm durch die dargestellte Systemfunktion repräsentiert werden .
Die Anpassung der Parameter in der Objektantwort gemäß den oben genannten Ausführungsformen, d.h. in der Abbildungsfunktion oder in dem Quotienten der Abbildungsfunktionen erfolgt mit an sich bekannten numerischen Verfahren, wie zum Beispiel durch das Newton-Rhapson-Verfahren, das Powell-Verfahren, den Levenberg-Marquard-Algorithmus oder die Methode der konjugierten Gradienten (siehe z. B. obige Publikation von W. H. Press et al. ) .
Es werden zum Beispiel numerische Verfahren zur mehrdimensio- nalen Nullstellenbestimmung verwendet. In Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung kann eine Optimierung der numerischen Standardverfahren vorgesehen sein. Dies kann in Verbindung mit der Auswertung der Bildsignale bei mehrdimensionaler Abbildung (z.B. 2D-BiId) erfolgen. So kann zum
Beispiel bei RGB-Aufnahmen des Augenhintergrundes durch eine Bilderkennung, vorzugsweise an einer Aufnahme im grünen Spektralbereich, zunächst die Lage der Gefäße und die Gefäßdicke festgestellt werden. Im Anschluss kann dann die Gefäß- dicke als Startwert für die erfindungsgemäße spektrale Auswertung verwendet werden. Nachfolgend kann man weitere Startwerte für die SauerstoffSättigung und den Hämatokrit festlegen. Durch eine stückweise Linearisierung der Objektantwort und eine anschließende Anpassung der Parameter lassen sich in wenigen Iterationsschritten die lokal gültigen Werte für die Sauerstoffsättigung, die Gefäßdimension und den Hämatokrit ermitteln .
4. Optimierung der spektralen Messbedingungen
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Optimierung der spektralen Messbedingungen vorgesehen, um die gesuchten Zustandsbedingungen des Objektes mit möglichst hoher Sicherheit zu bestimmen. Hierzu wird vor der Messung am Objekt (Schritt 0.1 in Figur 1), insbesondere beim Design der Messeinrichtung, nach dem folgenden Verfahren eine Determinante maximiert, die von einer Funktionalmatrix abgeleitet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der theoretischen Objektantwort nach den Zustandsbedingungen um- fassen. Dieses Verfahren wird im Folgenden unter beispielhaften Bezug auf die Rechnung mit Quotienten q*ι ( J SLrdλ/ \SL„dλ ) auf der Basis der theoretischen Objektantwort für paarweise verschiedene Messbedingungen Lr,g beschrieben.
Es wird die Abbildung P : (p(x'))→(q*i,ie{0,...,k-l}) betrachtet. Die
Quotienten q*t sind aus der Menge der Quotienten q*nm so auszuwählen, dass sie linear unabhängig sind (es gilt: k<_M) . Mit der bekannten Objektantwort S kann die Funktionalmatrix
(Jakobimatrix) J der Abbildung P unter Verwendung der Gleichungen (Ia) und (3) berechnet werden:
Die Elemente von p£t',) können nur dann berechnet werden, wenn die Gesamtzahl k der ausgewählten Quotienten q*ι größer oder gleich der Anzahl N der zu ermittelnden Zustandsbedingungen und kleiner oder gleich der Anzahl M der aufgenommenen Bilder ist (N<k< M) . Für den Spezialfall N = k ist die Matrix J quadratisch. In diesem Fall werden die spektralen Messbedingungen Lr so gewählt, dass die Determinante der Funktionalmatrix J maximal wird. Für den in der Praxis häufiger auftretenden Fall N≠k ist die Funktionalmatrix J nicht quadratisch. In diesem Fall wird der Ausdruck -\]det(J J) in den Punkten der oben beschriebenen relevanten Gebiete im Raum der Elemente von p(x') durch die geeignete Wahl der spektralen Wellenlängenverteilungen maximiert, die für die Messungen verwendet werden. In diesem Fall ist die Bestimmung der Komponenten von p(x') aus den aufgenommenen Bildern in der Umgebung des jeweils betrachteten Punktes mit maximaler Genauigkeit möglich. Dabei ist ^det(J J) ein Maß für die Eindeutigkeit der Bestimmung der Komponenten von p(x') .
In Figur 5 ist ein Verfahren zur Maximierung von -^det(J J)
für den Fall N ≠ k dargestellt (Maximierung von ydet(J J) ) . Für N = k wird die Größe \det(J)\ maximiert.
Für die Maximierung von
werden zuerst die Objektantwort S (Schritt SOl) und n spektrale Verteilungen Lr (Schritt S02) bereitgestellt. Auf der Grundlage der Objekt- dq*i antwort S werden die partiellen Ableitungen berechnet dpj
(Schritt S03) und in Bezug auf die Wellenlänge integriert, wobei eine Wichtung mit den aktuellen spektralen Verteilungen Lr vorgesehen ist (Schritt S04) . Die Berechnung der partiellen Ableitungen bei Schritt S03 kann analytisch oder numerisch erfolgen. Es ist bevorzugt, dass die verwendete Modellfunktion in den relevanten Parameterbereichen einfach diffe- renzierbar ist. Alternativ kann eine numerische Differentiation (z. B. bei tabellarischen oder interpolierten Werten) vorgesehen sein.
Anschließend werden die Funktionalmatrix J (Schritt S05) und die Größe
(Schritt S06) berechnet. Bei Schritt S07
wird abgefragt, ob die Größe ^det(J J) ein Maximum erreicht hat. Falls dies nicht der Fall ist, werden die spektralen Verteilungen Lr variiert und für eine wiederholte Abarbeitung der Schritte S04 bis S06 bereitgestellt. Falls die Größe tjdetfj J) ein Maximum erreicht hat, werden die aktuellen spektralen Verteilungen gespeichert und zur Ansteuerung der Messeinrichtung 100 (siehe zum Beispiel Figur 3), insbesondere zur Ansteuerung der Lichtquelle 11 verwendet.
Falls N < k gilt, so sind die Zeilen der Funktionalmatrix nicht voneinander unabhängig. In diesem Fall ist es möglich, k— N Größen, die nicht unmittelbar mit dem Problem zusammenhängen, in die Optimierung der spektralen Verteilungen einzu- beziehen. Derartige Größen sind zum Beispiel weitere Eigenschaften des optischen Aufbaus, sowie der Preis der zur Erzeugung der spektralen Verteilung benötigten Komponenten (Lichtquellen, Optiken und dergleichen) .
Ort (repräsentiert durch p) im Parameterraum unterscheiden. In diesem Fall wird aus den unterschiedlichen Werten für
■ydet(J J) ein Mittelwert gebildet, der dann maximiert werden kann. Diese Mittelwertbildung kann gewichtet erfolgen, um be- sonders relevante Punkte im Rahmen der Komponenten von p besonders zu berücksichtigen oder um Bereiche von verminderter Bedeutung wenig oder nicht zu berücksichtigen. In einem Gebiet im Raum der Komponenten von p ist deren Bestimmung aus den aufgenommenen Bildern dann eindeutig möglich, wenn das Vorzeichen von det(JτJ) im gesamten betrachteten Bereich gleich ist.
5. Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin im Augenhintergrund
Ausführungsformen der dritten und vierten Gesichtspunkte der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin im Augenhintergrund beschrieben. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern entsprechend zur Erfassung der Autofluoreszenz anderer Pigmente im Auge oder anderen biologischen Proben, insbesondere in vivo-Proben möglich. Einzelheiten der Anregung des Pigments und der Fluo-
reszenzmessung werden im Folgenden nicht beschrieben, soweit diese Techniken bereits von den herkömmlichen spektroskopischen Messverfahren bekannt sind.
Figur 6 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Messeinrichtung 100, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist und eine Beleuchtungseinrichtung 10, eine Detektoreinrichtung 20 und eine Steuereinrichtung 30 um- fasst. Für die bevorzugte Anwendung der Erfindung bei der Er- fassung von Lipofuszin im Augenhintergrund ist die Messeinrichtung 100 vorzugsweise auf der Basis einer an sich bekannten Funduskamera gebildet, die mit einer angepassten Lichtquelle ausgestattet und für einen Filterwechsel konfiguriert ist (siehe unten) .
Die Beleuchtungseinrichtung 10 umfasst eine Lichtquelle 11 und einen Anregungs-Filter 12. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere für die Erfassung von Lipofuszin, umfasst die Lichtquelle 11 eine einzige Leucht- diode, insbesondere eine einzige im blauen Spektralbereich emittierende Leuchtdiode (z. B. Leuchtdiode "OSRAM Ostar blue" vom Typ "LE B A2A"), z. B. mit einer maximalen Emission λmax im Bereich von 455 nm bis 465 nm. Der Anregungsfilter 12 ist zur Anpassung des Anregungs-Wellenlängenbereiches, insbe- sondere zur Unterdrückung langwelliger Restemissionen der Lichtquelle, die in die Emissions-Wellenlängenbereiche der Fluorophore fallen würden, vorgesehen. Die langwelligen Emissionen werden vorzugsweise auf einen Wert unterhalb von 1 % relativ zur maximalen Emission der Leuchtdiode unterdrückt.
Die Lichtquelle 11 kann alternativ z. B. eine Breitband- Weißlichtquelle umfassen. In diesem Fall ist der Anregungs- Filter 12 dazu eingerichtet, Anregungslicht mit einem Spektrum im gewünschten Anregungs-Wellenlängenbereich aus dem
Breitbandspektrum der Weißlichtquelle auszuschneiden. Alternativ kann die Lichtquelle 11 eine Anordnung von Leuchtdioden oder Laserdioden umfassen, welche in gleichen oder verschiedenen Spektralbereichen emittieren. Es können z. B. zwei oder mehr im blauen Spektralbereich oder in verschiedenen Spektralbereichen emittierende Leuchtdioden vorgesehen sein. Die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts kann durch die Ansteuerung der Leuchtdioden oder Laserdioden gebildet werden, wobei der Anregungs-Filter 12 für eine Feinanpassung des Spektrums des Anregungslichts an die Absorption des zu erfassenden Pigments vorgesehen sein kann. Wenn die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts durch die Ansteuerung schmalbandiger Leuchtdioden oder Laserdioden gebildet wird, könnte der Anregungsfilter 12 weggelassen werden.
Das Anregungslicht wird von der Lichtquelle 11, ggf. mit dem Anregungs-Filter 12 über einen Strahlteilerspiegel 13 auf dem Anregungs-Strahlengang 14 zum Auge 1, insbesondere zum Augenhintergrund 2 gelenkt. Der Anregungs-Filter 12 umfasst z. B. einen Filter vom Typ Semrock FF01-457/50. Zur Ausleuchtung können auf dem Anregungs-Strahlengang 14 weitere optische Komponenten, z. B. eine Abbildungsoptik vorgesehen sein (nicht dargestellt) .
Die Detektoreinrichtung 20 umfasst eine Detektorkamera 21 und zwei Emissions-Filter 22, die abwechselnd mit einem Filterwechsler 23 mit der Detektorkamera 21 kombinierbar sind. Die Detektorkamera 21 umfasst vorzugsweise eine CCD-Kamera. Es kann z. B. eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera, wie eine "Dolphin 145 B", Hersteller: Allied Vision Technologies (AVT), vorgesehen sein, um Fluoreszenzemissionen aus dem Auge ortsaufgelöst zu erfassen. Alternativ kann eine Farb-CCD-Kamera vorgesehen sein. Ein Emissions-Strahlengang 24 verläuft vom Auge 1, insbesondere vom Augenhintergrund 2 über den Strahlteiler-
Spiegel 13 und einen der Emissions-Filter 22 zur Detektorkamera 21.
Die Emissionsfilter 22 sind so gewählt, dass Fluoreszenzlicht in den gewünschten Emissions-Wellenlängenbereichen zum Detektor 21 durchgelassen wird. Die Emissions-Filter 22 umfassen z. B. optische Standardfilter (Typ: Semrock FF01525/50 und Schott OG570) . Der Filterwechsler 23 umfasst bspw. ein Filterrad oder einen Filterschlitten.
Die Steuereinrichtung 30 umfasst einen elektronischen Schaltkreis, z. B. einen Steuerungscomputer, der zur Verarbeitung von Signalen (Betriebszustands-Signale, Messsignale) der Komponenten 10, 20 und zur Bereitstellung von Steuersignalen eingerichtet ist. Die Steuereinrichtung 30 ist insbesondere mit der Lichtquelle 11, dem Detektor 21 und dem Filterwechsler 23 verbunden. Die Steuereinrichtung 30 enthält auch einen Rechnerkreis, mit dem die Autofluoreszenz aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten berechnet werden kann. Des Weiteren ist die Steuereinrichtung 30 mit einer Anzeigeeinrichtung, z. B. einem Anzeigebildschirm, einer Ausgabeeinrichtung, wie z. B. einem Drucker, und einer Nutzerschnittstelle, wie z. B. einer Tastatur, verbunden (nicht dargestellt) .
Das erfindungsgemäße Verfahren, das vorzugsweise mit der Messeinrichtung 100 gemäß Figur 6 durchgeführt wird, ist schematisch in Figur 7 illustriert.
Bei einem ersten Schritt Sl wird die Beleuchtung des Auges 1 aktiviert. Bei der Beleuchtung wird Anregungslicht, das einen vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich λex aufweist, auf dem Anregungs-Strahlengang 14 zum Auge 1 gelenkt (Figur 6) . Die Aktivierung der Lichtquelle 11 bedeutet, dass die Lichtquelle 11 für die folgenden Schritte S2 und S3 für einen
Pulsbetrieb vorbereitet oder für einen permanenten Betrieb eingeschaltet wird.
Vorzugsweise ist der Pulsbetrieb vorgesehen, bei dem die Lichtquelle 11 bei den Schritten S2 und S3 pulsförmig betätigt wird. In diesem Fall wird die Reizung des Auges minimiert. Die pulsförmige Betätigung der Lichtquelle 11 erfolgt mit einem vorbestimmten Zeitabstand, in dem sich die Messbedingungen nicht oder möglichst wenig ändern.
Bei Schritt S2 erfolgt eine erste Fluoreszenzmessung in einem ersten Emission-Wellenlängenbereich λem,i. Hierzu wird das durch die z. B. pulsförmige Betätigung der Lichtquelle 11 angeregte Fluoreszenzlicht vom Augenhintergrund 2 auf dem Emis- sions-Strahlengang 24 zur Detektorkamera 21 gelenkt.
Anschließend folgt bei Schritt S3 eine zweite Fluoreszenzmessung mit einem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich λem,2/ der vom ersten Emissions-Wellenlängenbereich λem,i abweicht. Die Einstellung des zweiten Emissions-Wellenlängenbereiches λem,2 erfolgt durch Einsetzen des zweiten Filters 22 mit dem Filterwechsler 23 in den Emissions-Strahlengang 24. Der Filterwechsler 23 wird mit einem Schrittmotor betätigt, welcher einen Filterwechsel innerhalb des gewünschten Zeitabstandes zwischen den Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Die Wellenlängenbereiche sind so gewählt, dass eine Überlappung des Anre- gungs-Wellenlängenbereiches λex mit einem der Emissions- Wellenlängenbereiches λem, i und λem,2 vermieden wird.
Bei den ersten und zweiten Fluoreszenzmessungen werden von den einzelnen Pixeln der Detektorkamera 21 spektral integrierte Fluoreszenzintensitäten aufgenommen, die charakteristisch für die Fluoreszenzemissionen in den ersten und zweiten
Emissions-Wellenlängenbereichen sind. Die integrierten Fluoreszenzintensitäten bilden Fluoreszenzsignale Si, S2, auf deren Grundlage bei Schritte S4 in der Steuereinrichtung 30 für jedes Pixel ein Autofluoreszenzsignal S berechnet wird.
Anschließend folgt bei Schritt S5 einer der Teilschritte einer Datenverarbeitung der ermittelten Autofluoreszenz, einer Datenspeicherung, z. B. in der Steuereinrichtung 30 und einer Anzeige eines Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes, z. B. durch eine Grauwert- oder Falschfarbendarstellung.
Die Figuren 8 und 9 illustrieren spektroskopische Eigenschaften von Lipofuszin und weiteren Pigmenten im Augenhintergrund, auf deren Grundlage die Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin erfolgt (siehe D. Schweitzer et al . "Towards Metabolie Mapping Retina" in "Microscopy Research And Tech- nique" Bd. 70, 2007, S. 410 - 419) . Figur 8 zeigt die Spektren der Absorption A (willkürliche Einheiten) von Lipofuszin (A2E) und der Pigmente AGE (so genannte "Advanced Glycitation End Products", die z. B. Carboxy-Methyllysin (CML), Carboxy- Ethyllysin (CEL) und Argpyrimidine umfassen) und FAD (so genanntes "Flavindinucleotid" ) , jeweils multipliziert mit der Transmission der okularen Medien im Auge (TOm) • Der erfindungsgemäß bevorzugte Anregungs-Wellenlängenbereich λex, der sich z. B. von 427 nm bis 477 nm erstreckt, ist in Figur 8 mit einem Balken markiert. Vorteilhafterweise stimmt der Anregungs-Wellenlängenbereich im Wesentlichen mit dem Absorptionsmaximum des zu untersuchenden Pigments Lipofuszin überein .
Figur 9 zeigt die normierten Intensitäten I der Fluoreszenz- Emissionen von Lipofuszin (A2E) und den Pigmenten AGE und FAD in Abhängigkeit von der Wellenlänge λ. Die bevorzugt realisierten Emissions-Wellenlängenbereiche λem, 1 und λem,2 sind
ebenfalls in Figur 9 illustriert. Sie erstrecken sich entsprechend in den Wellenlängenintervallen von 500 nm und 550 nm und oberhalb von 570 nm. Die Figuren 8 und 9 illustrieren als wichtiges Merkmal, das insbesondere für die näherungswei- se Erfassung der Autofluoreszenz eines interessierenden Pigments ausgenutzt wird, eine relativ gute Übereinstimmung der Anregungs- und Emissions-Spektren der übrigen Pigmente (hier z. B. AGE, FAD), die nicht das interessierende Pigment darstellen (hier z. B. A2E) .
Mit der Messung der Fluoreszenzsignale Si im ersten Emissi- ons-Wellenlängenbereich λem,i und S2 im zweiten Emissions- Wellenlängenbereich λem,2 wird das Autofluoreszenzsignal S von Lipofuszin gemäß S(x) = (S2(X) - l/D Si(X)) - Io ' C mit dem spektralen Mischungsfaktor D « 3 berechnet.
Dabei ist Io die bei einer Einzelmessung eingestrahlte Lichtintensität. Falls bei den ersten und zweiten Fluoreszenzmes- sungen verschiedene Lichtintensitäten verwendet werden, wird auf eine gemeinsame Lichtintensität normiert. C ist eine Konstante, die insbesondere von den eingesetzten Filtern (12, 22) und dem Spektrum der Lichtquelle 11 abhängt. Die Konstante C kann durch Kalibrierungsmessungen ermittelt oder als theoretischer Normierungswert eingeführt werden, x ist allgemein eine zweidimensionale Ortskoordinate des Bildes vom Augenhintergrund. Bei der Anzeige des Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes kann die Grauwert- oder Falschfarbendarstellung von Relativwerten der Autofluoreszenzsignale vorge- sehen sein, so dass die Werte I0 und C nicht ermittelt werden müssen .
Praktische Anwendungen der Erfindung ergaben eine Erfassung der Autofluoreszenz von Lipofuszin mit einem Resteinfluss der
Pigmente AGE und FAD in der Größenordnung von 1 V». Die Messung erfolgte mit einer Quantenausbeute, die um den Faktor 12 gegenüber der von R. J. Spaide vorgeschlagenen Methode größer ist.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Claims
1. Verfahren zur Ermittlung von Zustandsbedingungen p,(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), mit den Schritten:
- Bereitstellung einer Vielzahl von Messgrößen aus Messungen am Objekt (1) , wobei die Messgroßen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von einer Objektantwort S(p„λ) des Objektes (1) und von spektralen Messbedingungen Lr(k) der Messungen darstellbar sind, wobei die Objektantwort S(p,, λ) die Zustandsbedingungen p, als Parameter enthält, und
- Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) aus den Messgroßen, wobei - die Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(ptλ) derart umfasst, dass die Messgrόßen durch die Systemfunktion repräsentiert werden,
- die Messgrόßen aus Messsignalen Ar aus den Messungen am Objekt (1) gebildet sind, - die Messsignale Ar durch eine Abbildungsfunktion Ar= F (S(p,, λ) , Lr(k)) darstellbar sind gemäß
-CO wobei K(x) ein von Abbildungseigenschaften bei den Messungen abhangiger Inhomogenitätsfaktor ist, und - jede Messgroße ein Messsignal Ar umfasst und die Systemfunktion durch die Abbildungsfunktion f(S(phλ), Lr(k)) gegeben ist, dadurch gekennzeichnet:, dass - die Objektantwort S(p„X) den Inhomogenitatsfaktor K(x') als weiteren Parameter enthalt, und
- die Berechnung der Zustandsbedingungen p, eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) derart umfasst, dass die Messsignale Ar durch die Abbildungsfunktion F(S(p,X), Lr(k)) repräsentiert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem
- der Inhomogenitatsfaktor K durch eine Iteration, bei der von vorbestimmten Startwerten K', pt' ausgegangen wird, bei der
Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) oder aus einer vorbestimmten Modellfunktion ermittelt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem - die Objektantwort S(P11X) vom Inhomogenitatsfaktor K(x') unabhängig ist,
- jede Messgroße einen Signalquotienten qnm=A„/Am aus zwei Messsignalen An, An, umfasst, die verschiedenen spektralen Messbedingungen Ln(K), Ln, (K) zugeordnet sind, und die Systemfunk- tion durch den Quotienten der Abbildungsfunktionen F (S(pt,K), Ln(K))ZF (S(pt, λ),Lm(λ)) gegeben ist, und
- die Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) eine Anpassung der Parameter der Objektantwort S(p„λ) derart umfasst, dass die Signalquotienten qnm durch den Quotienten der Abbildungs- funktionen repräsentiert werden.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die spektralen Messbedingungen Lr(K) umfassen : - Beleuchtungsbedingungen mit vorbestimmten spektralen WeI- lenlangenverteilungen, und/oder
- Detektionsbedingungen mit vorbestimmten spektralen Wellen- langenverteilungen .
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem
- die spektralen Wellenlängenverteilungen mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm im Wellenlängenbe- reich von 200 nm bis 1,5 μm gewählt sind.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
- das Objekt (1) ein biologischer Organismus oder ein Teil von diesem ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem
- das Objekt (1) ein Auge oder ein biologisches Gewebe oder ein Teil von diesen, insbesondere der Augenhintergrund (2) ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem
- das Objekt (1) retinale Blutgefäße umfasst.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem
- die Zustandsbedingungen /?,-fo) mindestens eine der Größen Sau- erstoffgehalt von Blut, Hämatokrit von Blut und Durchmesser eines Blutgefäßes umfassen.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
- die Bereitstellung der Messgrößen unmittelbar durch die Messungen am Objekt (1) oder durch eine Ausgabe aus einem Da- tenspeicher erfolgt.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, mit dem Schritt:
- Auswahl der spektralen Messbedingungen Lr(k) mit einer Optimierungsprozedur, die eine Maximierung einer Determinante um- fasst, die von einer Funktionalmatrix J abgeleitet ist, deren Elemente partielle Ableitungen der Objektantwort nach den Zu- standsbedingungen pt(x) umfassen .
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem - die Auswahl der spektralen Messbedingungen Lr(λ) eine Maximierung der Größe yjdetfJ J) umfasst.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem
- bei der Maximierung der Größe mindestens ein vor- bestimmter Bereich im Parameterraum der Zustandsbedingungen
Pi(x) fest vorgegeben wird.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Beleuchtungsbedingungen mit einer Beleuchtungseinrichtung (10) eingestellt werden, die Leuchtdioden (11), Laser- Quellen und/oder eine Blitzlampe umfasst.
15. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem
- die Messungen am Objekt (1) mit einer Funduskamera (20) oder einem Mikroskop erfolgen.
16. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem
- die Messsignale Ar mit einem CCD-Sensor (21) erfasst werden.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem
- die Messsignale Ar mit dem CCD-Sensor (21) paarweise unmittelbar vor Beginn und nach Beendigung einer Zwischenspeicher- Phase des CCD-Sensors (21) erfasst werden, in der Ladungszu- stände von CCD-Elementen (23) des CCD-Sensors (21) in Zwischenspeichern gespeichert werden.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem
- für die paarweise Erfassung der Messsignale Ar bei aufein- ander folgenden Zwischenspeicher-Phasen eine Permutation der spektralen Messbedingungen Lr(k) vorgesehen ist.
19. Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - eine ortsausgelöste Visualisierung der Zustandsbedingungen pι(x) vorgesehen ist.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem
- die Visualisierung der Zustandsbedingungen pt(x) eine mindes- tens teilweise Überlagerung eines Bildes des Objektes mit einem Parameterbild umfasst, das die Visualisierung der Zustandsbedingungen pt(x) enthält .
21. Messeinrichtung (100) zur Ermittlung von Zustandsbedin- gungen pt(x) eines zu untersuchenden Objektes (1), die umfasst:
- eine Beleuchtungseinrichtung (10), die zur Beleuchtung des Objektes (1) unter verschiedenen spektralen Messbedingungen Lr(λ) eingerichtet ist, und
- eine Kameraeinrichtung (20) , die zur Messung einer Vielzahl von Messsignalen Ar unter den spektralen Messbedingungen Lr(λ) eingerichtet ist, wobei die Messsignale Ar durch eine Objektantwort bestimmt werden, welche die Zustandsbedingungen Pi als Parameter enthält, wobei - die Messsignale Ar als Messgroßen durch eine vorbestimmte Systemfunktion in Abhängigkeit von der Objektantwort S(p„λ) und von den spektralen Messbedingungen Lr(k) darstellbar sind, und - eine Auswertungseinrichtung (30) , die zur Berechnung der Zustandsbedingungen p,(x) aus den Messgroßen eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet dass die Auswertungseinrichtung (30) eine Anpassungseinheit (31) enthalt, mit der die Zustandsbedingungen p,(x) durch eine An- passung der Parameter der Objektantwort S(p,,λ) derart berechenbar sind, dass die Messgroßen durch die Systemfunktion repräsentiert werden.
22. Messeinrichtung gemäß Anspruch 21, bei der - die Beleuchtungseinrichtung (10) für eine Beleuchtung des Objekts (1) mit einer spektralen Breite im Bereich von 10 nm bis 70 nm im Wellenlängenbereich von 200 nm bis 1,5 μm eingerichtet ist.
23. Messeinrichtung gemäß Anspruch 21 oder 22, bei der
- die Beleuchtungseinrichtung (10) und die Kameraeinrichtung (20) Teile einer Funduskamera (30) oder eines Mikroskops sind.
24. Messeinrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 23, bei der
- die Beleuchtungseinrichtung (10) Leuchtdioden (11), Laser- Quellen und/oder eine Blitzlampe umfasst.
25. Messeinrichtung gemäß Anspruch 24, bei der
- die Beleuchtungseinrichtung (10) mit mindestens einem Filter ausgestattet ist.
26. Funduskamera (200), die eine Messeinrichtung (100) gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 25 aufweist.
27. Operationsmikroskop, das eine Messeinrichtung (100) ge- maß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 26 aufweist.
28. Computer-Programmprodukt, das sich auf einem Computerlesbaren Speichermedium befindet, mit einem Programmcode zur Ausführung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprü- che 1 bis 20.
29. Vorrichtung, die ein Computer-lesbares Speichermedium um- fasst, das Programmanweisungen zur Ausführung eines Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20 enthält.
30. Verfahren zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1), mit den Schritten:
- Beleuchtung des Auges (1) mit Anregungslicht in einem vorbestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich (λex) , und - Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (Sx) in einem ersten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,i) , gekennzeichnet: durch die weiteren Schritte:
- Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S2) in einem zweiten Emissions-Wellenlängenbereich (λem,2) , und - Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (Si, S2) .
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, bei dem
- die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale spektral integ- rierte Fluoreszenzintensitäten (Si, S2) entsprechend in den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen (λem,i, λera,2) umfassen.
32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 31, bei dem
- die Erfassung des Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments eine Approximation S = S (Si, S2, C) in Abhängigkeit von den Fluoreszenzsignalen (Si, S2) und von spektralen Messbedingun- gen der Beleuchtung und Fluoreszenzmessungen umfasst.
33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32, bei dem
- der Anregungs-Wellenlängenbereich (λex) so gewählt ist, dass eine Anregung des Pigments in dessen Maximum der effektiven Absorption erfolgt, wobei die effektive Absorption sich aus der Absorption des Pigments unter Berücksichtigung der Absorption okularer Medien ergibt.
34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 33, bei dem - die Wellenlängenbereiche so gewählt sind, dass sich der Anregungs-Wellenlängenbereich (λex) mit keinem von den ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereichen (λem, i/ λem,2) überlappt .
35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 34, bei dem
- das Pigment Lipofuszin umfasst, wobei
- der Anregungs-Wellenlängenbereich (λex) im Wellenlängenintervall von 400 nm bis 490 nm,
- der erste Emissions-Wellenlängenbereich (λem/i) im Wellen- längenintervall von 495 nm bis 560 nm, und
- der zweite Emissions-Wellenlängenbereich (λem,2) im Wellenlängenintervall oberhalb von 570 nm gewählt sind.
36. Verfahren gemäß Anspruch 35, bei dem - die Erfassung des Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments gemäß S = (S2 - l/D • Si) " I0 - C erfolgt, wobei D ein spektraler Mischungsparameter, I0 eine Normierungsintensität und C eine Konstante umfassen, welche die spektralen Messbedingungen repräsentiert.
37. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 36, bei dem - die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S2) ortsaufgelöst erfolgen.
38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 37, bei dem
- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S2) zeitlich aufeinander folgend vorgesehen ist.
39. Verfahren gemäß Anspruch 38, bei dem
- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S2) mit einem Zeitabstand erfolgen, der geringer als 500 ms ist.
40. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 38, bei dem
- die Messungen des ersten Fluoreszenzsignals (Si) und des zweiten Fluoreszenzsignals (S2) gleichzeitig erfolgen, wobei
- eine Trennung von Fluoreszenzlicht des Augenhintergrundes auf zwei Detektoren vorgesehen ist.
41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 40, bei dem - die ersten und zweiten Emissions-Wellenlängenbereiche
(λem,i, λem,2) mit optischen Filtern eingestellt werden.
42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 41, mit dem Schritt - Ermittlung einer Konzentration des Pigments aus dem Autofluoreszenzsignal (S) .
43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 42, mit dem Schritt
- Anzeige eines Autofluoreszenzbildes des Augenhintergrundes (2) .
44. Verfahren gemäß Anspruch 43, bei dem
- im Bild des Augenhintergrundes (2) Bereiche des Augenhintergrundes (2) , in denen das Autofluoreszenzsignal (S) oder die Konzentration des Pigments eine vorbestimmte Grenze über- schreitet, markiert sind.
45. Messeinrichtung (100), die zur Messung der Fluoreszenz eines Pigments im Auge (1) eingerichtet ist, umfassend:
- eine Beleuchtungseinrichtung (10), die zur Erzeugung von Anregungslichtes in einem vorbestimmten Anregungs-Wellen- längenbereich (λex) und zur Bestrahlung des Auges (1) eingerichtet ist, und
- eine Detektoreinrichtung (20) , die zur Messung eines ersten Fluoreszenzsignals (Si) in einem ersten Emissions-Wellen- längenbereich (λem,i) eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet:, dass
- die Detektoreinrichtung (20) zur Messung eines zweiten Fluoreszenzsignals (S2) in einem zweiten Emissions-Wellenlängen- bereich (λem,2) eingerichtet ist, und - die Messeinrichtung zur Erfassung eines Autofluoreszenzsignals (S) des Pigments aus den ersten und zweiten Fluoreszenzsignalen (Si, S2) eingerichtet ist.
46. Messeinrichtung gemäß Anspruch 45, bei der - ein Anregungs-Strahlengang (14) des Anregungslichtes und ein Emissions-Strahlengang (24) der Fluoreszenzemissionen zumindest abschnittsweise übereinstimmen.
47. Messeinrichtung gemäß Anspruch 45 oder 46, bei der
- die Detektoreinrichtung einen Filterwechsler (23) aufweist, der so konfiguriert ist, dass zwischen zwei Fluoreszenzmessungen Emissions-Filter (22) im Emissions-Strahlengang (24) gewechselt werden können.
48. Messeinrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 47, bei der
- die Beleuchtungseinrichtung (10) eine einzige Leuchtdioden- anordnung mit einer einzelnen oder mehreren Leuchtdioden (11) umfasst .
49. Messeinrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 48, die Teil einer ophtalmologischen Funduskamera ist.
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STYLES I B ET AL: "Quantitative analysis of multi-spectral fundus images" MEDICAL IMAGE ANALYSIS NETHERLANDS, Bd. 10, Nr. 4, August 2006 (2006-08), Seiten 578-597, XP002512123 ISSN: 1361-8415 in der Anmeldung erwähnt * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017036600A1 (de) * | 2015-09-01 | 2017-03-09 | Carl Zeiss Meditec Ag | Fluoreszenzlichtdetektionssystem und mikroskopiesystem |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009018953A3 (de) | 2009-04-09 |
DE102007053074A1 (de) | 2009-05-14 |
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