EP4058783A1 - Prozesssteuerung/-regelung auf basis einer spektroskopischen bestimmung unbestimmter substanzkonzentrationen - Google Patents

Prozesssteuerung/-regelung auf basis einer spektroskopischen bestimmung unbestimmter substanzkonzentrationen

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Publication number
EP4058783A1
EP4058783A1 EP21706559.8A EP21706559A EP4058783A1 EP 4058783 A1 EP4058783 A1 EP 4058783A1 EP 21706559 A EP21706559 A EP 21706559A EP 4058783 A1 EP4058783 A1 EP 4058783A1
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EP
European Patent Office
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concentration
sample
models
spectra
model
Prior art date
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Pending
Application number
EP21706559.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Marek HÖHSE
Alexander Graf
Christian Grimm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sartorius Stedim Biotech GmbH
Original Assignee
Sartorius Stedim Biotech GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Sartorius Stedim Biotech GmbH filed Critical Sartorius Stedim Biotech GmbH
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light
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    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
    • G01N2201/129—Using chemometrical methods

Definitions

  • the present invention relates to a method, a device and a computer program product for determining an undetermined concentration of at least one substance, in particular a biological substance such as a protein or a DNA in a sample by means of spectroscopy, in particular by means of UV / vis spectroscopy or by means of infrared , Raman and / or fluorescence spectroscopy.
  • the invention can be practiced in the broad bioprocess industries, including the environmental, agricultural and food industries, biofuels and pharmaceuticals.
  • concentrations of substances are important parameters or variables that are used throughout Process chain must be followed and determined again and again. This determination usually takes place offline, in particular as a random sample outside the container in which a fermentation broth is subjected to chemical and / or biochemical processes and not in real time.
  • a fermentation broth can be understood, for example, as a biotechnological medium, in particular as a product that can be a medium that contains at least one protein and / or one vaccine and / or one hormone.
  • the determination or measurement of the concentrations of substances is often carried out by means of optical spectroscopy, in particular by means of UV / vis absorption spectroscopy.
  • optical spectroscopy in particular by means of UV / vis absorption spectroscopy.
  • the molecules of the substance of a sample of the fermentation broth with individual, in particular essentially predetermined discrete wavelengths, the excitation wavelengths or excitation frequencies i correspond, excited and the absorbance or extinction or alternatively the intensity is determined at these essentially discrete excitation wavelengths in order to determine the concentration.
  • narrow-band sensors are often used for this purpose. However, the sensors do not necessarily have to be narrow-band. In the case of sensors, the excitation is usually essentially narrow-band, whereas the wavelength range can be detected or recorded relatively broadly.
  • a dispersive element such as a grating, a prism, etc. is often used.
  • broadband emitting light sources also called broadband light sources
  • broadband detecting sensors also called broadband sensors
  • a broadband light source can be, for example, a deuterium light source or a halogen light source.
  • the substance - in particular the protein concentration - can differ considerably.
  • the values for substance concentrations can vary, for example, between approximately 0 and approximately 200 g / l.
  • the hardware for example the measuring cell or the sensor, is often not suitable for all sub-ranges of the concentrations achieved. For example, because of the limited dynamic range of the detectors, many available online sensors only allow substance concentrations of up to about 10 g / l to be determined.
  • the optical path or path length must be adapted depending on the concentration range in order to be able to shift the detection range if necessary or to also be able to measure other substance concentrations. It is therefore possible that one and the same hardware, in particular not the same measuring cell, can be used for all applications, in particular for all cleaning steps.
  • UV sensors can often have significant undesirable cross-sensitivity between DNA and protein. This is the case, for example, when an increase in the DNA concentration leads to a supposedly higher one measured protein concentration leads. For example, it can happen that an absorption band for DNA overlaps with an absorption band for a protein. Since the bands are not isolated and cannot be recorded separately and independently using sensors, the problem often arises to clearly differentiate and identify which substances (here the protein or the DNA) have changed to what extent in terms of concentration.
  • UV-Vis spectrum can accordingly have a large number of other excitation wavelengths or frequencies.
  • a spectrum that is emitted by a light source can by all means be wider or more extensive than the part that is measured or detected by the sensor. It depends on the choice of sensors and the light source (s).
  • Such UV / vis spectrometers can accordingly comprise one or about two (possibly also several) light sources, which accordingly generate one or two excitation wavelengths.
  • corresponding sensors can each be designed to detect electromagnetic radiation in the wavelength range that is of interest.
  • UV sensors can detect a few narrow-band excitation wavelengths, in particular one or two, each having a wavelength of around 10 nm.
  • the central wavelengths that is to say the wavelengths at which the maximum lies, can be approximately 250 nm and / or approximately 280 nm.
  • different substances in particular different proteins, can have absorption bands which each have a maximum essentially centered around different excitation wavelengths.
  • the central wavelength of an absorption band or an absorption maximum can vary for different proteins.
  • the commercially available UV / vis spectrometers do not adapt the excitation and / or detection wavelength to the substances currently to be measured, in particular the protein currently to be measured. It is therefore a matter of chance whether a protein is measured by chance at the maximum or in the vicinity of the maximum of the absorption wavelength or whether the molecules of a protein are excited with the excitation wavelength around which the absorption band of the protein is centered or a maximum at this excitation wavelength having.
  • the previously determined excitation wavelength can lie beyond the wavelength range in which the absorption band has an absorption maximum.
  • the previously fixed excitation wavelength can overlap with a flank region of an absorption band.
  • a flank range that is to say a wavelength range for which the absorption levels off to higher or lower wavelengths around the absorption maximum, usually has a low sensitivity to changes in the concentration.
  • the degree of cross-sensitivity also depends in particular on the wavelength-dependent extinction coefficient e A of the target protein and the impurities (HCP) and their concentration ratio. For this reason, absorption values of host cell proteins (HCPs) are often recorded together with those for target proteins (cross-sensitivity is close to 100%) and it is hardly possible to isolate the respective contributions of both absorption values to the analysis of the respective concentration of both substances.
  • the object is to provide a method, a device and a computer program product for determining an undetermined concentration of at least one substance in a sample over a large concentration range.
  • the present invention is based on the generation of quantitative models, in particular on multivariate data analysis.
  • Essential concepts of multivariate data analysis such as PLS, OPLS, multivariate calibration, multivariate process modeling, hierarchical modeling, etc., are in the book “Multi- and Megavariate Data Analysis - Basic Principles and Applications” (3rd Edition) by L. Eriksson et ai. described in detail.
  • spectra in particular optical spectra, preferably absorption spectra and / or excitation spectra of a plurality of concentration samples, at least two concentration samples having mutually different concentrations of the substance;
  • the models each comprising an assignment and / or a plot of at least one spectral measured variable of the spectra to concentrations in concentration ranges, the spectral measured variable in particular comprising an absorbance and / or an intensity of the spectra and wherein the concentration ranges of two models are not identical, in particular two concentration ranges overlap or are adjacent to one another;
  • an undetermined concentration relates in particular to an unknown concentration or a concentration that has not yet been determined by means of reference analysis.
  • the prediction by means of the method achieves in particular a determination of the concentration.
  • a whole series or set of absorption values for a wavelength range can be recorded under this aspect.
  • entire spectra, in particular absorption or intensity spectra, of dilution samples of a dilution series and a sample are recorded or recorded.
  • spectra for example an absorption spectrum, are recorded instead of individual values such as an absorbance for an excitation wavelength.
  • a flow cell with a constant optical path length is particularly suitable.
  • a flow cell which has a sample layer thickness or an optical path length or a width of the interior between approximately 10 ⁇ m and approximately 10 cm, in particular between approximately 15 ⁇ m and approximately 5 mm and particularly preferably between approximately 50 ⁇ m and approximately 3 mm having.
  • a particularly preferred sample layer thickness is around 1 mm. This has the advantage that one or more samples can be examined several times or repeatedly with one and the same measuring cell.
  • the method can be adapted comprehensively to the substance in question for the respective medium to be examined.
  • the method can be used in particular for monitoring a downstream process.
  • the method also find application for monitoring a fermentation and / or an upstream process.
  • the medium to be separated and / or the medium to be purified for example the fermented broth with the target protein and / or the target DNA, can be used in a purification step, for example before, in and / or after a Filtration system and / or a dialysis unit to be monitored.
  • the method can be carried out particularly advantageously for analyzing a medium, in particular a fluid medium, in an SU bioreactor if a process in the bioreactor is to be monitored.
  • an SU bioreactor which for example can have an SU bag and / or another SU container and / or a hose with a flow measuring cell, preferably an SU flow cell, contains in particular a fermentation broth that goes through chemical and / or biological and / or biochemical processes .
  • the fermentation broth is then monitored downstream, preferably during purification.
  • the content is repeatedly analyzed over time and / or analyzed permanently at times.
  • a container can be equipped with a sensor, for example.
  • a container can be equipped with a bypass line or sampling line and a flow cell.
  • a wall projection with a measuring area can be arranged or provided on the container.
  • a spectrometer can be arranged directly or indirectly on the flow cell and / or on the wall projection, which spectrometer is designed to repeatedly or permanently or permanently record data, in particular measured absorption values. In this way, spectra can be recorded over a longer period of time, for example over many hours, in order to follow the processes over this period. For example, the concentration of a protein and / or a DNA can thus be followed and / or monitored.
  • the following downstream steps can occur, for example:
  • polishing steps (cation and / or anion exchange chromatography and / or size exclusion chromatography)
  • Concentration and / or buffer exchange such as ultrafiltration and / or diafiltration in the crossflow setup.
  • an advantage of this aspect is that different substances or substances can be analyzed in isolation from one another, provided that their bands do not have their local absorption or intensity maximum at identical wavelengths. If, for example, the absorption maximum of a “host cell protein” (HCPs) differs in its excitation wavelength and / or in its shape from that of the target protein, an analytical differentiation can be made possible by recording an entire spectrum.
  • HCPs host cell protein
  • the absorption spectrum in comparison to the spectrum of the target analyte is also important. In particular, the width of the peak, the maximum and the shape of the peak are important.
  • a superposition of several protein peaks of the HCPs can then result in a structure in the region of the protein absorption which does not necessarily correspond to a Gaussian-like absorption band.
  • so-called cross-sensitivities of the measurement method can be suppressed and / or bypassed.
  • An effective quality control of the medium can thus take place, so that it can be determined as precisely as possible how high the respective proportion of, for example, HCP and / or target protein is present in the medium. Based on this, it can be estimated whether further cleaning steps are necessary.
  • the aspect mentioned allows in particular the measurement of essentially continuous absorption spectra or absorption spectra comprising discrete measurement points, instead of measuring just individual absorption values at essentially singular wavelengths or measuring individual absorption values at relatively narrow wavelength ranges.
  • a continuous absorption spectrum between a wavelength range of approximately 280 nm and approximately 750 nm can be recorded, whereas a customary known method allows, for example, a measurement between approximately 310 nm and 320 nm.
  • the full width at half maximum (FWHM) can be relatively narrow-band in the case of LEDs and can be around 10 nm, for example.
  • the absorption spectroscopy in particular the UV absorption spectroscopy and the corresponding sensors, is preferably based on a comparatively broadband excitation or on a broadband emitted and correspondingly recorded spectrum.
  • Light sources can represent, for example, a deuterium lamp and / or a xenon lamp and / or one or more LEDs.
  • the invention is based on the Lambert-Beer law. In particular, it is avoided that the path length has to be varied in the case of fixed waves (or in the case of a few wavelengths that can be selected beforehand via the light source or detector / filter).
  • the invention allows the entire spectrum to be recorded and thus allows the possibility of choosing the effective e with a fixed or unchanged path length d. This is done via the selection of the wavelengths l to be used explicitly or using a multivariate algorithm.
  • said aspect allows the system to be monitored using a single flow cell with a constant optical path length.
  • various multivariate models e.g. PLS with substance concentration, in particular protein concentration as target variable and the absorption values of the respective spectral range as input variables
  • PLS concentration range
  • MLR Multiple Linear Regression
  • the selected wavelength ranges being determined by the absorbance of the target analyte (e.g. DNA or protein) or change the matrix can be influenced.
  • be at least two non-identical sub-ranges, in particular excitation wavelengths of a range are selected according to the criterion whether the maximum intensity of the absorption band is still within the usable dynamic range of the detector.
  • the individual wavelength ranges have different sensitivities with regard to the detection of the substance concentration for the absorption values selected for the models.
  • the dynamic range differs depending on the model. The same applies analogously to the achievable analytical accuracy of the measurement.
  • the spectra preferably include absorption spectra and / or intensity spectra, the absorption spectra and / or intensity spectra having a one-to-one assignment, in particular a one-to-one plot of the spectral measured variable, for example the absorption value and / or the intensity value, at several wavelengths, with preferably at least a subset of the absorption values or Intensity values that are assigned to the corresponding wavelengths have no saturation on the detector side.
  • the spectral measured variable can in particular be the absorption value or the intensity value.
  • a saturation on the detector side occurs when there is no longer a concentration-dependent change in the detector signal at a specific wavelength or a wavelength range.
  • a separate weighting or weighting of each wavelength can also take place. In this case it is usually not formally necessary to select wavelengths. A weighting close to 0 does essentially the same thing.
  • a detector signal can enter a saturation range if the electromagnetic radiation has too high an intensity or too high an absorbance at a certain wavelength or in a wavelength range, so that this corresponding value is outside the dynamic range of the detector.
  • saturation can take place in both directions of the “detector filling”, ie with regard to an “overflow” or an “underflow”.
  • UV spectroscopy if the sample is saturated, it absorbs too much light, so that the light arriving at the detector can no longer be distinguished from the dark noise of the detector.
  • the detector cannot provide a resolution of the intensity or the absorbance within the saturated area. For example, this can be the case if there is a very high concentration in a sample and / or a long optical path length is due to a very thick measuring cell, so that the absolute number of molecules that interact with the light or the electromagnetic radiation is particularly important is high.
  • the wavelength range to be investigated has essentially no saturation for all concentrations to be investigated, so that the differences in absorbance and / or intensity are resolved and / or the dependence on the concentration a concentration series can be displayed if necessary. If a wavelength range experiences saturation, the detector is blind to the actual spectral measured variable, that is to say the absorbance and / or the intensity.
  • the quantitative models preferably include at least one global model comprising a plurality of sub-models that do not overlap one another.
  • a global model can have values from about 0 g to about 150 g.
  • Possible local models have values from about 2 g to about 10 g, from about 10 g to about 50 g and from about 30 g to about 80 g.
  • a sub-model does not necessarily have to have a common limit value with the global model. Limit values can be identical, but this case is an exception.
  • a global model allows a process unit to estimate a rough dependency between the spectral measurand of a spectrum and different concentration ranges.
  • the sub-models can essentially comprise relatively roughly graded concentration ranges that are limited to ever smaller ranges.
  • the sub-models of a global model can be graded, for example, into a first range from about 0 g / l to about 5 g / l, in a second range from about 0 g / l to about 25 g / l and in a third range from about 0 g / l to about 75 g / l.
  • sub-models do not necessarily have to start at 0. This can possibly even be unfavorable, since in this case the model area has to be kept unnecessarily wide.
  • the process step contains concentrations from about 50 to about 75 g
  • an optimal model will contain a slightly larger range (e.g. 45-80 g / l).
  • the quantitative models preferably each include at least one individually selected sub-model.
  • a sub-model can include any concentration range.
  • several sub-models can be created, each with different concentration ranges.
  • at least two concentration ranges can essentially overlap, essentially adjoin one another and / or be spaced apart from one another.
  • a sub-model can in particular be a real subset (e.g. with a restricted y-range) of the superordinate model spectrum set.
  • the quantitative models preferably include hierarchically organized models corresponding to at least a first hierarchical level and a second hierarchical level, the first hierarchical level in particular comprising a global model and the second hierarchical level comprising a local model.
  • a global model of the process unit and / or the user allows a rough dependency between the spectral measured variable of a spectrum and different concentration ranges to be recognized and / or assessed, for example automatically or automatically.
  • the sub-models can essentially comprise relatively roughly graded concentration ranges that are limited to ever smaller ranges.
  • the sub-models of a global model can, for example, be graded into a first range between approximately 0 g / l and 5 g / l, a second range between approximately 0 g / l and 25 g / l and a third range between approximately 0 g / l l and 75 g / l.
  • a local model of the process unit and / or the user allows a more finely resolved dependency between the spectral measurement of a spectrum and different concentration ranges to be recognized and / or assessed, in particular recognized automatically or automatically.
  • the sub-models can essentially comprise relatively finely graduated concentration ranges.
  • the sub-models of a local model can, for example, be graded into a first range between approximately 0 g / l and 5 g / l, a second range between approximately 5 g / l and 25 g / l and a third range between approximately 25 g / l l and 75 g / l.
  • the concentration areas of a local model are essentially adjacent to one another.
  • the assignment of the sample spectrum to at least one quantitative sub-model preferably includes an estimate based on determined and in particular based on displayed data, in particular based on displayed spectra.
  • a quick, uncomplicated estimation for example “by hand” and / or on the basis of a rough approximation, can provide a first approximate result, which can then be verified and / or specified more precisely using a fit, for example.
  • the assessment by the user occurs in particular when selecting the sub-models.
  • the user can choose the 0-50 g / l model because, for example, a content of around 40 g / l is expected at the time of measurement.
  • a classification can be carried out via PLS-DA or SIMCA or Euclidean distances or Mahalanobis distance between model and current spectra can be determined. This shows which of the models - based on different concentration ranges - the current spectrum best fits.
  • the sample spectrum is preferably assigned to at least one quantitative model (M) by means of Euclidean distance and / or Mahalanobis and / or PLS-DA and / or SIMCA.
  • Assigning the sample spectrum to at least one quantitative model by means of Euclidean distance and / or Mahalanobis and / or PLS-DA and / or SIMCA has the advantage that precise predictions about the concentration of a substance in a medium or in a sample can be taken. Accuracy of the concentration prediction achieved.
  • some processes can have a very wide range of protein concentrations that should preferably be covered. It may be that the model areas are too small and, as a result, it may be necessary to switch between the models within a process
  • the accuracy of the prediction depends in particular on the area of the model. It may be that this range is too small in relation to the error of the reference and as a result an algorithm cannot determine which wavelengths are required to determine the analyte concentration. It may also be that the range is too large and, as a result, it will not always be the highest, which may cause a jump in the forecast.
  • the control and / or regulation is preferably carried out with regard to the at least one parameter and the parameter comprises at least one of the following parameters: a valve circuit, a pump control, a media flow, a media pressure, a gas pressure, a pH value, a filtration step, a fractionation step, a time control, a process time setting, a temperature, an ion concentration, a chromatography step.
  • the process control to which the forecast value is passed on can influence the process to the desired extent on the basis of the forecast value determined.
  • a process can thus be controlled and / or regulated efficiently based on a specific prediction value.
  • the feedback can in particular serve to make the process more efficient and / or to obtain the product or the substance particularly gently and / or to protect it from possible denaturation and / or damage due to undesired values of the process parameters.
  • the process parameters that can be influenced include the following: a valve circuit, a flow pressure, a gas pressure, a pH value, a filtration step, a fractionation step, a time control, a process time setting, a temperature, an ion concentration or a salt concentration or a titer, a gradient, a chromatography step.
  • the at least one sample spectrum of the sample is preferably recorded online or in real time, in particular during or during the process, and the control and / or regulation also preferably takes place during the process as a direct consequence of the determined prediction value for the undetermined concentration.
  • Real-time monitoring allows the process unit and / or the user and / or an automated apparatus to intervene immediately in the process parameters on the basis of the determined prediction value or on the basis of the determined concentration of the substance in question. Immediate intervention in the process allows, in particular, the regulation and / or control of the process. In other words, feedback can take place in such a way that at least one process parameter is monitored and / or controlled and / or regulated on the basis of the determined concentration value of at least one substance. This also avoids having to take a random sample of the medium and measure it ex situ. The sample or the medium can take place in situ, in particular during a process within a system, for example within a fermentation vessel and / or within a downstream system, for example upstream and / or downstream of a chromatography unit.
  • Quantitative models are preferably generated by means of multivariate model creation, in particular by means of a multivariate regression method, such as preferably by means of multiple linear regression (MLR), and / or partial least squares (PLS) and / or orthogonal partial least squares (OPLS).
  • MLR multiple linear regression
  • PLS partial least squares
  • OPLS orthogonal partial least squares
  • a multivariate regression method allows efficient automated determination or creation of models with a high degree of precision.
  • Parameters which determine the desired conditions in the automation for example maximum and / or minimum values for process parameters, can be specified by the process unit and / or the user.
  • the process can thus be automated or automatically monitored in real time even in the absence of a user.
  • at least a partial range, in particular individual wavelengths of the spectra of the majority of the concentration samples, is weakened or excluded by weighting.
  • At least one sub-range in particular individual wavelengths of the spectra of the majority of the concentration samples and preferably sub-ranges for which the spectra are saturated, are weakened and in particular excluded for use on the sample spectrum.
  • Weighting can for example take place automatically on the basis of predetermined criteria and / or can be predetermined by the process unit and / or the user.
  • At least one sub-range in particular individual wavelengths of the spectra of the majority of the concentration samples, preferably sub-ranges for which there is a linear dependence between wavelengths and measured values, are weighted more heavily for application to the sample spectrum, the weighting being manual or by means of an algorithm, in particular Factor analysis, factor loadings or RLS loadings, regressions in RLS and / or OPLS takes place.
  • the acquisition of a large number of sample measured values is preferably carried out with a single, essentially identical gap width of one or more measuring cells.
  • Maintaining a single measuring cell enables the process unit and / or the user to determine the concentration particularly efficiently, since the replacement of hardware, in particular measuring cells, can be reduced and possibly completely avoided.
  • the circumstances under which measurements are carried out are thus constant and variations in the measurement configuration and the resulting incorrect settings are avoided.
  • the reversible setting of a measuring cell to a certain layer thickness can be flawed.
  • an additional method step or several additional method steps, which include setting the layer thickness are avoided, which makes the method particularly efficient.
  • a device for controlling and / or regulating a process, in particular a downstream biopnocess, based on the prediction of an undetermined concentration of at least one substance in a sample or a medium by means of spectroscopy, in particular UV / vis spectroscopy comprises:
  • At least one interface for obtaining spectra of a plurality of concentration samples of the at least one substance and of at least one sample spectrum of the sample or of the medium;
  • At least one process unit for controlling and / or regulating the process with respect to at least one parameter on the basis of the prediction value for the undetermined concentration.
  • the device preferably comprises a spectrometer for recording the spectra of the plurality of concentration samples of the at least one substance and / or of the at least one sample spectrum of the sample.
  • a computer program product comprises computer-readable instructions which, when the program is executed by a suitable computer-aided system, cause the program to carry out the steps of the method according to the above aspect or one of the embodiments.
  • the invention can be implemented with single-use (SU) - or disposable systems, comprising, for example, SU downstream elements, SU fermentation containers, SU bags, SU containers each with a wall projection which comprises a gap and window through which the The contents of the container can be analyzed spectroscopically in situ, i.e. in the container in real time.
  • Tube lines with SU flow lines can also be used with preference, which can also be combined or directly connected to SU containers.
  • Add 1 is a schematic illustration of exemplary process monitoring for a downstream process
  • FIG. 2 is an illustration of an exemplary spectrum of a protein band with marked wavelength ranges for various models
  • FIG. 3 is an illustration of an exemplary plot of absorption values of the exemplary protein band shown in FIG. 2 corresponding to different concentration samples against the corresponding concentration at three different excitation wavelengths;
  • FIG. 5 is a schematic illustration of an exemplary method for controlling a process
  • the process monitoring is implemented in this example by means of a UV / vis spectrometer 4.
  • the two representations of UV / vis spectrometers 4 shown in FIG. 1 can also be only a single UV / vis spectrometer 4.
  • the at least one UV / vis spectrometer 4 is connected or coupled to an evaluation unit.
  • the evaluation unit 9 in the present case comprises a computer with a desktop b or an output unit or a screen 9 a on which the measured spectra 1 a , 1 b can be displayed or represented.
  • the evaluation unit 9 can comprise an interface for receiving spectra, such as an interface for connecting a data cable.
  • the UV / vis spectrometer 4 can also have a Include an interface for obtaining spectra, so that the data can be tapped, for example, by a device and / or an evaluation unit 9 and / or a data carrier.
  • a réellerundes medium 5 a 7a can pass through a first measuring cell before it passes through the purification unit 6 and passes through.
  • the first measurement line 7a allows the process unit and / or the user to record a first spectrum 5a of the medium.
  • the first measuring cell 7a comprises in particular a flow cell.
  • the medium 5a can in particular comprise one or more substances to be monitored.
  • the medium 5 a can in particular comprise impurities or substances that are to be separated from the medium 5 a.
  • the medium 5 a can comprise HCPs which are to be separated or separated or isolated from the medium 5 a.
  • the medium 5a to be purified can also be examined inside a container.
  • a range of 1 a of the medium to be purified 5a can be at least partially received or measured or detected within a fermentation vessel.
  • the medium 5 passes through a downstream of the first cell 7a, a purification unit 6.
  • the purification unit 6 is particularly designed to isolate or separate the medium 5 a from impurities and / or undesired substances, so that the medium 5b after passing through the purification unit 6 at least essentially no longer includes the undesired substance, for example HPCs.
  • the essentially purified medium 5b only includes what is desired Substances such as target molecules, in particular target proteins and / or salts, in particular buffer substances.
  • the at least partially purified medium 5b leaves the purification unit 6 after the purification step and passes or passes through a further measuring cell 7b.
  • it can also be the first measuring cell 7a, in particular it can be the first cleaned measuring cell 7a, but it is preferred that the cleaned medium 5b passes a non-identical further or second measuring cell 7b, since it may be in the first measuring cell 7a could be contaminated with the impurities.
  • the second measuring cell 7b can, however, be an identical model of the first measuring cell 7a.
  • a further spectrum 1b can be recorded by the UV / vis spectrometer 4.
  • the screen 9 a in FIG. 1 exemplifies a spectrum 1 b, in particular an absorption spectrum of the at least partially purified medium 5 b, which essentially only has band b.
  • the first band a which was still visible in the first spectrum 1 a and which was caused, for example, by the contamination, is at least no longer visible in the displayed spectrum 1 b of the purified medium 5 b.
  • the second band b which is caused, for example, by the target substance, for example by the target protein, is still visible, however. This indicates that the substance which generates the first band a has largely been separated from the medium 5b in the purification unit 6.
  • Two optical light guides 8 are arranged on and / or in the measuring cells 7a, 7b.
  • electromagnetic radiation can be coupled into one of the two optical light guides 8, for example from the side of the UV / vis spectrometer, which emerges from the optical light guide 8 on the side of the measuring cell 7a, 7b and at least partially passes through the measuring cell 7a, 7b, so that an optical light guide 8 on the opposite side of the respective measuring cell 7a, 7b can at least partially detect the transmitted electromagnetic radiation and at least partially transmit or guide it to the UV / vis spectrometer 4.
  • the process monitoring can also take place on and / or in a container.
  • At least one optical light guide can be guided to and / or into a fermentation container so that it can stimulate the medium in the fermentation container by means of coupled light and / or the light that passes or has passed through and possibly stimulated at least part of the medium, can capture or lead to a detector or a sensor.
  • the monitoring can take place at least partially in situ and / or ex situ.
  • elements that may be required for monitoring such as sensors and / or light guides, protrude into the interior of the fermentation vessel and in particular are in direct physical contact with the medium, in particular the fermentation broth (in situ), and / or from the outside , for example on a window with optical access to the interior, so that direct physical contact with the medium can be avoided (ex situ).
  • the measuring cells 7a, 7b in particular have an essentially constant optical path length or thickness.
  • the optical path length of the light or the thickness of the measuring cell 7a, 7b can be between approximately 100 nm and approximately 10 cm, in particular between approximately 500 nm and approximately 5 mm and particularly preferably between approximately 800 nm and approximately 3 mm.
  • FIG. 2 is an illustration of an exemplary spectrum of a protein band with marked wavelength ranges for various models.
  • the absorbance 2 is plotted between about 240 nm and about 360 nm against the wavelength l and thus the spectrum 1 results, in particular the absorption spectrum for a band that has its local maximum between about 270 nm and 280 nm and one on both sides showing falling edge.
  • the absorption band is caused by an exemplary protein.
  • the invention is based on the measurement or acquisition of absorption spectra instead of individual wavelengths and / or wavelength ranges.
  • a medium in a measuring cell for example in a flow cell, which has an essentially constant thickness between approximately 100 nm and approximately 10 cm, in particular between approximately 500 nm and approximately 5 mm and particularly preferably between approximately 800 nm and approximately 3 mm, for example of about 1 mm.
  • various multivariate models are created that are based on the evaluation of different wavelength ranges.
  • the models can be based on PLS, for example, with the concentration of a predetermined protein being defined as the target variable and the absorption values of the respective spectral range serving as input variables.
  • the wavelength ranges can either be selected manually and / or determined using an algorithm and / or weighted differently. All selected wavelength ranges can be influenced by the absorbance of the target analyte (e.g. DNA or protein), the preferably linear range of the detector response or the changes in the matrix, e.g. due to particle scattering or changes in the buffer composition.
  • the target analyte e.g. DNA or protein
  • the preferably linear range of the detector response or the changes in the matrix e.g. due to particle scattering or changes in the buffer composition.
  • individual wavelength ranges are indicated which are each assigned to a model M1, M2, M3, M4.
  • the wavelength range assigned to model M1 is approximately between 270 nm and 280 nm.
  • the wavelength range assigned to model M2 is between approximately 280 nm and 290 nm.
  • the wavelength range assigned to model M3 is between approximately 290 nm and 300 nm and the wavelength range assigned to model M4 is between approximately 300 nm and 310 nm.
  • the individual wavelength ranges have different sensitivities with regard to the detection of the analyte concentration or the concentration of the substance in question.
  • model 1 which is assigned to the wavelength range in which the maximum of the absorption band falls, has a particularly high sensitivity compared to the other models.
  • the models that are assigned to the wavelength ranges that are essentially in the flank of the absorption band each show a decreasing sensitivity compared to one another from model 2 to model 4.
  • the sensitivity decreases with increasing wavelength.
  • the dynamic range thus differs depending on which model M1, M2, M3, M4 is selected. The same applies to the achievable analytical accuracy of the measurement. Compared to the trend in sensitivity, the opposite is true for the absolute measurable concentration of a substance.
  • Model 1 which is assigned to the wavelength range in which the maximum of the absorption band falls, has a low potential for detecting high concentrations. In contrast, this potential increases with increasing wavelength in the present case.
  • the model is based on the wavelengths with the highest absorbance or the maximum of a band, this model has the highest sensitivity, but the upper detection limit is reached quickly even at low substance concentrations.
  • the M4 model is mainly based on wavelength ranges that lie in the flank of the band. This means that the sensitivity is lower, but much higher substance concentrations can be measured. In particular, because of the high sensitivity, the maximum of an absorption band at a relatively low concentration reaches very high values which in particular exceed the dynamic range of a sensor or detector.
  • the individual wavelength ranges have different sensitivities with regard to the detection of the analyte concentration.
  • the dynamic range thus differs depending on the model, the same applies to the achievable analytical accuracy of the measurement.
  • Figure 2 illustrates this. It shows an example of an absorption band of a protein or a protein species. If the model in the core is based on the wavelengths with the highest absorption, this model has the highest sensitivity, but the upper detection limit is reached quickly even at low protein concentrations.
  • model 4 is mainly based on wavelength ranges that lie in the flank of the band. This means that the sensitivity is lower, but much higher protein concentrations can be measured.
  • FIG. 3 shows how the absorbance of the models based on different wavelength ranges of a single band behaves with changing protein concentrations.
  • FIG. 3 is a representation of the plot of absorption values 2 of the protein band shown in FIG. 2 for different concentrations c in each case at three different excitation wavelengths.
  • the protein band shown in FIG. 2 corresponds to only a single selected concentration.
  • the absorption 2 is plotted against the substance concentration c for different wavelength ranges of the protein band with the maximum at about 280 nm.
  • FIG. 3 it is shown in particular how the absorbance 2 of three models based on different wavelength ranges of a single band behaves with changing substance concentrations c.
  • the three models that were selected by way of example with regard to FIG. 3 are assigned wavelength ranges which each include the value of approximately 300 nm, 290 nm and 280 nm.
  • the recorded neighboring data points of a model were each connected with a linear connecting line.
  • models in areas that show essentially linear dependencies between absorbance 2 and concentration c are suitable for the reliable prediction of indeterminate concentrations.
  • the wavelength ranges or the models have different, essentially linear ranges.
  • the plot for about 300 nm shows a linear range over a particularly broad concentration c, namely between about 0 g / l and 150 g / l.
  • the entire range can be used to predict an indeterminate concentration, although the sensitivity or sensitivity of this wavelength to the concentration c is not high compared with the other models.
  • the plot for about 290 nm shows a high sensitivity compared to the plot for about 300 nm.
  • the plot for 280 nm shows a comparatively high sensitivity to changes in the concentration, but only the concentration range below about 10 g / l is linear. With regard to the spectrum shown in FIG. 2, the value of approximately 280 nm is relatively close to the maximum, whereas the other two values of approximately 290 nm and 300 nm lie in the region of the falling edge of spectrum 1.
  • linear areas of different sizes can be used for the evaluation.
  • the three models shown have different sensitivities, especially at low substance concentrations.
  • the model for 280 nm shows the highest sensitivity and thus also measurement accuracy at low substance concentrations, but the model at 300 nm has a much larger linear range up to 150 g / l protein. In this way it is possible to do justice to different applications, for example the monitoring of a DNA concentration and / or the concentration of different proteins, whereby the hardware can be retained and in particular no variation of the optical path length is assumed.
  • FIG. 4 is an illustration of the plot of absorption values for two exemplary bands at two different excitation wavelengths for different concentrations.
  • FIG. 4 shows the respective absorbance of two protein bands at different concentrations.
  • the band at 224 nm changes much more strongly with increasing substance concentration than the band at 280 nm and thus has a higher sensitivity.
  • the linear range for the band at 280 nm is much larger.
  • FIG. 5 is a schematic illustration of an exemplary method 100 for controlling a process. The method begins with step 101, in which a plurality of spectra of a concentration series of a specific substance, the concentration of which is to be determined in a medium or in a sample.
  • the protein to be separated can be a photosynthesis protein.
  • a dilution series can include staggered concentration ranges.
  • the concentrations of a substance can be at constant intervals for predetermined areas, wherein they can increase and / or decrease the constant intervals in areas.
  • the distances can also be selected to be non-constant for at least one area.
  • Such an example of a concentration series is given below: 100 mg / l; 400 mg / l; 700 mg / l; 1g / l; 1.5 g / l; 2 g / l; 2.5 g / l; 5 g / l; 7.5 g / l; 10 g / l; 20 g / l; 30 g / l; 40 g / l; 50 g / l; 75 g / l; 100 g / l; 150 g / l etc.
  • the concentration series preferably only comprises the substance to be determined in different concentrations dissolved in a suitable, essentially physiological solvent, in particular in an aqueous buffer solution, for example in a phosphate-buffered saline solution or a TBS buffer.
  • a suitable, essentially physiological solvent in particular in an aqueous buffer solution, for example in a phosphate-buffered saline solution or a TBS buffer.
  • the solution can also comprise a detergent and / or an addition of another substance to prevent possible denaturation of the substance.
  • a measuring cell with a constant gap width or sample layer thickness is used to record the spectra of the concentration series.
  • two optical light guides can be arranged at a constant distance at least partially within a container in which the medium is at least partially, one non-conductor being designed to emit light or electromagnetic radiation into the medium and the other light guide designed to do so is to at least partially absorb the transmitted radiation and forward it to an evaluation unit and / or the UV / vis spectrometer.
  • At least one spectrum is recorded, in particular in a range between approximately 200 nm and 700 nm.
  • suitable models for different concentration ranges are created in step 102.
  • multivariate models are created, preferably using partial least square (PLS) regression, orthogonal RLS (OPLS) regression and comparable regression concepts.
  • hierarchical models can be selected, each model covering a specific concentration range.
  • the rule is that the precision is high for low concentrations and decreases at higher concentrations and, as a result, model errors may occur.
  • the method 100 offers two combinable options, namely option A, a global model and option B, a local model.
  • the global model of option A includes the exemplary sub-models, namely models M1, M2 and M3, each based on spectra measured, for example, between approximately 0 g / l and 5 g / l, between approximately 0 g / l and 25 g / l and between about 0 g / l and 75 g / l. Additionally or alternatively, a local model can also be used.
  • the local model of option B includes the exemplary sub-models, namely models M4, M5 and M6, each based on spectra measured, for example, between approximately 0 g / l and 5 g / l, between approximately 5 g / l and 25 g / l and between about 25 g / l and 75 g / l.
  • the main difference between option A and option B is that for option B, the models M4, M5 and M6 do not all start at around 0 g / l, only the first model M4.
  • a hierarchical model can be selected that includes a global model (option A) over the entire concentration range (for example between about 0 g / l and 75 g / l) and represents a top hierarchy and further sub-models M4, M5, M6 (option B ) for individual concentration ranges (for example staggered between about 0 g / l and 75 g / l).
  • Sub-models are generally based on unsaturated spectra or spectral ranges, which are determined, for example, by means of an OPLS / PLS algorithm and / or by plotting the absorbance against the concentration of the relevant wavelengths. In other words, is the goal of a model in particular, to build on unsaturated spectral ranges. This applies to both the global model and the sub-models.
  • the linear range of each plot is determined with respect to each selected wavelength, which is followed by a decision as to whether the selected wavelength of a model can be used for a specific concentration range. In the linear range, the slope of the detector signal is usually maximum when the concentration changes.
  • the slope gradually decreases until there is essentially no change in the detector signal with a further increase in concentration.
  • the non-linear area can still be evaluated, but the prediction accuracy is lower in this area and the model is more complex, for example due to additional main components.
  • Standard MVDA methods are usually multilinear methods and therefore these non-linearities or non-linear areas cannot be optimally modeled. Therefore, linear areas of the plot are particularly suitable for determining an undetermined concentration of a substance.
  • a data set for modeling comprises a large number of spectra of samples with a known analyte content (eg protein).
  • Input variables are a large number of intensities at different wavelengths (X values) as well as reference values such as protein content or concentration (Y values).
  • the algorithm finds correlations in the multivariate space of the X values, which correspond to the course of the Y values. It is in particular the reference book “Multi- and Megavariate Data Analysis - Basic Principles and Applications” (3rd Edition) by L. Eriksson et al. referenced, in which (especially the 4th chapter) a detailed introduction to modeling, especially using PLS, can be found.
  • step 103 an online measurement or a real-time measurement of at least one sample spectrum of a sample or a medium, which in particular includes the substance to be determined, is recorded.
  • the term online measurement or real-time measurement relates to the fact that the medium or the sample is examined immediately before and / or after and / or during a process, so that a dynamic or direct based on the determined concentration of the substance is examined or several process parameters can be influenced.
  • step 104 the sample spectrum that was recorded in step 103 is classified in or assigned to at least one suitable model. Possible methods for classification include, for example, PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis), SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy) calculations of the Euclidean distances or a dendrogram.
  • the sample spectrum is compared with the spectrum sets of the individual models and a classification according to the best fit or best fit result is made.
  • a classification according to the best fit or best fit result is made.
  • at least one, but preferably several absorption values of a sample spectrum are compared with the corresponding absorption values of the spectra of different models.
  • the classification can also be based on process knowledge or known process parameters, e.g. on known concentration ranges of the process step.
  • the sample spectrum results in particular from a measurement, in particular from an online measurement in the process.
  • an optimally applicable model can be selected.
  • One criterion can, for example, be the expected concentration of the sample. Due to the process, the user can therefore classify relatively roughly whether the concentration of the sample is, for example, around 15 g / l or around 150 g / l, but a fine classification can only be made using the correspondingly selected model. It may therefore not be possible to estimate whether the concentration is around 12 g / l, 15 g / l or 17 g / l without a suitable model.
  • a suitable model would be, for example, a model between 5 and 20 g / l.
  • step 105 the model is applied to the sample spectrum in order to essentially at least approximately determine or predict the unknown concentration of the substance.
  • the prediction value or the determined concentration of the substance is then output by the computing unit in step 106 and passed on or sent to the process control in step 107.
  • the process control On the basis of the concentration value determined, the process control, to which this value is passed, can, in step 108, refer to the process in the desired Take influence. In this way, a process can be controlled and / or regulated based on a specific prediction value.
  • step 104 a current spectrum or a sample spectrum is assigned to a suitable model. With the aid of the selected model, the current or the concentration of the substance to be determined is determined in step 105.
  • step 106 the determined value for the concentration of the substance is output to an interface or an interface and passed on to a control unit in step 107.
  • the process control which receives the prediction value, can influence the process, in particular one or more process parameters, to the desired extent in step 108.
  • the modeling in particular the generation of several quantitative models based on the spectra of the concentration samples, is expressly different from a usual calibration.
  • a typical calibration can essentially be based on a linear regression between a wavelength and a protein concentration.
  • a linear regression is essentially based on a fit or a comparison calculation with a linear model.
  • a calibration can also be based on non-linear models.
  • the modeling described here is based in particular on PLS models.
  • PLS models are based on the main components of two matrices X and Y.
  • the main components should be calculated separately for the matrices X and Y in order to create a regression model between the entries or scores of the main components (and not the original data).
  • the matrix X is broken down into a matrix T (the "Score” matrix) and a matrix P "(the” Loadings "matrix) plus an error matrix E.
  • the matrix Y is broken down into the matrices U and Q and the error term F.
  • This equation can also be referred to as the "inner relationship".
  • the control can in particular have valves and pumps. Otherwise, the corresponding collected volume can be discarded, especially if it contains impurities.
  • changes in the pH value, conductivity, concentration and / or other parameters can be achieved by means of appropriate additions of substances and, in particular, these and / or other parameters can be regulated.
  • spectrum essentially means the absorption spectrum.
  • the term can also refer to an intensity spectrum, provided that absorption spectroscopy is not involved. This is the case, for example, for Raman spectroscopy, which does not measure the absorbance of light, but rather light with a “shifted” wavelength, triggered by the inelastic scattering of light on molecules. Without being restricted to UV / vis spectroscopy, however, the present embodiments essentially relate to the absorption spectra generated thereby.
  • sample is not limited to a random sample that can be examined ex-situ outside a container, for example outside a bioreactor. Rather, the term sample relates to the medium, in particular a liquid, a gas, a solid and / or any mixture thereof, which comprises the substance and is essentially located within the container during the measurement.
  • the sample is measured in particular in situ, i.e. essentially within the container in which the process also takes place. In particular, the sample is also not discarded but essentially remains with the entire medium in the container and, if necessary, remains exposed to all further process steps.
  • a sample may not be an identical medium. That is, the sample can mean the medium that happens to get into the measuring cell, for example into a flow cell, and is analyzed there.
  • the molecules and or atoms must must not necessarily be the same for each measurement of a permanent monitoring, rather the sample is determined by chance with each measurement.
  • the sample is particularly representative of the bulk.
  • the sample is particularly representative of the amount in the corresponding hose area.
  • HCPs Host cell proteins
  • the host cell can express HCPs or, on the other hand, it itself consists of HCPs, which are released upon cell disruption or cell death. During the cleaning process, most of the HCPs are usually removed (especially> 99%). If necessary, however, the remaining amounts of HCP can remain in the products, such as monoclonal antibodies (mAbs), antibody-drug conjugates (ADCs), therapeutic proteins, vaccines and other protein-based biopharmaceuticals, among others.
  • mAbs monoclonal antibodies
  • ADCs antibody-drug conjugates
  • a UV / vis spectrometer which is designed to detect essentially spectral information, can have a broadband light source.
  • an essentially broadband emission spectrum can also be generated through the use of several narrow and / or broadband emitting light sources.
  • An example of a light source emitting essentially broadband is a deuterium lamp (D2 lamp) or a halogen lamp.
  • narrowband ig with regard to the emission spectrum of an LED light source relates to light sources that emit electromagnetic radiation with an FWHM (spectral half-width) of values that are less than about 50 nm, in particular less than about 30 nm and particularly preferably less than are about 15 nm.
  • a light source with an FWHM of approximately 10 nm is a narrow-band light source.
  • one or more narrow-band emitting light sources are used to determine the extinction and, accordingly, a concentration of a very specific substance that absorbs electromagnetic radiation at a specific wavelength.
  • An example of the use of several such light sources is based on two light sources with each one FWHM of about 10 nm, each of which has maximum emission values or peak wavelengths at about 250 nm and about 280 nm.
  • the sensor can be selected in accordance with the selected light source and the corresponding emission spectrum, regardless of whether it emits narrow or broadband, in order to be able to detect at least part of the emission spectrum. In other words, it makes sense that the emission spectrum of the light source overlaps with the sensitive area of the sensor, in particular by more than about 50% and preferably by more than about 70%.
  • Sensors can also have, in particular, sensor elements with different sensitive wavelength ranges, which are designed to be able to detect electromagnetic radiation in wavelength ranges that are not identical to one another.
  • the light source or light sources is or are preferably designed to emit electromagnetic radiation in a wavelength range that is visible to humans, i.e. between about 380 nm and about 780 nm and in the UV range is between about 10 nm and about 380 nm.
  • the light source can also be designed to emit electromagnetic radiation in the infrared range, that is to say between approximately 780 nm and approximately 50 mhti.
  • the senor can be matched to the emission range.
  • An exemplary method for controlling or regulating a process can proceed as follows: 1. Detection of UV-Vis spectra from a concentration series
  • the highest concentration of a sample within a model is determined by the maximum absorbance in the corresponding wavelength range (model 1 with focus on 224 nm only includes samples from 0-2 g / l, model 5 with Focus on 300 nm includes all samples between 0 and 200 g / l b.
  • various calibration data sets can be created from the concentration series. From these, various models are then created using statistical methods (e.g. PLS). In this case, the Algorithm to redefine the wavelength ranges for each calibration data set (and will thus mainly select wavelengths in the flank of the protein band for models with high protein concentrations (and also not use the band at 224 nm)
  • the protein concentrations differ considerably (0-200 g / l), which is why the samples can usually only be measured conventionally in different dilution stages.
  • the optical path length must be changed depending on the concentration range in order to be able to expand the detection range if necessary. This means that one and the same hardware cannot be used for all applications.
  • existing UV sensors show considerable cross-sensitivity between DNA and protein. An increase in the DNA concentration therefore also leads to a higher measured protein content.
  • a sensor can also detect concentrations of about 50 g / l in the usual way if the path length is reduced accordingly. It must therefore be decided in advance whether a higher sensitivity and a limited concentration range or a broader concentration range and lower sensitivity is to be achieved. This is then determined in advance by choosing the path length.
  • the method according to the invention has the advantage that, without changing the hardware, a decision can be made retrospectively as to whether a high sensitivity or a higher concentration range or higher concentrations should generally be measured.
  • HCPs host cell proteins
  • a fiber was alternatively designed to be movable beforehand for the UV transmission measurement, so that the path length can be varied reproducibly and can also be chosen to be much smaller than the minimum path length of, for example, about 1 mm that is usual for UV sensors.
  • protein concentrations above 100 g / l can also be recorded.
  • the distance between the fibers must be adjustable in a highly precise and reproducible manner.
  • implementation can only be transferred to use in single-use systems under certain circumstances.
  • the method described herein for controlling or regulating a process is based in particular on the measurement of complete absorption spectra - instead of individual wavelength ranges - preferably using a flow cell with a constant optical path length.
  • a preferred flow cell thickness or sample layer thickness is approximately 1 mm.
  • various multivariate models e.g. PLS with protein as the target variable and the absorption values of the respective spectral range as input variables
  • PLS protein as the target variable and the absorption values of the respective spectral range as input variables
  • wavelength ranges can either be selected yourself or, with all selected wavelength ranges being influenced by the absorbance of the target analyte (DNA or protein).
  • the invention allows a precise determination of concentrations for DNA and / or proteins.
  • absorption spectra instead of values at discrete wavelengths
  • a data set is compiled into a concentration range and multivariate models are generated with regard to the results within different wavelength ranges.
  • Selected wavelength ranges show different sensitivities to DNA and / or protein. Individual wavelength ranges have different sensitivities.
  • the dynamic range (dynamic ranks) is different.
  • model 1 is assigned to the absorbance at the highest sensitivity, the dynamic range being correspondingly limited.
  • Model 4 is generated with reduced sensitivity, but the concentration range to be used can be expanded. The concentration values are determined by comparing the collected data with predefined models.
  • the invention makes it possible to avoid the usually required dilution of the samples during the measurement with regard to the limited dynamic range of the sensor.
  • cross-sensitivity when measuring between DNA and protein can be reduced or avoided.

Abstract

Verfahren zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses (3), insbesondere eines Downstream-Bioprozesses, basierend auf der Vorhersage einer unbekannten Konzentration von mindestens einer Substanz in einer Probe (5a, 5b) mittels Spektroskopie, insbesondere UV/vis-Spektroskopie, umfassend die Schritte: Erfassung (101) von Spektren (1) einer Mehrzahl von Konzentrationsproben, wobei mindestens zwei Konzentrationsproben mit unterschiedliche Konzentrationen der Substanz aufweisen; Generierung (102) mehrerer quantitativer Modelle (M) auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben, wobei die Modelle (M) jeweils eine Zuordnung zumindest einer spektralen Messgröße (2) der Spektren (1) zu Konzentrationen in Konzentrationsbereichen aufweisen, wobei die Konzentrationsbereiche zweier Modelle (M) nicht identisch sind; Erfassung (103) mindestens eines Probenspektrums (1; 1a, 1b) der Probe (5a, 5b); Zuordnung (104) des Probenspektrums (1; 1a, 1b) zu mindestens einem quantitativen Modell (M) der generierten quantitativen Modelle (M); Anwendung (105) des mindestens einen quantitativen Modells(M), welches dem Probenspektrum (1; 1a, 1b) zugeordnet wurde, auf das Probenspektrum (1; 1a, 1b), um einen Vorhersagewert für die unbestimmte Konzentration zu ermitteln; und Steuern und/oder Regeln (108) des Prozesses (3) bezüglich mindestens eines Parameters auf Basis des Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.

Description

"Prozesssteuerung/-rege!ung auf Basis einer spektroskopischen Bestimmung unbestimmter Substanzkonzentrationen"
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Computerprogrammprodukt zum Bestimmen einer unbestimmten Konzentration von mindestens einer Substanz, insbesondere einer biologischen Substanz wie beispielsweise eines Proteins oder einer DNA in einer Probe mittels Spektroskopie, insbesondere mittels UV/vis-Spektroskopie oder mittels Infrarot-, Raman- und/oder Fluoreszenzspektroskopie.
Bevorzugt kann die Erfindung realisiert werden in der breiten Bioprozessindustrie, einschließlich der Bereiche von Umwelt-, Agrar- und Lebensmittelindustrie, Biokraftstoffe und Pharmazeutika.
In Reinigungsschritten, insbesondere in Downstream-Prozessen, die in der Regel zur Abtrennung und Reinigung von Fermentationsprodukten aus einer Fermentationsbrühe eines biotechnologischen Prozesses angewandt werden, sind Konzentrationen von Substanzen, insbesondere Protein- und DNA-Konzentrationen wichtige Parameter bzw. Größen, die in der gesamten Prozesskette verfolgt und immer wieder bestimmt werden müssen. Diese Bestimmung erfolgt meist offline, insbesondere als Stichprobe außerhalb des Behälters, in dem eine Fermentationsbrühe chemische und/oder biochemische Prozesse durchläuft und nicht in Echtzeit. Eine Fermentationsbrühe kann beispielsweise als biotechnologisches Medium verstanden werden, insbesondere als ein Produkt, das ein Medium sein kann, welches zumindest ein Protein und/oder ein Vaccin und/oder ein Hormon aufweist.
Die Bestimmung bzw. Messung der Konzentrationen von Substanzen erfolgt oft mittels optischer Spektroskopie, insbesondere mittels UV/vis -Absorptionsspektroskopie. In der Regel werden dazu die Moleküle der Substanz einer Probe der Fermentationsbrühe mit einzelnen, insbesondere im Wesentlichen vorher festgelegten diskreten Wellenlängen, die Anregungswellenlängen bzw. Anregungsfrequenzen i entsprechen, angeregt und die Absorbanz bzw. Extinktion oder alternativ die Intensität wird bei diesen im Wesentlichen diskreten Anregungswellenlängen bestimmt, um die Konzentration zu ermitteln. Beispielsweise werden dazu oft schmalbandige Sensoren verwendet. Die Sensoren müssen jedoch nicht zwingend schmalbandig sein. Meistens ist die Anregung bei Sensoren im Wesentlichen schmalbandig wohingegen der Wellenlängenbereich relativ breit detektiert bzw. erfasst werden kann. In anderen Worten wird einerseits nur das schmalbandige Licht zur Anregung verwendet wird wohingegen der gemessene oder messbare Wellenlängenbereich relativ breit sein kann. Bei Spektrometern mit solchen Sensoren wird oft ein dispersives Element, wie beispielsweise ein Gitter, ein Prisma, etc. verwendet.
In Spektrometern, die dazu ausgelegt sind, spektrale Information zu erfassen, werden hingegen i.d.R. breitbandig emittierende Lichtquellen (auch breitbandige Lichtquellen genannt) und entsprechend breitbandig detektierende Sensoren (auch breitbandige Sensoren genannt) verwendet. Eine breitbandige Lichtquelle kann z.B. eine Deuterium-Lichtquelle oder eine Halogenlichtquelie sein.
In unterschiedlichen Stufen der Aufreinigung bzw. in unterschiedlichen Prozessschritten können sich die Substanz- insbesondere die Proteinkonzentrationen erheblich unterscheiden. Die Werte für Substanzkonzentrationen können beispielsweise zwischen etwa 0 und etwa 200 g/l variieren. Oft ist die Hardware, beispielsweise die Messzelle oder der Sensor nicht für alle Teilbereiche der erreichten Konzentrationen geeignet. Beispielsweise erlauben viele verfügbare Online Sensoren aufgrund des limitierten dynamischen Bereichs der Detektoren nur eine Bestimmung von Substanzkonzentrationen bis etwa 10 g/l. Hinzu kommt, dass die optische Weg- bzw. Pfadlänge je nach Konzentrationsbereich angepasst werden muss, um ggf. den Detektionsbereich verschieben zu können bzw. um auch andere Substanzkonzentrationen messen zu können. Somit kann ggf. nicht ein und dieselbe Hardware, insbesondere nicht dieselbe Messzelle für alle Anwendungen, insbesondere für alle Reinigungsschritte genutzt werden.
Darüber hinaus können UV-Sensoren oft eine erhebliche unerwünschte Kreuzempfindlichkeit zwischen DNA und Protein aufweisen. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn eine Erhöhung der DNA-Konzentration zu einer vermeintlich höheren gemessenen Proteinkonzentration führt. Beispielsweise kann es Vorkommen, dass eine Absorptionsbande für DNA mit einer Absorptionsbande für ein Protein überlappt. Da die Banden nicht isoliert vorliegen und mittels Sensoren nicht separat und unabhängig erfasst werden können, besteht das Problem oft dann, eindeutig zu unterscheiden und zu identifizieren, welche Substanzen (hier das Protein oder die DNA) sich in welchem Ausmaß bezüglich Konzentration verändert hat.
Es gibt Online-UV-Sensoren, die mit 1 oder 2 einzelnen Wellenlängenbereichen arbeiten (Optek, Pendotech), die aber bereits bei relativ niedrigen Proteinkonzentrationen gesättigt sind. In Spektrometern, die dazu ausgelegt sind, relativ breite spektrale Information zu erfassen, werden hingegen oft breitbandige Sensoren verwendet. Ein UV-Vis Spektrum kann entsprechend neben der Information typischer UV-Sensoren eine Vielzahl weiterer Anregungswellenlängen bzw. - frequenzen aufweisen. In anderen Worten kann ein Spektrum, das von einer Lichtquelle emittiert wird, durchaus breiter bzw. umfangreicher sein, als der Teil, der von dem Sensor gemessen bzw. erfasst wird. Dabei kommt es auf die Wahl Sensoren und der Lichtquelle(n) an. Solche UV/vis-Spektrometer können entsprechend ein oder etwa zwei (unter Umständen auch mehrere) Lichtquellen umfassen, die entsprechend ein oder zwei Anregungswellenlängen erzeugen. Entsprechend der Tatsache, dass z.B. zwei schmalbandig emittierende Lichtquellen verwendet werden können, können entsprechende Sensoren jeweils dazu ausgelegt sein in dem Wellenlängenbereich, das von Interesse ist, elektromagnetische Strahlung zu erfassen. So können UV- Sensoren wenige schmalbandige Anregungswellenlängen erfassen, insbesondere eine oder zwei, die jeweils etwa 10 nm in der Wellenlängenbreite aufweisen. Beispielsweise können die zentralen Wellenlängen, also die Wellenlängen, bei denen das Maximum liegt, bei etwa 250 nm und/oder etwa 280 nm liegen.
Es kann unter Umständen Vorkommen, dass das Nutzsignal in die Sättigung läuft. Ein Problem, das sich durch die Sättigung ergibt ist das Verhalten der Absorbanz bei einer definierten Wellenlänge und einer festen optischen Weglänge. Diesem Zusammenhang liegt das Lambert-Beer-Gesetz zugrunde: Wobei A der Absorbanz entspricht, 1Q der Intensität des einfallenden Lichtes entspricht, I der Intensität des Lichtes, welches die Probe passiert entspricht, el dem dekadischer Extinktionskoeffizienten bei der Wellenlänge 1 entspricht, c der Stoffmengenkonzentration der absorbierenden Substanz entspricht und d der Schichtdicke der Probe bzw. der Weglänge des Lichtes durch die Probe entspricht.
Das Problem der Sättigung tritt insbesondere bei hohen Absorbanzen A auf, da auf dem Messkanai die Intensität / bei hohen Konzentrationen c extrem klein wird und damit ggf. nicht mehr vom Rauschen des Detektors unterscheidbar ist. Daher geht bei hohen Konzentrationen c die Intensität / gegen null und damit wird A groß und das Verhalten des Nutzsignals A geht in einen nichtlinearen Sättigungsverlauf wegen des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) des Detektors.
Darüber hinaus können unterschiedliche Substanzen, insbesondere unterschiedliche Proteine Absorptionsbanden aufweisen, die jeweils im Wesentlichen zentriert um unterschiedliche Anregungswellenlängen ein Maximum aufweisen. In anderen Worten kann die zentrale Wellenlänge einer Absorptionsbande bzw. eines Absorptionsmaximums für verschiedene Proteine variieren. In der Regel passen die handelsüblichen UV/vis-Spektrometer die Anregungs- und/oder Detektionswellenlänge nicht an den aktuell zu messenden Substanzen insbesondere das aktuell zu messende Protein an. Somit unterliegt es dem Zufall, ob ein Protein zufällig im Maximum oder in der Nähe des Maximums der Absorptionswellenlänge gemessen wird bzw. ob die Moleküle eines Proteins mit der Anregungswellenlänge angeregt werden, um das die Absorptionsbande des Proteins zentriert ist bzw. zu dieser Anregungswellenläng ein Maximum aufweist. Mit hoher Wahrscheinlichkeit kann die zuvor festgelegte Anregungswellenlänge jedoch jenseits des Wellenlängenbereichs liegen, bei dem die Absorptionsbande ein Absorptionsmaximum aufweist. Beispielsweise kann die zuvor festgeiegte Anregungswellenlänge mit einem Flankenbereich einer Absorptionsbande überlappen.
Das Maximum ist insbesondere dann entscheidend bzw. relevant, wenn man zu geringeren Konzentrationen (kleinerer LOD) tendiert werden soll. Ein besseres Dynamikverhalten liegt jedoch meist auf der Flanke vor. Ein Flankenbereich, also ein Wellenlängenbereich, für den die Absorption zu höheren oder niedrigeren Wellenlängen um das Absorptionsmaximum abfiacht, weist üblicherweise eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Änderungen in der Konzentration auf. Das Maß der Kreuzempfindlichkeit hängt darüber hinaus auch insbesondere von den wellenlängenabhängigen Extinktionskoeffizienten eAdes Ziel- Proteins und der Verunreinigungen (HCP) zusammen und deren Konzentrtationsverhältnis. Aus diesem Grund werden oft Absorptionswerte von host cell Proteinen (HCPs) zusammen mit denen für Zielproteine erfasst (Kreuzempfindlichkeit ist nahe 100%) und eine Isolierung der jeweiligen Beiträge beider Absorptionswerte zur Analyse der jeweiligen Konzentration beider Substanzen ist kaum möglich.
Ein Ansatz, der dazu führt, dass ein breiter Bereich verschiedener Konzentrationen mittels UV/vis-Spektroskopie gemessen werden kann, umfasst eine reversible Änderung der optischen Weglänge durch eine Messzelle, welche die Probe beinhaltet. Dabei wird bei der Transmissionsmessung von UV/vis-Spektren eine Faser beweglich gestaltet, sodass die optische Weglänge reproduzierbar variiert werden kann (FlowVPE). Somit kann eine optische Weglänge auch weitaus kleinere Werte aufweisen als die bei UV-Sensoren übliche minimale Pfadlänge von etwa 1 mm. Auf diese Weise lassen sich auch Substanzkonzentration, insbesondere Proteinkonzentrationen über 100 g/l erfassen. Dieser Ansatz hat zur Folge, dass es bewegliche Teile in der Vorrichtung gibt und der Abstand zwischen den Fasern hoch präzise und reproduzierbar einstellbar sein muss. Kleinere Pfadlängen haben jedoch den Nachteil, dass hohe Konzentrationen meist mit hohen dynamischen Viskositäten einhergehen, was unter Umständen einen Nachteil für die Fluidik (inkl. Druckabfall, Scherströmungen etc.) darstellen kann.
Gemäß einem Aspekt besteht die Aufgabe in der Bereitstellung eines Verfahrens, einer Vorrichtung und einem Computerprogrammprodukt zur Bestimmung einer unbestimmten Konzentration von mindestens einer Substanz in einer Probe über einen großen Konzentrationsbereich.
Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der jeweiligen Hauptansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Generierung quantitativer Modelle, insbesondere auf multivariater Datenanalyse. Wesentliche Konzepte multivariater Datenanalyse, wie beispielsweise PLS, OPLS, multivariate Kalibrierung, multivariate Prozessmodellierung, hierarchisches Modellieren usw. werden in dem Fachbuch „Multi- and Megavariate Data Analysis - Basic principles and Applications“ (3rd Edition) von L. Eriksson et ai. detailliert beschrieben.
Die folgenden Aspekte lassen sich in unterschiedlichen Ausführungsformen, auch falls nicht explizit genannt, miteinander kombinieren, sofern sie sich nicht gegenseitig logisch ausschließen.
Gemäß einem Aspekt umfasst ein Verfahren zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses, insbesondere eines Downstream-Bioprozesses, basierend auf der Vorhersage einer unbekannten bzw. unbestimmten Konzentration von mindestens einer Substanz in einer Probe bzw. in einem Medium mittels Spektroskopie, insbesondere mittels UV/vis-Spektroskopie, die Schritte:
Erfassung von Spektren, insbesondere von optischen Spektren, bevorzugt von Absorptionsspektren und/oder Anregungsspektren einer Mehrzahl von Konzentrationsproben wobei mindestens zwei Konzentrationsproben zueinander unterschiedliche Konzentrationen der Substanz aufweisen;
Generierung mehrerer quantitativer Modelle auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben, wobei die Modelle jeweils eine Zuordnung und/oder eine Auftragung zumindest einer spektralen Messgröße der Spektren zu Konzentrationen in Konzentrationsbereichen umfassen, wobei die spektrale Messgröße insbesondere eine Absorbanz und/oder eine Intensität der Spektren umfasst und wobei die Konzentrationsbereiche zweier Modelle nicht identisch sind, insbesondere überlappen zwei Konzentrationsbereiche oder grenzen aneinander an;
Erfassung mindestens eines Probenspektrums der Probe bzw. des Mediums;
Zuordnung des Probenspektrums zu mindestens einem quantitativen Modell der generierten quantitativen Modelle; Anwendung des mindestens einen quantitativen Modells, welches dem Probenspektrum zugeordnet wurde, auf das Probenspektrum, um einen Vorhersagewert für die unbestimmte Konzentration zu ermitteln; und
Steuern und/oder Regeln des Prozesses bezüglich mindestens eines Parameters auf Basis des Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
Eine unbestimmte Konzentration betrifft vorliegend insbesondere eine unbekannte oder noch nicht mittels Referenzanalytik ermittelte Konzentration. Die Vorhersage mittels des Verfahrens erzielt insbesondere eine Bestimmung der Konzentration.
Anders als in üblichen Verfahren, in denen lediglich Absorptionswerte zu diskreten Wellenlängen erfasst werden, können unter diesem Aspekt eine ganze Reihe bzw. ein Satz von Absorptionswerten zu einem Wellenlängenbereich aufgezeichnet werden. Insbesondere werden ganze Spektren, insbesondere Absorptions- oder I ntensitätsspektren von Verdünnungsproben einer Ver ünnungsreihe und einer Probe aufgezeichnet bzw. erfasst. In anderen Worten werden Spektren, beispielsweise ein Absorptionsspektrum statt einzelne Werte wie beispielsweise eine Absorbanz zu einer Anregungswellenlänge aufgezeichnet.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass eine einzige Messzelle mit einer konstanten optischen Weglänge für die Messungen verwendet werden kann. Insbesondere eignet sich eine Flusszelle mit konstanter optischer Weglänge. Besonders bevorzugt ist dabei eine Flusszelle, die eine Probenschichtdicke bzw. eine optische Weglänge bzw. eine Breite des Innenraums zwischen etwa 10 pm und etwa 10 cm, insbesondere zwischen etwa 15 pm und etwa 5 mm und besonders bevorzugt zwischen etwa 50 pm und etwa 3 mm aufweist. Eine besonders bevorzugte Probenschichtd icke liegt bei etwa 1 mm. Dies hat den Vorteil, dass eine oder mehrere Proben mit ein und derselben Messzelle mehrmals bzw. wiederholt untersucht werden kann.
Je nachdem, welcher Prozess überwacht werden soll, kann das Verfahren für das jeweilige zu untersuchende Medium umfassend die in Frage stehende Substanz adaptiert werden. Das Verfahren kann insbesondere Anwendung zur Überwachung eines Downstream-Prozesses finden. Alternativ oder zusätzlich kann das Verfahren auch Anwendung zur Überwachung einer Fermentation und/oder eines Upstream- Prozesses finden.
Bei einer Fermentation, die Teil eines Upstream-Prozesses sein kann, bietet sich beispielsweise an, die Fermentationsbrühe innerhalb eines Bioreaktors zu überwachen. Bei einem Downstream-Prozess bietet sich beispielsweise an, die zu trennende und/oder das zu reinigende Medium, beispielsweise die fermentierte Brühe mit dem Zielprotein und/oder der Ziel-DNA in einem Reinigungsschritt, beispielsweise vor, an, in und/oder hinter einer Filtrationsanlage und/oder einer Dialyseeinheit zu überwachen.
Beispielsweise kann das Verfahren besonders vorteilhaft zur Analyse eines Mediums, insbesondere eines fluiden Mediums in einem SU Bioreaktor ausgeführt werden, sofern ein Prozess in dem Bioreaktor überwacht werden soll. Ein solcher SU Bioreaktor, der beispielsweise einen SU Beutel und/oder einen anderen SU Behälter und/oder einen Schlauch mit Durchfiussmesszelle, bevorzugt eine SU-Flusszelle aufweisen kann, beinhaltet insbesondere eine Fermentationsbrühe, die chemische und/oder biologische und/oder biochemische Prozesse durchläuft. Die Fermentationsbrühe wird anschließend im Downstream, bevorzugt bei der Aufreinigung überwacht. Zur Überwachung der Vorgänge bzw. Prozesse innerhalb des Behälters wird der Inhalt zeitlich wiederholt analysiert und/oder zeitweise permanent analysiert.
Ein Behälter kann dazu beispielsweise mit einem Sensor ausgestattet sein. Alternativ oder zusätzlich kann ein Behälter mit einer Bypassieitung oder Probenahmeleitung und einer Flusszelle ausgestattet sein. Alternativ oder zusätzlich kann an dem Behälter ein Wandungsvorsprung mit Messbereich angeordnet bzw. vorgesehen sein. An der Flusszelle und/oder an dem Wandungsvorsprung kann direkt oder indirekt ein Spektrometer angeordnet sein, welches dazu ausgelegt ist, wiederholt oder dauerhaft bzw. permanent Daten, insbesondere Absorptionsmesswerte zu erfassen. So können über einen längeren Zeitraum, beispielsweise über viele Stunden Spektren erfasst werden, um die Prozesse über diesen Zeitraum zu verfolgen. Beispielsweise kann somit die Konzentration eines Proteins und/oder einer DNA verfolgt und/oder überwacht werden. In einem System zur Produktaufreinigung, insbesondere zur Proteinaufreinigung können beispielhaft folgende Downstream-Schritte Vorkommen:
1. Zellabtrennung (Clarification)
2. Product capture (bind & elute)
3. Polishing Schritte (Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie)
4. Aufkonzentierungen und/oder Pufferaustausch, wie z.B. Ultra- und/oder Diafiltration im Crossflow setup.
5. Abreicherung von Viren, durch einen Filtrationsschritt und/oder Inaktivierung von Viren z.B. durch pH-Shift oder UV-C Behandlung, ...
6. Sterilfiltration
7. Füllprozesse (incl. Freeze and Thaw)
Darüber hinaus besteht ein Vorteil dieses Aspekts darin, dass verschiedene Substanzen bzw. Stoffe isoliert voneinander analysiert werden können, sofern deren Banden ihr lokales Absorptions- oder Intensitätsmaximum nicht bei identischen Wellenlängen aufweisen. Unterscheidet sich beispielsweise das Absorptionsmaximum eines „host cell proteins“ (HCPs) in seiner Anregungswellenlänge und/oder in seiner Form von dem des Zielproteins, so kann mittels der Erfassung eines gesamten Spektrums eine analytische Unterscheidung ermöglicht werden. Bei der Unterscheidung kommt es jedoch im Wesentlichen auch auf das Absorptionsspektrum im Vergleich zum Spektrum des Zielanalyten an. Insbesondere kommt es auf die Breite des Peaks, auf das Maximum und die Form des Peaks an. Eine Überlagerung mehrerer Proteinpeaks der HCPs können dann eine Struktur im Bereich der Proteinabsorption ergeben, die nicht zwingend einer Gauss-ähnlichen Absorptionsbande entspricht. Somit können sogenannte Kreuz-Empfindlichkeiten der Messmethode unterdrückt und/oder umgangen werden. Damit kann eine effektive Qualitätskontrolle des Mediums erfolgen, sodass möglichst genau bestimmt werden kann, wie hoch der jeweilige Anteil an beispielsweise HCP und/oder an Zielprotein in dem Medium vorliegt. Darauf basierend kann abgeschätzt werden, ob weitere Reinigungsschritte notwendig sind.
In anderen Worten erlaubt der genannte Aspekt insbesondere die Messung von im Wesentlichen kontinuierlichen Absorptionsspektren oder Absorptionsspektren umfassend diskrete Messpunkte, anstatt einer Messung von lediglich einzelnen Absorptionswerten bei im Wesentlichen singulären Wellenlängen oder einer Messung einzelner Absorptionswerte bei relativ schmalen Wellenlängenbereichen. Beispielsweise kann ein kontinuierliches Absorptionsspektrum zwischen einem Wellenlängenbereich von etwa 280 nm und etwa 750 nm erfasst werden, wohingegen eine übliches bekanntes Verfahren beispielsweise eine Messung zwischen etwa 310 nm und 320 nm erlaubt. Die Halbwertsbreite (FWHM - Full width at half maximum) kann bei LEDs relativ schmalbandig sein und beispielsweise etwa 10 nm betragen. Bevorzugt beruht die Absorptionsspektroskopie, insbesondere die UV Absorptionsspektroskopie und die entsprechenden Sensoren auf einer vergleichsweise breitbandigen Anregung bzw. auf einem breitbandig emittierten und entsprechend erfassten Spektrum. Lichtquellen können beispielsweise eine Deuterium-Lampe und/oder eine Xenonlampe und/oder eine oder mehrere LEDs darstellen.
Die Erfindung basiert auf dem Lambert-Beer-Gesetz. Insbesondere wird vermieden, dass bei fester Wellengänge (bzw. bei wenigen vorher über die Lichtquelle oder Detektor / Filter auswählbaren Wellenlängen) die Pfadlänge variiert werden muss. Die Erfindung erlaubt hingegen, das gesamte Spektrum aufzuzeichnen und erlaubt damit die Möglichkeit, bei fester bzw. unveränderter Weglänge d das effektive e zu wählen. Dies geschieht über die Auswahl der zu verwendenden Wellenlängen l explizit oder per multivariatem Algorithmus.
Insbesondere erlaubt der genannte Aspekt die Überwachung des Systems unter Verwendung einer einzigen Flusszelle mit konstanter optischer Pfadlänge. Abhängig von dem zu messenden Konzentrationsbereich werden verschiedene multivariate Modelle (z.B. PLS mit Substanzkonzentration, insbesondere Proteinkonzentration als Zielgröße und den Absorptionswerten des jeweiligen Spektralbereichs als Eingangsgrößen) erstellt, die auf der Auswertung verschiedener Wellenlängenbereiche basieren. Diese können entweder selbst ausgewählt werden oder über einen Algorithmus ausgewählt und/oder verschieden gewichtet werden (z.B. mittels PLS/Partial Least Square oder MLR/ Multiple Linear Regression), wobei die gewählten Wellenlängenbereiche durch die Absorbanz des Zielanalyten (z.B. DNA oder Protein) oder Änderung der Matrix beeinflusst werden. Insbesondere werden mindestens zwei nicht identische Teilbereiche insbesondere Anregungswellenlängen eines Bereichs nach dem Kriterium ausgewählt, ob die maximale Intensität der Absorptionsbande noch innerhalb des nutzbaren dynamischen Bereichs des Detektors liegt.
Insbesondere weisen die einzelnen Wellenlängenbereiche zu den für die Modelle gewählten Absorptionswerten unterschiedliche Empfindlichkeiten hinsichtlich der Detektion der Substanzkonzentration auf. Somit unterscheidet sich der dynamische Bereich je nach Modell. Analog gilt dasselbe für die erreichbare analytische Genauigkeit der Messung.
Bevorzugt umfassen die Spektren Absorptionsspektren und/oder Intensitätsspektren, wobei die Absorptionsspektren und/oder Intensitätsspektren eine eineindeutige Zuordnung, insbesondere eine eineindeutige Auftragung der spektrale Messgröße, beispielsweise des Absorptionswerts und/oder des Intensitätswerts, zu mehreren Wellenlängen, wobei vorzugsweise zumindest eine Teilmenge der Absorptionswerte oder Intensitätswerte, die den entsprechenden Wellenlängen zugeordnet sind, keine detektorseitige Sättigung aufweist. Die spektrale Messgröße kann insbesondere der Absorptionswert oder der Intensitätswert sein.
Eine detektorseitige Sättigung tritt dann auf, wenn keine konzentrationsabhängige Änderung des Detektorsignals bei einer bestimmten Wellenlänge oder einem Wellenlängenbereich mehr auftritt.
Insbesondere kann auch eine separate Wichtung bzw. Gewichtung jeder Wellenlänge erfolgen. In dem Fall ist es in der Regel formal nicht erforderlich Wellenlängen zu selektieren. Eine Wichtung nahe 0 bewirkt im Wesentlichen dasselbe.
Ein Detektorsignal kann in einen Sättigungsbereich gehen, wenn die elektromagnetische Strahlung bei einer bestimmten Wellenlänge oder in einem Wellenlängenbereich eine zu hohe Intensität oder eine zu hohe Absorbanz aufweist, sodass dieser entsprechende Wert außerhalb des dynamischen Bereichs des Detektors liegt. In anderen Worten kann eine Sättigung in beide Richtungen der „Detektorfüllung“, also hinsichtlich eines „overflows“ oder eines „underflows“ erfolgen. Bei der UV-Spektroskopie absorbiert die Probe im Falle einer Sättigung insbesondere zu viel Licht, sodass das am Detektor ankommende Licht nicht mehr vom Dunkelrauschen des Detektors unterschieden werden kann.
Sofern eine Sättigung erreicht wird, kann der Detektor keine Auflösung der Intensität oder der Absorbanz innerhalb des gesättigten Bereichs liefern. Beispielsweise kann dies der Fall sein, wenn eine sehr hohe Konzentration in einer Probe vorliegt und/oder eine hohe optische Weglänge durch eine sehr dicke Messzelle bedingt ist, sodass die absolute Anzahl von Molekülen, die mit dem Licht bzw. der elektromagnetischen Strahlung wechselwirken, besonders hoch ist. Zur Ermittlung der Abhängigkeit einer Absorbanz und/oder Intensität ist es günstig, wenn der zu untersuchende Wellenlängenbereich für alle zu untersuchenden Konzentrationen im Wesentlichen keine Sättigung aufweist, sodass die Unterschiede in der Absorbanz und/oder der Intensität aufgelöst und/oder die Abhängigkeit von der Konzentration einer Konzentrationsreihe ggf. dargestellt werden können. Sofern ein Wellenlängenbereich eine Sättigung erfährt, ist der Detektor blind für die eigentliche spektrale Messgröße, also die Absorbanz und/oder die Intensität.
Bevorzugt umfassen die quantitativen Modelle zumindest ein globales Modell umfassend mehrere Untermodelle, die einander nicht überschneiden.
Beispielsweise kann ein globales Modell Werte von etwa 0 g bis etwa 150 g aufweisen. Mögliche lokale Modelle Werte von etwa 2 g bis etwa 10 g von etwa 10 g bis etwa 50 g und von etwa 30 g bis etwa 80 g aufweisen. Ein Untermodell muss nicht zwingend einen gemeinsamen Grenzwert mit dem globalen Modell haben. Grenzwerte können zwar identisch sein, allerdings ist dieser Fall eine Ausnahme.
Ein globales Modell erlaubt einer Prozesseinheit, eine grobe Abhängigkeit zwischen der spektralen Messgröße eines Spektrums und verschiedenen Konzentrationsbereichen einzuschätzen. Die Untermodelle können im Wesentlichen relativ grob gestaffelte Konzentrationsbereiche umfassen, die auf immer kleiner werdende Bereiche eingegrenzt werden. Die Untermodelle eines globalen Modells können z.B. gestaffelt sein in einen ersten Bereich von etwa 0 g/l bis etwa 5 g/l, in einen zweiten Bereich von etwa 0 g/l bis etwa 25 g/l und in einen dritten Bereich von etwa 0 g/l bis etwa 75 g/l.
Untermodelle müssen jedoch nicht zwingend bei 0 starten. Dies kann ggf. sogar ungünstig sein, da der Modellbereich in dem Fall unnötig breit gehalten werden muss. Wenn der Prozessschritt z.B. Konzentrationen von etwa 50 bis etwa 75 g enthält, wird ein optimales Modell einen etwas größeren Bereich enthalten (z.B. 45-80 g/l).
Bevorzugt umfassen die quantitativen Modelle jeweils zumindest ein individuell ausgewähltes Untermodell.
Ein Untermodell kann einen beliebigen Konzentrationsbereich umfassen. Insbesondere können mehrere Untermodelle mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationsbereichen erstellt werden. Dabei können sich zumindest zwei Konzentrationsbereiche im Wesentlichen überlappen, im Wesentlichen aneinander angrenzen und/oder voneinander beabstandet sein. Ein Untermodel kann insbesondere eine echte Teilmenge (z.B. mit einem eingeschränktem y-Bereich) der übergeordneten Modellspektrenmenge sein.
Bevorzugt umfassen die quantitativen Modelle hierarchisch organisierte Modelle entsprechend zumindest einer ersten Hierarchiestufe und einer zweiten Hierarchiestufe, wobei insbesondere die erste Hierarchiestufe ein globales Modell umfasst und die zweite Hierarchiestufe ein lokales Modell umfasst.
In einer ersten Hierarchiestufe erlaubt ein globales Modell der Prozesseinheit und/oder dem Verwender, eine grobe Abhängigkeit zwischen der spektrale Messgröße eines Spektrums und verschiedenen Konzentrationsbereichen beispielsweise automatisch bzw. automatisiert zu erkennen und/oder einzuschätzen. Die Untermodelle können im Wesentlichen relativ grob gestaffelte Konzentrationsbereiche umfassen, die auf immer kleiner werdende Bereiche eingegrenzt werden. Die Untermodelle eines globalen Modells können z.B. gestaffelt sein in einen ersten Bereich zwischen etwa 0 g/l und 5 g/l, in einen zweiten Bereich zwischen etwa 0 g/l und 25 g/l und in einen dritten Bereich zwischen etwa 0 g/l und 75 g/l. In einer zweiten Hierarchiestufe erlaubt ein lokales Modell der Prozesseinheit und/oder dem Verwender, eine feiner aufgelöste Abhängigkeit zwischen der spektralen Messgröße eines Spektrums und verschiedenen Konzentrationsbereichen zu erkennen und/oder einzuschätzen, insbesondere automatisch bzw. automatisiert zu erkennen. Die Untermodelle können im Wesentlichen relativ fein gestaffelte Konzentrationsbereiche umfassen. Die Untermodelle eines lokalen Modells können z.B. gestaffelt sein in einen ersten Bereich zwischen etwa 0 g/l und 5 g/l, in einen zweiten Bereich zwischen etwa 5 g/l und 25 g/l und in einen dritten Bereich zwischen etwa 25 g/l und 75 g/l. Insofern grenzen die Konzentrationsbereiche eines lokalen Modells im Wesentlichen aneinander an.
Bevorzugt umfasst die Zuordnung des Probenspektrums zu mindestens einem quantitativen Untermodell eine Abschätzung auf Basis ermittelter und insbesondere auf Basis angezeigter Daten, insbesondere auf Basis angezeigter Spektren.
Eine schnelle unkomplizierte Abschätzung, beispielsweise „per Hand“ und/oder anhand einer groben Näherung kann ein erstes näherungsweises Ergebnis liefern, das im Anschluss beispielsweise mittels Fit verifiziert und/oder präzisiert werden kann.
Die Abschätzung durch den Verwender tritt insbesondere allein bei der Auswahl der Submodelle ein. D.h. in einem Beispiel kann der Anwender sich für das Modell 0-50 g/l entscheiden, weil zum Messzeitpunkt z.B. ein Gehalt von etwa 40 g/l erwartet wird. Alternativ kann eine Klassifizierung über PLS-DA oder SIMCA erfolgen oder euklidische Distanzen oder Mahalanobis Distanz zwischen Modell- und aktuellen Spektren ermittelt werden. Daraus ergibt sich, zu welchem der Modelle - basierend auf verschiedenen Konzentrationsbereichen - das aktuelle Spektrum am besten passt.
Bevorzugt erfolgt die Zuordnung des Probenspektrums zu mindestens einem quantitativen Modell (M) mittels euklidischer Distanz und/oder Mahalanobis und/oder PLS-DA und/oder SIMCA erfolgt.
Eine Zuordnung des Probenspektrums zu mindestens einem quantitativen Modell mittels euklidischer Distanz und/oder Mahalanobis und/oder PLS-DA und/oder SIMCA hat den Vorteil, dass präzise Vorhersagen über die Konzentration einer Substanz in einem Medium bzw. in einer Probe getroffen werden können. Genauigkeiten der Konzentrationsvorhersage erreicht. In der Anwendung können manche Prozesse einen sehr großen Bereich an Proteinkonzentrationen aufweisen, die bevorzugt abgedeckt werden sollten. Ggf. kann es sein, dass die Modellbereiche zu klein sind und infolgedessen kann ein Umschalten zwischen den Modellen innerhalb eines Prozesses erforderlich
Die Genauigkeit der Vorhersage hängt insbesondere vom Bereich des Modells ab. Ggf. kann es sein, dass dieser Bereich zu klein im Verhältnis zum Fehler der Referenz ist und infolgedessen kann ein Algorithmus nicht ermitteln, welche Wellenlängen zur Bestimmung der Analytkonzentration erforderlich sind. Ggf. kann es auch sein, dass der Bereich zu groß ist und infolgedessen werden nicht immer die höchsten sein, welcher ggf. einen Sprung in der Vorhersage bewirken kann.
Bevorzugt erfolgt das Steuern und/oder Regeln bezüglich des mindestens einen Parameters und der Parameter umfasst mindestens einen aus den folgenden Parametern: eine Ventilschaltung, eine Pumpensteuerung, einen Medienfluss, einen Mediendruck, einen Gasdruck, einen pH-Wert, einen Filtrierungsschritt, einen Fraktionierungsschritt, eine Zeitsteuerung, eine Prozesszeiteinstellung, eine Temperatur, eine lonenkonzentration, einen Chromatographie-Schritt.
Die Prozessteuerung, an die der Vorhersagewert weitergegeben wird, kann auf Basis des ermittelten Vorhersagewertes auf den Prozess in gewünschtem Maße Einfluss nehmen. Somit lässt sich ein Prozess effizient basierend auf einem bestimmten Vorhersagewert steuern und/oder regeln. Die Rückkopplung kann insbesondere dazu dienen, den Prozess effizienter zu gestalten und/oder das Produkt bzw. die Substanz besonders schonend zu gewinnen und/oder vor einer möglichen Denaturierung und/oder Beschädigung durch unerwünschte Werte der Prozessparameter zu bewahren. Die Prozessparameter, auf die beispielsweise Einfluss genommen werden kann können die besagten umfassen: eine Ventilschaltung, einen Flussdruck, einen Gasdruck, einen pH-Wert, einen Filtrierungsschritt, einen Fraktionierungsschritt, eine Zeitsteuerung, eine Prozesszeiteinstellung, eine Temperatur, eine lonenkonzentration bzw. eine Salzkonzentration bzw. einen Titer, einen Gradienten, einen Chromatographie-Schritt. Bevorzugt erfolgt die Erfassung des mindestens einen Probenspektrums der Probe online b zw. in Echtzeit, insbesondere während eines bzw. während des Prozesses und das Steuern und/oder Regeln erfolgt bevorzugt auch während des Prozesses als unmittelbare Folge des ermittelten Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
Eine Echtzeitüberwachung erlaubt der Prozesseinheit und/oder dem Verwender und/oder einer automatisierten Apparatur ein sofortiges Eingreifen in die Prozessparameter auf Basis des ermittelten Vorhersagewertes bzw. auf Basis der ermittelten Konzentration der in Frage stehenden Substanz. Ein sofortiges Eingreifen in den Prozess erlaubt insbesondere, das Regeln und/oder Steuern des Prozesses. In anderen Worten kann eine Rückkopplung derart erfolgen, dass mindestens ein Prozessparameter auf Basis des ermittelten Konzentrationswertes mindestens einer Substanz kontrolliert und/oder gesteuert und/oder geregelt wird. Es wird damit auch ggf. vermieden, dass eine Stichprobe von dem Medium entnommen und ex situ gemessen werden muss. Die Probe bzw. das Medium kann in situ, insbesondere während eines Prozesses innerhalb einer Anlage, beispielsweise innerhalb eines Fermentationsbehälters und/oder innerhalb einer Downstream Anlage, beispielsweise vor und/oder hinter einer Chromatographie-Einheit erfolgen.
Bevorzugt erfolgt die Generierung quantitativer Modelle mittels multivariater Modellerstellung, insbesondere mittels einer multivariaten Regressionsmethode wie bevorzugt mittels multiple linear Regression (MLR), und/oder partial least squares (PLS) und/oder orthogonal partial least squares (OPLS).
Eine multivariate Regressionsmethode erlaubt ein effizientes automatisiertes Ermitteln bzw. Erstellen von Modellen mit einer hohen Präzision. Parameter, die bei der Automatisierung erwünschte Bedingungen bestimmen, beispielsweise Maximal- und/oder Minimalwerte für Prozessparameter, können durch die Prozesseinheit und/oder den Verwender vorgegeben werden. Der Prozess kann somit auch in Abwesenheit eines Verwenders in Echtzeit automatisiert bzw. automatisch überwacht werden. Insbesondere wird mindestens ein Teilbereich, insbesondere einzelne Wellenlängen der Spektren der Mehrzahl der Konzentrationsproben durch eine Gewichtung abgeschwächt oder ausgeschlossen.
Beispielsweise wird mindestens ein Teilbereich, insbesondere einzelne Wellenlängen der Spektren der Mehrzahl der Konzentrationsproben und bevorzugt Teilbereiche, für die eine Sättigung der Spektren eintritt, für die Anwendung auf das Probenspektrum durch eine Gewichtung abgeschwächt und insbesondere ausgeschlossen.
Durch die Gewichtung beispielsweise um einen Faktor (Faktoren in diesem Beispiel normiert auf 1), der sehr viel kleiner als 1 ist, beispielsweise für Werte, die kleiner als etwa 0,1 , insbesondere kleiner als etwa 0,05 und bevorzugt kleiner als etwa 0,01 sind, kann ausgeschlossen werden, dass unerwünschte Daten, beispielsweise Absorptionswerte, für die eine Sättigung eintritt, automatisch aber unerwünscht in die Erstellung eines Modells und/oder die Ermittlung der Konzentration einer Substanz eingehen. Dies kann auch der Fall sein für Konzentrationsbereiche, für die eine Absorbanz bei einer Wellenlänge eine Abhängigkeit von der Konzentration aulweist, die stark von einer linearen Konzentration abweicht. Ebenfalls können Konzentrationsbereiche und/oder Wellenlängen betroffen sein, bei denen die Absorbanz eine besonders niedrige Sensibilität gegenüber der Konzentrationsänderung aufweist. Eine Gewichtung kann beispielsweise automatisch erfolgen auf Basis vorgegebener Kriterien und/oder von der Prozesseinheit und/oder dem Verwender vorbestimmt werden. Fürdie Erstellung von Modellen ist es besonders bevorzugt, eine lineare Abhängigkeit der Absorbanz von der Konzentration einer Konzentrationsreihe zu berücksichtigen bzw. zu bevorzugen, da somit die Vorhersage bzw. Bestimmung bzw. Abschätzung der Konzentration besonders präzise erfolgen kann.
Bevorzugt wird bzw. werden mindestens ein Teilbereich, insbesondere einzelne Wellenlängen der Spektren der Mehrzahl der Konzentrationsproben, bevorzugt Teilbereiche für die eine lineare Abhängigkeit zwischen Wellenlängen und Messwerten vorliegen, für die Anwendung auf das Probenspektrum stärker gewichtet, wobei die Gewichtung manuell oder mittels eines Algorithmus, insbesondere Faktoranalyse, factor loadings bzw. RLS loadings, Regressionen in RLS und/oder OPLS erfolgt.
Für die Erzeugung von Modellen ist es besonders vorteilhaft, Bereiche, für die eine lineare Abhängigkeit der Absorbanz von der Konzentration einer Konzentrationsreihe zumindest näherungsweise besteht, stärker zu gewichten. Die Vorhersage auf Basis einer linearen Abhängigkeit der Konzentration kann besonders präzise erfolgen.
Bevorzugt erfolgt die Erfassung einer Vielzahl von Proben-Messwerten bei einer einzigen im Wesentlichen identischen Spaltbreite einer oder mehrerer Messzelle/n.
Das Beibehalten einer einzigen Messzelle ermöglicht der Prozesseinheit und/oder dem Verwender eine besonders effiziente Bestimmung der Konzentration, da der Austausch von Hardware, insbesondere von Messzellen verringert ggf. vollständig vermieden werden kann. Die Umstände unter denen gemessen wird, sind somit konstant und es werden Variationen der Messkonfigurierung und daraus resultierende fehlerhafte Einstellungen vermieden. Beispielsweise kann das reversible Einsteflen einer Messzelle auf eine bestimmte Schichtdicke mit Fehlem behaftet sein. Darüber hinaus wird ein zusätzlicher Verfahrensschritt oder werden mehrere zusätzliche Verfahrensschritte, die das Einstellen der Schichtdicke umfassen, vermieden, was das Verfahren besonders effizient macht.
Gemäß einem Aspekt umfasst eine Vorrichtung zum Steuern und/oder Regeln eines Prozesses, insbesondere eines Downstream-Biopnozesses, basierend auf der Vorhersage einer unbestimmten Konzentration von mindestens einer Substanz in einer Probe bzw. einem Medium mittels Spektroskopie, insbesondere UV/vis- Spektroskopie:
Mindestens eine Schnittstelle zum Erhalt von Spektren einer Mehrzahl von Konzentrationsproben der mindestens einen Substanz und von mindestens einem Probenspektrum der Probe bzw. des Mediums;
Mindestens eine Einheit zur
Generierung quantitativer Modelle auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben, Zuordnung des Probenspektrums zu mindestens einem quantitativen Modell der generierten quantitativen Modelle; und
Anwendung des mindestens einen quantitativen Modells, welches dem Probenspektrum zugeordnet wurde, auf das Probenspektrum, um einen Vorhersagewert für die unbestimmte Konzentration zu ermitteln;
Mindestens eine Prozesseinheit zum Steuern und/oder Regeln des Prozesses bezüglich mindestens eines Parameters auf Basis des Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
Bevorzugt umfasst die Vorrichtung ein Spektrometer zur Erfassung der Spektren der Mehrzahl von Konzentrationsproben der mindestens einen Substanz und/oder des mindestens einen Probenspektrums der Probe.
Gemäß einem Aspekt umfasst ein Computerprogrammprodukt computeriesbare Befehle, die bei der Ausführung des Programms durch ein geeignetes computergestütztes System dieses veranlassen, die Schritte des Verfahrens nach dem obigen Aspekt oder einer der Ausführungsformen auszuführen.
Alle optionalen und bevorzugten Merkmale der Aspekte, Beispiele und Ausführungsformen des Verfahrens können entsprechend mit der Vorrichtung und/oder dem Computerprogrammprodukt kombinierbar sein. Infolgedessen ergeben sich die entsprechenden Vorteile und technischen Effekte, die hierin genannt sind.
Insbesondere kann die Erfindung realisiert werden mit Single-Use (SU)- bzw. Einweg- Systemen, umfassend beispielsweise SU Downstream-Elemente, SU Fermentationsbehälter, SU Beutel, SU Behälter mit jeweils einem Wandungsvorsprung, welcher einen Spalt und Fenster umfasst, durch welche der Inhalt des Behälters spektroskopisch in situ, also im Behälter in Echtzeit analysiert werden kann. Bevorzugt können auch tube lines mit SU Durchflusszeile verwendet werden, welche auch in Kombination oder direkter Verbindung zu SU Behältern stehen können.
Im Folgenden werden einige Ausführungsbeispieie näher beschrieben, wobei die Erfindung nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt sein soll. Einzelne Merkmale, die in einer bestimmten Ausführungsform beschrieben werden, können beliebig kombiniert werden, vorausgesetzt, sie schließen einander nicht aus. Darüber hinaus sind verschiedene Merkmale, die in den beispielhaften Ausführungsformen zusammen bereitgestellt werden, nicht als die Erfindung einschränkend anzusehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Füg. 1 ist eine schematische Darstellung einer beispielhaften Prozessüberwachung für einen Downstreamprozess;
Fig. 2 ist eine Darstellung eines beispielhaften Spektrums einer Proteinbande mit markierten Wellenlängenbereichen zu verschiedenen Modellen;
Fig. 3 ist eine Darstellung einer beispielhaften Auftragung von Absorptionswerten der in Fig. 2 dargestellten beispielhaften Proteinbande entsprechend von unterschiedlichen Konzentrationsproben gegen die entsprechende Konzentration bei drei unterschiedlichen Anregungswellenlängen;
Fig. 4 ist eine Darstellung einer beispielhaften Auftragung von Absorptionswerten unterschiedlicher Konzentrationsproben gegen die entsprechende Konzentration bei zwei unterschiedlichen Anregungswellenlängen;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften Verfahrens zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses; und
Fig. 6 zeigt die beispielhafte Vorhersage gegenüber dem Referenzwert für DNA.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer beispielhaften Prozessüberwachung für einen Downstreamprozess 3. Die Prozessüberwachung wird in diesem Beispiel mittels eines UV/vis Spektrometers 4 verwirklicht. Bei den beiden in der Fig. 1 gezeigten Darstellungen von UV/vis Spektrometern 4 kann es sich auch lediglich um ein einziges UV/vis Spektrometer 4 handeln. Das zumindest eine UV/vis Spektrometer 4 ist an eine Auswerteeinheit angeschlossen bzw. gekoppelt. Die Auswerteeinheit 9 umfasst vorliegend einen Rechner mit einem Desktop b zw. einer Ausgabeeinheit bzw. einen Bildschirm 9a, auf dem die gemessenen Spektren 1a, 1b angezeigt bzw. dargestellt werden können. Die Auswerteeinheit 9 kann eine Schnittstelle zum Erhalt von Spektren umfassen, wie zum Beispiel eine Schnittstelle zum Anschluss eines Datenkabels. Zusätzlich oder alternativ kann auch das UV/vis Spektrometer 4 eine Schnittstelle zum Erhalt von Spektren umfassen, sodass die Daten beispielsweise von einem Gerät und/oder einer Auswerteeinheit 9 und/oder einem Datenträger abgegriffen werden können.
Ein aufzureinigendes Medium 5a kann eine erste Messzelle 7a durchlaufen bevor es die Aufreinigungseinheit 6 passiert bzw. durchläuft. Die erste Messzeile 7a erlaubt dem der Prozesseinheit und/oder dem Verwender ein erstes Spektrum 5a von dem Medium aufzunehmen. Die erste Messzelle 7a umfasst insbesondere eine Flusszelle. Das Medium 5a kann in diesem Schritt insbesondere eine oder mehrere zu überwachende Substanzen umfassen. Darüber hinaus kann das Medium 5a insbesondere Verunreinigungen bzw. Substanzen, die von dem Medium 5a getrennt werden sollen, umfassen. Beispielsweise kann das Medium 5a HCPs umfassen, welche von dem Medium 5a abgetrennt bzw. getrennt bzw. isoliert werden sollen. Der Bildschirm 9a in Fig. 1 stellt beispielhaft ein Spektrum 1a insbesondere ein Absorptionsspektrum des aufzureinigenden Mediums 5a dar, welches zwei Banden a, b aufweist. Die erste Bande a kann beispielsweise von der Verunreinigung hervorgerufen werden und die zweite Bande b kann beispielsweise von der Zielsubstanz, beispielsweise dem Zielprotein hervorgerufen werden. Alternativ zu der ersten Messzelie 7a kann das aufzureinigendes Medium 5a auch innerhalb eines Behälters untersucht werden. Beispielsweise kann ein Spektrum 1a von dem aufzureinigenden Medium 5a zumindest teilweise innerhalb eines Fermentationsbehälters aufgenommen bzw. gemessen bzw. erfasst werden.
Das Medium 5a durchläuft hinter der ersten Messzelle 7a eine Aufreinigungseinheit 6. Die Aufreinigungseinheit 6 kann beispielsweise folgende Verfahren zur Reinigung bzw. T rennung ermöglichen: Filtration, Chromatographie, insbesondere
Säulenchromatographie und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Elektrophorese, Extraktion, Fällung, Sedimentation, Zentrifugieren und/oder Dialyse etc. Die Aufreinigungseinheit 6 ist insbesondere dazu ausgeiegt, das Medium 5a von Verunreinigungen und/oder unerwünschten Substanzen zu isolieren bzw. zu trennen, sodass das Medium 5b nach durchlaufen der Aufreinigungseinheit 6 zumindest die unerwünschte Substanz, beispielsweise HPCs, im Wesentlichen nicht mehr umfasst. Das im Wesentlichen aufgereinigte Medium 5b umfasst hingegen nur noch erwünschte Substanzen, wie beispielsweise Zielmoieküle, insbesondere Zieiproteine und/oder Salze, insbesondere Puffersubstanzen.
Das zumindest teilweise aufgereinigte Medium 5b verlässt nach dem Schritt der Aufreinigung die Aufreinigungseinheit 6 und passiert bzw. durchläuft eine weitere Messzelle 7b. Es kann sich alternativ auch um die erste Messzelle 7a handeln, insbesondere kann es sich um die erste gereinigte Messzefle 7a handeln, jedoch ist es bevorzugt, dass das aufgereinigte Medium 5b eine nicht identische weitere bzw. zweite Messzelle 7b passiert, da es ggf. in der ersten Messzelle 7a mit den Verunreinigungen kontaminiert werden könnte. Bei der zweiten Messzelle 7b kann es sich jedoch um ein identisches Modell der ersten Messzelle 7a handeln.
Wenn das Medium in, insbesondere durch die weiteren Messzeile 7b fließt oder sich zumindest zweitweise darin befindet, kann ein weiteres Spektrum 1b von dem UV/vis Spektrometer 4 erfasst werden. Der Bildschirm 9a in Fig. 1 stellt beispielhaft ein Spektrum 1 b insbesondere ein Absorptionsspektrum des zumindest teilweise aufgereinigten Mediums 5b dar, welches im Wesentlichen nur noch die Bande b aufweist. Die erste Bande a, die noch im ersten Spektrum 1a sichtbar war und die beispielsweise von der Verunreinigung hervorgerufen wurde ist zumindest nicht mehr sichtbar in dem angezeigten Spektrum 1 b des aufgereinigten Mediums 5b. Die zweite Bande b, die beispielsweise von der Zielsubstanz, beispielsweise von dem Zielprotein hervorgerufen wird, ist jedoch noch sichtbar. Dies indiziert, dass die Substanz, die die erste Bande a erzeugt, größtenteils von dem Medium 5b in der Aufreinigungseinheit 6 getrennt wurde.
An und/oder in den Messzellen 7a, 7b sind jeweils zwei optische Lichtleiter 8 angeordnet. Dabei kann in einen der beiden optischen Lichtleiter 8, beispielsweise von der Seite des UV/vis Spektrometers eine elektromagnetische Strahlung gekoppelt werden, welche auf der Seite der Messzelle 7a, 7b aus dem optischen Lichtleiter 8 heraustritt und die Messzelle 7a, 7b zumindest teilweise passiert, sodass ein optischer Lichtleiter 8 auf der Gegenseite der jeweiligen Messzelle 7a, 7b die transmittierte elektromagnetische Strahlung zumindest teilweise erfassen kann und diese zumindest teilweise an das UV/vis Spektrometer 4 senden bzw. leiten kann. Alternativ kann die Prozessüberwachung auch an und/oder in einem Behälter erfolgen. Beispielsweise kann mindestens ein optischer Lichtleiter an und/oder in einen Fermentationsbehälter geführt werden, sodass dieser mittels eingekoppeltem Licht das Medium in dem Fermentationsbehälter anregen kann und/oder das Licht, das zumindest einen Teil des Mediums passiert bzw. durchlaufen und ggf. angeregt hat, einfangen bzw. zu einem Detektor bzw. einem Sensor leiten kann. Die Überwachung kann einerseits zumindest teilweise in situ und/oder ex situ erfolgen. In anderen Worten können Elemente, die zur Überwachung ggf. benötigt werden, wie Sensoren und/oder Lichtleiter in den Innenraum des Fermentationsbehälters hineinragen und insbesondere in direktem physischen Kontakt mit dem Medium, insbesondere der Fermentationsbrühe stehen (in situ), und/oder von außen, beispielsweise an einem Fenster mit optischem Zugang zum Innenraum angeordnet sein, sodass ein direkter physischer Kontakt mit dem Medium vermieden werden kann (ex situ).
Die Messzellen 7a, 7b weisen insbesondere eine im Wesentlichen konstante optische Pfadlänge bzw. Dicke auf. Die optische Pfad länge des Lichtes bzw. die Dicke der Messzelle 7a, 7b kann zwischen etwa 100 nm und etwa 10 cm, insbesondere zwischen etwa 500 nm und etwa 5 mm und besonders bevorzugt zwischen etwa 800 nm und etwa 3 mm liegen.
Fig. 2 ist eine Darstellung eines beispielhaften Spektrums einer Proteinbande mit markierten Wellenlängenbereichen zu verschiedenen Modellen. Die Absorbanz 2 ist zwischen etwa 240 nm und etwa 360 nm gegen die Wellenlänge l aufgetragen und somit ergibt sich das Spektrum 1 , insbesondere das Absorptionsspektrum für eine Bande, die ihr lokales Maximum in etwa zwischen 270 nm und 280 nm hat und zu beiden Seiten eine abfallende Flanke zeigt. Die Absorptionsbande wird hervorgerufen durch ein beispielhaftes Protein.
Die Erfindung basiert auf der Messung bzw. Erfassung Absorptionsspektren statt einzelner Wellenlängen und/oder Wellenlängenbereiche. Dabei befindet sich während der Messung ein Medium in einer Messzelle, beispielsweise in einer Flusszelle, die eine im Wesentlichen konstante Dicke zwischen etwa 100 nm und etwa 10 cm, insbesondere zwischen etwa 500 nm und etwa 5 mm und besonders bevorzugt zwischen etwa 800 nm und etwa 3 mm, beispielsweise von etwa 1mm aufweist. Abhängig von dem zu messenden Konzentrationsbereich werden verschiedene multivariate Modelle erstellt, die auf der Auswertung verschiedener Wellenlängenbereiche basieren. Die Modelle können dabei beispielsweise auf PLS basieren, wobei die Konzentration eines vorbestimmten Proteins als Zielgröße festgelegt ist und die Absorptionswerten des jeweiligen Spektralbereichs als Eingangsgrößen dienen.
Die Wellenlängenbereiche können entweder selbst per Hand ausgewählt werden und/oder übereinen Algorithmus bestimmt und/oder unterschiedlich gewichtet werden. Dabei können alle gewählten Wellenlängenbereiche durch die Absorbanz des Zielanalyten (z.B. DNA oder Protein), dem vorzugsweise linearen Bereich der Detektorantwort oder der Änderungen der Matrix, z.B. durch Partikelstreuung oder Änderungen der Pufferzusammensetzung, beeinflusst werden.
In der Fig. 2 sind einzelne Wellenlängenbereiche angedeutet, die jeweils einem Modell M1, M2, M3, M4 zugeordnet sind. Beispielsweise liegt der Wellenlängenbereich, der dem Modell M1 zugeordnet ist, etwa zwischen 270 nm und 280 nm. Der Wellenlängenbereich, der dem Modell M2 zugeordnet ist, liegt zwischen etwa 280 nm und 290 nm. Der Wellenlängenbereich, der dem Modell M3 zugeordnet ist, liegt zwischen etwa 290 nm und 300 nm und der Wellenlängenbereich, der dem Modell M4 zugeordnet ist, liegt zwischen etwa 300 nm und 310 nm.
Die einzelnen Wellenlängenbereiche weisen unterschiedliche Empfindlichkeiten hinsichtlich der Detektion der Analytkonzentration bzw. der Konzentration der in Frage stehenden Substanz auf. Beispielsweise weist das Modell 1 , das dem Wellenlängenbereich zugeordnet ist, in das das Maximum der Absorptionsbande fällt, eine besonders hohe Empfindlichkeit auf verglichen mit den anderen Modellen. Die Modelle, die den Wellenlängenbereichen zugeordnet sind, die im Wesentlichen in der Flanke der Absorptionsbande liegen, zeigen von Modell 2 nach Modell 4 hin jeweils eine abnehmende Empfindlichkeit im Vergleich zueinander. In anderen Worten gilt für die hier gezeigte Einteilung der Modelle, dass die Empfindlichkeit mit zunehmender Wellenlänge abnimmt. Somit unterscheidet sich der dynamische Bereich je nachdem, welches Modell M1, M2, M3, M4 gewählt ist. Ähnliches gilt für die erreichbare analytische Genauigkeit der Messung. Verglichen mit dem Trend der Empfindlichkeit verhält es sich genau anders herum mit der absolut messbaren Konzentration einer Substanz. Das Modell 1, das dem Wellenlängenbereich zugeordnet ist, in das das Maximum der Absorptionsbande fällt, weist ein geringes Potential auf, hohe Konzentrationen nachzuweisen. Hingegen steigt dieses Potential mit zunehmender Wellenlänge im vorliegenden Fall. Die Modelle, die Wellenlängen am Rand der Flanke der Bande zugeordnet sind, zeigen eine besonders hohe Fähigkeit, hohe Konzentrationen anzudeuten.
Basiert das Modell auf den Wellenlängen mit der höchsten Absorbanz bzw. dem Maximum einer Bande, so hat dieses Modell die höchste Empfindlichkeit, allerdings ist die obere Detektionsgrenze bereits bei geringen Substanzkonzentrationen schnell erreicht. Das Modell M4 basiert hingegen hauptsächlich auf Wellenlängenbereichen, welche in der Flanke der Bande liegen. Somit ist die Empfindlichkeit geringer, dafür können jedoch weitaus höhere Substanzkonzentrationen gemessen werden. Insbesondere erreicht das Maximum einer Absorptionsbande bei schon relativ geringen Konzentration wegen der hohen Empfindlichkeit sehr hohe Werte, die insbesondere den dynamischen Bereich eines Sensors bzw. Detektors überschreiten.
In anderen Worten weisen die einzelnen Wellenlängenbereiche unterschiedliche Empfindlichkeiten hinsichtlich der Detektion der Analytkonzentration auf. Somit unterscheidet sich der dynamische Bereich je nach Modell, das gleiche gilt für die erreichbare analytische Genauigkeit der Messung. Fig. 2 veranschaulicht dies. Es zeigt beispielhaft eine Absorptionsbande von einem Protein bzw. einer Proteinspezies. Basiert das Modell im Kem auf den Wellenlängen mit der höchsten Absorption, so hat dieses Modell die höchste Empfindlichkeit, allerdings ist die obere Detektionsgrenze bereits bei geringen Proteinkonzentrationen schnell erreicht. Das Modell 4 basiert hingegen hauptsächlich auf Wellenlängenbereiche, welche in der Flanke der Bande liegen. Somit ist die Empfindlichkeit geringer, dafür können jedoch weitaus höhere Proteinkonzentrationen gemessen werden.
Dies wird auch in den unterschiedlichen linearen Bereichen der verschiedenen Modelle deutlich. Fig. 4 zeigt die Absorbanz bzw. Absorption zweier Proteinbanden bei verschiedenen Konzentrationen. Die Bande bei 224 nm ändert sich weitaus stärker mit steigender Proteinkonzentration als die 280er Bande (und hat damit eine höhere Empfindlichkeit). Dafür ist der lineare Bereich bei der 280er Bande weitaus größer.
In Fig. 3 ist gezeigt, wie sich die Absorbanz der Modelle basierend auf verschiedenen Wellenlängenbereichen einer einzigen Bande bei sich ändernden Proteinkonzentrationen verhält.
Anhand der jeweiligen Auftragungen der Absorptionswerte 2 zu jeweils bestimmten Wellenlängen l in Abhängigkeit der Konzentration wird die zuvor beschriebene Abhängigkeit beschrieben in den folgenden Figuren Fig. 3 und Fig. 4 beschrieben.
Fig. 3 ist eine Darstellung der Auftragung von Absorptionswerten 2 der in Fig. 2 dargestellten Proteinbande für jeweils unterschiedliche Konzentrationen c bei drei unterschiedlichen Anregungswellenlängen. Die in Fig. 2 dargestellte Proteinbande entspricht jedoch nur einer einzigen ausgewählten Konzentration. In anderen Worten ist die Absorption 2 gegen die Substanzkonzentration c für verschiedene Wellenlängenbereiche der Proteinbande mit dem Maximum bei etwa 280 nm aufgetragen. In Fig. 3 ist insbesondere dargestellt, wie sich die Absorbanz 2 dreier Modelle basierend auf verschiedenen Wellenlängenbereichen einer einzigen Bande bei sich ändernden Substanzkonzentrationen c verhält.
Die drei Modelle, die hinsichtlich der Fig. 3 beispielhaft gewählt wurden, sind Wellenlängenbereichen zugeordnet, die jeweils den Wert von etwa 300 nm, 290 nm und 280 nm umfassen. Die erfassten benachbarten Datenpunkte eines Modells wurden jeweils mit einer linearen Verbindungslinie verbunden. Insbesondere eignen sich Modelle in Bereichen, die im Wesentlichen lineare Abhängigkeiten zwischen Absorbanz 2 und Konzentration c zeigen, für die zuverlässige Vorhersage von unbestimmten Konzentrationen. Wie aus der Darstellung in Fig. 3 sichtbar wird, weisen die Wellenlängenbereiche bzw. die Modelle unterschiedliche im Wesentlichen lineare Bereiche auf.
Beispielsweise zeigt die Auftragung für etwa 300 nm einen linearen Bereich über eine besonders breite Konzentration c, und zwar zwischen etwa 0 g/l und 150 g/l. Der gesamte Bereich kann zur Vorhersage einer unbestimmten Konzentration herangezogen werden, wenngleich die Sensitivität bzw. Empfindlichkeit dieser Wellenlänge gegenüber der Konzentration c vergleichsweise mit den anderen Modellen nicht hoch ist. Die Auftragung für etwa 290 nm zeigt eine hohe Sensitivität im Vergleich mit der Auftragung für etwa 300 nm. Der lineare Bereich innerhalb dem zuverlässige Vorhersagen getroffen werden können, endet jedoch bereits für Werte ab etwa 50 g/l. Die Auftragung für 280 nm zeigt eine vergleichsweise hohe Sensitivität gegenüber Veränderungen in der Konzentration, allerdings ist lediglich der Konzentrationsbereich unterhalb von etwa 10 g/l linear. Hinsichtlich des in Fig. 2 dargestellten Spektrums liegt der Wert von etwa 280 nm relativ nahe am Maximum, wohingegen die anderen beiden Werte von etwa 290 nm und 300 nm im Bereich der abfallenden Flanke des Spektrums 1 liegen.
In anderen Worten gilt, dass je nachdem, welches Modell gewählt wurde, verschieden große lineare Bereiche zur Auswertung herangezogen werden können. Die drei dargestellten Modelle haben unterschiedliche Empfindlichkeiten, insbesondere bei niedrigen Substanzkonzentrationen. Das Modell für 280 nm zeigt die höchste Empfindlichkeit und somit auch Messgenauigkeit bei niedrigen Substanzkonzentrationen, dafür besitzt das Modell bei 300 nm einen weitaus größeren linearen Bereich bis 150 g/l Protein. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedenen Anwendung gerecht zu werden, beispielsweise die Überwachung einer DNA-Konzentration und/oder die Konzentration verschiedener Proteine, wobei die Hardware beibehalten werden kann und insbesondere keine Variation der optischen Pfad länge vorausgesetzt wird.
Fig.4 ist eine Darstellung der Auftragung von Absorptionswerten zweier beispielhafter Banden bei zwei unterschiedlichen Anregungswellenlängen für unterschiedliche Konzentrationen. In anderen Worten zeigt die Fig. 4 die jeweilige Absorbanz zweier Proteinbanden bei verschiedenen Konzentrationen. Die Bande bei 224 nm ändert sich weitaus stärker mit steigender Substanzkonzentration als die Bande bei 280 nm und hat damit eine höhere Empfindlichkeit. Dafür ist der lineare Bereich bei der Bande bei 280 nm weitaus größer. Fig. 5 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften Verfahrens 100 zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses. Das Verfahren beginnt mit dem Schritt 101, in dem eine Mehrzahl von Spektren einer Konzentrationsreihe einer bestimmten Substanz, deren Konzentration in einem Medium bzw. in einer Probe bestimmt werden soll. Beispielsweise kann es sich bei dem zu trennenden Protein um ein Protein der Photosynthese handeln. Beispielsweise kann eine Verdünnungsreihe gestaffelte Konzentrationsbereiche umfassen. Insbesondere können die Konzentrationen einer Substanz für vorbestimmte Bereiche in konstanten Abständen liegen, wobei die die konstanten Abstände bereichsweise vergrößern und/oder verkleinern können. Zusätzlich oder alternativ können die Abstände zumindest für einen Bereich auch nicht konstant gewählt sein. Ein solches Beispiel einer Konzentrationsreihe ist im Folgenden gegeben: 100 mg/l; 400 mg/l; 700 mg/l; 1g/l; 1 ,5 g/l; 2 g/l; 2,5 g/l; 5 g/l; 7,5 g/l; 10 g/l; 20 g/l; 30 g/l; 40 g/l; 50 g/l; 75 g/l; 100 g/l; 150 g/l usw.
Bevorzugt umfasst die Konzentrationsreihe lediglich die zu bestimmende Substanz in unterschiedlichen Konzentrationen gelöst in einem geeigneten im Wesentlichen physiologischen Lösungsmittel, insbesondere in einer wässrigen Pufferlösung, beispielsweise in einer Phosphatgepufferten Salzlösung oder einem TBS-Puffer. Ggf. kann die Lösung auch ein Detergens und/oder ein Zusatz einer anderen Substanz zur Verhinderung einer möglichen Denaturierung der Substanz umfassen.
Für die Erfassung der Spektren der Konzentrationsreihe wird insbesondere eine Messzelle mit einer konstanten Spaltbreite bzw. Probenschichtd icke verwendet. Alternativ können zwei optische Lichtleiter mit einem konstanten Abstand zumindest teilweise innerhalb eines Behälters, in dem sich das Medium zumindest teilweise befindet, angeordnet sein, wobei ein Nichtleiter dazu ausgelegt ist, Licht bzw. elektromagnetische Strahlung in das Medium zu emittieren und der andere Lichtleiter dazu ausgelegt ist, die transmittierte Strahlung zumindest teilweise aufzunehmen und an eine Auswerteeinheit und/oder das UV/vis Spektrometer weiterzuleiten.
Für jede Konzentrationsprobe der Konzentrationsreihe wird jeweils mindestens ein Spektrum, insbesondere in einem Bereich zwischen etwa 200 nm und 700 nm erfasst. Anhand der Spektren der Konzentrationsreihe, bei der üblicherweise Absorptionswerte gegen die Wellenlänge aufgetragen werden, werden im Schritt 102 geeignete Modelle für verschiedene Konzentrationsbereich erstellt. Insbesondere werden multivariate Modelle erstellt, bevorzugt mittels partial least square (PLS) Regression, orthogonal RLS (OPLS) Regression und vergleichbaren Regressionskonzepten.
Insbesondere können hierarchische Modelle gewählt werden, wobei jedes Modell einen bestimmten Konzentrationsbereich abdeckt. Für hierarchische Modelle gilt in der Regel, dass die Präzision für niedrige Konzentrationen hoch ist und bei höheren Konzentrationen abnimmt und demzufolge ggf. Modellfehler auftreten können.
Das Verfahren 100 bietet zwei kombinierbare Optionen, und zwar Option A, ein globales Modell und Option B, ein lokales Modell. Das globale Modell der Option A umfasst die beispielhaften Untermodelle und zwar Modelle M1 , M2 und M3, jeweils basierend auf Spektren gemessen beispielsweise zwischen etwa 0 g/l und 5 g/l, zwischen etwa 0 g/l und 25 g/l und zwischen etwa 0 g/l und 75 g/l. Zusätzlich oder alternativ kann auch ein lokales Modell angewandt werden. Das lokale Modell der Option B umfasst die beispielhaften Untermodelle und zwar Modelle M4, M5 und M6, jeweils basierend auf Spektren gemessen beispielsweise zwischen etwa 0 g/l und 5 g/l, zwischen etwa 5 g/l und 25 g/l und zwischen etwa 25 g/l und 75 g/l. Der wesentliche Unterschied zwischen Option A und Option B besteht darin, dass für Option B, die Modelle M4, M5 und M6 nicht alle bei etwa 0 g/l beginnen, sondern lediglich das erste Modell M4.
Optional kann ein hierarchisches Modell gewählt werden, das ein globales Modell (Option A) übereinen gesamten Konzentrationsbereich (beispielsweise zwischen etwa 0 g/l und 75 g/l) umfasst und eine oberste Hierarchie darstellt und weitere Untermodelle M4, M5, M6 (Option B) für einzelne Konzentrationsbereiche (beispielsweise gestaffelt zwischen etwa 0 g/l und 75 g/l).
Untermodelle basieren in der Regel jeweils auf nicht-gesättigten Spektren bzw. Spektrenbereichen, welche beispielsweise mittels eines OPLS/PLS Algorithmus, und/oder mittels Auftragung der Absorbanz gegen die Konzentration der relevanten Wellenlängen ermittelt wird. In anderen Worten ist das Ziel eines Modells insbesondere, auf nicht gesättigten Spektrenbereichen aufzubauen. Dies trifft sowohl auf das globale Modell als auch auf die Untermodelle zu. Insbesondere erfolgt eine Bestimmung des linearen Bereiches jeder Auftragung bezüglich jeder gewählten Wellenlänge, auf die eine Entscheidung folgt, ob die gewählte Wellenlänge eines Modells für einen bestimmten Konzentrationsbereich angewendet werden kann. Im linearen Bereich ist die Steigung des Detektorsignals bei Konzentrationsänderungen in der Regel maximal. Oberhalb des linearen Bereiches nimmt die Steigung sukzessive ab, bis es im Wesentlichen keine Änderung des Detektorsignals bei weiterer Konzentrationserhöhung gibt. Der nichtlineare Bereich kann weiterhin ausgewertet werden, allerdings ist in diesem Bereich die Vorhersagegenauigkeit geringer und es liegt eine höhere Komplexität des Modells vor, beispielsweise aufgrund von zusätzlichen Hauptkomponenten. Standard MVDA Verfahren stellen in der Regel multilineare Verfahren dar und daher können diese Nichtlinearitäten bzw. nicht linearen Bereiche nicht optimal modelliert werden. Deshalb eignen sich insbesondere lineare Bereiche der Auftragung zur Bestimmung einer unbestimmten Konzentration einer Substanz.
Ein Datensatz zur Modellierung umfasst eine Vielzahl an Spektren von Proben mit bekanntem Analytgehalt (z.B. Protein). Eingangsgrößen sind eine Vielzahl von Intensitäten bei verschiedenen Wellenlängen (X-Werte) sowie Referenzwerte, wie beispielsweise Proteingehalt bzw. -Konzentration (Y-Werte). Der Algorithmus findet Korrelationen im multivariaten Raum der X-Werte, die dem Verlauf der Y-Werte entsprechen. Es wird insbesondere auf das Fachbuch „Multi- and Megavariate Data Analysis - Basic principles and Applications“ (3rd Edition) von L. Eriksson et al. verwiesen, in dem (insbesondere 4. Kapitel) eine ausführliche Einführung zur Modellierung, insbesondere mittels PLS zu finden ist.
Im folgenden Schritt 103 wird eine Online-Messung bzw. eine Echtzeitmessung mindestens eines Probenspektrums einer Probe bzw. eines Mediums erfasst, das insbesondere die zu bestimmende Substanz umfasst. Der Begriff Online-Messung bzw. Echtzeitmessung bezieht sich auf den Umstand, dass das Medium bzw. die Probe unmittelbar vor und/oder nach und/oder während eines Prozesses untersucht wird, sodass dynamisch bzw. unmittelbar auf Basis der ermittelten Konzentration der Substanz auf ein oder mehrere Prozessparameter Einfluss genommen werden kann. Im Schritt 104 wird das Probenspektrum, das in Schritt 103 aufgenommen wurde in mindestens ein geeignetes Modell eingeordnet bzw. diesem zugeordnet. Mögliche Methoden zur Klassifizierung umfassen z.B. PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis), SIMCA-Berechnungen (Soft Independent Modeling of Class Analogy) der euklidischen Distanzen oder ein Dendrogramm. Das Probenspektrum wird mit den Spektrensätzen der einzelnen Modelle verglichen und eine Einordnung nach bestem Fit bzw. nach bestem Fitergebnis getroffen. In anderen Worten werden insbesondere zumindest ein, bevorzugt jedoch mehrere Absorptionswerte eines Probenspektrums mit den entsprechenden Absorptionswerten der Spektren verschiedener Modelle verglichen.
Zusätzlich oder alternativ kann die Einordnung auch auf Prozesswissen bzw. bekannten Prozessparametem basieren, z.B. auf bekannten Konzentrationsbereichen des Prozessschrittes.
Das Probenspektrum ergibt sich insbesondere aus einer Messung, insbesondere aus einer online Messung im Prozess. Ein optimal anzuwendendes Modell kann insbesondere ausgewählt werden. Ein Kriterium kann beispielsweise die zu erwartende Konzentration der Probe darstellen. Der Anwender kann aufgrund des Prozesses demzufolge relativ grob einordnen, ob die Konzentration der Probe beispielsweise bei etwa 15 g/l oder bei etwa 150 g/l liegt, allerdings kann eine feine Einordnung nur mittels des entsprechend gewählten Modells erfolgen. Es kann also unter Umständen ohne zutreffendes Modell nicht abgeschätzt werden, ob die Konzentration bei etwa 12 g/l, 15 g/l oder 17 g/l liegt. Ein geeignetes Modell wäre beispielsweise ein Modell zwischen 5 und 20 g/l.
Im Schritt 105 wird das Modell auf das Probenspektrum angewandt, um die unbekannte Konzentration der Substanz im Wesentlichen zumindest näherungsweise zu bestimmen bzw. vorherzusagen. Anschließend wird der Vorhersagewerte bzw. der bestimmte der Konzentration der Substanz von der Recheneinheit im Schritt 106 ausgegeben und in Schritt 107 an die Prozesssteuerung weiteregegeben bzw. gesandt. Auf Basis des ermittelten Konzentrationswertes kann somit die Prozessteuerung, an die dieser Wert weitergegeben wird, im Schritt 108 auf den Prozess in gewünschtem Maße Einfluss nehmen. Somit lässt sich ein Prozess basierend auf einem bestimmten Vorhersagewert steuern und/oder regeln.
In anderen Worten wird im Schritt 104 ein aktuelles Spektrum bzw. ein Probenspektrum zu einem passenden Modell zugeordnet. Unter Zuhilfenahme des gewählten Modells wird unter Schritt 105 die aktuelle bzw. die zu bestimmende Konzentration der Substanz bestimmt. Unter Schritt 106 wird der ermittelte Wert für die Konzentration der Substanz an ein Interface bzw. an eine Schnittstelle ausgegeben und im Schritt 107 an eine Kontrolleinheit weitergegeben. Auf Basis des ermittelten Konzentrationswertes kann die Prozessteuerung, die den Vorhersagewert erhält, im Schritt 108 auf den Prozess, insbesondere auf einen oder mehrere Prozessparameter in gewünschtem Maße Einfluss nehmen.
Die Modellierung, insbesondere die Generierung mehrerer quantitativer Modelle auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben unterscheidet sich ausdrücklich von einer üblichen Kalibrierung. Eine typische Kalibrierung kann beispielsweise im Wesentlichen auf einer linearen Regression zwischen einer Wellenlänge und einer Proteinkonzentration basieren. Eine lineare Regression basiert im Wesentlichen auf einem Fit bzw. einer Abgleichsrechnung mit einem linearen Modell. Eine Kalibrierung kann auch auf nicht linearen Modellen basieren. Die hier beschriebene Modellierung basiert hingegen insbesondere auf PLS-Modellen.
Insbesondere basieren PLS-Modelle ("Partial Least Squares") auf den Hauptkomponenten zweier Matrizen X und Y. Dabei sollen für die Matrizen X und Y jeweils die Hauptkomponenten getrennt berechnet werden, um ein Regressionsmodell zwischen den Einträgen bzw. Scores der Hauptkomponenten (und nicht den Originaldaten) zu erstellen. Die Matrix X wird dazu in eine Matrix T (die "Score'-Matrix) und eine Matrix P' (die "Loadings'-Matrix) plus einer Fehlermatrix E zerlegt. Die Matrix Y wird in die Matrizen U und Q und den Fehlerterm F zerlegt. Diese zwei Gleichungen können als die "äusseren Beziehungen" bezeichnet werden. Das Ziel von PLS ist es, insbesondere die Norm von F zu minimieren und gleichzeitig eine Korrelation zwischen X und Y zu erhalten, in der die Matrizen U und T wie folgt in Beziehung zueinander gesetzt werden: U = BT. Diese Gleichung kann auch als die "innere Beziehung" bezeichnet werden. Die Steuerung kann insbesondere Ventile und Pumpen aufweisen. Andernfalls kann das entsprechende gesammelte Volumen verworfen werden, insbesondere, wenn es Verunreinigungen aufweist. Darüber hinaus können mittels entsprechender Zugaben von Substanzen Änderungen hinsichtlich des pH-Wertes, der Leitfähigkeit, der Konzentration und/oder anderer Parameter erzielt werden und insbesondere können diese und/oder andere Parameter geregelt werden.
Mit dem Begriff Spektrum ist im Wesentlichen das Absorptionsspektrum gemeint. Der Begriff kann sich jedoch auch auf ein Intensitätsspektrum beziehen, sofern keine Absorptionsspektroskopie betroffen ist. Dies ist beispielsweise der Fall für die Raman Spektroskopie, bei keine Absorbanz von Licht, sondern Licht mit einer „verschobenen“ Wellenlänge gemessen wird, ausgelöst durch die inelastische Streuung von Licht an Molekülen. Ohne auf die UV/vis Spektroskopie beschränkt zu sein, beziehen sich die vorliegenden Ausführungsformen jedoch im Wesentlichen auf die dadurch erzeugten Absorptionsspektren.
Es werden vorliegend auch hauptsächlich Absorptionsbanden von Proteinen dargestellt und diskutiert. Jedoch kann die Erfindung auch auf allen anderen Substanzen, insbesondere Molekülen basieren, die mittels der Molekülspektroskopie untersucht werden können.
Der Begriff „Probe“ begrenzt sich nicht auf eine Stichprobe, die ex-situ also außerhalb eines Behälters, beispielsweise außerhalb eines Bioreaktors untersucht werden kann. Vielmehr bezieht sich der Begriff Probe auf das Medium, insbesondere eine Flüssigkeit, ein Gas, einen Feststoff und/oder ein beliebiges Gemisch daraus, welches die Substanz umfasst und sich während der Messung im Wesentlichen innerhalb des Behälters befindet. Die Messung der Probe erfolgt insbesondere in-situ, also im Wesentlichen innerhalb des Behälters, in dem auch der Prozess erfolgt. Insbesondere wird die Probe auch nicht verworfen sondern verbleibt im Wesentlichen mit dem gesamten Medium in dem Behälter und bleibt ggf. allen weiteren Prozessschritten ausgesetzt. Eine Probe ist ggf. kein identisches Medium. Das heißt, mit Probe kann das Medium gemeint sein, die zufälligerweise in die Messzelle, beispielsweise in eine Flusszelle, gelangt und dort analysiert wird. Die Moleküle und oder Atome müssen nicht zwingend bei jeder Messung einer dauerhaften Überwachung dieselben sein, vielmehr bestimmt sich die Probe bei jeder Messung durch Zufall. Bei Messung in Behältern ist die Probe insbesondere repräsentativ zum Bulk. Bei einer Messung in Schlauchleitungen ist die Probe insbesondere repräsentativ zur Menge in dem entsprechenden Schlauchbereich.
Host cell proteins (HCPs) können prozessbedingte Verunreinigungen sein, die von der Wirtszelle (host cell), die zur Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen verwendet wird, exprimiert werden. Die Hostzelle kann einerseits HCPs exprimieren oder sie besteht andererseits selbst aus HCPs, die bei Zellaufaufschluss oder Zelltod frei gesetzt werden. Während des Reinigungsprozesses wird üblicherweise der Großteil der HCPs entfernt (insbesondere > 99%). Gegebenenfalls können die restlichen HCP-Mengen jedoch in den Produkten verbleiben, wie unter anderem monoklonale Antikörpern (mAbs), Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), therapeutische Proteine, Impfstoffe und andere proteinbasierte Biopharmazeutika.
Ein UV/vis-Spektrometer, das dazu ausgeiegt ist, im Wesentlichen spektrale Information zu erfassen, kann eine breitbandige Lichtquelle aufweisen. Andererseits kann ein im Wesentlichen breitbandiges Emissionsspektrum auch durch den Einsatz mehrerer schmal- und/oder breitbandig emittierenden Lichtquellen erzeugt werden. Ein Beispiel für eine im Wesentlichen breitbandig emittierende Lichtquelle ist eine Deuterium-Lampe (D2 -Lampe) oder eine Halogen-Lampe.
Der Begriff „schmalband ig“ hinsichtlich des Emissionsspektrums einer LED-Lichtquelle bezieht sich auf Lichtquellen, die elektromagnetische Strahlung emittieren mit einer FWHM (spektrale Halbwertsbreite) von Werten, die kleiner als etwa 50 nm, insbesondere kleiner als etwa 30 nm und besonders bevorzugt kleiner als etwa 15 nm sind. Beispielsweise ist eine Lichtquelle mit einer FWHM von etwa 10 nm eine schmalband ige Lichtquelle. Oft wird eine oder werden mehrere schmalbandig emittierende Lichtquellen verwendet, um die Extinktion und entsprechend eine Konzentration eines ganz bestimmten Stoffs zu ermitteln, der bei einer ganz bestimmten Wellenlänge elektromagnetische Strahlung absorbiert. Ein Beispiel für eine Verwendung mehrerer solcher Lichtquellen basiert auf zwei Lichtquellen mit jeweils einer FWHM von etwa 10 nm, die jeweils maximale Emissionswerte bzw. Peakwellenlängen bei etwa 250 nm und etwa 280 nm aufweisen.
Entsprechend der gewählten Lichtquelle und des entsprechenden Emissionsspektrums, egal ob schmal- oder breitbbandig emittierend, kann der Sensor ausgewählt werden, um zumindest einen Teil des Emissionsspektrums erfassen zu können. In anderen Worten ist es sinnvoll, dass das Emissionsspektrum der Lichtquelle sich mit dem sensitiven Bereich des Sensors überschneidet, insbesondere zu mehr als etwa 50 % und bevorzugt zu mehr als etwa 70 %.
Auch Sensoren können insbesondere Sensorelemente mit unterschiedlichen sensitiven Wellenlängenbereichen aufweisen, die dazu ausgelegt sind, in jeweils in zueinander nicht identischen Wellenlängenbereichen elektromagnetische Strahlung erfassen zu können.
Die Lichtquelle bzw. Lichtquellen, egal ob schmal- oder breitbandig emittierend, ist bzw. sind bevorzugt dazu ausgelegt in einem Wellenlängenbereich elektromagnetische Strahlung zu emittieren, die für den Menschen sichtbar ist, also zwischen etwa 380 nm und etwa 780 nm undr im UV-Bereich liegt, also zwischen etwa 10 nm und etwa 380 nm.
Alternativ oder zusätzlich kann die Lichtquelle auch dazu ausgelegt sein, elektromagnetische Strahlung im Infrarot-Bereich, also zwischen etwa 780 nm und etwa 50 mhti zu emittieren.
Der Sensor kann, wie bereits beschrieben auf den Emissionsbereich abgestimmt sein.
Im Folgenden werden weitere Ausführungen und Merkmale in anderen Worten genannt, wobei diese Merkmale insbesondere kombinierbar mit vorherigen Merkmalen sind.
Ein beispielhaftes Verfahren zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses kann wie folgt ablaufen: 1. Detektion von UV-Vis Spektren einer Konzentrationsreihe
2. a. Erstellung von auf verschiedenen Wellenlängenbereichen beruhenden Modellen, dabei wird die höchste Konzentration einer Probe innerhalb eines Modells durch die maximale Absorbanz in dem entsprechenden Wellenlängenbereich bestimmt (Modell 1 mit Fokus auf 224 nm beinhaltet nur die Proben von 0-2 g/l, Modell 5 mit Fokus auf 300 nm beinhaltet alle Proben zwischen 0 und 200 g/l b. Alternativ zu 2a können auch zunächst verschiedene Kalibrationsdatensätze aus der Konzentrationsreihe erstellt werden. Aus denen werden dann über statistische Methoden (z.B. PLS) verschiedene Modelle erstellt. In diesem Fall wird der Algorithmus die Wellenlängenbereiche für jeden Kalibrationsdatensatz neu festlegen (und wird so bei Modellen mit hohen Proteinkonzentrationen hauptsächlich Wellenlängen in der Flanke der Proteinbande auswählen (und auch die Bande bei 224nm nicht verwenden)
3. Online Messung im Prozess
4. Klassifizierung des online Spektrums mit den Modellen und Auswahl des am besten passendsten Modell. Hierbei können Algorithmen wie PLS-DA oder die Berechnung der euklidischen oder Mahalanobis Distanz oder SIMCA eingesetzt werden
5. Anwendung des Modells auf das online Spektrum
6. Alternativ zu 4 und 5 ist bei jeder unit Operation der benötige Messbereich klar. Mit diesem Wissen kann auch das valide Modell selbst ausgewählt werden.
Gleichzeitig wird durch die Erfassung des kompletten UV-Vis Spektrums eine Kreuzempfindlichkeit zwischen DNA und Protein verringert oder vermieden und es kann gelingen, HCPs und Zielprotein getrennt zu erfassen. Fig. 6 zeigt die Vorhersage gegenüber dem Referenzwert für DNA bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen. Die Färbung der einzelnen Punkte entspricht den verschiedenen Proteingehalten der Probe. Der Modellfehler ist trotz der stark unterschiedlichen Proteinkonzentrationen akzeptabel. Die Kreuzempfindlichkeit ist gering. Im Downstream Prozess sind Protein- und DNA-Konzentrationen in der Regel wichtige Parameter, die in der gesamten Prozesskette immer wieder bestimmt werden. Diese Bestimmung erfolgt konventionell meist offline durch die Messung der UV-Vis Absorbanz mit der Anregung einzelner Wellenlängen (z.B. mit schmalbandig emittierenden LEDs).
Abhängig vom Prozessschritt unterscheiden sich die Proteinkonzentrationen erheblich (0-200 g/l), weshalb die Proben konventionell meist nur in verschiedenen Verdünnungsstufen gemessen werden können. Verfügbare Online Sensoren erlauben aufgrund des limitierten dynamischen Bereichs (Bereich innerhalb dem im Wesentlichen keine Sättigung auftritt) der Detektoren z.B. eine Bestimmung von Proteingehalten bis etwa 10 g/l. Dabei muss die optische Pfadlänge je nach Konzentrationsbereich geändert werden, um ggf. den Detektionsbereich erweitern zu können. Somit kann nicht ein und dieselbe Hardware für alle Anwendungen genutzt werden. Weiterhin zeigen bestehende UV-Sensoren eine erhebliche Kreuzempfindlichkeit zwischen DNA und Protein. Eine Erhöhung der DNA Konzentration führt somit auch zu einem höheren gemessenen Proteingehalt.
Es sei jedoch erwähnt, dass auch auf übliche Weise ein Sensor bis Konzentrationen von etwa 50 g/l detektieren kann, wenn die Pfad länge entsprechend verkleinert wird. Es muss also vorab entschieden werden, ob eine höhere Empfindlichkeit und ein limitierter Konzentrationsbereich oder einen breiteren Konzentrationsbereich und geringere Empfindlichkeit erzielt werden soll. Dies wird dann vorab durch die Wahl der Pfad länge festgelegt. Das erfindungsgemäße Verfahren hat hingegen den Vorteil, dass ohne Änderung der Hardware im Nachhinein entschieden werden kann, ob eine hohe Empfindlichkeit oder einen höheren Konzentrationsbereich oder höhere Konzentrationen generell gemessen werden soll.
Wie oben bereits erwähnt, gibt es in konventionellen Systemen Online-UV-Sensoren, die mit 1 oder 2 einzelnen Wellenlängenbereichen arbeiten (Optek, Pendotech), die aber bereits bei relativ niedrigen Proteinkonzentrationen gesättigt sind und deshalb einen geringen dynamischen Bereich aufweisen (siehe „Classic UV meter maxed out" in FlowVPE.pptx). Die Wellenlänge der Absorbanz verschiedener Proteine kann variieren. Bestehende Systeme passen die Anregungs- und/oder Detektionswellenlänge i.d.R. nicht an das aktuell zu messende Protein an bzw. die Anregungswellenlänge muss vorab definiert werden und kann nicht ad hoc softwareseitig je nach Applikation geändert werden. Somit kann das Protein ggf. zufällig im Maximum der Absorptionswellenlänge gemessen werden (höchste Empfindlichkeit), weitaus häufiger wird es aber Vorkommen, dass die Anregungsstrahlung in der Flanke der Proteinabsorption liegt (geringere Empfindlichkeit). Aus demselben Grund werden host cell Proteine (HCPs) i.d.R. zusammen mit dem Zielprotein erfasst (Kreuzempfindlichkeit ist nahe 100%). Bei der konventionellen Messung kann nur in dem Fall, dass sich die Absorptionsmaxima und/oder die Bandenbreite oder Bandenform der HCPs vom Zieiprotein unterscheiden, die Erfassung des gesamten Spektrums eine analytische Unterscheidung ermöglichen.
Hinsichtlich diesen Umstandes wurde alternativ bei der UV-T ransmissionsmessung zuvor auch eine Faser beweglich gestaltet, sodass die Pfad länge reproduzierbar variiert werden kann und auch weitaus kleiner als die bei UV-Sensoren übliche minimale Pfad länge von beispielsweise etwa 1 mm gewählt werden kann. Auf diese Weise lassen sich auch Proteinkonzentrationen über 100 g/l erfassen. Allerdings muss der Abstand zwischen den Fasern hoch präzise und reproduzierbar einstellbar sein. Weiterhin ist eine Umsetzung aufgrund der komplexen Messanordnung nur unter Umständen auf den Einsatz in Single-Use Systemen übertragbar.
Das hierin beschriebene Verfahren zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses basiert insbesondere auf der Messung von kompletten Absorptionsspektren - statt einzelner Wellenlängenbereiche - bevorzugt unter Verwendung einer Flusszelle mit konstanter optischer Pfadlänge. Eine bevorzugte Flusszellendicke bzw. Probenschichtdicke liegt bei etwa 1 mm. Abhängig vom zu messenden Konzentrationsbereich werden insbesondere verschiedene multivariate Modelle (z.B. PLS mit Protein als Zielgröße und den Absorptionswerten des jeweiligen Spektralbereichs als Eingangsgrößen) erstellt, die auf der Auswertung verschiedener Wellenlängenbereiche bestehen.
Diese Wellenlängenbereiche können entweder selbst ausgewählt werden oder wobei alle gewählten Wellenlängenbereiche durch die Absorbanz des Zielanalyten (DNA oder Protein) beeinflusst werden. Die Erfindung erlaubt eine präzise Bestimmung von Konzentrationen für DNA und/oder Proteine. Dabei werden insbesondere Absorptionsspektren (anstelle von Werten bei diskreten Wellenlängen) in einer Zelle bei einer konstanten optischen Pfadlänge von beispielsweise etwa 1 mm erfasst. Insbesondere erfolgt eine Zusammenstellung eines Datensatzes zu einem Konzentrationsbereich und ein Generieren multivariater Modelle hinsichtlich der Ergebnisse innerhalb verschiedener Wellenlängenbereiche. Ausgewählte Wellenlängenbereiche zeigen unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber DNA und/oder Protein. Einzelne Wellenlängenbereiche haben unterschiedliche Empfindlichkeiten. Der Dynamikbereich (dynamic ränge) ist unterschiedlich.
In Fig. 2 ist Modell 1 beispielsweise der Absorbanz bei höchster Empfindlichkeit zugeordnet, wobei der Dynamikbereich entsprechend begrenzt ist. Modell 4 wird bei reduzierter Empfindlichkeit erzeugt, aber der zu verwendende Konzentrationsbereich kann ausgedehnt werden. Die Bestimmung der Konzentrationswerte erfolgt durch Vergleich der gesammelten Daten mit vorab festgelegten Modellen.
Dies erlaubt eine besonders einfache Bestimmung von Protein- und DNA- Konzentrationen im Downstream-Prozess und ermöglicht, die in der Praxis stark variierenden Konzentrationsbereiche von DNA und Protein zu erfassen. Darüber hinaus erlaubt die Erfindung die Vermeidung der üblicherweise erforderlichen Verdünnung der Proben bei der Messung hinsichtlich des begrenzten Dynamikbereichs des Sensors. Darüber hinaus kann die Kreuzempfindlichkeit bei der Messung zwischen DNA und Protein reduziert bzw. vermieden werden.
Bezugszeichenliste
1 Optisches Spektrum
1a Optisches Spektrum von Probe während Prozess vor Aufreinigung
1b Optisches Spektrum von Probe während Prozess nach Aufreinigung
2 Absorptionswert(e)
3 Prozess, beispielsweise Downstreamprozess
4 UV/vis Spektrometer
5a Medium bzw. Probe im Prozess vor Aufreinigung 5b Medium bzw. Probe im Prozess nach Aufreinigung
6 Aufreinigungseinheit
7 Messzelle
8 Optischer Lichtleiter
9 Auswerte-ZRecheneinheit
9a Desktop bzw. Bildschirm
100 Verfahren nach einer Ausführungsform
101 Aufnahme von Spektren einer Konzentrationsreihe
102 Erstellung mehrerer Modelle für einzelne Konzentrationsbereiche
103 Online Messung: Aufnahme eines Probenspektrums während des Prozesses
104 Einordnung des Probenspektrums in ein geeignetes Modell
105 Anwendung des Modells auf das Probenspektrum
106 Ausgabe Vorhersagewert
107 Weitergabe des Vorhersagewertes an Prozesssteuerung
108 Geänderte Prozesskontrolle auf Basis der Vorhersage l Wellenlänge
Ml-6 Modelle

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Steuern bzw. Regeln eines Prozesses (3), insbesondere eines Downstream-Bioprozesses, basierend auf der Vorhersage einer unbekannten Konzentration von einer oder mehreren Substanzen in einer Probe (5a, 5b) mittels Spektroskopie, insbesondere UV/vis-Spektroskopie, umfassend die Schritte:
Erfassung (101) von Spektren (1) einer Mehrzahl von Konzentrationsproben, wobei mindestens zwei Konzentrationsproben zueinander unterschiedliche Konzentrationen der einen oder der mehreren Substanzen aufweisen;
Generierung (102) mehrerer quantitativer Modelle (M) auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben, wobei die Modelle (M) jeweils eine Zuordnung zumindest einer spektralen Messgröße (2) der Spektren (1) zu Konzentrationen in Konzentrationsbereichen aufweisen, wobei die Konzentrationsbereiche zweier Modelle (M) nicht identisch sind;
Erfassung (103) mindestens eines Probenspektrums (1 ; 1a, 1b) der Probe (5a, 5b);
Zuordnung (104) des Probenspektrums (1 ; 1a, 1b) zu mindestens einem quantitativen Modell (M) der generierten quantitativen Modelle (M);
Anwendung (105) des mindestens einen quantitativen Modells(M), welches dem Probenspektrum (1 ; 1a, 1b) zugeordnet wurde, auf das Probenspektrum (1 ; 1a, 1b), um einen Vorhersagewert für die unbestimmte Konzentration zu ermitteln; und
Steuern und/oder Regeln (108) des Prozesses (3) bezüglich mindestens eines Parameters auf Basis des Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Spektren eine eineindeutige Zuordnung der spektralen Messgröße (2) zu mehreren Wellenlängen (l) umfasst und vorzugsweise zumindest eine Teilmenge der spektralen Messgröße (2), die den entsprechenden Wellenlängen (l) zugeordnet ist, keine detektorseitige Sättigung aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die quantitativen Modelle (M) zumindest ein globales Modell (M) umfassen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die quantitativen Modelle (M) hierarchisch organisierte Modelle (M) entsprechend zumindest einer ersten Hierarchiestufe und einer zweiten Hierarchiestufe umfassen, wobei insbesondere die erste Hierarchiestufe ein globales Modell umfasst und die zweite Hierarchiestufe mindestens ein lokales Modell umfasst.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zuordnung des Probenspektrums (1; 1a, 1b) zu mindestens einem quantitativen Modell (M) mittels euklidischer Distanz und/oder Mahalanobis und/oder PLS-DA und/oder SIMCA erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Steuern und/oder Regeln bezüglich des mindestens einen Parameters erfolgt und der Parameter mindestens einen aus den folgenden Parametern umfasst: eine Ventilschaltung, eine Pumpensteuerung, einen Medienfluss, einen Mediendruck, einen Gasdruck, einen pH- Wert, einen Filtrierungsschritt, einen Fraktionierungsschritt, eine Zeitsteuerung, eine Prozesszeiteinstellung, eine Temperatur, eine lonenkonzentration, einen Chromatographie-Schritt.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erfassung des mindestens einen Probenspektrums (1 ; 1a, 1b) der Probe (5a, 5b) in- oder online erfolgt und das Steuern und/oder Regeln bevorzugt auch während des Prozesses erfolgt als unmittelbare Folge des ermittelten Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Generierung quantitativer Modelle (M) mittels multivariater Modellerstellung, insbesondere mittels multivariater Regression wie bevorzugt mittels MLR, und/oder PLS und/oder OPLS erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teilbereich, insbesondere einzelne Wellenlängen (l) der Spektren (1) der Mehrzahl der Konzentrationsproben durch eine Gewichtung abgeschwächt oder ausgeschlossen werden.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Teilbereich, insbesondere einzelne Wellenlängen (l) der Spektren (1) der Mehrzahl der Konzentrationsproben, bevorzugt Teilbereiche für die eine lineare Abhängigkeit zwischen Wellenlängen (l) und Messwerten vorliegen, für die Anwendung auf das Probenspektrum (1 ; 1a, 1b) stärker gewichtet werden, wobei die Gewichtung manuell oder mittels eines Algorithmus, insbesondere Faktoranalyse Regressionen in PLS und/oder OPLS.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erfassung einer Vielzahl von Proben-Messwerten bei einer einzigen im Wesentlichen identischen Spaltbreite einer oder mehrerer Messzelle/n erfolgt.
12. Vorrichtung zum Steuern und/oder Regeln eines Prozesses, insbesondere eines Downstream-Bioprozesses (3), basierend auf der Vorhersage einer unbestimmten Konzentration von mindestens einer Substanz in einer Probe (5a, 5b) mittels Spektroskopie umfassend
Mindestens eine Schnittstelle zum Erhalt von Spektren einer Mehrzahl von Konzentrationsproben der mindestens einen Substanz und von mindestens einem Probenspektrum (1 ; 1a, 1b) der Probe (5a, 5b);
Mindestens eine Einheit zur
Generierung quantitativer Modelle (M) auf Basis der Spektren der Konzentrationsproben,
Zuordnung des Probenspektrums (1 ; 1a, 1b) zu mindestens einem quantitativen Modell (M) der generierten quantitativen Modelle (M); und
Anwendung des mindestens einen quantitativen Modells (M), welches dem Probenspektrum (1 ; 1 a, 1b) zugeordnet wurde, auf das Probenspektrum (1 ; 1a, 1b), um einen Vorhersagewert für die unbestimmte Konzentration zu ermitteln; Mindestens eine Prozesseinheit zum Steuern und/oder Regeln des Prozesses bezüglich mindestens eines Parameters auf Basis des Vorhersagewertes für die unbestimmte Konzentration.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, ferner umfassend ein Spektrometer (4) zur Erfassung der Spektren der Mehrzahl von Konzentrationsproben der mindestens einen Substanz und/oder des mindestens einen Probenspektrums (1; 1a, 1b) der Probe (5a, 5b).
14. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, ferner umfassend eine Messzelle, insbesondere eine Einweg-Messzelle, die dazu ausgelegt ist, die Probe (5a, 5b) mit der Substanz aufzunehmen und zu leiten und an der das mindestens eine Probenspektrum (1; 1a, 1b) erfasst werden kann.
15. Computerprogrammprodukt, umfassend computerlesbare Befehle, die bei der Ausführung des Programms durch ein geeignetes computergestütztes System dieses veranlassen, die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 auszuführen.
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