JP6314872B2 - 含有蛍光成分数決定方法及びその含有蛍光成分数決定方法を用いた分光蛍光光度計 - Google Patents

Description

本発明は、試料に励起光を照射したときに生ずる蛍光を測定する含有蛍光成分数決定方法及びその含有蛍光成分数決定方法を用いた分光蛍光光度計に関する。

基底状態の分子に光を照射すると、分子はエネルギーレベルの高い励起状態に遷移する。そして、励起状態の分子は、エネルギーの一部を振動や熱により失った後、光放射による失活により基底状態に戻る。このときに分子が発する光が蛍光である。
そこで、分子が発する蛍光を検出することによって、その試料に含まれる蛍光成分の定性や定量分析を行うために、設定励起波長λ_ＥＸの光を試料に照射し、そのときに試料から放出される蛍光を測定する分光蛍光光度計が開発されている（例えば、特許文献１参照）。

図３は、従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。分光蛍光光度計１０１は、設定励起波長λ_ＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光を測定する検出部３０と、分光蛍光光度計１０１全体を制御するコンピュータ１５０とを備える。
試料室２０には、分析対象となる試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセル等が配置されるようになっている。

照射部１００は、白色光を出射する高輝度のキセノンアークランプやフラッシュキセノンランプ等を光源とする光源部１１と、白色光を波長分解するための凹面回折格子１２ａと励起側スリット１３とミラー１５とを有する励起分光器１０とを備える。
凹面回折格子１２ａはコンピュータ１５０の制御によって回転し、任意の設定励起波長λ_ＥＸの光を試料Ｓに対して照射することができるようになっている。

検出部３０は、試料Ｓから放出される蛍光を波長分解して目的波長範囲λ_ＥＭ１〜λ_ＥＭ２の光を光検出器３２に対して出射する凹面回折格子３１ａと、目的波長範囲λ_ＥＭ１〜λ_ＥＭ２の光強度を検出する光検出器３２と、蛍光側スリット３４とを備える。
凹面回折格子３１ａはコンピュータ１５０の制御によって回転し、任意の目的波長範囲λ_ＥＭ１〜λ_ＥＭ２の光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。

コンピュータ１５０においては、ＣＰＵ（制御部）１５１とメモリ１５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ１５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部５１ｂと、分析部１５１ｃとを有する。

このような分光蛍光光度計１０１によれば、ユーザーが試料Ｓの測定を実行する際には、まず、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。そして、ユーザーは入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａと光検出器制御部５１ｂとを制御することにより、設定励起波長λ_ＥＸ（例えば３５０ｎｍ）の光を試料Ｓに対して所定時間（例えば２０μ秒間）照射する。そして、試料Ｓから放出される目的波長範囲λ_ＥＭ１〜λ_ＥＭ２（例えば３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）の蛍光を光検出器３２に導き、光検出器３２から光強度信号（蛍光強度）Ｉ（ｔ）を所定時間間隔（例えば３秒間）で取得していく。

その後、試料Ｓの測定が終了すると、分析部１５１ｃは、蛍光強度Ｉと時間ｔとの関係を示す減衰曲線を得て（図４参照）、その減衰曲線を下記式（１）に当てはめてフィッティングし、最もよく一致する蛍光寿命ｒと初期蛍光強度Ｉ_０とを推定している。このとき、対数をとると直線となるため、対数をとってフィッティングすることも行われている。
Ｉ（ｔ）＝Ｉ_０×ｅｘｐ（−ｔ／ｒ） ・・・（１）
これにより、分析部１５１ｃは、蛍光寿命ｒと初期蛍光強度Ｉ_０とから、その試料Ｓに含まれる蛍光成分の定性や定量分析を行っている。

ところで、試料Ｓには、１種類の蛍光成分だけでなく複数種類ｎの蛍光成分を含むものがある。この場合、ユーザーが入力装置５２を用いて「蛍光成分数ｎ」を入力した後、分析部１５１ｃは、減衰曲線を下記式（２）に当てはめてフィッティングし、最もよく一致するｎ種類の蛍光寿命ｒ_１、ｒ_２、・・・ｒ_ｎとｎ種類の初期蛍光強度Ｉ_０１、Ｉ_０２、・・・Ｉ_０ｎとを推定している。
Ｉ（ｔ）＝Ｉ_０１×ｅｘｐ（−ｔ／ｒ_１）＋Ｉ_０２×ｅｘｐ（−ｔ／ｒ_２）＋・・・＋Ｉ_０ｎ×ｅｘｐ（−ｔ／ｒ_ｎ） ・・・（２）

特開２００６−３００６３２号公報

しかしながら、上述したような分光蛍光光度計１０１では、分析部１５１ｃが蛍光寿命ｒ_１、ｒ_２、・・・ｒ_ｎと初期蛍光強度Ｉ_０１、Ｉ_０２、・・・Ｉ_０ｎとを推定する前に、ユーザーが試料Ｓに含まれている「蛍光成分数ｎ」を入力する必要がある。しかしながら、未知試料Ｓの場合、含まれる「蛍光成分数ｎ」が既知であることは少なく、ユーザーが推定した「蛍光成分数ｎ」を入力している。そして、分析部１５１ｃは、この仮定に基づいて入力された「蛍光成分数ｎ」に対応する式（２）に減衰曲線を当てはめてフィッティングをかけており、また、ユーザーはそのフィッティング結果を見て、推定された蛍光寿命ｒ_１、ｒ_２、・・・ｒ_ｎに理論的な理由付けができるか、残差が少ないかどうかを判断している。そのため、ユーザーによる個人差が結果に影響するという問題点があった。

本件発明者は、上記課題を解決するために、未知試料Ｓに含まれている「蛍光成分数ｎ」を決定することができる含有蛍光成分数決定方法について検討を行った。図５（ａ）は、既知の蛍光寿命ｒ_１’（＝２００ｕｓ）を有する蛍光成分１を含む試料Ｓを測定した際に得られた減衰曲線の一例であり、図６（ａ）は、既知の蛍光寿命ｒ_１’（＝４０ｕｓ）を有する蛍光成分１と既知の蛍光寿命ｒ_２’（＝２００ｕｓ）を有する蛍光成分２とを含む試料Ｓを測定した際に得られた減衰曲線の一例である。図６（ａ）に示すように、早い時間区間の減衰曲線では蛍光成分１と蛍光成分２との寄与があるが、遅い時間区間の減衰曲線では蛍光成分２の寄与が支配的である。

よって、図５（ａ）の減衰曲線を、第１時間区間、第２時間区間、・・・、第Ｘ時間区間というように時間区間をずらしながら所定時間間隔Δｔ毎に、試料Ｓに含まれる蛍光成分数ｎを１種類と仮定して式（１）に当てはめてフィッティングして、Ｘ個の蛍光寿命ｒ_１、ｒ_２、・・・ｒ_ｘを推定すると、蛍光寿命ｒは図５（ｂ）に示すように２００ｕｓとなり変化しないが、図６（ａ）の減衰曲線を同様に、所定時間間隔Δｔ毎に式（１）に当てはめてフィッティングしてＸ個の蛍光寿命ｒ_１、ｒ_２、・・・ｒ_ｘを推定すると、蛍光寿命ｒは図６（ｂ）に示すように測定終了時間ｔ_ｅに近づくにつれ２００ｕｓとなり、蛍光成分２の寄与が増加していく。つまり、測定終了時間ｔ_ｅ付近では最も蛍光寿命ｒが長い蛍光成分のみが寄与している。

そこで、得られた測定開始時間ｔ_０〜測定終了時間ｔ_ｅの減衰曲線を、所定時間間隔Δｔ毎に式（１）に当てはめてフィッティングすることにより、時間に対する蛍光寿命ｒの変化を算出して、蛍光寿命ｒの変化がなければ、蛍光成分数ｎは１種類であるとし、一方、蛍光寿命ｒの変化があれば、蛍光成分２と異なる蛍光成分が含まれていると判定することを見出した。
また、異なる蛍光成分が含まれると判定したときには、最も蛍光寿命ｒ_２’が長い蛍光成分２に対応する理論減衰曲線を図６（ａ）の減衰曲線から除去することで、新たな減衰曲線（第２減衰曲線）を作成して、第２減衰曲線に対して上述したことを繰り返すことにより、第２減衰曲線において蛍光成分数ｎが１種類であるか否かを判定することにした。これにより、上述した手順を繰り返していくことで、試料Ｓに含まれている「蛍光成分数ｎ」を決定することを見出した。

すなわち、本発明の含有蛍光成分数決定方法は、設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、前記検出部で検出された光強度の時間変化であるＮ＝１とした第Ｎ減衰曲線を作成して蛍光寿命ｒを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計に用いられる含有蛍光成分数決定方法であって、測定終了時間より所定時間前となる時点から当該測定終了時間までの所定時間間隔となる第Ｘ時間区間の第Ｎ減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を１種類と仮定して蛍光寿命ｒ_Ｘを算出する第Ｘ蛍光寿命算出ステップと、前記第Ｘ時間区間より前の所定時間間隔となる第（Ｘ−１）時間区間の第Ｎ減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を１種類と仮定して蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}を算出するように、当該Ｘ値を減少させながら蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・を算出していく蛍光寿命変化算出ステップと、蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・が変化しないと判定したときには、前記試料に含まれる蛍光成分数をＮ種類とする判定ステップと、前記判定ステップで蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・が変化していくと判定したときには、蛍光寿命ｒ_Ｘの蛍光成分に対応する理論減衰曲線を、第Ｎ減衰曲線から除去することにより、第（Ｎ＋１）減衰曲線を作成する作成ステップと、第（Ｎ＋１）減衰曲線について、第Ｘ蛍光寿命算出ステップと蛍光寿命変化算出ステップと判定ステップと作成ステップとを実行するように、前記Ｎ値を増加させながら蛍光成分数を算出する多成分算出ステップとを含むようにしている。

ここで、「設定励起波長」とは、ユーザー等によって分析前に予め決められた任意の波長であり、例えば３５０ｎｍ等となる。
また、「所定時間間隔」とは、ユーザー等によって測定前に予め決められた任意の時間間隔であり、例えば、１μ秒間等となる。
また、「測定終了時間」とは、ユーザー等によって測定後等に決められる任意の時間であり、例えば、蛍光の光強度が０となる時間等となる。
さらに、「理論減衰曲線」とは、ある蛍光寿命ｒを有する蛍光成分が示すであろうと文献等に記載されたり算出されたりした減衰曲線のことをいう。

以上のように、本発明の含有蛍光成分数決定方法によれば、ユーザーによる個人差が結果に影響することなく「蛍光成分数ｎ」を決定することができる。また、原理上、推定可能な「蛍光成分数ｎ」に上限はない。

＜他の課題を解決するための手段および効果＞
また、本発明の分光蛍光光度計は、設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、前記検出部で検出された光強度の時間変化である第Ｎ減衰曲線に基づいて蛍光寿命ｒを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、前記制御部は、請求項１に記載の含有蛍光成分数決定方法に基づいて、蛍光成分数を算出するようにしてもよい。

以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、制御部が「蛍光成分数ｎ」を決定するため、ユーザーが試料Ｓに含まれている「蛍光成分数ｎ」を入力する必要がなくなる。

本発明に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図。 本発明の分光蛍光光度計の使用方法の一例を説明するフローチャート。 従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図。 蛍光強度Ｉと時間ｔとの関係を示す減衰曲線。 既知の蛍光寿命ｒ_１を有する蛍光成分１を含む試料Ｓを測定した際に得られた減衰曲線の一例を示すグラフ。 既知の蛍光寿命ｒ_１を有する蛍光成分１と既知の蛍光寿命ｒ_２を有する蛍光成分２とを含む試料Ｓを測定した際に得られた減衰曲線の一例を示すグラフ。

以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれることはいうまでもない。

図１は、本発明の実施形態に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。なお、分光蛍光光度計１０１と同様のものについては、同じ符号を付している。
分光蛍光光度計１は、設定励起波長λ_ＥＸの光を出射する照射部１００と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光を測定する検出部３０と、分光蛍光光度計１全体を制御するコンピュータ５０とを備える。

コンピュータ５０においては、ＣＰＵ（制御部）５１とメモリ５４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置５２と、表示装置５３とが連結されている。また、ＣＰＵ５１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１００を制御する光源部制御部５１ａと、光検出器３２からの光強度信号を取得する光検出器制御部５１ｂと、分析部５１ｃとを有する。

ここで、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明する。図２は、分光蛍光光度計１を使用する使用方法の一例について説明するためのフローチャートである。
分光蛍光光度計１の使用方法は、第１減衰曲線を取得する減衰曲線取得ステップＡと、第Ｘ時間区間の第Ｎ減衰曲線に基づいて蛍光寿命ｒ_Ｘを算出する第Ｘ蛍光寿命算出ステップＢと、Ｘ値を減少させながら蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}、・・・、ｒ_１を算出していく蛍光寿命変化算出ステップＣと、試料Ｓに含まれる蛍光成分数をＮ種類とする判定ステップＤと、第（Ｎ＋１）減衰曲線を作成する作成ステップＥと、Ｎ値を増加させる多成分算出ステップＦとを含む。

（Ａ）減衰曲線取得ステップ
まず、ステップＳ１０１の処理において、ユーザーは、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。
次に、ステップＳ１０２の処理において、ユーザーは、入力装置５２を用いて光源部制御部５１ａと光検出器制御部５１ｂとを制御することにより、設定励起波長λ_ＥＸ（例えば、３５０ｎｍ）の光を試料Ｓに対して所定時間（例えば１０μ秒間）照射する。そして、試料Ｓから放出される目的波長範囲λ_ＥＭ１〜λ_ＥＭ２（例えば３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）の蛍光を光検出器３２に導き、光検出器３２から光強度信号（蛍光強度）Ｉ（ｔ）を所定時間間隔（例えば１μ秒間）で得ることにより減衰曲線を取得する。

（Ｂ）第Ｘ蛍光寿命算出ステップ
次に、ステップＳ１０３の処理において、蛍光成分数を示すパラメータＮ＝１とする。つまり、試料Ｓに含まれる蛍光成分数を１種類と仮定する。
次に、ステップＳ１０４の処理において、測定開始時間ｔ_０〜測定終了時間ｔ_ｅの第Ｎ減衰曲線を所定時間間隔ΔｔでＸ個に分割し、その時間区間の位置を示すパラメータＸ＝Ｘ（最終の時間区間）とする。
次に、ステップＳ１０５の処理において、分析部５１ｃは、第Ｘ時間区間（時間（ｔ_ｅ−Δｔ）〜時間ｔ_ｅ）の第Ｎ減衰曲線を、式（１）に当てはめてフィッティングし、最もよく一致する蛍光寿命ｒ_Ｘと初期蛍光強度Ｉ_０ｘとを算出する。

（Ｃ）蛍光寿命変化算出ステップ
次に、ステップＳ１０６の処理において、Ｘ＝Ｘ−１とする。つまり、第Ｘ時間区間より設定時間前（例えば１μ秒前）となる第（Ｘ−１）時間区間とする。
次に、ステップＳ１０７の処理において分析部５１ｃは、第（Ｘ−１）時間区間の第Ｎ減衰曲線を、式（１）に当てはめてフィッティングし、最もよく一致する蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}と初期蛍光強度Ｉ_{０（Ｘ−１）}とを算出する。
次に、ステップＳ１０８の処理において、分析部５１ｃは、Ｘ＝１（最初の時間区間）であるか否かを判定する。Ｘ＝１でないと判定したときには、ステップＳ１０６の処理に戻る。つまり、Ｘ値を減少させながら蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}、・・・、ｒ_１を算出していく。一方、Ｘ＝１であると判定したときには、ステップＳ１０９の処理に進む。

（Ｄ）判定ステップ
次に、ステップＳ１０９の処理において、分析部５１ｃは、蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}、・・・、ｒ_１が変化するか否かを判定する。蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}、・・・、ｒ_１が変化しないと判定したときには、ステップＳ１１２の処理において、分析部５１ｃは、「蛍光成分数」をＮ種類とする。つまり、ここに至り試料Ｓには１種類の蛍光成分しか含まれていないものと判定し、「蛍光成分数」を決定して、本フローチャートを終了させる。

（Ｅ）作成ステップ
一方、蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}、・・・、ｒ_１が変化すると判定したときには、ステップＳ１１０の処理において、蛍光寿命ｒ_Ｘの蛍光成分に対応する理論減衰曲線を、第Ｎ減衰曲線から除去することにより、第（Ｎ＋１）減衰曲線を作成する。つまり、最も長い蛍光寿命ｒ_Ｘの蛍光成分の影響を除いた減衰曲線を作成する。

（Ｆ）多成分算出ステップ
次に、ステップＳ１１１の処理において、Ｎ＝Ｎ＋１として、ステップＳ１０４の処理に戻る。つまり、１種類の蛍光成分しか含まれなくなる減衰曲線になるまで、ステップＳ１０４の処理〜ステップＳ１１１の処理が繰り返されることになる。

以上のように、本発明の分光蛍光光度計１によれば、ＣＰＵ５１が「蛍光成分数ｎ」を決定することにより、試料Ｓに含まれる「蛍光成分数ｎ」をユーザーが入力する必要をなくすことができる。

本発明は、試料に励起光を照射したときに生じる蛍光を測定する分光蛍光光度計等に利用することができる。

１ 分光蛍光光度計
２０ 試料室
３０ 検出部
５１ ＣＰＵ（制御部）
１００ 照射部
Ｓ 試料

Claims (2)

1. 設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、
   前記試料が配置される試料室と、
   前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、
   前記検出部で検出された光強度の時間変化であるＮ＝１とした第Ｎ減衰曲線を作成して蛍光寿命ｒを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計に用いられる含有蛍光成分数決定方法であって、
   測定終了時間より所定時間前となる時点から当該測定終了時間までの所定時間間隔となる第Ｘ時間区間の第Ｎ減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を１種類と仮定して蛍光寿命ｒ_Ｘを算出する第Ｘ蛍光寿命算出ステップと、
   前記第Ｘ時間区間より前の所定時間間隔となる第（Ｘ−１）時間区間の第Ｎ減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を１種類と仮定して蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}を算出するように、当該Ｘ値を減少させながら蛍光寿命ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・を算出していく蛍光寿命変化算出ステップと、
   蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・が変化しないと判定したときには、前記試料に含まれる蛍光成分数をＮ種類とする判定ステップと、
   前記判定ステップで蛍光寿命ｒ_Ｘ、ｒ_{（Ｘ−１）}、ｒ_{（Ｘ−２）}・・・が変化していくと判定したときには、蛍光寿命ｒ_Ｘの蛍光成分に対応する理論減衰曲線を、第Ｎ減衰曲線から除去することにより、第（Ｎ＋１）減衰曲線を作成する作成ステップと、
   第（Ｎ＋１）減衰曲線について、第Ｘ蛍光寿命算出ステップと蛍光寿命変化算出ステップと判定ステップと作成ステップとを実行するように、前記Ｎ値を増加させながら蛍光成分数を算出する多成分算出ステップとを含むことを特徴とする含有蛍光成分数決定方法。
2. 設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、
   前記試料が配置される試料室と、
   前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、
   前記検出部で検出された光強度の時間変化である第Ｎ減衰曲線に基づいて蛍光寿命ｒを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、
   前記制御部は、請求項１に記載の含有蛍光成分数決定方法に基づいて、蛍光成分数を算出することを特徴とする分光蛍光光度計。

Images