DE60131837T2 - Analyse der fluoreszenzintensitäts- und lebensdauerverteilung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Charakterisieren von Proben mit fluoreszierenden Teilchen und auf Anwendungen dieses Verfahrens.
  • Die Verwendung von Fluoreszenz hat sich in den letzten Jahrzehnten schnell entwickelt, da sie bei verschiedenen wissenschaftlichen Anwendungen eine hohe Empfindlichkeit bietet. Neue Entwicklungen in der Instrumentierung, Datenanalyse, Sonden und Einstellung haben zu einer erhöhten Popularität einer Technik geführt, die auf einem Phänomen beruht, das vor fast 150 Jahren entdeckt wurde (Stokes, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 142, 463–562, 1852). Bei mehreren Anwendungen in physikalischer Chemie, Biologie und Medizin wird Fluoreszenz als empfindliches Mittel zum Nachweisen chemischer Bindungsreaktionen in verdünnten Lösungen verwendet. Wirkstoff-Screening und die Entwicklung pharmazeutischer Assays sind Beispiele für Anwendungsgebiete dieser Art.
  • Neben klassischen Verfahren auf der Basis des Nachweises von Veränderungen in makroskopischen Fluoreszenzmerkmalen, wie Gesamtintensität oder Anisotropie, wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere verschiedene Fluktuationsverfahren entwickelt, mit denen man Spezies aufgrund von Eigenschaften, die charakteristisch für einzelne Moleküle sind, voneinander unterscheiden kann. Eine der ausgeklügeltsten Fluoreszenztechniken mit Einzelmolekülempfindlichkeit ist die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), die verschiedene Spezies in erster Linie aufgrund der unterschiedlichen Translationsdiffusionskoeffizienten auflösen kann (Magde et al., Phys. Rev. Lett. 29, 704–708, 1972; Elson et al., Biopolymers 13, 1–27, 1974; Rigler et al., Eur. Biophys. J. 22, 169–175, 1993; Müller et al., Biophys. J. 78, 474–486, 2000). Vor kurzem fand dieses Fluoreszenzfluktuationsverfahren sein Gegenstück in der Fluoreszenzintensitätsvertei lungsanalyse (FIDA), die verschiedene fluoreszierende Spezies gemäß ihrer spezifischen Helligkeit voneinander unterscheiden kann (Kask et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13756–13761, 1999). Der Ausdruck "spezifische Helligkeit" bezeichnet allgemein die mittlere Zählrate des Detektors für Licht, das von einem Teilchen einer gegebenen Spezies emittiert wird, das sich in einem bestimmten Punkt in der Probe befindet, herkömmlicherweise an dem Punkt, wo der Wert der Helligkeitsprofilfunktion gleich eins ist.
  • Neben Verfahren wie FCS und FIDA, die Spezies aufgrund einer einzelnen spezifischen physikalischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, wurden auch zweidimensionale Verfahren entwickelt, bei denen man zwei Detektoren verwendet, die verschiedene Polarisationskomponenten oder Emissionsbanden der Fluoreszenz messen. Insbesondere die Fluoreszenzkreuzkorrelationsanalyse und die zweidimensionale Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (2D-FIDA) sind Verfahren, mit denen man Spezies aufgrund von zwei Typen von spezifischer Helligkeit erkennen kann (Kask et al., Biophys. J. 55, 213–920, 1989; Schwille et al., Biophys. J. 72, 1878–1886, 1997; Kask et al., Biophys. J. 78, 2000). Eine zweidimensionale Kombination von FIDA und FCS ist auch aus WO 98/57150 bekannt.
  • Während FCS, FIDA und die genannten zweidimensionalen Verfahren statistische Verfahren der Fluktuationsspektroskopie sind, gibt es auch ein anderes breites Forschungsgebiet mit dem Ziel, einzelne Moleküle zu identifizieren. Viele Anwendungen machen sich die Fluoreszenzlebensdauer als intrinsische molekulare Eigenschaft zu Nutze, die empfindlich gegenüber allen Veränderungen der direkten Umgebung des Moleküls ist. Anders als die oben genannten Fluktuationsverfahren ist die Fluoreszenzlebensdaueranalyse (FLA) jedoch grundsätzlich eine makroskopische Technik, die die Unterscheidung verschiedener Fluoreszenzabklingzeiten ermöglicht, ohne dass Fluktuationen der Anzahl der Moleküle in dem überwachten Probenvolumen notwendig sind. Daher werden Fluoreszenzlebensdauermessungen gewöhnlich in Küvetten bei hohen Probenkonzentrationen durchgeführt. Der Nachteil dieser Ausführung besteht jedoch darin, dass das experimentell gesammelte Anregungs-bis-Nachweis-Verzögerungszeit-Histo gramm Beiträge von verschiedenen Spezies beinhaltet, die schwierig aufzulösen sind. Außerdem hat FLA nur eine geringe Robustheit, d. h. geringfügig falsche Annahmen führen zu sehr falschen Ergebnissen.
  • Dagegen wurden Lebensdauerexperimente auch auf extrem niedrige mittlere Teilchenzahlen angewendet. Dieser Ansatz, der im Gegensatz zu herkömmlicher FLA steht, wurde als Burst-Integrated-Fluoreszenzlebensdaueranalyse (BIFL) eingeführt (Keller et al., Applied Spectroscopy 50, 12A–32A, 1996). BIFL sucht nach Fluoreszenzausbrüchen (Bursts) von einzelnen Molekülen oberhalb einer bestimmten Schwellenintensität. Ihr Nachteil besteht darin, dass sie nur bei sehr niedrigen Konzentrationen von erheblich weniger als einem Teilchen pro Messvolumen angewendet werden kann und daher eine relativ lange Datensammelzeit notwendig ist.
  • Wenn Fluoreszenzlebensdauerexperimente in der Zeitdomäne mit zeitkorrelierter Einzelphotonzählung (TCSPC) durchgeführt wird, wird die Anregungs-bis-Nachweis-Verzögerungszeit t von einzelnen Photonen aufgezeichnet und in einem Histogramm gesammelt. Um daraus die Fluoreszenzlebensdauer zu ermitteln, wird eine theoretische Verteilung P(t) gegen diese experimentellen Daten angepasst. Gewöhnlich wird P(t) durch eine mono- oder multiexponentielle Abklingfunktion beschrieben, die mit der betreffenden Instrumentenansprechfunktion (IRF) gefaltet wird. Während diese Art von Analyse es ermöglicht, Bestandteile der Probe gemäß ihren einzelnen Lebensdauern τ zu charakterisieren, ermöglicht sie nicht die Bestimmung ihrer Konzentrationen c und der spezifischen Helligkeit q, sondern nur der Produkte qc.
  • Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren mit hoher Genauigkeit und Robustheit anzugeben, das die Charakterisierung von einzelnen Teilchen auf der Grundlage ihrer Fluoreszenzeigenschaften ermöglicht.
  • Das Verfahren von Anspruch 1 bietet eine Lösung für die obigen Probleme.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Charakterisieren von Proben mit fluoreszierenden Teilchen vorgestellt, das die folgenden Schritte umfasst. Zuerst werden Teilchen in einem Messvolumen durch eine Reihe von Anregungsimpulsen angeregt, und die emittierte Fluoreszenz wird überwacht, indem man Sequenzen von Photonenzählereignissen nachweist. Zu diesem Zweck könnte vorzugsweise ein konfokales Auflichtmikroskop in Verbindung mit einer Laserimpulsanregung mit einer hohen Wiederholungsfrequenz (z. B. 100 MHz) verwendet werden. Die Anzahl der Photonenzählereignisse in Zählzeitintervallen einer gegebenen Breite sowie die Nachweisverzögerungszeiten der Photonenzählereignisse relativ zu den entsprechenden Anregungsimpulsen werden bestimmt. Eine Funktion der Nachweisverzögerungszeiten wird aufgebaut, wie es unten im Einzelnen beschrieben ist, und als nächster Schritt wird eine Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten P ^(n, t, ...) bestimmt, wobei wenigstens eines der Argumente die Anzahl der Photonenzählereignisse ist und ein anderes Argument die Funktion von Nachweisverzögerungszeiten ist. Danach wird eine Verteilung von Teilchen als Funktion von wenigstens zwei Argumenten auf der Basis der Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t, ...) bestimmt, wobei eines der Argumente eine spezifische Helligkeit (oder ein Maß dafür) der Teilchen ist und ein anderes Argument eine Fluoreszenzlebensdauer (oder ein Maß dafür) der Teilchen ist. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das Fluoreszenzintensitäts- und -lebensdauerverteilungsanalyse (FILDA) genannt wird, hat den Vorteil, dass es möglich ist, absolute Konzentrationen zu bestimmen, eine Größe, die mit herkömmlicher FLA nicht direkt zugänglich ist. Wenn die kombinierte Information gemäß der vorliegenden Erfindung in einer solchen korrelierten Weise verwendet wird, führt sie zu einer signifikant erhöhten Genauigkeit im Vergleich zu FIDA und Fluoreszenzlebensdaueranalyse allein. Im Gegensatz zu BIFL, die nach Fluoreszenzausbrüchen von einzelnen Molekülen oberhalb einer bestimmten Schwellenintensität sucht, analysiert FILDA vorzugsweise die relativen Fluktuationen des gesamten Datenstroms und zieht somit die Möglichkeit einer gleichzeitigen Photonenemission aus verschiedenen Molekülen in Betracht. Daher kann die vorliegende Erfindung auch in erheblich höheren Konzentrationen verwendet werden als BIFL.
  • Im Folgenden werden die zugrundeliegende Theorie sowie bevorzugte Ausführungsformen ausgearbeitet und auf simulierte sowie experimentelle Daten angewendet. Die herausragende Leistung bei der Auflösung verschiedener Spezies wird gezeigt, indem die Bindung von Calmodulin an einen Peptidliganden quantifiziert wird, was eine breite Anwendbarkeit in den Life Sciences verspricht.
  • Wie oben skizziert wurde, beruht die vorliegende Erfindung auf einem Verfahren, das wenigstens zweidimensional ist: Verschiedene fluoreszierende Teilchenspezies in der Probe werden anhand von spezifischen Helligkeits- sowie Lebensdauerwerten voneinander unterschieden. In manchen Fällen könnte es jedoch vorteilhaft sein, weitere Teilcheneigenschaften in Betracht zu ziehen, wie ihren Diffusionskoeffizienten oder die Helligkeit in Bezug auf zwei verschiedene Photonendetektoren, die die Fluoreszenz einer unterschiedlichen Farbe oder Polarisation messen. In diesen Fällen ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung höher- als nur zweidimensional, was durch die Pünktchen in der Formel der Wahrscheinlichkeitsfunktion zum Ausdruck gebracht wird. Der Einfachheit halber wird der größte Teil der folgenden Erläuterungen jedoch für den zweidimensionalen Fall ausgearbeitet.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren entwickelt, das geeignet ist, um unterschiedliche Spezies einer Probe gemäß ihren Lebensdauern τ und Helligkeitswerte q voneinander zu unterscheiden und ihre absoluten Konzentrationen c zu bestimmen. Der Schlüssel besteht darin, eine gemessene zweidimensionale FILDA-Verteilung P ^(n, t) der Anzahl der nachgewiesenen Photonenzählereignisse n und die integrierte Verzögerungszeit τ zu analysieren, wobei man einen theoretischen Ausdruck für die erwartete Verteilung P(n t) anwendet. Im Folgenden wird eine Erweiterung der Theorie der FIDA (Kask et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13756–13761, 1999) vorgestellt, die zu einem schnellen und effizienten Algorithmus führt, der für die Anpassung der gemessenen zweidimensionalen FILDA-Verteilung geeignet ist. Unter Verwendung der Darstellung der erzeugenden Funktionen wird das Problem zuerst auf das einer einzigen Spezies reduziert. Im Falle von einzelnen Spezies wird P(n, t) als Produkt von zwei Faktoren P(n), der Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse, und P(t|n), der integrierten Verzögerungszeitverteilung über n Photonenzählereignisse, ausgedrückt. Da die Berechnung von P(n) durch die Theorie von FIDA und die von P(t|n = 1) = P(t) durch die Theorie von FLA gelöst ist, muss man nur noch zusätzlich P(t|n) aus P(t|1) berechnen.
  • Ein größerer bevorzugter Bestandteil der FILDA-Theorie gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Konzept der erzeugenden Funktionen. Die erzeugende Funktion der Wahrscheinlichkeitsverteilung P(n, t) ist definiert als
    Figure 00060001
  • Die Nachweisverzögerungszeit t jedes Photons wird in diskreten Intervallen dargestellt. Bei dieser Definition ist es zweckmäßig, Argumente der erzeugenden Funktion, ξ und η, in der Form eiφ auszuwählen. Wegen dieser Selektion stehen G(ξ, η) und P(n, t) über eine zweidimensionale Fourier-Transformation miteinander in Zusammenhang, die durch schnelle Algorithmen berechnet werden kann (Brigham, The Fast Fourier Transform, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1974).
  • Der Grund dafür, dass die Darstellung der erzeugenden Funktion zweckmäßig ist, wird klar, wenn man vergleicht, wie verschiedene Beiträge in P(n, t) und G(ξ, η) enthalten sind. Wenn man zum Beispiel zwei unabhängige fluoreszierende Spezies hat, die getrennt die Verteilungen P1(n, t) und P2(n, t) ergeben würden, wird die resultierende Verteilung als Faltung
    Figure 00060002
    ausgedrückt, während die Beziehung in der Darstellung der erzeugenden Funktion als einfaches Produkt G(ξ, η) = G1(ξ, η)G2(ξ, η). (3) ausgedrückt wird.
  • Die Berechnung von Faltungen ist sehr zeitraubend, aber die Berechnung eines Produkts ist schnell und leicht. Weiterhin ist die Verallgemeinerung von Gleichung 3 auf mehr als zwei Spezies einfach. Die Kenntnis einer theoretischen Beschreibung einer einzelnen Spezies ist bereits ausreichend, da Gleichung 3 diese Beschreibung einfach durch ein Produkt auf den Fall mehrerer Komponenten ausdehnt. Daher wird im Folgenden der Fall einer einzigen Spezies betrachtet.
  • Die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Nachweisverzögerungszeit für jedes Photon kann als Funktion angesehen werden, die für die gegebene Spezies charakteristisch ist und weder von der Zahl der emittierten oder zuvor nachgewiesenen Photonen noch von den Koordinaten der Moleküls, das das Photon emittiert, abhängt. Dies bedeutet, dass P(n, t) dargestellt werden kann als P(n, t) = P(n)P(t|n), (4)wobei P(t|n) die Wahrscheinlichkeitsverteilung der integrierten Nachweisverzögerungszeit von n Photonen ist und P(n) die Wahrscheinlichkeitsverteilung zum Nachweisen von n Photonen innerhalb des gegebenen Zählzeitintervalls ist. Da P(t|n) durch die n-fache Faltung aus P(t|1) berechnet wird, kann aus Gleichung 3 abgeleitet werden, dass die eindimensionale erzeugende Funktion von P(t|n) die n-te Potenz der erzeugenden Funktion von P(t|1) ist: G(η|n) = [G(η|1)]n. (5)
  • Einsetzen der Gleichungen 4 und 5 in Gleichung 1 führt zu dem folgenden Ausdruck: G(ξ, η) = Σ nP(n)[G(η|1)]n)ξn (6) G(ξ, η) = G(ξG(η|1)] (7)
  • Gemäß Gleichung 6 ist jede Spalte der G(ξ, η)-Matrix, die einem gegebenen η-Wert entspricht, eine eindimensionale Fourier-Transformierte der Funktion P(n)[G(η|1)]n, während gemäß Gleichung 7 jedes Element der G(ξ, η)-Matrix auch als Fourier-Transformierte von P(n) am Punkt ξ G(η|1) ausgedrückt werden kann.
  • G(η|1) ist die erzeugende Funktion (hier: die eindimensionale Fourier-Transformierte) der erwarteten Nachweisverzögerungszeitverteilung eines Photons P(t|1), das von einer bestimmten Spezies stammt. Die Funktion P(t|1) ist die zyklische Faltung der IRF und eine Exponentialfunktion mit einer Abklingzeit, die für die gegebene Spezies charakteristisch ist.
  • Das Problem, wie P(n) berechnet wird, wurde von Kask et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13756–13761, 1999) beschrieben. P(n) wird mit Hilfe seiner erzeugenden Funktion berechnet, die im Falle einer einzigen Spezies ausgedrückt wird als G(ξ) = exp⌊c∫(e(ξ-1)qTB(r) – 1)dV⌋, (8)wobei B(r) die räumliche Helligkeitsfunktion ist, q sie scheinbare spezifische Helligkeit ist, T die Breite des Zählzeitintervalls ist, c die scheinbare Konzentration ist und dV ein Volumenelement ist. Das Integral auf der rechten Seite von Gleichung 8 kann numerisch berechnet werden. Die Beziehung zwischen der räumlichen Helligkeit und den entsprechenden Volumenelementen (die bei der Berechnung der rechten Seite von Gleichung 8 benötigt wird) wird vorzugsweise durch eine empirische Formel von drei Einstellungsparametern a1, a2 und a3 ausgedrückt:
    Figure 00080001
    wobei u = In[B(0)/B(r)] ist und A0 ein Koeffizient ist, der verwendet wird, um die Volumeneinheit auszuwählen. Die Beziehung zwischen der räumlichen Helligkeit B und den Volumenelementen dV könnte jedoch auch durch eine Beziehung
    Figure 00090001
    ausgedrückt werden. Die Beziehung zwischen der wahren und der scheinbaren Konzentration und zwischen der wahren und der scheinbaren spezifischen Helligkeit wird in der Theorie von FIMDA vorgestellt (Palo et al., Biophys. J. 79, 2858–2866, 2000).
  • Im Folgenden wird eine Theorie vorgestellt, die voraussagt, wie capp und qapp von T abhängen. Der Fall von einzelnen Spezies wird untersucht, und die erste und die zweite faktorielle Kumulante der Verteilung, die Gleichung 3 entspricht, werden berechnet. Die faktoriellen Kumulanten sind definiert als
    Figure 00090002
    was Folgendes ergibt: K1 = 〈n〉 = cappqappT (9b) K2 = 〈n(n – 1)〉 – 〈n〉2 = cappqapp 2T2 (9c)wobei Normierungsbedingungen ∫BdV = 1, (9d) ∫B2dV = 1. (9e)verwendet wurden. (Man beachte, dass die Gleichungen 9b und 9c in völliger Übereinstimmung mit den Formeln von Qian und Elson sind (Biophys. J. 57: 375–380, 1990). Aus Gleichung 9b kann man folgern, dass capp(T)qapp(T) = 〈I〉, (9f) wobei 〈I〉 ≡ 〈n〉T/T die mittlere Zählrate ist, die nicht von der Wahl von T abhängt. Wir fahren fort, indem wir die folgende Beziehung zwischen der zweiten Kumulanten der Verteilung der Zahl der Zählereignisse P(n; T) und der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität G(t) = 〈I(0)I(t)〉 – 〈I〉2 einsetzen:
    Figure 00100001
  • Unter Einführung der Notation
    Figure 00100002
    gelangt man von den Gleichungen 9g und 9c zu capp(T)qapp 2(T) = capp(0)qapp 2(0)Γ(T) (9i)
  • Von den Gleichungen 9f und 9i gelangt man zu
    Figure 00100003
    qapp(T) = qapp(0)Γ(T), (9k)
  • Als letzter Schritt zur Ableitung des theoretischen Ausdrucks für die erzeugende Funktion von P(n, t) für einzelne Spezies werden Gleichung 7 und 8 miteinander kombiniert, was Folgendes ergibt: G(ξ, η) = exp⌊c∫dV(exp{[ξG(η|1) – 1]qB(r)T} – 1)⌋ (10)
  • Gleichung 10 ist ein kompakter theoretischer Ausdruck. Die Abhängigkeit von G(ξ, η) von der Fluoreszenzlebensdauer wird nur durch die Funktion G(η|1) ausgedrückt. Es ist jedoch möglicherweise aus Gleichung 6 noch transparenter als aus Gleichung 10, dass zwei eindimensionale Verteilungen P(n) und P(t|1) das Ergebnis G(ξ, η) für eine einzige Spezies vollständig determinieren. Für mehrere Spezies ergeben die Gleichungen 3 und 10: G(ξ, η) = exp[Σ ici∫dV(exp{[ξGi(η|1) – 1]qiB(r)T} – 1)] (11)wobei der Index i verschiedene Spezies bezeichnet.
  • Diskrete Fourier-Transformationsalgorithmen können verwendet werden, wenn man erzeugende Funktionen aus Wahrscheinlichkeitsverteilungen berechnet oder umgekehrt. Dies bedeutet, die Verteilungsfunktion wird künstlich als Funktion von zyklischen Argumenten angesehen. Daher sollten Zyklusperioden definiert werden. In der Dimension der Zahl der Zählereignisse ist es zweckmäßig, die Periode bei einem Wert von n zu definieren, an dem P(n) praktisch auf Null abgefallen ist. In der Dimension der Nachweisverzögerungszeit sollten zwei verschiedene Periodenwerte in Betracht gezogen werden.
  • Wenn P(t|1) berechnet wird, sollte die ausgewählte Periode des Zyklus mit der Periode der Laseranregung zusammenfallen. Hier wird berücksichtigt, dass die Fluoreszenzabklingfunktion während einer Impulsperiode Nl nicht auf Null abzufallen braucht. Nachdem P(t|1) in der Periode von aufeinanderfolgenden Anregungsimpulsen 0 < t ≤ Nl berechnet wurde, ist die Funktion im Intervall Nl ≤ t < Nt von Nullstellen aufgefüllt, wobei Nt den Wert der Zyklusperiode von P(n, t) in der t-Dimension bezeichnet. Ein Wert von Nt wird dort ausgewählt, wo die Verteilung P(n, t) praktisch auf Null abgefallen ist. Danach wird Gleichung 6 angewendet, um die Fourier-Transformierte von P(n, t) zu berechnen.
  • Wie oben erläutert wurde, sollte bei der Berechnung von P(t|1) und seiner erzeugenden Funktion die ausgewählte Periode der Wahrscheinlichkeitsverteilung natürlich mit der Periode der Laseranregung zusammenfallen. Wenn man annimmt, dass die Impulszeit in Nl Nachweisverzögerungszeitintervalle der Breite Δ unterteilt wird, wird die ideale periodisierte Wahrscheinlichkeitsverteilung, die einer δ-Anregung entspricht, im Intervall 0 < t ≤ Nl als
    Figure 00120001
    ausgedrückt, wobei τ die Lebensdauer der Fluoreszenz bezeichnet. Der leichteste Weg, um die Faltung von Pδ(t) mit der zeitlichen Ansprechfunktion R(t) (die ebenfalls eine periodisierte Funktion ist) zu berechnen, führt über die Fourier-Transformierte:
    Figure 00120002
  • Der Genauigkeit halber kann P(t|1) mit einer hohen Zeitauflösung berechnet werden. Man könnte hier zum Beispiel eine achtmal so hohe Auflösung verwenden, wie es in dem unten beschriebenen Experiment 2 geschehen ist. Nachdem P(t|1) im Intervall 0 < t ≤ Nl berechnet wurde, wird die Funktion durch eine Reihe von Nullstellen im Intervall Nl ≤ t < Nt ergänzt. Hier bezeichnet Nt den Wert der Periodisierung von P(n, t) in der t-Dimension.
  • Gewichte der Anpassung
  • Zur Vereinfachung kann man annehmen, dass Zahlen von Zählereignissen in aufeinanderfolgenden Zählzeitintervallen unabhängig voneinander sind. Diese Annahme ist strenggenommen nicht richtig, da molekulare Koordinaten über einige Zählintervalle hinweg signifikant miteinander korreliert sind, aber sie kann dennoch erfolgreich angewendet werden. Unter dieser Annahme ist die Zahl der Ereignisse bei einem gegebenen Paar (n, t) binomial um den Mittelwert M P(n, t) herum verteilt, wobei M die Zahl der Zählzeitintervalle pro Experiment ist. Dies ergibt den folgenden Ausdruck für Gewichte W(n, t) des Kleinste-Quadrate-Problems
    Figure 00120003
    Figure 00130001
    wobei χ2 der Kleinste-Quadrate-Parameter ist, P ^(n, t) das gemessene FILDA-Histogramm ist und P(n, t) die theoretische Verteilung ist.
  • Die Gewichte W(n, t) von Gleichung 12 sind für die Anpassung gut genug, würden aber zu unterschätzten statistischen Fehlern führen, wenn man sie für diesen Zweck verwendete. Daher werden statistische Fehler von FILDA anhand der Anpassung einer Reihe von experimentellen und simulierten Daten bestimmt.
  • Wenn wir auf die Erfindung unter allgemeineren Aspekten zurückkommen, sei erwähnt, dass das zweite Argument der Wahrscheinlichkeitsfunktion nicht die bloße individuelle Nachweisverzögerungszeit für jedes Photon ist, sondern eher eine Funktion davon, wie eine integrierte Nachweisverzögerungszeit über alle nachgewiesenen Photonen in einem gegebenen Zählzeitintervall. Man beachte, dass ein Molekül kaum zwei Photonen aus einem einzigen Anregungsimpuls emittieren kann, aber in den unten vorgestellten Beispielen gibt es 10 000 Anregungsimpulse pro Zählzeitintervall, was erklärt, warum man während dieser Zeit Dutzende von Photonen von einem einzigen Molekül nachweisen kann. Diese vorteilhafte Wahl des zweiten Arguments hängt mit der Eigenschaft der Fluoreszenz zusammen, dass eine Reihe von Photonen, die in einem kurzen Zeitintervall nachgewiesen werden, wahrscheinlich von einem einzigen Molekül emittiert werden, insbesondere wenn die optimale Konzentration für die Durchführung des vorliegenden Verfahrens, die nur geringfügig unter einem Molekül pro Messvolumen liegt, verwendet wird. Bei der klassischen Lebensdaueranalyse geht diese Information verloren. Aus diesem Grund erweist sich das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung als das genauere Analyseverfahren, auch wenn spezifische Helligkeitswerte von zwei Teilchenspezies, die in der Probe vorhanden sind, zufällig identisch sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Funktion von Nachweisverzögerungszeiten invariant in Bezug auf die Reihenfolge der Nachweisverzögerungszeiten von Photonenzählereignissen, die in demselben Zählzeitintervall nachgewiesen wurden. Vorzugsweise ist die Funktion der Nachweiszeiten eine Summe oder ein Mittelwert. Die Nachweisverzögerungszeiten für jedes Photon, d. h. die Nachweiszeiten von Photonenzählereignissen relativ zu den entsprechenden Anregungsimpulsen könnten durch ganze Zahlen mit einer bekannten Beziehung zu den Nachweiszeiten ausgedrückt werden. Diese Beziehung ist idealerweise eine quasilineare. Die Funktion der Nachweisverzögerungszeiten könnte vorzugsweise eine Summe oder ein Mittelwert der ganzen Zahlen sein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Verteilungsfunktion der Teilchen bestimmt, indem man die experimentell bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t, ...) durch eine entsprechende angepasste theoretische Wahrscheinlichkeitsfunktion P(n, t, ...) wiedergibt. Diese theoretische Verteilungsfunktion P(n, t, ...) wird vorzugsweise durch ihre erzeugende Funktion
    Figure 00140001
    berechnet. Im Falle eines einzelnen Detektors ist die experimentell bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion eine zweidimensionale Funktion, wie es oben erläutert wurde; es ist also bevorzugt, die Verteilungsfunktion von Teilchen zu bestimmen, indem man die experimentell bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t) durch eine entsprechende angepasste theoretische Wahrscheinlichkeitsfunktion P(n, t) wiedergibt. Letztere wird vorzugsweise anhand ihrer erzeugenden Funktion
    Figure 00140002
    berechnet.
  • Soweit die vorliegende Erfindung durch Anpassen einer gemessenen zweidimensionalen Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse (n) und der vorzugsweise integrierten Nachweisverzögerungszeit (t) durchgeführt wird, ist das Grundproblem eine Formel zur Berechnung der theoretischen Wahrscheinlichkeitsverteilung P(n, t). Beide Argumente der Wahrscheinlichkeitsverteilung sind typische Beispiele für additive Variablen: Wenn ein Molekül zum Beispiel n1 Photonen mit einer integrierten Nachweisverzögerungszeit t1 emittiert und ein anderes Molekül n2 Photonen mit einer integrierten Nachweisverzögerungszeit t2 emittiert, dann emittieren sie zusammen n1 + n2 Photonen mit einer integrierten Nachweisverzögerungszeit t1 + t2. In diesem Fall ist es zweckmäßig, eine Darstellung der erzeugenden Funktion auszuwählen, wenn man die interessierende Wahrscheinlichkeitsverteilung ausdrückt, wie es oben beschrieben ist.
  • Es ist weiterhin bevorzugt, eine zeitliche Ansprechfunktion des experimentellen Geräts zu bestimmen, die bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n, t, ...) zu berücksichtigen ist. Die zeitliche Ansprechfunktion kann anhand eines getrennten Experiments bestimmt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Menge von verschiedenen Werten für die Breite der Zählzeitintervalle verwendet, wobei die Breite ein weiteres Argument der Wahrscheinlichkeitsfunktion ist. In diesem besonderen Fall kann vorteilhafterweise der Diffusionskoeffizient (oder ein Maß dafür) der Teilchen bestimmt werden. Folglich wird er zu einem dritten Argument der Verteilungsfunktion von Teilchen. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Fluoreszenzintensitäts-Lebensdauer-multiple-Verteilungsanalyse (FILMDA) genannt.
  • Die Zählzeitintervalle könnten zeitlich aufeinanderfolgend sein, oder sie könnten überlappen.
  • Wie oben erwähnt, werden Konzentrationen von Teilchen vorzugsweise so ausgewählt, dass sie ungefähr ein oder weniger Moleküle pro Messvolumen betragen. Wenn Experimente bei erheblich niedrigeren Konzentrationen als ein Teilchen pro Messvolumen durchgeführt werden, würden sie zu einer langsamen Erfassung von brauchbarer Information führen, da der größte Teil der Datenerfassungszeit mit Warten verbracht wird, d. h. ohne Teilchen im Messvolumen. Dies wäre eine Situation, die bei Hochdurchsatz-Screening-Experimenten besonders unerwünscht ist.
  • Ein einziger, zwei oder mehr Photonendetektoren werden als Nachweiseinrichtungen verwendet, und es handelt sich dabei vorzugsweise entweder um eine Avalanche-Photodiode oder einen Photomultiplier. Wenigstens zwei Photonendetektoren können zum Beispiel verwendet werden, um die Fluoreszenz verschiedener Farben oder Polarisationen zu überwachen.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für die Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Assays, die Assayentwicklung und diagnostische Zwecke geeignet. Es kann jedoch auch in den Life Sciences und verwandten Technologien verbreitet angewendet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind konfokale Techniken besonders gut geeignet, um die fluktuierende Intensität der Fluoreszenz zu überwachen. Sie können, wie es oben skizziert wurde, auf ein weites Feld von Anwendungen, wie Biomedizin usw., angewendet werden. Die konjugierte fokale (konfokale) Technik beruht auf der Verwendung einer Punktlichtquelle, die scharf auf einen beugungsbegrenzten Punkt auf der Probe fokussiert ist. Das emittierte Licht wird durch ein räumliches Filter (Lochblende) betrachtet, das das Blickfeld so isoliert, dass es genau mit dem beleuchteten Punkt zusammenfällt. So sind die Beleuchtungs- und die Nachweisapertur optisch miteinander konjugiert. Licht, das aus anderen Brennebenen als der der Objektivlinse stammt, wird verworfen, was effektiv eine sehr kleine Feldtiefe ergibt. Daher wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein konfokales Mikroskop verwendet, um die Intensität der Fluoreszenz zu messen. Um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, ist es nützlich, die Fluoreszenz mit Hilfe einer Apparatur zu messen, die Folgendes umfasst: eine Strahlungsquelle (12) zur Bereitstellung von anregender Strahlung (14), ein Objektiv (22) zur Fokussierung der anregenden Strahlung (14) in ein Messvolumen (26), einen Detektor (42) zum Nachweis von Emissionsstrahlung (30), die aus dem Messvolumen (26) stammt, und eine undurchsichtige Einrichtung (44), die im Weg (32) der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) positioniert ist, um den zentralen Teil der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) auszulöschen. Es könnte besonders bevorzugt sein, einen optischen Aufbau zu verwenden, wie er im Einzelnen in 6 beschrieben ist.
  • Im Vergleich zu bekannten mehrdimensionalen Fluoreszenzfluktuationsverfahren ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sehr speziell, da die zweite stochastische Variable des Histogramms (oder der Wahrscheinlichkeitsfunktion) vorzugsweise die Summe oder der Mittelwert von Anregungs-bis-Nachweis-Verzögerungszeiten über die Anzahl der in einem gegebenen Zählzeitintervall nachgewiesenen Photonen ist. Für sich allein hat diese Variable, wenn überhaupt, nur geringen Wert. Sie erhält ihre Bedeutung erst dann, wenn sie mit der Zahl der Photonenzählereignisse verbunden wird. Eine naheliegende Wahl der beiden Variablen, wenn man die Helligkeits- und Lebensdaueranalyse miteinander kombiniert, wäre die Zahl der Photonenzählereignisse und jede individuelle Anregungs-bis-Nachweis-Verzögerungszeit; die Wahl der vorliegenden Erfindung schafft jedoch ein Verfahren mit einer erheblich besseren Genauigkeit als die naheliegende Wahl. Ein weiterer Grund für den Erfolg dieser speziellen Wahl besteht darin, dass die Anpassungsfunktion des Histogramms (oder die Wahrscheinlichkeitsfunktion) über ihre Fourier-Transformierte, d. h. unter Verwendung der Darstellung der erzeugenden Funktionen, schnell berechnet werden kann.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele veranschaulicht, die den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
  • 1: (A) FILDA-Histogramm einer Bodipy630/650-Lösung mit einer Datensammelzeit von T = 2 s. (B) Gewichtete Residuen der Anpassung von Gleichung 10 an das FILDA-Histogramm von (A) (Gewichtung gemäß Gleichung 12). Die Anpassung führte zu Werten von c = 2,3, q = 23,2 kHz, τ = 3,3 ns und χ2 = 1,1.
  • 2: Abhängigkeit der Variationskoeffizienten von FILDA (Erfindung), von FLA (Stand der Technik) und FIDA (Stand der Technik) von der Konzentration der fluoreszierenden Spezies. Für jedes der drei Verfahren wurden 100 zufällige Histogramme für ein 1:1-Gemisch von zwei fluoreszierenden Spezies bei einer Datensammelzeit von 20 s simuliert. Die Eingabeparameter für die Simulation waren: Konzentration c1 = c2 (x-Achse), Helligkeit q1 = 30 kHz und q2 = 15 kHz, Lebensdauer τ1 = 3,0 ns und τ2 = 1,5 ns. Alle Parameter (c1, c2, q1, q2, τ1, τ2 bei FILDA; c1, c2, q1, q2 bei FIDA und c1q1, c2q2, τ1, τ2 bei FLA) wurden einer Anpassung unterzogen. Der Variationskoeffizient des Konzentrationswerts c2 der zweiten (schwächeren) Komponente ist auf dieser Graphik aufgetragen. Die Analyse von 100 Histogrammen ergibt 7,1% Genauigkeit der Standardfehler.
  • 3: Abhängigkeit der Variationskoeffizienten von FILDA von der Datensammelzeit T (obere x-Achse). Die Analyse wurde an 100 simulierten Histogrammen eines 1:1-Farbstoffgemischs mit den folgenden Eingabeparametern durchgeführt: Konzentration c1 = c2 = 0,2, Helligkeit q1 = 30 kHz und q2 = 15 kHz, Lebensdauer τ1 = 3,0 ns und τ2 = 1,5 ns. Die Analyse von 100 Histogrammen ergibt 7,1% Genauigkeit der Standardfehler. Die untere x-Achse zeigt T–1/2, um die lineare Abhängigkeit zu verdeutlichen.
  • 4: Bindung des markierten Zielpeptids H-KRRWKKNFIAK-NH2 an Calmodulin, wie sie durch FILDA überwacht wurde (Datensammelzeit T = 2 s, Fehlerbalken aus der Mittelung über 10 wiederholte Messungen). Die durchgezogene Kurve resultiert aus einer hyperbolischen Anpassung an die Daten, was eine Bindungskonstante KD = 38 ± 3 nM ergab.
  • 5: Veranschaulichung von Intensitätsgraphiken von Histogrammen von Experiment 2. Die x-Achsen zeigen die mittlere Impuls-bis-Photonen-Verzögerungszeit; die y-Achsen zeigen die Anzahl der Photonenzählereignisse. Eine dunklere Intensität entspricht einer höheren Anzahl von Ereignissen.
  • 6 zeigt eine Ausführungsform einer Apparatur, die zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Apparatur 10 umfasst einen Laser 12, der als Lichtquelle dient, um die Probe mit einem Bündel von kohärenter monochromatischer Anregungsstrahlung 14 zu beleuchten. Die Anregungsstrahlung 14 wird durch eine Linse 16 parallel gemacht und erreicht einen dichroitischen Spiegel 20. Der Winkel zwischen der optischen Achse 18 und dem dichroitischen Spiegel 20 beträgt vorzugsweise 45°. Der dichroitische Spiegel 20 reflektiert die Anregungsstrahlung 14 in Richtung auf eine Objektivlinse 22, deren Brennpunkt 24 innerhalb eines Probenvolumens 26 liegt. Das Probenvolumen 26 und die Objektivlinse 22 sind vorzugsweise durch ein transparentes Deckglas 28 voneinander getrennt, zum Beispiel durch den Boden einer kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatte, die die Probe enthält. Die Probe enthält vorzugsweise fluoreszenzmarkierte Moleküle oder andere Teilchen. Aufgrund der Anregung durch eine geeignete Anregungsstrahlung 14 emittieren die in der Probe vorhandenen Moleküle oder anderen Teilchen Strahlung 30. Die Emissionsstrahlung 30 tritt durch die Objektivlinse 22 und erreicht den dichroitischen Spiegel 20, der für die Emissionsstrahlung 30 transparent ist. Danach tritt die Emissionsstrahlung durch ein Filter 34 und eine Kollimatorlinse 36 auf der optischen Achse 32. Eine Lochblende 38 befindet sich im Brennpunkt der Kollimatorlinse 36. Emissionsstrahlung 30, die durch die Lochblende 38 tritt, erreicht eine weitere Linse 40 und wird danach durch den Photodetektor 42 nachgewiesen. Innerhalb des Weges der Emissionsstrahlung 30, insbesondere zwischen dem dichroitischen Spiegel 20 und dem Photodetektor 42, wird eine undurchsichtige Einrichtung 44 bereitgestellt, durch die ein zentraler Teil der Emissionsstrahlung 30 nicht hindurchtreten kann. Dieser zentrale Teil der Emissionsstrahlung 30 stammt aus Bereichen auf der optischen Achse 32 vor oder hinter dem Brennpunkt 24 der Anregungsstrahlung 14. Nur Emissionsstrahlung 30, die aus dem Brennpunkt 24 oder seiner direkten Nachbarschaft stammt, tritt durch die Lochblende 38 und erreicht den Photodetektor 42. Anstatt eine undurchsichtige Einrichtung 44 innerhalb des Weges der Emissionsstrahlung 30 zu platzieren, ist auch der Weg der Anregungsstrahlung 14 geeignet, um eine undurchsichtige Einrichtung 44 zu positionieren. Insbesondere kann eine undurchsichtige Einrichtung 44 zwischen dem Laser 12 und dem dichroitischen Spiegel 20 positioniert werden. Die Verwendung einer undurchsichtigen Einrichtung 44, wie sie hier im Einzelnen beschrieben ist, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis.
  • Experiment 1
  • Materialien und Verfahren
  • Experimentelles Gerät
  • Ein konfokales Standard-Auflichtmikroskop (ConfoCor; Evotec BioSystems und Carl Zeiss, Deutschland), wie es in der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie verwendet wird (Rigler et al., Eur. Biophys. J. 22, 169–175, 1993; Koppel et al., Biophys. J. 16, 1315–1329, 1976) ist das zentrale optische Teil des vorliegenden FILDA-Experiments gemäß der Erfindung. Da FILDA sowohl die kontinuierliche spezifische Helligkeit als auch die zeitaufgelöste Fluoreszenzlebensdaueranalyse miteinander kombiniert, wird eine schnelle gepulste Laserdiode (Crystal GmbH, Berlin, Deutschland, 635 nm, 1 mW) für die Anregung verwendet. Mit einer Wiederholungsrate von 100 MHz erscheint die Strahlung als quasikontinuierliche Welle für den Intensitätsfluktuationsnachweis, während der entsprechende Impulsabstand von 10 ns bei einer Impulsbreite von 1,5 ns auch eine ausreichend genaue Untersuchung der Fluoreszenzlebensdauer der verwendeten Farbstoffe (Cy5, Oxazin-Farbstoff MR121, Oxazin-Farbstoff EVOblue30, Bodipy630/650) ermöglicht.
  • Für die Anregung der Fluoreszenz durchläuft das Laserlicht einen Strahlaufweiter und wird durch einen dichroitischen Spiegel (635LP, Chroms, Brattleboro, Vt., USA) auf das Mikroskopobjektiv (UApo/340, 40x, N. A. 1,15, Olympus Optical Co. Ltd, Tokyo, Japan) gerichtet. Die Fluoreszenz wird von demselben Objektiv durch den dichroitischen Spiegel, einen spektralen Bandpassfilter (670DF40, Omega, Brattleboro, Vt., USA) hindurch gesammelt und auf eine konfokale Lochblende fokussiert, die dazu dient, das Licht außerhalb des Brennpunkts zurückzuweisen. Das Licht, das durch die 70-μm-Lochblende tritt, wird durch eine Silicium-Photonenzähl-Avalanche-Diode (SPCM-AQ-131, EG&G Optoelectronics, Vaudreuil, Quebec, Kanada) nachgewiesen.
  • Detektorimpulse sowie Laserauslöseimpulse werden einer Einsteckkarte für einen Computer zugeleitet. Diese bei Evotec konstruierte Karte besteht aus zwei Untereinheiten, von denen die eine ein Modul für zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) ist. Dieses Modul weist die Verzögerungszeit eines Photonenzählereignisses in Bezug auf den eintreffenden Laserimpuls nach. Ein Zeit-Digital-Wandler (TDC) quantifiziert diese zeitliche Information mit einer Auflösung von 70 ps und einer Umwandlungsrate von 2 MHz. Die andere Untereinheit ist ein elektronischer Zähler, der eine interne Uhr mit einer Zeitauflösung von 50 ns verwendet, um die Zeit zwischen einem beliebigen Paar von nacheinander nachgewiesenen Photonenzählereignissen (Photonenintervallzeit) zu erhalten. Es werden also für jedes nachgewiesene Photonenzählereignis gleichzeitig zwei unabhängige Zeiten aufgezeichnet: die mikroskopische Verzögerungszeit (ns) der Photonenzählereignisse in Bezug auf die entsprechenden Laserimpulse, die die Information über die Fluoreszenzlebensdauer enthält, und die makroskopische Photonenintervallzeit (μs bis ms), die die Information über Fluoreszenzintensität und Fluktuation codiert. Aus diesen Fluoreszenz-Rohdaten werden zwei eindimensionale Histogramme berechnet; (i) die Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse, die in Zählzeitintervallen von 100 μs gesammelt wurden (FIDA), und (ii) die Verteilung der Verzögerungszeit (FLA). Weiterhin wird das zweidimensionale FILDA-Histogramm gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut, das sowohl die Zahlen der Photonenzählereignisse als auch die Verzögerungszeiten über das Zählzeitintervall von 100 μs integrierten umfasst.
  • Aus FCS-Messungen wurde die mittlere Diffusionszeit der Fluoreszenzfarbstoffe MR121, EVOblue30 und Bodipy630/650 zu 200 μs bestimmt. Mit einer Diffusionskonstante von D = 3 × 10–6 cm2/s ergibt dies einen radialen 1/e2-Radius von 0,5 μm (Rigler et al., Eur. Biophys. J. 22, 169–175, 1993). Die zeitlich gemittelte Laserstrahlleistung unter dem Objektiv betrug 200 μW.
  • Experimentelle Verfahren
  • Um die Geräte zu eichen, wurden vier verschiedene Eichmessungen durchgeführt; (i) Tageslicht als zufällige Quelle von Photonen, um die Daten in Bezug auf die ungleichmäßige Kanalbreite des TDC zu korrigieren, (ii) Streulicht des einfallenden Laserstrahls von reinen Puffer- oder Wasserproben, um die IRF der Geräte zu bestimmen, (iii) reine Farbstofflösung, um die räumlichen Helligkeitsparameter von Gleichung 9 zu bestimmen, und (iv) Messung an reinem Wasser, um unabhängige Schätzwerte für die Dunkel- und gestreuten Raman-Zählraten zu erhalten. Letztere werden als zwei "Spezies" angesehen, die stets vorhanden sind. Sie haben beide Poisson-Verteilungen der Zahl der Zählereignisse, aber äußerst verschiedene Verteilungen der Verzögerungszeit.
  • Als Beispiel zeigt 1A das erhaltene FILDA-Histogramm einer ungefähr 1 nM Bodipy630/650-Lösung. Die x-Achse stellt die Summe der Verzögerungszeiten dar, während die y-Achse die oben beschriebene Zahl der Photonenzählereignisse darstellt. Daten- für dieses Histogramm wurden 2 s lang gesammelt. Die Anpassung dieses zweidimensionalen Histogramms an die Fourier-Transformierte von Gleichung 11 ergibt die Konzentration oder mittlere Anzahl von Molekülen im Nachweisvolumen, c = 2,3, die spezifische Helligkeit, q = 23,2 kHz, und die Fluoreszenzlebensdauer, τ = 3,3 ns, was mit den Werten, die durch FIDA und FLA allein bestimmt wurden (Daten nicht gezeigt), sowie mit zuvor berichteten Lebensdauern für Bodipy630/650 in Einklang steht. Um die Güte der Anpassung (GOF) zu beurteilen, zeigt 1B die gewichteten Residuen
    Figure 00220001
    mit einem Kleinste-Quadrate-Wert von χ2 = 1,1.
  • Datensimulationen
  • Reale Proben, die ein Gemisch von Molekülen umfassen, welche willkürlich gewählte Parameter (Helligkeits- und Fluoreszenzlebensdauerwerte) ausdrücken, sind schwierig herzustellen. Daher wurden bestimmte Bewertungen mit Hilfe von simulierten Daten durchgeführt. Mehrere Mengen von Histogrammen für FILDA (vorliegende Erfindung), FIDA (Stand der Technik) und FLA (Stand der Technik) wurden gemäß dem Algorithmus simuliert, der an anderer Stelle (Palo et al. Biophys. J. 79, 2858–2866, 2000; worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird) ausführlich beschrieben ist. Dieser Algorithmus beinhaltet einen Random Walk von einzelnen Molekülen und eine Umrechnung von Helligkeitsintegralen in statistische Zahlen von Zählereignissen. Als Modifikation dieses Algorithmus wird jedem Photon zusätzlich eine zufällige Nachweisverzögerungszeit je nach der Lebensdauer der gegebenen Spezies zugeordnet, und die in Simulationen verwendete IRF wurde so ausgewählt, dass sie mit derjenigen des realen Experiments identisch ist. Die erhaltenen zufälligen Zahlen von Zählereignissen und Nachweisverzögerungszeiten wurden anschließend verwendet, um Histogramme für FILDA, FIDA und FLA zu berechnen.
  • Die Simulationen wurden als angemessenen Werkzeug für die Abschätzung statistischer Fehler der extrahierten Parameter angesehen. Zu diesem Zweck wurden typischerweise N = 40–100 Realisierungen von Experimenten mit einer gegebenen Menge von molekularen Parametern simuliert.
  • Anpassung
  • Experimentelle oder simulierte FILDA-(vorliegende Erfindung), FIDA-(Stand der Technik) und FLA-Verteilungen (Stand der Technik) werden mit Hilfe eines Standard-Marquardt-Algorithmus angepasst. Das für FIDA entworfene Anpassungsprogramm verwendet grundsätzlich Gleichung 8, während das Anpassungsprogramm für FILDA auf Gleichung 11 beruht. Wie oben erwähnt, ist die Anpassungskurve für FLA signifikant einfacher als bei FILDA, weil sie nur auf der Berechnung von P(t|1) beruht.
  • Biochemisches System: Die Calmodulin-Peptid-Wechselwirkung
  • Calmodulin (MW 16,7 kDa) ist ein regulatorisches Protein, das an einer Vielzahl von Ca2+-abhängigen zellulären Signalwegen beteiligt ist (Klee, Biochemistry 27, 6645–6653, 1988). Anhand von Strukturen mit atomarer Auflösung wurden zwei ähnliche Domänen mit jeweils zwei Ca2+-Bindungsstellen identifiziert (Babu et al., Nature 315, 37–40, 1985; Babu et al., J. Mol. Biol. 204, 191–204, 1988; Chattopadhyaya et al., J. Mol. Biol. 228, 1177–1192, 1992; Wilmann et al., Cell Mol. Biol. Noisy-le-grand, 46, 883–894, 2000), die für Calmodulin in Lösung durch einen flexiblen Linker miteinander verbunden sind (Ikura et al., Cell Calcium 13, 391–400, 1992). Nach der Bindung von Ca2+ werden diejenigen Reste, die die Bindungsstelle für die meisten Zielproteine bilden, zum Lösungsmittel hin exponiert. Die relevante Peptidsequenz von einem der Zielproteine (z. B. Myosin-Leichte-Ketten-Kinase der glatten Muskulatur, sm-MLCK) ist KRRWKKNFIA, das als Zielpeptid ausgewählt wurde. Am C-Terminus wurde ein zusätzlicher Lysinrest eingeführt, um den C-Terminus mit einem Farbstoff (z. B. MR121) zu markieren. Da die vorwiegenden Wechselwirkungsstellen des Zielpeptids (das mit beiden Calmodulin-Domänen wechselwirkt) als C- und N-Terminus identifiziert wurden (Meador et al., Science 257, 1251–1255, 1992; Meador et al., Science 262, 1718–1721, 1992), sollte sich die molekulare Umgebung des Farbstoffs bei der Bindung verändern. Fluoreszenzlebensdauer, molekulare Intensität sowie FILDA sollten daher ein Bindungsereignis anzeigen.
  • Calmodulin wurde von BIOMOL bezogen (aus Rinderhirn, Chargen-Nr. P4639c, 1 mg, lyophilisiert). Das Protein wurde in 25 mM Tris/HCl, pH 8, gelöst und in Aliquoten bei 4°C aufbewahrt. Das Peptid (H-KRRWKKNFIAK-NH2) wurde bei Evotec synthetisiert und am C-terminalen Lysinrest mit dem Oxazinfarbstoff MR121 markiert (Absorptionsmaximum = 661 nm). Der Puffer, der in allen Experimenten verwendet wurde, beinhaltete 25 mM Tris/HCl, pH 8, 1 mM CaCl2, 100 mM KCl und 0,05% Pluronic. Calmodulin und das fluoreszenzmarkierte Peptid wurden vor der Messung 10 Minuten lang inkubiert.
  • Fluoreszenzfarbstoffe und Sondenhandhabung
  • Die verwendeten Farbstoffe waren Bodipy630/650 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), Cyanin 5 (Cy5) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), MR 121 (Roche Diagnostics, Penzberg, Deutschland) und EVOblue 30 (EVOTEC BioSystems AG, Hamburg, Deutschland), die alle ihr Anregungsmaximum um 635 nm herum haben. Farbstofflösungen wurden in ultrareinem Wasser hergestellt.
  • Als Proben wurden die fluoreszierenden Sonden in Konzentrationen von etwa 1 nM hergestellt. Wegen einer möglichen Adsorption der Moleküle an Glasober flächen ist es nicht ausreichend, ihre Konzentrationswerte aus Verdünnungsverhältnissen zu bestimmen; eine viel bessere Schätzung erfolgt durch FILDA selbst, da dieses Verfahren absolute Konzentrationen ergibt. Alle Experimente wurden bei 22°C Raumtemperatur durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Ein neues Verfahren wird am besten bewertet, wenn es auf der Basis von statistischen Fehlern, die aus simulierten Daten, oder aus einfachen Testexperimenten, bei denen dasselbe Gerät und dieselbe Abfolge von Photonenzählereignissen verwendet werden, erhalten werden, mit bekannten Verfahren verglichen wird. Daher wurde das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (FILDA) in einem ersten Schritt auf verschiedene Farbstofflösungen und Gemische angewendet, und die Ergebnisse wurden mit denjenigen von FLA und FIDA verglichen.
  • Testexperimente und Datensimulation
  • Zuerst wurde eine Reihe von 40 Messungen an einem 2:1-Farbstoffgemisch von EVOblueTM 30 und MR121 mit einer Gesamtfarbstoffkonzentration von ungefähr 1 nM durchgeführt, wobei parallel Daten für FILDA, FIDA und FLA gesammelt wurden. Diese Reihe von Experimenten mit einer Dauer von jeweils Tc = 2 s wurde in Simulationen unter Verwendung von ähnlichen Molekülparametern wiederholt. Alle Daten wurden mit einer unterschiedlichen Zahl von fixierten Parametern angepasst, die durch Experimente an den jeweiligen einzelnen Farbstofflösungen vorbestimmt wurden. Die geschätzten Parameter für alle drei Verfahren sind in Tabelle 1 zusammengestellt. In dem besonderen Fall von einzelnen Spezies ist FILDA in keiner Weise statistisch genauer als eine einfache Kombination von FIDA und FLA. Dies ist zu erwarten, da alle Moleküle identisch sind und man nichts dabei zu gewinnen hat, Verzögerungszeiten nach Ausbrüchen von einzelnen Molekülen zu gruppieren. Bezüglich des Gemisch von zwei Farbstoffen führten die Anpassungen über alle Daten jedoch je nach Verfahren und der Zahl der freien Parameter zu verschiedenen Mittelwerten und statisti schen Fehlern für die Zahl der Moleküle pro konfokales Volumen, c1 und c2, ihre Helligkeitswerte q1 und q2 und Lebensdauern τ1 und τ2. In Tabelle 1 sind diese Fehler in Klammern als Verhältnis von Standardabweichung zu Mittelwert (Variationskoeffizient CV) angegeben. Noch einmal sei erwähnt, dass FLA des Standes der Technik nur die Produkte c1q1 und c2q2 anstatt c1 und c2 ergibt. Wenn c1 und c2 die einzigen beiden Parameter sind, die einer Anpassung unterzogen werden, d. h. Helligkeits- und/oder Lebensdauerwerte auf die vorbestimmten Werte aus Tabelle 1 fixiert sind, sind FILDA und FLA fast gleich in Bezug auf die Genauigkeit, während FIDA höhere CV-Werte hat. Diese Strategie kann in mehreren biologischen Assays angewendet werden, die zum Beispiel die Bindung zweier Moleküle überwachen, von denen eines fluoreszierend ist, wo man tatsächlich spezifische Mengen des freien und gebundenen Zustands der fluoreszierenden Verbindung im voraus bestimmen und nur die beiden Konzentrationen anpassen kann. Sehr oft kann dieses Schema jedoch nicht verwendet werden, sondern es muss eine größere Zahl von Parametern angepasst werden. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass es mehrere beteiligte Bindungsstellen gibt und die spezifische Helligkeit des Komplexes vom Ausmaß der Bindung abhängt und daher möglicherweise nicht fixiert wird. Ein weiteres Beispiel kommt beim Wirkstoff-Screening vor, wo die Wirkung bestimmter Chemikalien oder natürlicher Verbindungen gegen ein biologisches Target getestet wird. Es wird meistens angenommen, dass die Verbindungen nicht fluoreszierend sind, aber in manchen Fällen erweisen sie sich als autofluoreszierend. Diese Proben können mit zusätzlichen Parametern, die die autofluoreszierende Verbindung charakterisieren, aber nicht im voraus bekannt sind, an ein 2 + 1-Komponenten-Modell angepasst werden.
  • Hier wird die Überlegenheit von FILDA der vorliegenden Erfindung sichtbar. Wenn es vier freie Parameter gibt, zum Beispiel wenn die beiden Lebensdauerparameter ebenfalls einer Anpassung unterzogen werden, werden die statistischen Fehler von FILDA im Vergleich zu FLA um einen Faktor von etwa zwei reduziert. Dieser Faktor ist noch höher, wenn die statistischen Fehler mit denjenigen von FIDA und frei laufenden Helligkeitswerten verglichen werden. Im Falle von sechs angepassten Parametern ergibt FILDA außerdem mit niedrigen CV-Werten immer noch überzeugende Ergebnisse. Tabelle 1: Variationskoeffizienten (CVs) von FILDA (Erfindung), von FLA (Stand der Technik) und FIDA (Stand der Technik) an einem Farbstoffgemisch von MR121 und Evoblue 30 bei der Datensammelzeit von 2 s: Vergleich von experimentellen und simulierten Daten
    Figure 00270001
  • Die CVs wurden über 40 wiederholte Messungen berechnet. Die mittleren Ergebnisse der Analyse von experimentellen Daten wurden als Eingabegrößen für den Simulationsalgorithmus verwendet: Konzentration c1 = 0,24 und c2 = 0,44, Helligkeit q1 = 17,5 kHz und q2 = 7,5 kHz, Lebensdauer τ1 = 1,72 ns und τ2 = 0,54 ns.
    • (a):
    FLA ergibt c1q1 und c2q2 anstatt c1 und c2;
    x:
    die Analyse führte zu CVs von über 50%;
    ():
    CVs der Analyse an simulierten Daten
    #:
    fixiert auf die besten bekannten Werte.
  • Unter einem praktischen Gesichtspunkt stellt sich jedoch die Frage, ob FILDA diese hohe Genauigkeit über einen weiten Bereich von Konzentrationen beibehält. Daher wurde eine Reihe von 100 Histogrammen für FILDA (vorliegende Erfindung), FIDA (Stand der Technik) und FLA (Stand der Technik) für verschiedene Konzentrationen eines 1:1-Gemischs von zwei fluoreszierenden Spezies simuliert, und die Ergebnisse wurden erneut verglichen. Ein Unterschied eines Faktors von 2 in der spezifischen Helligkeit (q1 = 30 kHz und q2 = 15 kHz) sowie in der Lebensdauer (τ1 = 3,0 ns und τ2 = 1,5 ns), aber eine gleiche Diffusionszeit (200 μs) für beide Spezies wurde ausgewählt. Alle Histogramme wurden an ein zweikomponentiges Modell angepasst, wobei alle Parameter der Anpassung unterzogen wurden. Da alle Verfahren bei sehr niedrigen sowie bei sehr hohen Konzentrationen Schwierigkeiten hatten, die Spezies bei einer Datenerfassungszeit von Tc = 2 s eindeutig aufzulösen, wurde diese Zeit auf Tc = 20 s verlängert. 2 zeigt die Abhängigkeit des statistischen Fehlers bei allen drei Verfahren von der Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs, die durch die CV-Werte des schwächsten Signals c2 repräsentiert wird. Innerhalb eines Konzentrationsbereichs von c < 5 Moleküle pro Messvolumen ergibt FILDA den kleinsten Fehler, während FLA nur bei erheblich höheren Konzentrationen statistisch genauer ist. Dies ist nicht überraschend, da FLA nur von der Zahl der nachgewiesenen Photonen abhängt, die linear von der Konzentration abhängt. Dagegen werden FILDA und FIDA von den relativen Fluktuationen des Fluoreszenzsignals beeinflusst, die gemäß ∝ c–1/2 reduziert werden. Bei extrem niedrigen Konzentrationen besteht das Fluoreszenzsignal grundsätzlich aus seltenen Einzelmolekülereignissen, die während einer Datensammelzeit von 20 s schließlich vielleicht nicht nachgewiesen werden. Bei einer längeren Erfassungszeit lassen sich diese seltenen Ereignisse mit einem Fluktuationsverfahren wie FILDA jedoch viel besser annähern als mit herkömmlicher FLA.
  • Die lineare Abhängigkeit der statistischen Fehler verschiedener FILDA-Parameter von Tc–1/2 ist in 3 gezeigt. Die aufgetragenen CV-Werte ergeben sich aus demselben Simulationsschema wie oben, aber mit einer einzigen Konzentration von c1 = c2 = 0,2. Es ist deutlich zu erkennen, dass brauchbare CV-Werte bereits mit Datenerfassungszeiten von 10 s erreicht werden können, obwohl kein Parameter fixiert wurde, d. h. es wurde keine a-priori-Information verwendet.
  • Biochemisches System
  • Die experimentelle Verwendung von FILDA wird anhand der Bestimmung der Bindungskonstante der oben eingeführten Calmodulin-Peptid-Wechselwirkung demonstriert. Zu diesem Zweck wurde ein Titrationsexperiment durchgeführt, wobei die Konzentration des markierten Peptids (H-KRRWKKNFIAK-NH2 (MR121)) konstant auf 2,5 nM gehalten wurde, während Calmodulin einer Titration unterzogen wurde (0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM, 10 μM, 50 μM). Alle Experimente wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, d. h. mit demselben Puffer, derselben Anregungsleistung und derselben Datenerfassungszeit von 2 s pro Messung, die 10mal pro Probe wiederholt wurde.
  • Als erster Schritt wurden die Lebensdauer τfrei = 1,90 ± 0,02 ns und die spezifische Helligkeit qfrei = 6,5 ± 0,3 kHz anhand einer auf die reine Peptidlösung angewendeten Einkomponentenanalyse bestimmt. Die Zugabe von überschüssigem Calmodulin (50 μM) zu 2,5 nM Peptid führte zu einer Probe, bei der der größte Teil des Peptids an Calmodulin gebunden war. Der Komplex war sowohl durch eine längere Fluoreszenzlebensdauer τgebunden = 3,00 ± 0,01 ns als auch eine höhere spezifische Helligkeit qgebunden = 15,0 ± 0,6 kHz im Vergleich zum freien Peptid gekennzeichnet, was auf Änderungen der molekularen Umgebung des Farbstoffs (z. B. Abnahme der Polarität) hinweist. Dann wurde dieses Gemisch mit allen drei Verfahren (FILDA, FIDA und FLA) analysiert, wobei je nach Verfahren eine zweikomponentige Anpassung mit fixiertem τfrei und/oder qfrei verwendet wurde.
  • Als nächster Schritt wurde eine zweikomponentige Analyse auf die gesamte Reihe von Calmodulin-Konzentrationen angewendet. Bei diesen Untersuchungen wurden die Lebensdauer- und Helligkeitsparameter auf die obigen Werte für das gebundene bzw. ungebundene Peptid fixiert. Auf diese Weise bestimmt FILDA die Konzentrationen Cgebunden des gebundenen Peptids, d. h. des Calmodulin-Peptid-Komplexes, und Cungebunden des ungebundenen, d. h. freien, Peptids. Dies ermöglicht die Berechnung des Anteils fgebunden = (Cgebunden/(Cgebunden + Cungebunden)) an gebundenem Peptid, der in 4 gegen die Konzentration des hinzugefügten Calmodulins aufgetragen ist (schwarze Flecken, die Fehlerbalken resultieren aus der Mittelung über 10 Messungen). Die durchgezogene Linie zeigt eine hyperbolische Anpassung an die Daten, was eine Bindungskonstante für die Calmodulin-Peptid-Wechselwirkung von KD = 38 ± 3 nM ergibt. Vergleichbare Bindungskurven wurden mit FLA und FIDA (Daten nicht gezeigt) mit ähnlichen KD-Werten von 17 ± 1 nM bzw. 29 ± 4 nM erhalten. Diese Werte stimmen gut mit Affinitäten überein, die in der Literatur angegeben sind (Barth et al., J. Biol. Chem. 273, 2174–2183, 1998), und beweisen, dass FILDA ein geeignetes Verfahren zur Überwachung der Reaktivität eines biochemischen Systems ist.
  • Um einige Informationen über die statistische Genauigkeit dieses Experiments in Bezug auf mögliche Wirkstoff-Screening-Anwendungen zu erhalten, kann der Z'-Wert der Bindungskurve berechnet werden. Dies wird über die Mittelwerte fhoch und ftief und ihre Standardabweichungen stdev(fhoch) und stdev(ftief) des Anteils fgebunden des gebundenen Peptids bewerkstelligt, die aus der zweikomponentigen Analyse der Lösung des gebundenen Peptids (50 μM Calmodulin, hoch) bzw. der reinen Peptidlösung (0 Calmodulin, niedrig) resultieren.
  • Figure 00300001
  • Der Z'-Wert setzt die statistischen Fehler der Bestimmung von fgebunden in Beziehung zu seinem dynamischen Bereich. Es ist daher ein sehr wichtiger statistischer Parameter, um die Durchführbarkeit und Effizienz eines bestimmten Auslese- und Analyseverfahrens zur Bewertung des Bindungsgrads oder allgemein jedes Reaktionsgrads eines biochemischen Systems zu beurteilen. Sein maximaler Wert ist Z' = 1,0, während im Allgemeinen Z' > 0,5 eine Voraussetzung für Wirkstoff-Screening-Anwendungen ist.
  • Aus 4 wird unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung und einer Datenerfassungszeit von 2 s ein Z'-Wert von 0,97 ± 0,01 für die Calmodulin-Peptid-Wechselwirkung erhalten. Zum Vergleich ergibt die Anwendung von FLA des Standes der Technik und von FIDA des Standes der Technik Z'-Werte von 0,92 ± 0,02 bzw. 0,73 ± 0,07. Mit Z'-Werten in der Nähe von 1 sind alle Verfahren sehr gut für die Verwendung im Wirkstoff-Screening geeignet.
  • Bei Wirkstoff-Screening-Anwendungen wird jedoch versucht, die Auslesezeit so weit wie möglich zu minimieren. Somit wurden die Z'-Werte von FILDA für die Calmodulin-Peptid-Wechselwirkung für abnehmende Datenerfassungszeiten T bestimmt: Z' (T = 1 s) = 0,85 ± 0,04, Z' (T = 0,5 s) = 0,81 ± 0,05, Z' (T = 100 ms) = 0,54 ± 0,11, und Z' (T = 50 ms) = 0,35 ± 0,16 (bei Datenerfassungszeiten von unter 10 ms ist FILDA aufgrund von negativen Z'-Werten nicht anwendbar). Daher ist "FILDA" der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, das die Voraussetzungen eines effizienten Wirkstoff-Screenings auch bei Auslesezeiten von unter 1 s bis zu 100 oder 50 ms erfüllt.
  • Experiment 2
  • Als Grundbestandteil der Geräte wird ein konfokales Auflichtmikroskop verwendet, das mit einem Impulslaser, einem Zeit-Amplituden-Wandler (TAC) und einer Datenerfassungskarte kombiniert wird. Für jedes nachgewiesene Photon werden zwei Zeitintervalle synchron bestimmt und gespeichert: Die seit dem vorigen Photonenzählereignis verstrichene Zeit und das Zeitintervall zwischen dem Photonennachweis und dem verursachenden Laserimpuls. Das erste Zeitintervall wird in Einheiten der Kartenuhrperiode von 50 ns gemessen, während die zeitliche Auflösung des TAC 70 ps betrug. Aus Rohdaten bei einer gegebenen Breite des Zählzeitintervalls (gewöhnlich 100 μs) und einem gegebenen Auflösungswert der Verzögerungszeit (entweder 280 oder 560 ps) wurden ein- und zweidimensionale Verteilungen für FIDA (Stand der Technik), FLA (Stand der Technik) und FILDA (vorliegende Erfindung) berechnet. In einer Reihe von Messungen wurde wenigstens eine Messung durchgeführt, bei der der Detektor das Tageslicht als zufällige Quelle von Photonen überwachte, um andere Daten in bezug auf die ungleichmäßige Kanalbreite des TAC zu korrigieren. Eine andere Messung, bei der der Detektor das von milchigen Proben ausgehende Streulicht des einfallenden Lasers überwachte, wurde durchgeführt, um die Punktausbreitungsfunktion der Geräte zu bestimmen. Außerdem war eine Messung mit reinem Wasser geeignet, um unabhängige Schätzwerte für die Dunkel- und gestreuten Raman-Zählraten zu erhalten, die als zwei "Spezies" angesehen werden, die stets vorhanden sind. Sie haben beide Poisson-Verteilungen der Zahl der Zählereignisse, aber äußerst verschiedene Verteilungen der Verzögerungszeit.
  • Als Proben wurde eine Reihe von wässrigen reinen Farbstofflösungen in Konzentrationen von etwa 10–9 M sowie ihren Gemischen in einem Konzentrationsverhältnis von ungefähr 1:1 hergestellt. Wegen der möglichen Adsorption der Farbstoffe an Glasoberflächen ist es nicht zweckmäßig, Konzentrationswerte der Farbstoffe aus Verdünnungsverhältnissen zu bestimmen; eine viel bessere Schätzung ist FILDA selbst. Die verwendeten Farbstoffe waren Bodipy 630, Cy5 und UR 121. Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • 5 zeigt Intensitätsgraphiken von gemessenen Histogrammen des vorliegenden Experiments. Die x-Achsen zeigen die mittlere Impuls-bis-Photonen-Verzögerungszeit; die y-Achsen zeigen die Anzahl der Photonenzählereignisse, und eine höhere Intensität entspricht einer höheren Anzahl von Ereignissen. In 5 werden drei Beispiele für die gemessenen Verteilungen M P ^(n, t) als Intensitätsgraphiken, zwei Beispiele für einzelne Spezies und das dritte für ihr Gemisch vorgestellt (M ist die Gesamtzahl der Zählzeitintervalle pro Experiment). Die gewichteten Residuen der Anpassung (nicht gezeigt) sind statistisch gestreut, außer dass häufig die Datenpunkte (n, t) = (1, 0) und (1, 1) (die dem untersten Teil des aufsteigenden Randes des Anregungsimpulses entsprechen) von der Anpassungskurve um bis zu 5 Einheiten der Standardabweichung abweichen. Die obere Graphik visualisiert die Verteilung Nr. 12, die an einer Cy5-Lösung gemessen wurde (die von den drei Farbstoffen die kürzeste Lebensdauer hat), die mittlere Graphik ist die Verteilung Nr. 7, die an einer Bodipy630-Lösung (mit der längsten Lebensdauer) gemessen wurde, und die untere Graphik ist die Verteilung Nr. 30, die einem Gemisch dieser Farbstoffe entspricht. Tatsächlich ist das x-Argument der Funktion, das technisch angepasst wird, die Summe und nicht der Mittelwert der Verzögerungszeit, aber die Verteilungsfunktion der mittleren Verzögerungszeit scheint visuell informativer zu sein.
  • Die volle Breite beim halben Maximum (FWHM) der Antwortfunktion dieses Experiments beträgt fast 2 ns, was sogar im Vergleich zur Impulszeit von 10 ns erheblich breit ist und Lebensdauern von zwei Farbstoffen von den dreien überschreitet, aber sie lässt sich noch anwenden, um zwei Komponenten mit einer sich um den Faktor 2 unterscheidenden Lebensdauer aufzulösen. Die Dunkel- und Streuzählraten von Wasser wurden zu 0,20 bzw. 0,29 kHz bestimmt und auf diese Werte fixiert, wenn man Daten aus fluoreszierenden Proben fixierte.
  • Es durch die vorliegende Erfindung ist möglich, Werte von räumlichen Einstellungsparametern a1 und a2 anhand von Daten von einzelnen Spezies abzuschätzen, aber wegen der relativ niedrigen absoluten Werte von q, die mit dem Impulslaser geringer Leistung erhältlich sind, sind die entsprechenden statistischen Fehler hoch, ungefähr 20%. Die Ergebnisse der anschließenden Analyse hängen jedoch nur schwach von den exakten Werten der Einstellungsparameter ab. Daher wurden a1 und a2 einfach auf die gerundeten Werte, die durch FIDA bei kontinuierlicher Laseranregung bestimmt wurden, a1 = –0,40 und a2 = 0,08 fixiert.
  • Nach dem Fixieren der Werte für Dunkel- und Streuzählraten und räumliche Parameter sind die einzigen Anpassungsparameter die Konzentration (c), die spezifische Helligkeit (q) und die Lebensdauer (τ) für jede Spezies. Tatsächlich konnten die Verteilungen, die von einzelnen Spezies erhalten wurden, gut angepasst werden, wenn man einzelne Spezies annahm, während die Verteilungen, die aus zweikomponentigen Gemischen erhalten wurden, eine zweikomponentige Analyse erforderten, um zu statistisch gestreuten Residuen zu führen. Es wurde bereits nach den ersten Testexperimenten gezeigt, dass das vorgestellte neue Fluoreszenzfluktuationsverfahren als empfindliches Verfahren verwendet werden kann, um zwei fluoreszierende Komponenten voneinander zu trennen, ihre Konzentrationen zu bestimmen und sie in Bezug auf spezifische Helligkeit und Lebensdauer der Fluoreszenz zu charakterisieren. Man beachte, dass statistische Fehler signifikant gesenkt werden können, indem man noch ein paar Parameter auf zuvor bestimmte Werte fixiert; dies ist eine Standardmethode im Wirkstoff-Screening.
  • Experiment 3
  • Unter Verwendung der Gewichte von Gleichung 12 wurden theoretische Fehler der vorliegenden Erfindung in mehreren ausgewählten Fällen berechnet und mit den entsprechenden Fehlern der Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) und Fluoreszenzlebensdaueranalyse (FLA) verglichen. Einige der Ergebnisse der zweikomponentigen Fälle sind in Tabelle 2 vorgestellt. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur ein qualitativ stärkeres Verfahren als FIDA oder FLA ist (denn die Spezies werden anhand der beiden spezifischen Größen q und τ erkannt), sonder innerhalb des optimalen Konzentrationsbereichs seine statistischen Fehler auch geringer sind. Nur bei signifikant hohen Konzentrationswerten, wo FILDA und FIDA als im Wesentlichen auf Fluktuation beruhende Methoden ihre Leistungsfähigkeit im Unterschied zu FLA verlieren, ist FLA statistisch das genaueste der drei Verfahren. Tabelle 2. Theoretische Fehler der zweikomponentigen FILDA (vorliegende Erfindung), FIDA (Stand der Technik) und FLA (Stand der Technik) In allen Fällen war T = 100 μs, c1 = c2, q1 = 50 kHz, q2 = 25 kHz, τ1 = 3 ns, τ2 = 1,5 ns, Dunkelzählrate 0,2 kHz, Streuzählrate 1 kHz, Dauer 20 s.
    c1, c2 prozentualer Fehler bei FILDA von ...
    c1 c2 Q1 q2 τ1 τ2
    0,05 6,1 6,5 3,8 3,9 1.7 3.1
    0,2 2,9 3,2 1,6 2,0 0.80 1.6
    1,0 2,0 2,2 0,88 1,5 0.50 1.2
    5,0 3,3 3,4 1,0 2,1 0.69 2.4
    prozentualer Fehler bei FIDA von ...
    c1 c2 Q1 q2
    0,05 17 20 4,3 11
    0,2 11 11 2,9 7,2
    1,0 14 13 3,3 9,1
    5,0 52 44 11 38
    prozentualer Fehler bei FLA von ...
    c1q1 c2q2 T1 T2
    0,05 17 34 6,3 13
    0,2 7,6 15 2,8 5,6
    1,0 3,3 6,5 1,2 2,4
    5,0 1,4 2,9 0,53 1,1
    Tabelle 3. Ergebnisse von FILDA-Experimenten gemäß der vorliegenden Erfindung Die angegebenen Fehlerwerte sind statistische Fehler, die theoretischen Gewichten entsprechen.
    Probe Datensammelzeit, s Nummer des Experiments in einer Reihe Konzentration c spezifische Helligkeit q, kHz Lebensdauer τ, ns
    Cy5 3,5 12 1,71 ± 0,02 20,2 ± 0,3 0,724 ± 0,004
    13 1,84 19,7 0,721
    14 1,74 20,0 0,719
    UR125 13,1 21 0,498 ± 0,005 17,5 ± 0,2 1,830 ± 0,008
    22 0,460 17,7 1,836
    23 0,463 18,3 1,805
    Gemisch von Cy5 und UR125 5,1 36 0,66 ± 0,05 0,62 ± 0,05 19,9 ± 0,5 16,1 ± 0,5 0,724 ± 0,028 1,72 ± 0,06
    37 0,71 0,54 20,1 16,3 0,716 1,72
    38 0,64 0,60 21,6 14,9 0,685 1,61

Claims (21)

  1. Verfahren zum Charakterisieren von Proben mit fluoreszierenden Teilchen, die folgenden Schritte umfassend: – Anregen von Teilchen in einem Messvolumen zur Emission von Fluoreszenz durch eine Reihe von Anregungsimpulsen; – Überwachen der emittierten Fluoreszenz durch Nachweisen von Sequenzen von Photonenzählereignissen unter Verwendung einer Nachweiseinrichtung; – Bestimmen der Zahl der Photonenzählereignisse in Zählzeitintervallen gegebener Breite; – Bestimmen der Nachweisverzögerungszeiten der Photonenzählereignisse relativ zu den entsprechenden Anregungsimpulsen in den Zählzeitintervallen; – Bestimmen einer Funktion der Nachweisverzögerungszeiten; – Bestimmen einer Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten P ^(n, t, ...), wobei wenigstens eines der Argumente die Anzahl der Photonenzählereignisse ist und ein anderes Argument die Funktion von Nachweisverzögerungszeiten ist; und – Bestimmen einer Verteilung von Teilchen als Funktion von wenigstens zwei Argumenten aus der Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t, ...), wobei wenigstens eines der Argumente eine spezifische Helligkeit der Teilchen oder ein Maß dafür ist und ein anderes Argument eine Fluoreszenzlebensdauer der Teilchen oder ein Maß dafür ist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Funktion der Nachweiszeiten invariant ist in Bezug auf die Reihenfolge der Nachweisverzögerungszeiten von Photonenzählereignissen, die in demselben Zählzeitintervall nachgewiesen werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Funktion der Nachweisverzögerungszeiten eine Summe oder ein Mittelwert ist.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nachweisverzögerungszeiten von Photonenzählereignissen relativ zu den entsprechenden Anregungsimpulsen durch ganze Zahlen ausgedrückt werden, die eine bekannte Beziehung zu den Nachweisverzögerungszeiten, insbesondere eine quasilineare Beziehung, haben.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Funktion der Nachweisverzögerungszeiten eine Summe oder ein Mittelwert der ganzen Zahlen ist.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verteilungsfunktion der Teilchen bestimmt wird, indem man die experimentell bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t, ...) durch eine entsprechende angepasste theoretische Wahrscheinlichkeitsfunktion P(n, t, ...) wiedergibt.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die theoretische Verteilung P(n, t, ...) über ihre erzeugende Funktion
    Figure 00380001
    berechnet wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Verteilungsfunktion der Teilchen bestimmt wird, indem man die experimentell bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion P ^(n, t) durch eine entsprechende angepasste theoretische Wahrscheinlichkeitsfunktion P(n, t) wiedergibt, die vorzugsweise über ihre erzeugende Funktion
    Figure 00390001
    berechnet wird.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei in Berechnungen der theoretischen Wahrscheinlichkeitsfunktion P(n, t, ...) die optische räumliche Helligkeitsfunktion B(r) durch eine getrennt bestimmte Beziehung zwischen räumlicher Helligkeit B und Volumenelementen dV berücksichtigt wird.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Beziehung zwischen der räumlichen Helligkeit B und den Volumenelementen dV über eine Variable u = In(B0/B) durch eine Beziehung
    Figure 00390002
    ausgedrückt wird, wobei B0 die maximale Helligkeit ist und A0, a1, a2 und a3 empirische Parameter der räumlichen Helligkeitsfunktion sind.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei eine zeitliche Ansprechfunktion der experimentellen Geräte bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n, t, ...) berücksichtigt wird, wobei die zeitliche Ansprechfunktion vorzugsweise durch ein getrenntes Experiment bestimmt wird.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei eine Menge von verschiedenen Wahrscheinlichkeitsfunktionen P(n, t, ...) bestimmt wird, wobei jede Wahrscheinlichkeitsfunktion auf Zahlen von Photonenzählereignissen beruht, die in Zählzeitintervallen unterschiedlicher Breite bestimmt wurden.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zählzeitintervalle zeitlich aufeinanderfolgend sind.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zählzeitintervalle einander überlappen.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei ein Diffusionskoeffizient oder irgendein anderes Maß der Diffusion ein weiteres Argument der Verteilungsfunktion der Teilchen ist.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei Konzentrationen von Teilchen so ausgewählt werden, dass sie ungefähr einem oder weniger Teilchen pro Messvolumen entsprechen.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei ein einziger, zwei oder mehr Photonendetektoren als Nachweiseinrichtung verwendet werden und es sich dabei vorzugsweise entweder um eine Avalanche-Photodiode oder einen Photomultiplier handelt.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei wenigstens zwei Photonendetektoren als Nachweiseinrichtung verwendet werden, die die Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen oder Polarisationen überwachen.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die fluoreszierenden Teilchen unter Anwendung eines homogenen Fluoreszenzassays charakterisiert werden.
  20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Verwendung in der Diagnostik, im Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening, bei der Optimierung von Eigenschaften von Molekülen und bei der Identifizierung spezifischer Zellpopulationen.
  21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei eine konfokale Apparatur verwendet wird, wobei die konfokale Apparatur vorzugsweise Folgendes umfasst: – eine Strahlungsquelle (12) zur Bereitstellung von anregender Strahlung (14); – ein Objektiv (22) zur Fokussierung der anregenden Strahlung (14) in ein Messvolumen (26); – einen Detektor (42) zum Nachweis von Emissionsstrahlung (30), die aus dem Messvolumen (26) stammt; und – eine undurchsichtige Einrichtung (44), die im Weg (32) der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) positioniert ist, um den zentralen Teil der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) auszulöschen.
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