DE10222359B4

DE10222359B4 - Verfahren zur spektral differenzierenden, bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht

Info

Publication number: DE10222359B4
Application number: DE10222359A
Authority: DE
Inventors: Erwin Prof. Dr. Neher; Richard Neher
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2022-05-22
Also published as: DE10222359A1; US7304733B2; JP2005526246A; JP4486495B2; US20050243313A1; WO2003098174A1

Abstract

Verfahren zur bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, bei dem
– eine Probe, die Fluorophore wenigstens einer Spezies enthält, mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften definierten Anregungskanals bestrahlt wird und
– von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht von wenigstens einem Detektionskanal, der durch seine spektrale Detektionscharakteristik definiert ist, empfangen und in ein digitales Signal umgewandelt wird,
wobei das digitale Signal zur weiteren Verarbeitung in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert wird,
und wobei vor Durchführung der Messung die Eigenschaften des wenigstens einen Anregungskanals und des wenigstens einen Detektionskanals gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens, welches die Fluoreszenzcharakteristik wenigstens eines vom Benutzer in der Probe vermuteten Fluorophors berücksichtigt, vorgegeben werden,
dadurch gekennzeichnet, dass
zur Durchführung einer spektral differenzierenden Messung einer Probe, welche Fluorophore verschiedener Spezies enthält, im Rahmen des Optimierungsverfahrens
a) ein...

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, bei dem

– eine Probe, die Fluorophore wenigstens einer Spezies enthält, mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften definierten Anregungskanals bestrahlt wird und
– von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht von wenigstens einem Detektionskanal, der durch seine spektrale Detektionscharakteristik definiert ist, empfangen und in ein digitales Signal umgewandelt wird,

Ein solches Verfahren ist bekannt aus DE 198 29 944 C2 .

Zur Optimierung einer Messung ist die für die spezielle Probe optimierte Wahl der Eigenschaften des Anregungskanals und des Detektionskanals von besonderer Bedeutung. Der Begriff des Anregungskanals ist in diesem Zusammenhang als die Summe der Eigenschaften des die Fluoreszenz anregenden Lichtes zu verstehen. Dies umfasst insbesondere die spektralen Eigenschaften, zu denen im Rahmen dieser Beschreibung auch die Intensität der jeweiligen spektralen Komponenten gerechnet wird. Allerdings können auch andere Eigenschaften, wie etwa der Anregungszeitpunkt und/oder die Anregungsdauer, zusammengefasst als Anregungszeit, mit zur Definition eines Anregungskanals verwendet werden. In analoger Weise wird hier der Begriff des Detektionskanals als die Summe der Eigenschaften der das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht leitenden, filternden und detektierenden Elemente verstanden. Dies umfasst wiederum einerseits die spektralen Eigenschaften, einschl. der jeweiligen Empfindlichkeiten für einzelne spektrale Komponenten, sowie andererseits die Detektionszeit, den Detektionszeitpunkt und die Detektionsdauer. Spezielle Kombinationen von je einem Anregungskanal und einem Detektionskanal werden im Folgenden zusammenfassend als Messkanäle bezeichnet.

Um auch solchen Benutzern, die sich nicht eingehend mit den konkreten technischen Parametern der verwendeten Apparatur befasst haben, eine sichere und komfortable Messung zu ermöglichen, ist es wünschenswert die Messkanaleinstellungen möglichst automatisiert vorgeben zu lassen, d.h. automatisierte Einstellung von Filtern, Strahlteilern, Lichtquellen etc. oder Anweisung zur manuellen Einstellung solcher Elemente. Das in DE 198 29 944 C2 offenbarte Verfahren verfolgt den Ansatz, durch Vergleich des Emissions- bzw. Anregungsspektrums einer vom Benutzer in der Probe vermuteten Fluorophorenspezies mit charakteristischen Spektren von in der Apparatur verfügbaren Lichtquellen und Filtern eine automatische Optimierung der Gerätekonfiguration zu erreichen. Der Vergleich beruht auf Umrechnung der Spektren in Binärketten und AND-Verknüpfung der Binärketten zur Ermittlung der bestmöglichen Übereinstimmung zwischen spektralen Eigenschaften des Anregungskanals und dem Anregungsspektrum des Fluorophors bzw. zwischen dem Emissionsspektrum des Fluorophors und den spektralen Eigenschaften des Detektionskanals. Dieses einfache Verfahren ist in Fällen geeignet, in denen die Probe ledigliche eine einzelne Fluorophorenspezies aufweist. In komplexeren. Fällen, in denen eine Differenzierung mehrerer Fluorophorenspezies erforderlich ist, ist das Verfahren jedoch nicht anwendbar.

Die moderne Biologie versucht aber, die Komplexität ihrer Messmethoden an die Komplexität der untersuchten Proben anzupassen und ist somit vielfach daran interessiert, eine möglichst große Zahl von unterschiedlichen Markierungen in einer Probe gegeneinander aufzulösen.

Insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Vielzahl spezifischer Fluoreszenzsonden entwickelt worden. Diese eignen sich beispielsweise zur spezifischen Markierung von Antikörpern, bestimmten DNA-Sequenzen oder anderen biologischen Strukturen. Sie umfassen weiter Fusionskonstrukte bestimmter Proteine mit fluoreszierenden Proteinen, wie etwa GFP (Green Fluorescent Protein) oder YFP (Yellow Fluorescent Protein). Weiter sind besondere Indikatorfarbstoffe von ihnen umfasst, deren Fluoreszenz im Hinblick auf ihre Intensität und/oder ihr Emissionsspektrum mit der Konzentration bestimmter Ionen, beispielsweise Calcium, korreliert ist.

Ein anderes, besonders aktuelles Problem ist die quantitative Erfassung von Fluorophoren, die miteinander durch fluoreszenzlose Energieübertragung FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in Wechselwirkung treten. Solche FRET-Paare, bestehend aus Donor und Akzeptor, sind im optischen Mikroskop räumlich nicht gegeneinander auflösbar. Vielmehr wird die Überlagerung der Donor- und Akzeptor-Spektren bzw. ihr Verhältnis zueinander gemessen.

Ein weiteres, aktuelles Problem ist die Auftrennung der Fluoreszenz eines Indikatorfarbstoffs in die Anteile der gebundenen und freien Form des Fluorophors zum Zwecke der Verhältnisbildung und anschließenden Berechnung der Aktivität eines Liganden.

Ein weiteres Problem, das bei nahezu allen bildgebenden Fluoreszenzverfahren in der Biologie zum Tragen kommt, ist die Berücksichtigung der sog. Autofluoreszenz, d.h. der unspezifischen Hintergrundfluoreszenz, die viele Strukturen, wie etwa Zellen und Substratträger zeigen.

Eine wesentliche, prinzipielle Schwierigkeit liegt darin, dass die in der Regel verwendeten organischen Fluorophore relativ breite Excitations- und Emissionsspektren aufweisen, was auf die Vielzahl der in diesen organischen Molekülen beteiligten phononischen Subniveaus zurückzuführen ist. Damit wird es vergleichsweise schwer, einzelne, in der Probe enthaltene Spezies von Fluorophoren spezifisch anzuregen oder spezifisch zu detektieren. Vielmehr erhält man in der Regel als Signal eine komplexe Zusammensetzung von Beiträgen der unterschiedlichen Spezies.

Konventionell behilft man sich damit, möglichst weit auseinander liegende Anregungskanäle und möglichst enge Detektionskanäle zu verwenden. In der gängigen Praxis sind verschiedene Methoden bekannt, die auf die optimale spektrale Auflösung der unterschiedlichen Fluophorenarten gegeneinander abzielen und von den Eigenschaften der Fluorophore und ihrer Kombination abhängen. So ist es beispielsweise möglich, bei einem gegebenen Detektionskanal mehrere Aufnahmen nacheinander mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen durchzuführen, wobei die Anregungswellenlängen jeweils so gewählt sind, dass das Absorptionsmaximum jeweils einer Fluorophorenspezies möglichst genau getroffen wird. In diesem Fall wird je Messung ein Messkanal benutzt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Probe bei einer Excitationswellenlänge anzuregen, die im Bereich der Anregungsspektren mehrerer Fluorophorenspezies liegt, und das Emissionslicht durch Filtersätze oder Kaskaden von Strahlteilern in spektrale Bereiche aufzuteilen und diese Teile getrennten Photosensoren zuzuführen. Bei diesem Verfahren werden also mehrere Messkanäle gleichzeitig benutzt. Sind die Emissions- bzw. Excitationsbanden der interessierenden Fluorophore genügend weit voneinander getrennt, lassen sich die Frequenzbereiche der einzelnen Messkanäle so wählen, dass jeder Kanal einem Fluorophor entspricht. Nachteilig bei diesen Techniken ist, dass meist ein gewisses Übersprechen zwischen den Kanälen nicht vermeidbar ist. Dies trifft insbesondere zu, wenn eine Vielzahl unterschiedlicher Fluorophore in einer Probe verwendet wird, wobei sich deren Spektren aufgrund der begrenzten Bandbreite der nutzbaren Wellenlängen überlappen. Dem kann zwar dadurch entgegengewirkt werden, dass die spektralen Begrenzungen der einzelnen Detektionskanäle, beispielsweise durch enge Bandpassfilter, scharf begrenzt werden. Dies hat allerdings zur Folge, dass ein großer Teil der emittierten Fluoreszenzphotonen nicht zur Signalgebung beiträgt, was sich negativ auf die Qualität des detektierten Signals auswirkt. Insbesondere ist dies unerwünscht, da wegen Bleichprozessen der Fluorophore in der Probe die Gesamtzahl der von einem gegebenen Präparat emittierbaren Photonen begrenzt ist, andererseits aber aufgrund des Photonenrauschens die Qualität und Auflösung einer Messung umso besser ist, je mehr Photonen zur Messung beitragen. Nahezu alle Fluoreszenzphotonen können zwar dadurch nutzbar gemacht werden, dass das emittierte Fluoreszenzlicht spektral zerlegt und das Spektrum mittels einer großen Vielzahl spektraler Kanäle weiterbehandelt wird. Das relative Rauschen in jedem einzelnen, extrem engen Kanal wächst dabei jedoch erheblich an, da für jeden einzelnen Kanal nur vergleichsweise wenige Photonen zur Verfügung stehen, so dass sich dieses Verfahren nur in besonders lichtstarken Anwendungsfallen eignet.

Die angesprochenen Probleme lassen sich stark reduzieren, wenn breite Messkanäle gewählt werden, deren Übersprechen bewusst in Kauf genommen wird, und die aufgenommenen Daten einer erheblichen, rechnerischen Nachbearbeitung bzw. Auswertung unterzogen werden. Hierzu werden die aufgenommenen Signale in den Detektoren oder nachgeschalteten Umwandlungseinheiten in digitale Daten konvertiert und in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert. Bei vielen Anwendungen, wie z.B. der Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) ist die Digitalisierung und Nachbearbeitung der Daten sogar ein wesentlicher Bestandteil der Technik.

Die zuvor angesprochene Auswertung der Daten geschieht üblicherweise mittels einer Verrechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage. Besonders gute Ergebnisse hat man mit der Methode des sog. „Linear Unmixing" erzielt. Diese ist beispielsweise beschrieben in DE 199 15 137 C2 sowie von Farkas et al.: „Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bio-imaging", Computerized Medical Imaging and Graphics, 22 (1998), S. 89–102 oder von Dickinson et al.: „Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscop ", BioTechniques 31, Nr. 6 (2001), S. 1272–1278 sowie Boardman: „Inversion of imaging spectrometry data using singular value decomposition", Proc. IGARSS, 89, Nr. 4 (1989), S. 2069–2072 offenbart.

Die Methode beruht auf der Aufstellung und Lösung eines inhomogenen, linearen Gleichungssystems, das über die bekannten Eigenschaften der Messkanäle einen Zusammenhang herstellt zwischen dem gemessenen Signal und der Fluorophorenzusammensetzung in der Probe. Dieses Gleichungssystem lässt sich mathematisch in Matrixschreibweise darstellen als y ⇀ = AB ⇀ + I ⇀·b ⇀ (1)oder in Komponentenschreibweise

Diese Formeln sind folgendermaßen zu verstehen: Der Vektor B ⇀ repräsentiert die unterschiedlichen Spezies von Fluorophoren in ihrer relativen Konzentration in einem gegebenen Bildpunkt. Die Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies sei p. Damit weist der Vektor B ⇀ p Komponenten B_μ auf. Der Vektor y ⇀ repräsentiert das in jedem Messkanal detektierte Signal. Die Anzahl der Messkanäle sei q. Damit weist der Vektor y ⇀ q Komponenten y_r auf. Wurden für die Messung beispielweise vier unterschiedliche Anregungswellenlängen und vier unterschiedliche spektrale Detektionsfenster verwendet, ist die Anzahl der Messkanäle q = 16. Der Vektor I ⇀ stellt die für jeden Messkanal verwendete Anregungsintensität dar und weist somit q Komponenten I_r auf. Die Matrix A ist die Koeffizientenmatrix die die chemische Komposition B ⇀ von Fluorophoren über die Anregungsintensitäten I_r der Anregungskanäle und die übrigen Eigenschaften α_μr der Messkanäle mit dem Ergebnissignal y ⇀ verknüpft. Die Matrix A hat also pq Elemente I_rα_μr. Der Vektor b ⇀ mit q Komponenten b_r schließlich ist eine Korrekturgröße, die das Streulicht oder ein anderes Hintergrundlicht in jedem Messkanal wiedergibt. Die Größen B_μ sind in der Regel als ortsabhängig aufzufassen, während die übrigen Größen auf der jeweils rechten Seite der Gleichungen (1) und (2) Parameter darstellen, die normalerweise für alle Pixel gleich sind. Autofluoreszenz des Messobjektes kann entweder als Fluoreszenz eines zusätzlichen Fluorophors B_μ oder aber als Hintergrundlicht b_r (falls ortsunabhängig) behandelt werden. Bei Vorliegen von FRET kann ein FRET-Paar als eigenständiger Chromophor aufgefasst werden, dessen Konzentration durch eine der Größen B_μ gegeben ist.

Ziel des „Linear Unmixing" ist es, die Lösung B ⇀ des vorstehenden linearen Gleichungssystems zu finden, was mathematisch durch einfache Inversion der Koeffizientenmatrix A möglich ist, sofern die Zahl der Gleichungen q größer oder gleich der Anzahl der unterschiedlichen Fluorophorenspezies p ist. Für die algorithmische Umsetzung dieser mathematischen Operation sind dem Fachmann eine Reihe numerischer Verfahren bekannt.

Eine Implementierung dieses Auswerteverfahrens in einer LSM-Vorrichtung wurde von der Firma Carl Zeiss, Jena, Deutschland, in deren Laser-Scanning-Mikroskop LSM 510 meta realisiert.

Aus dem Bereich der Pigmentfarbstoffe ist von Breuning et al: „Multikomponentenanalyse im Sekundentakt", GIT-Labor-Fachzeitschrift 4/2000, S. 430–433 ein ebenfalls auf linearer Regression basiertes Auswerteverfahren beschrieben.

Wie erläutet, bietet das Verfahren des „Linear Unmixing" ein probates Mittel der Datenauswertung bei Kenntnis der Eigenschaften der verwendeten Messkanäle. Nachteilig ist jedoch, dass die Auswahl der geeigneten Messkanäle, d.h. die Einstellung sämtlicher Parameter wie Anregungswellenlänge, -intensität, -zeit und Detektionswellenlängen und -zeit, nach wie vor der Intuition des Benutzers unterworfen ist. Da sich die Intuition jedoch nach anschaulichen Regeln richtet, die es dem Benutzer nahe legen, nach wie vor möglichst je einen Messkanal einer Fluorophorenspezies zuzuordnen, werden die Möglichkeiten, die die komplexe Datenanalyse bietet, in der Regel nicht ausgenutzt.

DE 197 57 740 A1 offenbart ein spezielles Verfahren aus dem Bereich der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), die auf der Korrelation zeitlicher Fluktationen der Fluoreszenzintensität in einem minimierten Messvolumen basiert.

DE 199 56 620 A1 offenbart ein konfokales 2-Photonen-Fluoreszenzmikroskop, welches zur Erfassung von Fluoreszenzlebensdauern geeignet ist.

DE 100 35 190 A1 offenbart eine Vorrichtung zur 2-Photonen-Fluoreszenz-Koinzidenzanalyse und ein entsprechendes Verfahren.

DE 100 08 594 A1 offenbart eine Einrichtung und ein Verfahren zur Kombination von klassischer Fluoreszenzmikroskopie und FCS.

DE 42 10 970 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung verschiedener Moleküle anhand von Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauer.

DE 197 18 016 A1 offenbart ein Verfahren zur statistischen Auswertung von Fluoreszenz-Einzelphotonenzählermessungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Verfahren derart weiterzubilden, dass für Fälle, in denen in einer Probe eine Mehrzahl von Fluorophorenspezies vorliegt, eine automatisierte Optimierung der Messkanäle ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass zur Durchführung einer spektral differenzierenden Messung einer Probe, welche Fluorophore verschiedener Spezies enthält, im Rahmen des Optimierungsverfahrens

a) ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, – dessen Koeffizienten spektrale Eigenschaften von Messkanälen, die jeweils als Kombination eines Anregungs- und eines Detektionskanals definiert sind, repräsentieren, – und das den Zusammenhang beschreibt zwischen der vom Benutzer vermuteten Fluorophoren-Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Messkanal-Eigenschaften rechnerisch resultierenden Signal,
b) die Koeffizienten solange variiert werden, bis eine eindeutige Lösung des Gleichungssystems möglich ist, und
c) die ermittelten Koeffizienten als Ergebnis des Optimierungsverfahrens der Vorgabe der Eigenschaften der Anregungs- und Detektionskanäle zugrunde gelegt werden.

Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Die Erfindung baut auf einem gattungsgemäßen Verfahren dadurch auf, dass kein simpler Vergleich der Spektren von Fluorophoren und Apparatur durchgeführt wird, sondern dass erfindungsgemäß im Rahmen des mathematischen Optimierungsverfahrens ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, das den Zusammenhang zwischen einer vom Benutzer vermuteten Fluorophoren-Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Eigenschaften der Messkanäle resultierenden Signal beschreibt. Dieses Merkmal greift die mathematische Grundlage des „Linear Unmixing" auf. Allerdings wendet es diese Grundidee in genau entgegengesetzter Weise als beim Stand der Technik an. Während nämlich beim „Linear Unmixing" bei bekannten Komponenten y_r und bekannten, die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten α_μr die relativen Konzentrationen B_μ der einzelnen Fluorophorenspezies gesucht sind, zielt das erfindungsgemäße Verfahren vielmehr darauf ab, durch Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten α_μr eine Optimierung des Systems in dem Sinne herbeizuführen, dass die Lösung des Gleichungssystems möglichst eindeutig erfolgen kann. Die Optimierung ist also auf die Lösbarkeit des Gleichungssystems ausge richtet, insbesondere auf deren Eindeutigkeit. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass ein sich an die Messung anschließendes Auswerteverfahren, das auf der Methode des „Linear Unmixing" basiert, nicht etwa deshalb scheitert, weil die die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten im speziellen Fall so gewählt waren, dass die Zahl der linear unabhängigen Gleichungen des Systems die Zahl der vorhandenen Fluorophorenspezies unterschreitet und das Gleichungssystem somit nicht mehr eindeutig lösbar ist.

Ein solches mathematisches Optimierungsverfahren ist streng zu trennen von der automatischen Ansteuerung bestimmter Standardeinstellungen, die ab Werk programmiert sein können oder sich an einer vom Benutzer selbst eingerichteten Einstellungsbibliothek orientieren. Vielmehr gibt der Benutzer der Datenverarbeitungsanlage ein, welche Fluorophore er in der Probe vermutet bzw. deren Charakteristiken. Diese Angaben werden dann dem mathematischen Optimierungsverfahren zugrunde gelegt, das die für die speziellen Belange des Benutzers optimalen Einstellungen der Messkanäle errechnet. Damit kann insbesondere eine sich der Intuition weitgehend widersetzende, im Hinblick auf eine mathematische Auswertung der aufgenommenen Daten aber besonders günstige Segmentierung des gesamten Fluoreszenzspektrums vorgenommen werden anstatt mit Filtern enge Bänder auszuschneiden und die Anzahl der zum Signal beitragenden Photonen und damit die Signalqualität unnötig zu reduzieren.

Vorteilhafterweise sind die Charakteristiken einer Vielzahl von Fluorophoren in einer oder mehreren Bibliotheken in einer Speichereinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert, so dass es genügt, wenn der Benutzer die von ihm in der Probe vermuteten Fluorophore identifiziert, ohne deren vollständige Charakteristiken eingeben zu müssen.

Günstigerweise ist das Optimierungsverfahren so flexibel gestaltet, dass es nicht ausschließlich auf die Lösbarkeit bzw. Eindeutigkeit der Lösung des Gleichungssystems hin optimiert wird, sondern zusätzlich vom Benutzer gewählte Nebenbedingungen berücksichtigt werden. Beispiele für derartige Nebenbedingungen sollen weiter unten erläutert werden.

Vorteilhafterweise umfasst das Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines Matrixausdrucks, der diejenige Matrix enthält, die von den Koeffizienten des vorgenannten linearen Gleichungssystems gebildet wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist dies so zu verstehen, dass sich die algorithmische Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens mathematisch als Optimierung einer Konditionszahl des genannten Matrixausdrucks darstellen lässt. Je nach konkreter Umsetzung kann es möglich sein, auf die explizite Definition einer Matrix oder eines Arrays im Rahmen eines Computerprogramms zu verzichten.

Besonders bevorzugter Weise wird der Matrixausdruck, der der Berechnung der Konditionszahl zugrunde gelegt wird, als linksseitiges Matrixprodukt der Matrix A mit ihrer Transponierten A^T, also A^TA, gebildet. Dem liegt die Überlegung zugrunde, dass die Ausdrücke der Gleichungen 1 und 2 durch linksseitige Multiplikation mit A^T überführt werden können in AT(y ⇀ – I ⇀·b ⇀) = ATAB ⇀ (3)

Bekanntermaßen führt die linksseitige Multiplikation mit der Transponierten einer Matrix zur Symmetrisierung des sich ergebenden Matrixausdrucks, was einer Ausgleichsrechnung im Sinne der Gauss'schen Minimierung der Fehlerquadratsumme entspricht.

Bei expliziter Berücksichtigung des Rauschens der Messkanäle kann eine mit den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtete Matrix herangezogen werden, was als Minimierung der aus der Statistik bekannten Größe χ² (Chi Quadrat) betrachtet werden kann.

So kann beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform die zu optimierende Konditionszahl im Wesentlichen der Determinante des Matrixausdrucks, insbesondere des Ausdrucks A^TA entsprechen. Alternativ können als Optimierungskriterium Konditionszahlen verwendet werden, die auch die Spur N des Matrixausdrucks enthalten. In einem weiteren Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als zu optimierende Konditionszahl die Größe

verwendet, wobei det die Determinante, N die Spur und n die Dimension des Matrixausdrucks ist. Bei einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Konditionszahl das Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrixausdrucks benutzt. Es hat sich gezeigt, dass die Optimierung jeder dieser Konditionszahlen durch Variation der Matrixelemente I_rα_μr zu einer Wahl von Messkanaleigenschaften führen, die sich zwar der Intuition in vielen Fällen stark widersetzen, jedoch im Hinblick auf eine der Messung nachgeschaltete Datenauswertung, insbesondere vermittels der Methode des „Linear Unmixing" hervorragende Ergebnisse liefern.

Dabei führt die Optimierung verschiedener Konditionszahlen in verschiedenen Fallkonstellationen zu unterschiedlich guten Ergebnissen. Es ist daher besonders vorteilhaft, das erfindungsgemäße Verfahren dahingehend weiterzubilden, dass dem Benutzer die Möglichkeit gegeben wird, eine globale Charakteristik des erwarteten Messergebnisses, beispielsweise sehr schwache Fluoreszenz, besonders große Anzahl unterschiedlicher Fluorophore, spektral besonders nah benachbarte Fluorophore etc., anzugeben und damit oder direkt die zu optimierende Konditionszahl festzulegen.

Die Umsetzung des berechneten Optimierungsergebnisses in die Realisierung physikalischer Eigenschaften der Messkanäle kann auf vielfache Weise durchgeführt werden. So bietet sich beispielsweise eine Frequenz- oder Frequenzbandwahl im Anregungs- und/oder Detektionsstrahlengang durch einstellbare Filter wie etwa AOTFs (Acusto Optic Tunable Filters) oder LCTFs (Liquid Crystal Tunable Filters) an. Ebenso können feste Kanten-, Bandpassfilter und/oder Strahlteiler, die beispielsweise auf motorisch angetriebenen Filterschiebern oder -rädern angeordnet sind, zum Einsatz kommen. Eine weitere Möglichkeit der automatischen Beeinflussung der Messkanalcharakteristiken besteht in der Variation der Anregungsintensitäten, beispielsweise durch Einbringen sog. Graukeile in den Anregungsstrahlengang. Auch die zeitlichen Charakteristika der Messkanäle lassen sich in Umsetzung des erfindungsgemäßen Optimierungsverfahrens variieren. Beispielsweise kann die Anregungsdauer variiert oder es können zur Trennung von Fluoreszenzkomponenten mit kurzer und langer Lebensdauer zeitliche Detektionsfenster definiert werden. Hierzu ist dem Fachmann eine Vielzahl von Umsetzungsmöglichkeiten bekannt.

Konditionszahlen von Matrizen, wie oben erwähnt, liefern im Wesentlichen Abschätzungen maximaler Fehler, die jedoch in der Praxis oft weit unterschritten werden können. Dies trifft insbesondere zu, wenn bekannte Strukturen eines gegebenen Problems berücksichtigt werden. In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Möglichkeit einer weitergehenden Optimierung vorgesehen, bei der die speziellen Eigenschaften der experimentellen Störquellen bei Fluoreszenzmessungen formuliert werden. Insbesondere ist vorteilhafterweise ein zweiter Optimierungsschritt vorgesehen, in dem durch Variation der die Eigenschaften der Messkanäle beschreibenden Koeffizienten das Rauschen des zu erwartenden Signals optimiert wird.

Dieser erfinderischen Idee liegt die folgende Erkenntnis zugrunde. Sind die Koeffizienten der Matrix A bzw. des Matrixausdrucks A^TA bestimmt, vorzugsweise durch Anwendung des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschrittes optimiert, lautet die Lösung des linearen Gleichungssystems ⟨B ⇀⟩ = (ATA)–1AT(y ⇀ – I ⇀·b ⇀) (5)

Dabei bezeichnet ⟨B ⇀⟩ den Erwartungswert der Lösung B ⇀, womit berücksichtigt wird, dass der Vektor y ⇀ – I ⇀·b ⇀ mit einer experimentellen Schwankung σ ⇀ behaftet ist. Der Vektor σ ⇀ ist zu verstehen als kompo nentenweise Quadratwurzel der Ausdrücke σ 2 / r, die jeweils als Erwartungswerte der Varianz des Messwertes y_r zu verstehen sind. Diese setzten sich aus zwei Komponenten zusammen, nämlich dem Photonenrauschen, dessen Varianz proportional zum Signalniveau ist, und dem davon statistisch unabhängigen, konstanten Detektorrauschen, das sich aus Dunkelstrom und Ausleserauschen des jeweiligen Detektors zusammensetzt. σ2r = yrs + σ20,r (6)

Dabei ist s eine Proportionalitätskonstante (ein geeignet berechneter Einzelphotonenbeitrag) und σ 2 / 0,r die Summe aller konstanten Beiträge zur Varianz des Signals im Kanal r.

Nach der Methode der Gauß'schen Fehlerfortpflanzung lässt sich die Schwankung σ_μB der Komponente B_μ des Vektors B ⇀ beschreiben als

Da Gleichung (5) ein lineares Gleichungssystem ist und I ⇀·b ⇀ nicht von y_r abhängt, ist

wobei c_μr das Element der r-ten Zeile und μ-ten Spalte der Matrix C = (A^TA)^–1A^T ist. Daher ist

Dieser Ausdruck oder auch die Summe aller Abweichungsquadrate

lässt sich im Raum aller Messkanalparameter minimieren. Allerdings enthalten laut Gleichung (6) die Größen σ 2 / r die Messwerte y_r, sodass für die Minimierung von S 2 / B vom Benutzer Angaben über die Größe der erwarteten Signale gemacht werden müssen.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es im Wesentlichen diese Größe S 2 / B, die durch Variation der die Messkanäle beschreibenden Koeffizienten optimiert wird.

Dabei ist vorzugsweise vorgesehen, dass das Rauschen des zu erwartenden Signals unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird. Eine dieser Nebenbedingungen, die auch im Rahmen des oben beschriebenen, ersten Optimierungsschritts Anwendung finden können, kann bei einer vorteilhaften Ausbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Höchstgrenze für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore sein. Da bei fortschreitender Bleichung das Signal abnimmt, während bestimmte Anteile des Rauschens zeitunabhängig sind, kann die Optimierung unter Umständen in Bezug auf Beleuchtungsdauer bzw. -intensität erfolgen. Als weitere mögliche Nebenbedingung kann mit Vorteil die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten, vorzugsweise vom Benutzer vorgegebenen, Intensität genutzt werden. Diese Nebenbedingung bietet sich insbesondere an, wenn das erwartete Signal so niedrig ist, dass das Gesamtrauschen des Messkanals durch Dunkelstrom und Ausleserauschen des Detektors dominiert wird.

Als weitere, mögliche Nebenbedingung kann in einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die maximale spektrale Auflösung verschiedener Fluorophore in einem bestimmten Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes genutzt werden. Dies kommt insbesondere dort zum Tragen, wo ein oder mehrere verschiedene Fluorophore vor dem Hintergrund einer allgemeinen, unspezifischen Autofluoreszenz der Probe aufgelöst werden sollen oder falls ein bestimmter Bildbereich für den Benutzer von besonderem Interesse ist.

Bei einer weiteren, günstigen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, als Nebenbedingung die Minimierung des relativen Fehlers der Messkanäle zu nutzen. Diese Form der Nebenbedingung wird vorzugsweise dann eingeführt, wenn Verhältnismessungen, wie etwa bei FRET-Messungen, durchgeführt werden sollen.

Besonders günstig kann es sein, wenn der Benutzer die Möglichkeit erhält, zusätzlich zu einer oder mehreren Nebenbedingungen oder an ihrer statt Informationen zu einem vermuteten Modell des Rauschens, beispielsweise poisonbasiert, eingeben kann.

In besonders bevorzugter Weise wird das erfindungsgemäße Optimierungsverfahren im Rahmen eines iterativen, dialoggesteuerten Prozesses zur Definition der Nebenbedingungen durchgeführt, der es dem Benutzer erlaubt, nach Durchführung eines vorläufigen Optimierungsschrittes weitere Informationen einzugeben und einen oder mehrere erneute Optimierungsschritte anzufügen.

Um die Vorteile und Besonderheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise umsetzen zu können, ist A eine Vorrichtung, wie beispielweise ein Laser-Scanning-Mikroskop, vorgesehen, dessen digitale Datenverarbeitungsanlage derart programmiert ist, dass das vorbeschriebene, erfindungsgemäße Optimierungsverfahren durchführbar ist, und die über die weiter oben erwähnten technischen Einrichtungen zur automatischen Einstellung der Messkanaleigenschaften verfügt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnung erläutert. Es zeigt die einzige Figur den schematischen Aufbau eines wie vorstehend beschrieben eingerichteten Laser-Scanning-Mikroskops.
In der in der Figur gezeigten, Vorrichtung ist diese als Laser-Scanning-Mikroskop realisiert. Das System besteht im Wesentlichen aus drei Teilen, nämlich einer Datenverarbeitungsanlage 10, einer Benutzerschnittstelle 20 sowie einem optisch/elektronischen Aufbau 30. Die Datenverarbeitungsanlage umfasst eine Berechnungseinheit 11, in der die zur Durchführung des beschriebenen Optimierungsverfahrens sowie vorzugsweise die zur Auswertung der aufgenommenen Daten notwendigen Rechnungen durchgeführt werden. Weiter ist eine Speichereinheit 12 umfasst, in der einerseits aufgenommene Daten gespeichert oder zwischengespeichert werden können, andererseits aber auch die zur Durchführung des Verfahrens notwendigen Programmbefehle sowie Bibliotheken gespeichert sind, in denen die für die Berechnungen erforderlichen Daten gespeichert sind. Diese sind etwa Anregungs-, Fluoreszenzspektren sowie Fluoreszenzlebensdauern einer Vielzahl von Fluorophoren, spektrale Charakteristiken einer Vielzahl von Filtern oder Farbteilern sowie die Empfindlichkeitscharakteristiken verschiedener Detektoren. Auch die spektralen und elektronischen Merkmale verschiedener Lichtquellen, insbesondere Laser, können in der Speichereinheit 12 der Datenverarbeitungsanlage 10 gespeichert sein.
Weiter umfasst die Datenverarbeitungsanlage 10 eine Datenschnittstelle 13, über die die aufgenommenen Messdaten sowie Benutzereingaben über eine Steuerleitung 120 über die Benutzerschnittstelle 20 in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist und Steuerbefehle an einstellbare Komponenten des optisch/elektronischen Aufbaus 30 der Vorrichtung sowie Informationen an die Benutzerschnittstelle 20 ausgegeben werden können.
Die genannten Elemente der Datenverarbeitungsanlage 10 können auf vielfache, dem Fachmann bekannte Weise realisiert und in ihren technischen Einzelheiten der speziellen jeweiligen Konfiguration angepasst werden.
Zur Messung einer Fluoreszenzprobe 40 wird diese unter dem Mikroskopobjektiv 39 platziert. Über die Benutzerschnittstelle 20 kann der Benutzer verschiedene Daten in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingeben, die die vermutete chemische Fluorophorenzusammensetzung, voraussichtliche Intensitäten und/oder Optimierungsnebenbedingungen, wie beispielsweise Bleichgrenzen, eingeben. Aufgrund dieser Vorgaben berechnet die Berechnungseinheit 11 der Datenverarbeitungsanlage 10 gemäß dem beschriebenen Optimierungsverfahren diejenigen Werte, entsprechend denen der optisch/elektronische Aufbau 30 einzustellen ist. Hierdurch werden die Messkanäle als spezifische Kombinationen spezieller Anregungs- und Detektionskanäle definiert. In der in der Figur gezeigten Vorrichtung sind die Anregungskanäle vergleichsweise einfach ausgeführt. Sie bestehen im Wesentlichen aus zwei Laser 31a und 31b, die über motorisch ansteuerbare Kollimatoren 32a, 32b, Umlenkspiegel 33a, 33b, 33c, ein motorisch ansteuerbares Strahlteilerrad 34a, einen Scanningspiegel 35 und eine Scanninglinse 36 durch das Mikroskopobjektiv 39 die Fluoreszenzprobe 40 beleuchten. Die Eigenschaften des Anregungslichtes in Bezug auf Wellenlänge und Intensität sind durch Ansteuerung der Laser 31a, 31b, der Kollimatoren 32a, 32b sowie des Strahlteilerrades 34a über die Steuerleitungen 131a, 131b und 134a einstellbar. Selbstverständlich liegt es nahe Lichtquellen anderer Art und/oder anderer Zahl zu verwenden oder die Einstellung der Eigenschaften des Anregungslichtes durch andere oder weitere ansteuerbare Komponenten, wie etwa Neutralgrau-Filterschiebern, zu realisieren.
Die Ansteuerung des Scanningspiegels 35 über die Steuerleitung 135 geschieht auf herkömmliche Weise.
Das Fluoreszenzlicht, das in der Figur schematisch als gestrichelte Linie dargestellt ist, läuft von der Fluoreszenzprobe 40 durch das Mikroskopobjektiv 39, Umlenkspiegel 33c, Scanninglinse 36 und Scanningspiegel 35 auf das motorisch ansteuerbare Strahlteilerrad 34a zu. Bei geeigneter Einstellung des Strahlteilerrades 34a passiert der wesentliche Anteil des Fluoreszenzlichtes den eingestellten Strahlteiler, während Licht im Bereich der Anregungswellenlänge reflektiert wird. Die Einstellung der Detektionskanäle erfolgt über die Einstellung dieses Strahlteilerrades 34a sowie über die Einstellungen weiterer Strahlteilerräder 34b und 34c, die über die Steuerleitungen 134b und 134c entsprechend den von dem Optirnierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden. Eine weitere Kanalspezifizierung erfolgt über die Einstellung der Filterräder 36a und 36b, die über die Steuerleitungen 136a und 136b gemäß den von dem Optimierungsverfahren ermittelten Parametern eingestellt werden.
Das so vorselektionierte Fluoreszenzlicht fällt auf verschiedene Detektoren 37a, 37b und 37c, deren Daten über die Eingangsleitun gen 137a, 137b und 137c in die Datenverarbeitungsanlage 10 eingespeist werden. Je nach speziellem Aufbau werden die Daten bereits in den Detektoren 37a, 37b, 37c oder erst in der Datenschnittstelle 13 der Datenverarbeitungsanlage 10 digitalisiert. Die so aufgenommenen und in der Speichereinheit 12 der digitalen Datenverarbeitungsanlage 10 gespeicherten Daten werden von der Berechnungseinheit 11 von bekannten Datenauswertungsprogrammen ausgewertet, wobei vorzugsweise die Methode des „Linear Unmixing" Anwendung findet.
Die beschriebene Einstellung bzw. Definition der Messkanäle bezieht sich in dem gezeigten Ausführungsbeispiel sowohl auf die spektrale Sektionierung des Fluoreszenzlichtes als auch auf die Anzahl der verwendeten Messkanäle, d.h. die Anzahl der verwendeten Kombinationen von Anregungs- und Detektionskanälen. Dabei sind die Anzahl und Art der Detektoren ebenso variabel wie die der Lichtquellen. Insbesondere können, in der Figur nicht gezeigt, Detektoren verwendet werden, die beispielsweise bzgl. ihrer Detektionszeit, d.h. Detektionsdauer und/oder Detektionszeitpunkt, gemäß errechneten Optimierungsparametern angesteuert werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die für den LSM-Aufbau erforderlichen Pinholes 38a-c ansteuerbar zu gestalten und ihren Durchmesser in die Reihe der Optimierungsparameter aufzunehmen.

10: digitale Datenverarbeitungsanlage
11: Berechnungseinheit von 10
12: Speichereinheit von 10
13: Datenschnittstelle von 10
120: Steuerleitung
131a,b: Steuerleitung
134a-c: Steuerleitung
135: Steuerleitung
136a,b: Steuerleitung
137a-c: Eingangsleitung
20: Benutzerschnittstelle
30: optisch/elektronischer Aufbau
31a,b: Laser
32a,b: Kollimator
33a-c: Umlenkspiegel
34a-c: Strahlteilerrad
35: Scanningspiegel
36: Scanninglinse
37a-c: Detektor
38a-c: Pinhole
39: Mikroskopobjektiv
40: Fluoreszenzprobe

Claims

Verfahren zur bildgebenden Messung von Fluoreszenzlicht, bei dem – eine Probe, die Fluorophore wenigstens einer Spezies enthält, mit Anregungslicht wenigstens eines durch seine spektralen Eigenschaften definierten Anregungskanals bestrahlt wird und – von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht von wenigstens einem Detektionskanal, der durch seine spektrale Detektionscharakteristik definiert ist, empfangen und in ein digitales Signal umgewandelt wird, wobei das digitale Signal zur weiteren Verarbeitung in einer Speichereinheit einer digitalen Datenverarbeitungsanlage gespeichert wird, und wobei vor Durchführung der Messung die Eigenschaften des wenigstens einen Anregungskanals und des wenigstens einen Detektionskanals gemäß dem Ergebnis eines von einer Berechnungseinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage durchgeführten, mathematischen Optimierungsverfahrens, welches die Fluoreszenzcharakteristik wenigstens eines vom Benutzer in der Probe vermuteten Fluorophors berücksichtigt, vorgegeben werden, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung einer spektral differenzierenden Messung einer Probe, welche Fluorophore verschiedener Spezies enthält, im Rahmen des Optimierungsverfahrens a) ein lineares Gleichungssystem aufgestellt wird, – dessen Koeffizienten spektrale Eigenschaften von Messkanälen, die jeweils als Kombination eines Anregungs- und eines Detektionskanals definiert sind, repräsentieren, – und das den Zusammenhang beschreibt zwischen der vom Benutzer vermuteten Fluorophoren-Zusammensetzung der Probe und dem aufgrund der zu optimierenden Messkanal-Eigenschaften rechnerisch resultierenden Signal, b) die Koeffizienten variiert werden, bis eine eindeutige Lösung des Gleichungssystems möglich ist, und c) die ermittelten Koeffizienten als Ergebnis des Optimierungsverfahrens der Vorgabe der Eigenschaften der Anregungs- und Detektionskanäle zugrunde gelegt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Eindeutigkeit der Lösung des linearen Gleichungssystems unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren die Optimierung einer Konditionszahl eines Matrix-Ausdrucks umfasst, der die von den Koeffizienten des linearen Gleichungssystems gebildete Matrix enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixelemente des Matrix-Ausdrucks zur Minimierung der Größe χ² entsprechend den vom Benutzer erwarteten Messfehlern gewichtet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der die Koeffizientenmatrix enthaltende Matrix-Ausdruck im Wesentlichen das linksseitige Matrixprodukt der Koeffizientenmatrix mit ihrer Transponierten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Determinante des Matrix-Ausdrucks enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen die Spur des, Matrix-Ausdrucks enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen der Größe
entspricht, wobei det die Determinante, N die Spur und n die Dimension des Matrix-Ausdrucks ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konditionszahl im Wesentlichen das Verhältnis des kleinsten zum größten Eigenwert des Matrix-Ausdrucks enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer wählbar ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zu optimierende Konditionszahl vom Benutzer dadurch gewählt wird, dass eine globale Charakterisierung des zu erwartenden Signals in die digitale Datenverarbeitungsanlage eingegeben und die Konditionszahl automatisch ermittelt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mathematische Optimierungsverfahren einen weiteren Optimierungsschritt enthält, in dem durch Variation der Koeffizienten das Rauschen des zu erwartenden Signals optimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Rauschen des zu erwartenden Signals unter Berücksichtigung einer oder mehrerer durch den Benutzer einführbarer Nebenbedingungen optimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung eine Höchstgrenze oder das Optimum für die Bleichung eines oder mehrerer Fluorophore genutzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung des Rauschens eines Signals einer bestimmten Intensität genutzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die maximale spektrale Auflösung verschiedener Fluorophore in einem Bereich eines zuvor aufgenommenen Testbildes genutzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Nebenbedingung die Minimierung eines relativen Fehlers genutzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Optimierungsverfahren einen iterativen, dialoggesteuerten Prozess zur Definition der Nebenbedingungen umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu berücksichtigenden Fluoreszenzcharakteristiken aus einer Speichereinheit der digitalen Datenverarbeitungsanlage abgerufen werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die automatische Einstellung der Messkanaleigenschaften durch Ansteuerung und/oder motorische Bewegung von AOTFs, LCTFs, Kanten-, Bandpass-, Neutralgraufiltern und/oder Strahlteilern erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Definition der Anregungs- und/oder Detektionskanäle zusätzlich zu deren spektralen Eigenschaften weiter die Anregungszeit und/oder die Detektionszeit verwendet und von Koeffizienten des linearen Gleichungssystems repräsentiert werden.