JP3793531B2

JP3793531B2 - 蛍光寿命測定装置

Info

Publication number: JP3793531B2
Application number: JP2003348615A
Authority: JP
Inventors: 理小谷
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-10-07
Filing date: 2003-10-07
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2023-10-07
Also published as: US7265825B2; JP2005114528A; US20050072936A1; EP1522833A1

Description

本発明は、蛍光寿命の被測定試料に励起光を照射し、該試料から発する蛍光光子数を測定し、測定した蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命を算出する蛍光寿命測定装置に関するものである。

励起光を照射して試料を励起状態にし、試料が基底状態に遷移する過程で発する蛍光を測定し蛍光寿命を算出することにより、試料の種類または、試料の状態を知ることができる。蛍光寿命を算出するには、試料にパルス励起光を照射してから、蛍光が発するまでの時間を測定し、その時間分布から蛍光寿命を算出する時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ：Time Correlated Single Photon Counting）法が知られている（非特許文献１参照）。

一方、試料にパルス励起光を照射し、試料から放出される蛍光光子数を複数の時間帯において測定し、複数の時間帯において測定した蛍光光子数から蛍光寿命を算出する方法（以下、時間ゲート法と称す。）も知られている。時間ゲート法は、蛍光光子数を測定する時間帯である時間ゲートを適当に設定すると誤差の小さい蛍光寿命が算出できるという利点がある。

"Array fluorometry:the theory of the statisticall multiplexing of single photon timing " D.J.S.Brich et al,SPIE:Society of Photo-Optical Insturmentation Engineers Proceedings,.１９９０.

ところで、時間ゲート法は、複数の時間ゲートに入射した蛍光光子数にもとづき蛍光寿命を算出するが、蛍光光子の放出確率が一般的に小さいため、パルス励起光の照射を何度も行う必要があり、蛍光光子数の測定に長い時間を要するという問題点があった。

また、蛍光光子数の測定を短時間に行うために、蛍光光子の放出確率を大きくし、蛍光光子の放出確率が大きい時間帯に時間ゲートを設定すると、蛍光光子数の測定誤差が大きくなるという問題点があった。つまり、同じ時間ゲートに複数の蛍光光子が入射したときにこれらの蛍光光子を分別することが困難であるために、蛍光光子数の測定誤差を招くという問題点があった。そのため、蛍光光子数の測定誤差を小さくするため、１回のパルス励起光に対して各時間ゲートに入射する平均の蛍光光子数が各々の時間ゲートにおいて０．０１個程度と極めて低い放出確率にして蛍光光子数の測定を行う必要があった。結果的に１回の蛍光寿命の算出のために、最低数万回のパルス励起光の照射が必要となり、蛍光寿命の算出に多大な時間を要することが避けられないという問題点があった。

また、同一試料においても経時的に蛍光寿命自体が変わる場合があり、このような場合、蛍光寿命の算出に多大な時間を要する時間ゲート法では対応できず、蛍光寿命の経時変化を知ることができないとう問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易かつ短時間に、誤差の小さい蛍光寿命を算出することができる蛍光寿命測定装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、請求項１にかかる蛍光寿命測定装置は、試料にパルス励起光を照射し、該パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光光子数を、複数の測定対象時間帯である複数の時間ゲートにより測定し、該複数の時間ゲートにより測定した蛍光光子数から蛍光寿命を算出する蛍光寿命測定装置において、前記蛍光寿命の算出過程において、所定の確率分布にしたがい蛍光寿命の補正を行う補正手段を備えたことを特徴とする。

この請求項１の発明によれば、蛍光光子の放出確率を大きくし、複数の時間ゲートに入射する蛍光光子数を増加させても、測定した蛍光光子数を所定の確率分布にしたがうように補正することで、短時間に蛍光寿命の算出ができる。

また、請求項２にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記所定の確率分布は、前記パルス励起光により励起された前記試料から放出される蛍光光子数の確率分布として、ポアソン分布を使用することを特徴とする。

また、請求項３にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記補正手段は、前記複数の時間ゲートにより測定した各時間ゲートにおける蛍光光子数と前記パルス励起光の照射回数とを用いることを特徴とする。

本発明にかかる蛍光寿命測定装置によれば、複数の時間ゲートにより測定した蛍光光子数の分布を、所定の確率分布にしたがうように補正することにより、誤差が小さい蛍光寿命が短時間に算出できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる蛍光寿命測定装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態）
図１は、この発明の実施の形態である蛍光寿命測定装置１の概要構成を示すブロック図である。蛍光寿命測定装置１は、励起光を試料に照射して蛍光光子を発生させ、発生した蛍光光子を検出する測定部２と、測定部２で検出した蛍光光子の信号から複数の時間ゲートごとに蛍光光子数を測定する信号処理部４と、複数の時間ゲートごとに測定した蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命を算出する演算処理部５と、測定部２と信号処理部４と演算処理部５とを制御する制御部３とを有している。制御部３は、測定部２のパルスレーザ光源２ａの出射タイミングを制御し、信号処理部４の複数の時間ゲートの時間帯を制御し、演算処理部５の演算処理を制御している。

測定部１は、パルスレーザ光源２ａとレンズ系２ｂ，２ｄと試料２ｃと検出器２ｅとを有している。パルスレーザ光源２ａから出射されたパルス励起光はレンズ系２ｂにより試料２ｃに集光し、集光したパルス励起光によって試料２ｃは励起されて励起状態になり、励起状態から基底状態に遷移する間に所定の確率分布をもち蛍光光子を放出する。試料２ｃから放出された蛍光光子はレンズ系２ｄにより検出器２ｅに集光する。検出器２ｅは集光した蛍光光子を電気信号に変換して、信号処理部４に出力する。信号処理部４は、入力した電気信号を、複数の時間ゲートごとに蛍光光子数を測定し、測定した蛍光光子数を演算処理部５に出力する。

図２は、信号処理部４の概要構成を示すブロック図である。本実施の形態では、時間ゲートを２個使用している。信号処理部４は、アンプ４ａ，４ｂ，４ｃとスイッチＳ１，Ｓ２と波高分別器４ｄ，４ｅとカウンタ４ｆ，４ｇとを有している。信号処理部４は、検出部２ｅから入力した電気信号をアンプ４ａによって増幅し、スイッチＳ１，Ｓ２に分岐させている。スイッチＳ１，Ｓ２は、制御部３からのゲート制御信号によって「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングが制御され、「ＯＮ」動作の間だけ電気信号を、アンプ４ｂ，４ｃを介して波高分別器４ｄ，４ｅに出力している。つまりスイッチＳ１，Ｓ２の「ＯＮ」動作の時間がそれぞれの時間ゲートに相当する。波高分別器４ｄ，４ｅは、入力した電気信号を所定の値によって２値化し、２値化した信号をカウンタ４ｆ，４ｇに出力する。カウンタ４ｆ，４ｇは、２値化された信号を入力し、信号を入力した時に１蛍光光子を測定したとして時間ゲートごとに蛍光光子数を測定し、測定した蛍光光子数を演算処理部５に出力する。

演算処理部５は、信号処理部４から入力された時間ゲートごとの蛍光光子数をもとに、制御部３が設定した複数の時間ゲートごとに測定された蛍光光子数を検知し、各時間ゲートにおける蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命を算出する。

演算処理部５は、補正部５ａと蛍光寿命演算部５ｂとを有し、補正部５ａは、複数の時間ゲートごとに測定された蛍光光子数に補正を加え、補正した蛍光光子数を蛍光寿命演算部５ｂに出力する。蛍光寿命演算部５ｂは、補正された蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命を算出する。

一般的に励起状態から基底状態に遷移する過程で放出される蛍光光子の放出確率はポアソン分布にしたがうとされ、パルス励起光のエネルギーを増大させると蛍光光子の放出確率は高くなり、前述したように、蛍光光子数の測定誤差が生じ易い。

従来は、このような測定誤差が生じることを避けるために、パルス励起光のエネルギーを所定値まで減少させ、蛍光光子の放出確率を低くしていた。そのため、蛍光寿命を算出するために多大の時間を要していた。

この実施の形態は、測定した蛍光光子数の分布をポアソン分布にしたがうように補正し、蛍光光子の放出確率が高い時間ゲートを設定して蛍光光子数の測定を行っても、誤差の小さい蛍光寿命を短時間に算出できる。

つぎに、補正部５ａにおける補正について説明する。補正内容は、信号処理部４から入力した複数の時間ゲートごとに測定された蛍光光子数の時間に対する分布が、ポアソン分布にしたがうように補正するものである。試料２ｃから放出される蛍光光子が、１回のパルス励起光の照射において、所定の時間ゲートΔＴに入射する平均蛍光光子数をμ個とすると、時間ゲートΔＴにおいて入射する蛍光光子数がｒ個である確率ｐ（ｒ，μ）は以下の式（１）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（１）
また、ｒが１以上とすると、式（１）から式（２）が導き出される。

・・・・・・・・・・・・・・・・（２）
パルス励起光の照射をＮ回行い、時間ゲートΔＴにおいて測定された蛍光光子数をｋ個とすると、時間ゲートΔＴにおいて測定された平均の蛍光光子数（カウントレート）ｘは、ｘ＝ｋ／Ｎとなる。一方、時間ゲートΔＴにおいて蛍光光子が入射しない確率ｐ（０，μ）はカウントレートｘを用いて以下の式（３）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（３）
また、同様に時間ゲートΔＴにおいて蛍光光子が入射しない確率ｐ（０，μ）は、式（１）から以下の式（４）によって表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（４）
式（３），（４）から時間ゲートΔＴにおいて入射する平均蛍光光子数μは、以下の式（５）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（５）
したがって、時間ゲートΔＴにおいて入射する蛍光光子数をｍ個とすると、ｍは以下の式（６）のように、パルス励起光の照射回数Ｎと時間ゲートΔＴにおいて入射した平均蛍光光子数μとの乗算値になる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（６）
つまり補正部５ａは、制御部３から入力するパルス励起光の照射回数と測定部４から入力する測定された蛍光光子数とから式（６）を演算し、測定された蛍光光子数ｋ個を実際に入射した蛍光光子数ｍ個に補正する。

補正部５ａは、上述したｋ個からｍ個に変更した蛍光光子数を蛍光寿命演算部５ｂに出力し、蛍光寿命演算部５ｂは、入力した蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命の算出を行う。

つぎに、蛍光寿命演算部５ｂの演算について説明する。複数の時間ゲートを第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２とに設定し、第１の時間ゲートΔＴ１において測定された蛍光光子数をｋ１個とし、第２の時間ゲートΔＴ２において測定された蛍光光子数をｋ２個とし、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２の測定開始時間の時間差をｔとすると、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２との時間幅が等しいとき、蛍光寿命τは以下の式（７）で表される。

・・・・・・・・・・・・・・・・（７）

図３は、レーザ光源の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作と、スイッチＳ１，Ｓ２の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。制御部３は、測定部２のパルスレーザ光源２ａのレーザ光の出射タイミングと信号処理部３のスイッチＳ１，Ｓ２とを制御することによって、第１の時間ゲートΔＴ１と第２の時間ゲートΔＴ２と時間差ｔとを設定している。

補正部５ａは、式（６）を用いて測定した蛍光光子数ｋ１個をｍ１個に補正し、同様にｋ２個をｍ２個に補正して蛍光寿命演算部５ｂに出力する。蛍光寿命演算部５ｂは、入力した第１の時間ゲートΔＴ１に入射した蛍光光子数をｍ１個とし、第２の時間ゲートΔＴ２に入射した蛍光光子数をｍ２個として、式（８）を演算して蛍光寿命τを算出する。

・・・・・・・・・・・・・・・・（８）
このようにして、測定した蛍光光子数をポアソン分布にしたがった補正を行い、補正を行った蛍光光子数にもとづいて蛍光寿命τを算出すると、蛍光光子の放出確率が大きい時間帯において蛍光光子の測定を行っても、誤差の小さい蛍光寿命が短時間に算出できる。

式（８）では、ｋ１，ｋ２個を補正したｍ１，ｍ２個を使用したが、１回のパルス励起光の照射において、第１の時間ゲートΔＴ１，第２の時間ゲートΔＴ２に入射した蛍光光子数の平均値をそれぞれμ１，μ２とすると式（６）の関係よりｍ１，ｍ２を計算せずに、μ１，μ２から蛍光寿命τを算出することもできる。

図４は、カウントレートｘに対する蛍光寿命との関係を表したグラフである。第１の時間ゲートΔＴ１を１６ｎｓとし、第２の時間ゲートΔＴ２を１６ｎｓとし、時間差ｔを１６ｎｓとして蛍光寿命を算出している。なお、各プロットは１３１，０７２回のパルス励起光の照射と蛍光光子数の測定結果にもとづくものである。図４に図示されたプロットの集合は、補正を行わない蛍光光子数の値にもとづいて算出した蛍光寿命τ１と、補正を行った蛍光光子数の値にもとづいて算出した蛍光寿命τ２とを示している。

図４において補正された蛍光寿命τ２は、３．９６ｎｓとなりカウントレートｘに係わらずほぼ一定となっている。一方、補正されない蛍光寿命τ１は、カウントレートｘが増大するにしたがい増加している。これは蛍光光子の放出確率を増加させカウントレートｘを増大させると蛍光光子の測定誤差が増大することを示している。カウントレートｘを増加させると、第１の時間ゲートΔＴ１における蛍光光子の測定数が第２の時間ゲートΔＴ２における蛍光光子の測定数と比較すると相対的に少なくなり、その結果、蛍光寿命τ１の値が増加することになる。

これに対して、補正を行った場合、測定した蛍光光子数の分布をポアソン分布にしたがうよう補正し、上述した蛍光光子数の測定誤差を補償しているため、算出された蛍光寿命τ２はカウントレートｘに依存することなくほぼ一定の値に収束している。この結果、パルス励起光のエネルギーを増大させ、蛍光光子の放出確率を増加させてもカウントレートｘに依存しない蛍光寿命が算出でき、つまり短時間で誤差の小さい蛍光寿命が算出できることを示している。

図５は、カウントレートｘと平均の蛍光寿命との関係を示したグラフである。各プロットは、５００，０００回のパルス励起光の照射と蛍光光子数の測定とを行って蛍光寿命を１回算出し、この蛍光寿命の算出を１００回行った平均値を表している。図４と同様に、測定した蛍光光子数の値の補正を行わずに算出した平均の蛍光寿命τ１´と、蛍光光子数の値の補正を行って算出した平均の蛍光寿命τ２´との双方を示している。図５は、測定した蛍光光子数に補正を行わないとカウントレートｘの増加にともなって算出される蛍光寿命の値が増加し、誤差が大きくなることを示している。

上記の実施の形態においては複数の時間ゲート数を２に設定したが、時間ゲート数が２個の場合には、式（８）から分かるように、蛍光光子数から算出できる蛍光寿命の値は一つだけである。試料に含まれる蛍光物質の成分が一種類だけの場合には、２個の時間ゲートにより測定可能であるが、複数の蛍光物質が含まれており、それぞれの蛍光寿命が異なるような場合がしばしば存在する。このような試料に含まれる各蛍光成分の蛍光寿命を測定する際には、３個以上の時間ゲートを用いた測定を行い、その結果を複数の蛍光寿命成分を含んだ関数でフィッティングすることで各蛍光成分の蛍光寿命を算出する。

しかし、式（５）は試料に複数の蛍光成分が含まれている場合を想定していないので、ここではｑ種類の蛍光寿命の成分が含まれている場合について考える。それぞれの成分が蛍光光子を放出する事象は独立試行と考えることができるので、各成分から放出される蛍光光子数の確率分布は、それぞれがポアソン分布にしたがう。

このとき、パルス励起光の１回の照射あたりに、ｉ番目の成分からの蛍光光子が、ある時間ゲート内に入射する平均の蛍光光子数をμｉとすると、この成分ｉからの蛍光光子がこの時間ゲートに入射しない確率は、以下の式（９）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（９）
となる。よって、ｑ個の成分のうち少なくとも一つの成分の蛍光光子がこの時間ゲートに入射する確率をＰとすると、Ｐは以下の式（１０）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（１０）
となる。さらにμを以下の式（１１）のように表し、

・・・・・・・・・・・・・・・・（１１）
と置けば、μはパルス励起光の１回の照射あたりに全ての蛍光成分からこの時間ゲートに入射する平均の蛍光光子数となり、Ｐは以下の式（１２）で表せる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（１２）
また、この時間ゲートで実際に測定したときのカウントレートをｘとすれば、以下の式（１３）が成り立ち、

・・・・・・・・・・・・・・・・（１３）
式（１２），（１３）から以下の式（１４）が導かれる。

・・・・・・・・・・・・・・・・（１４）
が得られる。

式（１４）は、式（５）と等価であり、試料に複数の蛍光寿命の成分が含まれている場合にも、上述の実施の形態と同様に、複数の時間ゲートぞれぞれで測定した蛍光光子数とパルス励起光の照射回数から、パルス励起光の１回の照射あたりに各時間ゲートに入射した平均の蛍光光子数、あるいは実際に入射した蛍光光子数を求められる。

上述の試料に複数の蛍光寿命の成分が含まれている場合など、スイッチを２個以上のｎ個設けることにより、時間ゲート数をｎ個に設定してもよい。図６は、スイッチＳ１〜Ｓｎの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイムチャートである。このように、スイッチＳ１〜Ｓｎを設けることによって、時間ゲートΔＴ１〜ΔＴｎを設定することができ、時間ゲート数が増加すれば、各時間ゲートにおける蛍光光子数の測定が正確になり、より高精度の蛍光寿命が算出できる。

また、図７は図６と同様に、スイッチＳ１〜Ｓｎの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイムチャートである。図７では、パルス励起光の照射後、時間の経過にともなって時間ゲートの時間帯が長くなるようにしている。このようにすると、蛍光光子の放出確率に合わせて蛍光光子数を測定することができる。つまり、測定された蛍光光子数の誤差が均一になるようにしている。結果的に算出される蛍光寿命は高精度になる。

また、図８は図６と同様に、スイッチＳ１〜Ｓｎの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイムチャートである。図８では、パルス励起光の照射後、時間の経過とともに時間ゲートの時間帯が長くなるようにするとともに、夫々の時間ゲート間に蛍光光子の測定を行わない時間帯を設けるようにしている。このようにすると、複数の時間ゲートに跨って蛍光光子が測定されることが避けられ、より正確な蛍光光子数が測定できる。

この発明の実施の形態である蛍光寿命測定装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態の測定部の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態のパルスレーザ光源とスイッチの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。この発明の実施の形態の補正による効果を示すグラフである。この発明の実施の形態の補正による効果を示すグラフである。この発明の実施の形態の変形例であるパルスレーザ光源とスイッチの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。この発明の実施の形態の変形例であるパルスレーザ光源とスイッチの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。この発明の実施の形態の変形例であるパルスレーザ光源とスイッチの「ＯＮ」，「ＯＦＦ」動作のタイミングを示すタイミングチャートである。

符号の説明

１蛍光寿命測定装置
２測定部
２ａパルスレーザ光源
２ｂ，２ｄレンズ系
２ｃ試料
２ｅ検出器
３制御部
４信号処理部
４ａ，４ｂ，４ｃアンプ
４ｄ，４ｅ波高分別器
４ｆ，４ｇカウンタ
５演算処理部
５ａ補正部
５ｂ蛍光寿命演算部
Ｓ１，Ｓ２スイッチ

Claims

試料にパルス励起光を照射し、該パルス励起光によって励起された前記試料から放出される蛍光の寿命を算出する蛍光寿命測定装置において、
前記パルス励起光の照射によって発生する蛍光光子を受けて検出信号を出力する検出器と、
前記検出信号に基づいて、前記パルス励起光の照射時刻から異なる所定時間を経過した複数の時間帯でそれぞれ蛍光光子が発生したか否かを検出する光子発生検出手段と、
前記パルス励起光を繰り返して照射したときの、各時間帯において前記光子発生検出手段がそれぞれ検出した蛍光光子の数を計数する計数手段と、
前記計数手段によって計数された各時間帯の各蛍光光子の数並びに前記パルス励起光の照射回数、または、前記パルス励起光の照射回数に対する各時間帯の蛍光光子数の割合を、前記蛍光光子の発生確率に関する所定の確率分布に基づいて補正する補正手段と、
前記補正手段によって補正された値に基づいて蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光寿命測定装置。
前記所定の確率分布は、前記パルス励起光により励起された前記試料から放出される蛍光光子数の確率分布として、ポアソン分布を使用することを特徴とする請求項１に記載の蛍光寿命測定装置。
前記光子発生検出手段は、各時間帯を形成する時間ゲート形成手段によって前記検出信号を切り出して、所定の閾値と比較することによって蛍光光子の発生を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光寿命測定装置。