JP6287883B2 - 分光蛍光光度計及びそれに用いられる補正関数作成方法 - Google Patents
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Description
本発明は、試料に励起光を照射したときに生ずる蛍光を測定する分光蛍光光度計及びそれに用いられる補正関数作成方法に関する。
基底状態の分子に光を照射すると、分子はエネルギーレベルの高い励起状態に遷移する。そして、励起状態の分子は、エネルギーの一部を振動や熱により失った後、光放射による失活により基底状態に戻る。このときに分子が発する光が蛍光である。
そこで、分子が発する蛍光がどのようなものであるかを検討するために、或る励起波長Λｅｘの光を試料に照射し、そのときに試料から放出される蛍光スペクトルを測定する分光蛍光光度計が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
そこで、分子が発する蛍光がどのようなものであるかを検討するために、或る励起波長Λｅｘの光を試料に照射し、そのときに試料から放出される蛍光スペクトルを測定する分光蛍光光度計が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
図８は、従来の分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。
分光蛍光光度計１０１は、励起波長λｅｘの光を出射する照射部１０と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する検出部３０と、分光蛍光光度計１０１全体を制御するコンピュータ１４０とを備える。
試料室２０には、分析試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセル等が配置されるようになっている。
分光蛍光光度計１０１は、励起波長λｅｘの光を出射する照射部１０と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する検出部３０と、分光蛍光光度計１０１全体を制御するコンピュータ１４０とを備える。
試料室２０には、分析試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセル等が配置されるようになっている。
照射部１０は、白色光を出射する高輝度のキセノンアークランプやキセノンフラッシュランプ等の光源１１と、白色光を波長分解するための凹面回折格子１２と励起側スリット１３とミラー１５とリファレンス光検出器１４とビームスプリッタ１６とを備える。
凹面回折格子１２は、コンピュータ１４０によって回転されるようなっており、任意の励起波長λｅｘの光を試料Ｓに対して照射することができるようになっている。
凹面回折格子１２は、コンピュータ１４０によって回転されるようなっており、任意の励起波長λｅｘの光を試料Ｓに対して照射することができるようになっている。
ビームスプリッタ１６は、入射した光を、リファレンス光検出器１４と試料Ｓとに対して分割して出射するようになっている。例えば、入射した光の数％程度を反射光としてリファレンス光検出器１４に対して出射するとともに、残りの透過光を試料Ｓに対して出射する。
そして、リファレンス光検出器１４は、Ｓｉ−ＰＤ（シリコンフォトダイオード）や光電子増倍管等であり、ビームスプリッタ１６からの反射光を検出し、光源モニタ値として光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）をコンピュータ１４０に出力する。
そして、リファレンス光検出器１４は、Ｓｉ−ＰＤ（シリコンフォトダイオード）や光電子増倍管等であり、ビームスプリッタ１６からの反射光を検出し、光源モニタ値として光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）をコンピュータ１４０に出力する。
検出部３０は、試料Ｓから放出される蛍光を波長分解して蛍光波長λｅｍの光を光検出器３２に対して出射する凹面回折格子３１と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する光検出器３２と、蛍光側スリット３４とを備える。なお、光検出器３２は、検出感度が高い点から光電子増倍管等が用いられる。
凹面回折格子３１は、コンピュータ１４０によって回転されるようなっており、任意の蛍光波長λｅｍの光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。これにより、凹面回折格子３１は、コンピュータ１４０によって回転されながら、所定領域の蛍光波長λｅｍ１〜λｅｍ２の光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。
凹面回折格子３１は、コンピュータ１４０によって回転されるようなっており、任意の蛍光波長λｅｍの光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。これにより、凹面回折格子３１は、コンピュータ１４０によって回転されながら、所定領域の蛍光波長λｅｍ１〜λｅｍ２の光を光検出器３２に対して出射することができるようになっている。
コンピュータ１４０においては、ＣＰＵ（制御部）１４１とメモリ（記憶部）１４４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置４２と、表示装置４３とが連結されている。また、ＣＰＵ１４１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１０を制御する照射部制御部４１ａと、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を取得する光検出器制御部４１ｂと、蛍光スペクトルＩ（λｅｘ，λｅｍ）を作成する分析部４１ｃとを有する。
このような分光蛍光光度計１０１によれば、分析者が試料Ｓを分析する際には、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。そして、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、試料Ｓに対して或る励起波長Λｅｘ（例えば３５０ｎｍ）の光を照射するとともに、リファレンス光検出器１４から光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）を取得していく。また、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）で取得していく。その後、試料Ｓの分析が終了すると、分析部４１ｃは、光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）と光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ２）とに基づいて、蛍光スペクトルＩ（λｅｍ１）〜Ｉ（λｅｍ２）を作成する。
ところで、照射部１０において、光源１１は、励起波長λｅｘ毎のエネルギー放射特性が異なるものであり、凹面回折格子１２は、励起波長λｅｘ毎の波長回折特性が異なるものである。また、検出部３０において、光検出器３２は、蛍光波長λｅｍ毎の波長感度特性が異なるものであり、凹面回折格子３１は、蛍光波長λｅｍ毎の波長回折特性が異なるものである。
そこで、照射部１０におけるエネルギー放射特性や波長回折特性の影響を除外するための「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と、検出部３０における波長感度特性や波長回折特性の影響を除外するための「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを予め作成しておき、分析部４１ｃは、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」を用いて光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）を補正するとともに、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」を用いて光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ）を補正して、蛍光スペクトルＩ（λｅｍ）を作成している。
ここで、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを作成する補正関数作成方法の一例として、入射する光の量子数に比例した光強度の蛍光を発するローダミンＢ溶液を用いる方法について説明する。
まず、分析者は、所定濃度のローダミンＢ溶液Ｓａが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。次に、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、ローダミンＢ溶液Ｓａからの蛍光波長Λｅｍ（例えば６４０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，Λｅｍ）を検出するようにセットする。そして、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、凹面回折格子１２を回転させながら、ローダミンＢ溶液Ｓａに対して励起波長範囲λｅｘ１〜λｅｘ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）の光を照射するとともに、リファレンス光検出器１４は、光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を検出する。また、光検出器制御部４１ｂは、励起波長λｅｘ１にセットされた際に得られた光強度Ｉｅｍ（λｅｘ１，Λｅｍ）、・・・、励起波長λｅｘ２にセットされた際に得られた光強度Ｉｅｍ（λｅｘ２，Λｅｍ）を取得する。そして、下記式（１）が成立することにより、分析者は、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ，Λｅｍ）／Ｉｒｅｆ（λ）」をメモリ１４４に記憶させる。
Ｉｅｍ（λ，Λｅｍ）＝Ｉｒｅｆ（λ）×Ｆｅｘ（λ） ・・・（１）
まず、分析者は、所定濃度のローダミンＢ溶液Ｓａが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０に配置する。次に、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、ローダミンＢ溶液Ｓａからの蛍光波長Λｅｍ（例えば６４０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，Λｅｍ）を検出するようにセットする。そして、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、凹面回折格子１２を回転させながら、ローダミンＢ溶液Ｓａに対して励起波長範囲λｅｘ１〜λｅｘ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）の光を照射するとともに、リファレンス光検出器１４は、光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を検出する。また、光検出器制御部４１ｂは、励起波長λｅｘ１にセットされた際に得られた光強度Ｉｅｍ（λｅｘ１，Λｅｍ）、・・・、励起波長λｅｘ２にセットされた際に得られた光強度Ｉｅｍ（λｅｘ２，Λｅｍ）を取得する。そして、下記式（１）が成立することにより、分析者は、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ，Λｅｍ）／Ｉｒｅｆ（λ）」をメモリ１４４に記憶させる。
Ｉｅｍ（λ，Λｅｍ）＝Ｉｒｅｆ（λ）×Ｆｅｘ（λ） ・・・（１）
次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、ローダミンＢ溶液Ｓａに対して励起波長Λｅｘ（例えば６４０ｎｍ）の光を照射する。このとき、リファレンス光検出器１４は、光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）を検出しない。また、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度ＩｅｍＲ（Λｅｘ，λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）で取得する。
次に、分析者は、所定角度（例えば４５°）となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０に配置する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度ＩｅｍＢ（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度ＩｅｍＢ（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。そして、下記式（２）が成立することにより、分析者は、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」として「ＩｅｍＢ（λ，λ）／ＩｅｍＲ（Λｅｘ，λ））」をメモリ１４４に記憶させる。
ＩｅｍＢ（λ，λ）＝ＩｅｍＲ（Λｅｘ，λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（２）
ＩｅｍＢ（λ，λ）＝ＩｅｍＲ（Λｅｘ，λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（２）
さらに、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを作成する補正関数作成方法の他の一例として、波長λ毎のエネルギー放射特性ＩＳｔｄ（λ）が値付けされた標準光源を用いる方法について説明する。
まず、分析者は、標準光源Ｓｃを試料室２０に配置する。次に、分析者は標準光源Ｓｃを制御することにより、標準光源Ｓｃから検出部３０に対して光を照射する。これにより、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）で取得する。そして、下記式（３）が成立することにより、分析者は、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ）／ＩＳｔｄ（λ）」をメモリ１４４に記憶させる。
Ｉｅｍ（λ）＝ＩＳｔｄ（λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（３）
まず、分析者は、標準光源Ｓｃを試料室２０に配置する。次に、分析者は標準光源Ｓｃを制御することにより、標準光源Ｓｃから検出部３０に対して光を照射する。これにより、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）で取得する。そして、下記式（３）が成立することにより、分析者は、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ）／ＩＳｔｄ（λ）」をメモリ１４４に記憶させる。
Ｉｅｍ（λ）＝ＩＳｔｄ（λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（３）
次に、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０に配置する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ２，λｅｍ１）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。そして、下記式（４）が成立することにより、分析者は、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ，λ）／Ｆｅｍ（λ）」をメモリ１４４に記憶させる。
Ｉｅｍ（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（４）
Ｉｅｍ（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｅｍ（λ） ・・・（４）
なお、このような「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とは、分光蛍光光度計１０１に搭載されている光源１１や光学素子（ミラー１５やビームスプリッタ１６）や光検出器３２が個体毎に異なる波長分光特性を持っているため、例えば、光源１１が点灯寿命時間に到達して光源１１を交換したときや、光学素子が破損して別の光学素子に交換したときや、何らかの問題により光検出器３２を交換したときには、改めて作成されることになる。
しかしながら、上述したようなローダミンＢ溶液Ｓａを用いる補正関数作成方法では、所定濃度のローダミンＢ溶液Ｓａを準備しなければならず、経時変化や保管状況により溶液の濃度が変わると、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを正しく作成できないことがあった。なお、ローダミンＢ溶液Ｓａは、高濃度かつ赤褐色の溶液であるため、その濃度が変化していたとしても目視では濃度変化が判別できない。
一方、上述したような標準光源Ｓｃを用いる補正関数作成方法では、試料室２０に標準光源Ｓｃを設置する治具や、高出力のハロゲンランプやキセノンランプが用いられる標準光源Ｓｃに対して使用時の安全性を確保するためのユニットや、光検出器３２に入射する光を測定可能なレベルまで減光させるユニットや、高出力の電源等が必要となる。つまり、標準光源Ｓｃを含めたユニット構成がかなり大掛かりなものになるという問題点があった。
本件発明者らは、ローダミンＢ溶液Ｓａ等の使用に際して濃度管理を必要とせず、エネルギー放射特性ＩＳｔｄ（λ）が値付けされた標準光源Ｓｃの試料室２０への取付作業も不要で、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを作成する補正関数作成方法について検討を行った。
上述したような分光蛍光光度計１０１では、試料Ｓへ照射する前の励起光の一部を取り出して、その光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）をリファレンス光検出器１４で測定し、光検出器３２で測定された光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ）に比演算処理を行うことにより、光源１１の出力の不安定性を補正している。
上述したような分光蛍光光度計１０１では、試料Ｓへ照射する前の励起光の一部を取り出して、その光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）をリファレンス光検出器１４で測定し、光検出器３２で測定された光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ）に比演算処理を行うことにより、光源１１の出力の不安定性を補正している。
そこで、リファレンス光検出器１４に、光源１１の出力の不安定性を補正するモニタ機能に加えて、予め波長分光特性Ｆｒｅｆ（λ）を値付けしておくことで、光源１１や光学素子や光検出器３２を交換した際には、リファレンス光検出器１４の波長分光特性Ｆｒｅｆ（λ）を用いて「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とを作成する補助機能を持たせることを見出した。
すなわち、本発明の分光蛍光光度計は、白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解し励起波長λｅｘの光を試料に対して照射する回折格子と、前記励起波長λｅｘの光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）を検出するリファレンス光検出器と、前記励起波長λｅｘの光をリファレンス光検出器と試料とに分割して出射するビームスプリッタとを備える照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光を波長分解し蛍光波長λｅｍの光を光検出器に対して出射する回折格子と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する光検出器とを備える検出部と、前記照射部における光強度の波長分光特性を示す励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）、前記検出部における光強度の波長分光特性を示す蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）及び前記光検出器で検出された蛍光波長領域λｅｍ１〜λｅｍ２の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ２）に基づいて、蛍光スペクトルＩ（λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉ（λｅｘ，λｅｍ２）を作成する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、前記リファレンス光検出器における光強度の波長分光特性を示すリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を記憶した記憶部を備えるようにしている。
本発明の分光蛍光光度計によれば、例えば、光源を交換した場合には、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」を作成することになる。具体的には、まず、光源から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器は、光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）を検出する。次に、その光源からの励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器は、光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を検出する。このようにして例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して、光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ’（λｅｘｎ）を取得する。そして、下記式（５’）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」として「Ｉｒｅｆ’（λ）／Ｆｒｅｆ（λ）」を算出して記憶部に記憶させる。
Ｉｒｅｆ’（λ）＝Ｆｅｘ’（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５’）
Ｉｒｅｆ’（λ）＝Ｆｅｘ’（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５’）
以上のように、本発明の分光蛍光光度計によれば、追加された補助機能により、濃度管理を必要とするローダミンＢ溶液Ｓａの準備や、標準光源Ｓｃを含むユニットの取付作業を行うことなく、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」や「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」を作成することができる。
すなわち、分光蛍光光度計内に構成されている部品（リファレンス光検出器）を用いて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」や「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」を容易に作成することができる。
すなわち、分光蛍光光度計内に構成されている部品（リファレンス光検出器）を用いて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」や「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」を容易に作成することができる。
（他の課題を解決するための手段および効果）
また、上記発明において、上述したような分光蛍光光度計に用いられるリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成する補正関数作成方法であって、励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）を前記記憶部に記憶させるステップと、前記光源から出射された光の励起波長λｅｘを走査しながら、前記リファレンス光検出器からの光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）を取得するステップと、下記式（５）に基づいて、リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成するステップとを含むようにしてもよい。
Ｉｒｅｆ（λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５）
また、上記発明において、上述したような分光蛍光光度計に用いられるリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成する補正関数作成方法であって、励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）を前記記憶部に記憶させるステップと、前記光源から出射された光の励起波長λｅｘを走査しながら、前記リファレンス光検出器からの光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）を取得するステップと、下記式（５）に基づいて、リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成するステップとを含むようにしてもよい。
Ｉｒｅｆ（λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５）
また、上記発明において、上述したような分光蛍光光度計を用いて、前記励起側スペクトル補正関数Ｆ ｅｘ （λ）を更新する際に用いる励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）を作成する補正関数作成方法であって、前記照射部における前記光源及び／又は前記回折格子を交換するステップと、前記光源から出射された光の励起波長λｅｘを走査しながら、前記リファレンス光検出器からの光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ）を取得するステップと、下記式（５’）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」を作成するステップとを含むようにしてもよい。
Ｉｒｅｆ’（λ）＝Ｆｅｘ’（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５’）
Ｉｒｅｆ’（λ）＝Ｆｅｘ’（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５’）
さらに、上記発明において、上述したような分光蛍光光度計において積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）を作成する補正関数作成方法であって、前記試料室に積分球を配置するステップと、前記光源から出射された光の励起波長λｅｘと前記光検出器に出射される光の蛍光波長λｅｍとを等しく保ちながら走査することで、前記光検出器からの光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ，λｅｍ）を取得するステップと、下記式（８）に基づいて、「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」を作成するステップとを含むようにしてもよい。
Ｉｅｍ’（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｓｐｈ（λ）／Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（８）
Ｉｅｍ’（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｓｐｈ（λ）／Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（８）
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明する。なお、本発明は、以下に説明するような実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の態様が含まれる。
図１は、本発明に係る分光蛍光光度計の一例を示す概略構成図である。なお、先に述べた分光蛍光光度計１０１と同様のものについては、同じ符号を付している。
分光蛍光光度計１は、励起波長λｅｘの光を出射する照射部１０と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する検出部３０と、分光蛍光光度計１全体を制御するコンピュータ４０とを備える。
分光蛍光光度計１は、励起波長λｅｘの光を出射する照射部１０と、試料Ｓが配置される試料室２０と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する検出部３０と、分光蛍光光度計１全体を制御するコンピュータ４０とを備える。
コンピュータ４０においては、ＣＰＵ（制御部）４１とメモリ（記憶部）４４とを備え、さらにキーボードやマウス等を有する入力装置４２と、表示装置４３とが連結されている。また、ＣＰＵ４１が処理する機能をブロック化して説明すると、照射部１０を制御する照射部制御部４１ａと、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を取得する光検出器制御部４１ｂと、蛍光スペクトルＩ（λｅｘ，λｅｍ）を作成する分析部４１ｃとを有する。
メモリ４４には、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」と、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」とが記憶されるようになっている。
メモリ４４には、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」と、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」とが記憶されるようになっている。
ここで、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」と「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」とを作成する補正関数作成方法の一例について説明する。図２は、波長λ毎のエネルギー放射特性ＩＳｔｄ（λ）が値付けされた標準光源を用いる補正関数作成方法の一例について説明するためのフローチャートである。
この補正関数作成方法は、以下に述べる「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」作成ステップＡと、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」作成ステップＢと、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」作成ステップＣとを含むものである。
この補正関数作成方法は、以下に述べる「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」作成ステップＡと、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」作成ステップＢと、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」作成ステップＣとを含むものである。
（Ａ）「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」作成ステップ（ステップＳ１０１〜Ｓ１０３）
まず、ステップＳ１０１の処理において、分析者は、標準光源Ｓｃを試料室２０にセットする。次に、分析者は標準光源Ｓｃを制御することにより、標準光源Ｓｃから検出部３０に対して光を照射する。
そして、ステップＳ１０２の処理において、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）で取得する。
次に、ステップＳ１０３の処理において、分析者は、前記の式（３）に基づいて、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ）／ＩＳｔｄ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
まず、ステップＳ１０１の処理において、分析者は、標準光源Ｓｃを試料室２０にセットする。次に、分析者は標準光源Ｓｃを制御することにより、標準光源Ｓｃから検出部３０に対して光を照射する。
そして、ステップＳ１０２の処理において、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）で取得する。
次に、ステップＳ１０３の処理において、分析者は、前記の式（３）に基づいて、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ）／ＩＳｔｄ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
（Ｂ）「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」作成ステップ（ステップＳ１０４〜Ｓ１０６）
次に、ステップＳ１０４の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ１０５の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１０６の処理において、分析者は、前記の式（４）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ，λ）／Ｆｅｍ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
次に、ステップＳ１０４の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ１０５の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。
次に、ステップＳ１０６の処理において、分析者は、前記の式（４）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」として「Ｉｅｍ（λ，λ）／Ｆｅｍ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
（Ｃ）「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」作成ステップ（ステップＳ１０７〜Ｓ１０８）
次に、ステップＳ１０７の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１から励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を取得する。このようにして例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を取得する。
次に、ステップＳ１０８の処理において、分析者は、前記の式（５）に基づいて、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」として「Ｉｒｅｆ（λ）／Ｆｅｘ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ１０８の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
次に、ステップＳ１０７の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１から励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を取得する。このようにして例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ（λｅｘ２）を取得する。
次に、ステップＳ１０８の処理において、分析者は、前記の式（５）に基づいて、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」として「Ｉｒｅｆ（λ）／Ｆｅｘ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ１０８の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
続いて、本発明の分光蛍光光度計１の使用方法について説明する。
（１）光源１１や凹面回折格子１２やミラー１５を交換した場合
「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」から「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図３のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ２０１の処理において、分析者は、入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１からの励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１からの励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を取得する。このようにして例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を取得する。
（１）光源１１や凹面回折格子１２やミラー１５を交換した場合
「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」から「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図３のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ２０１の処理において、分析者は、入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１からの励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、光源１１からの励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、リファレンス光検出器１４から励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を取得する。このようにして例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を取得する。
次に、ステップＳ２０２の処理において、分析者は、前記の式（５’）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」として「Ｉｒｅｆ’（λ）／Ｆｒｅｆ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ２０２の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
そして、ステップＳ２０２の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
（２）光検出器３２や凹面回折格子３１を交換した場合
「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」から「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図４のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ３０１の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ３０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、凹面回折格子３１を所定角度に回転させて、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、凹面回折格子３１を所定角度に回転させて、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。
「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」から「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図４のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ３０１の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ３０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、凹面回折格子３１を所定角度に回転させて、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、凹面回折格子３１を所定角度に回転させて、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。
次に、ステップＳ３０３の処理において、分析者は、下記式（４’）に基づいて、「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ’（λ）」として「Ｉｅｍ’（λ，λ）／Ｆｅｘ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
Ｉｅｍ’（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｅｍ’（λ） ・・・（４’）
そして、ステップＳ３０３の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
Ｉｅｍ’（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｅｍ’（λ） ・・・（４’）
そして、ステップＳ３０３の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
（３）リファレンス光検出器１４を交換した場合
「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」から「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図５のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ４０１の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）」から「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ’（λ）」に更新する補正関数作成方法の一例について、図５のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ４０１の処理において、分析者は、所定角度となるように硫酸バリウム板Ｓｂを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ４０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、硫酸バリウム板Ｓｂからの蛍光波長Λｅｍ（例えば、６４０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（Λｅｍ）を検出するようにセットする。そして、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、凹面回折格子１２を回転させながら、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長範囲λｅｘ１〜λｅｘ２（例えば２００ｎｍ〜６００ｎｍ）の光を照射する。これにより、光検出器制御部４１ｂは、光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ１，Λｅｍ）、・・・、光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ２，Λｅｍ）を取得する。このとき、下記式（６）が成立することになる。
Ｉｅｍ’（λ，Λｅｍ）＝Ｋ（λ）×Ｆｅｘ（λ） ・・・（６）
Ｉｅｍ’（λ，Λｅｍ）＝Ｋ（λ）×Ｆｅｘ（λ） ・・・（６）
次に、ステップＳ４０３の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、凹面回折格子１２を回転させながら、硫酸バリウム板Ｓｂに対して励起波長範囲λｅｘ１〜λｅｘ２（例えば、２００ｎｍ〜６００ｎｍ）の光を照射する。これにより、リファレンス光検出器１４からの蛍光波長λｅｘ１〜λｅｘ２の光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ１）〜Ｉｒｅｆ’（λｅｘ２）を取得する。また、光検出器制御部４１ｂは、光強度Ｉｅｍ’’（λｅｘ１，Λｅｍ）、・・・、光強度Ｉｅｍ’’（λｅｘ２，Λｅｍ）を取得する。このとき、下記式（７）が成立することになる。
Ｉｅｍ’’（λ，Λｅｍ）＝（Ｋ（λ）×Ｆｅｘ（λ））／（Ｆｅｘ（λ）×Ｆｒｅｆ’（λ）） ・・・（７）
Ｉｅｍ’’（λ，Λｅｍ）＝（Ｋ（λ）×Ｆｅｘ（λ））／（Ｆｅｘ（λ）×Ｆｒｅｆ’（λ）） ・・・（７）
次に、ステップＳ４０４の処理において、分析者は、式（６）と式（７）とに基づいて、「リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ’（λ）」として「Ｉｅｍ’（λ，Λｅｍ）／（Ｆｅｘ（λ）×Ｉｅｍ’’（λ，Λｅｍ））」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ４０４の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
そして、ステップＳ４０４の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
（４）積分球を用いる場合
「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」を作成する補正関数作成方法の一例について、図６のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ５０１の処理において、分析者は、積分球Ｓｄを試料室２０にセットする。そして、光が積分球Ｓｄの白色面に当たるようにセットする。
「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」を作成する補正関数作成方法の一例について、図６のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ５０１の処理において、分析者は、積分球Ｓｄを試料室２０にセットする。そして、光が積分球Ｓｄの白色面に当たるようにセットする。
次に、ステップＳ５０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、積分球Ｓｄに対して励起波長λｅｘ１（例えば２００ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ１（例えば２００ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ１，λｅｍ１）を取得する。次に、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、積分球Ｓｄに対して励起波長λｅｘ２（例えば２１０ｎｍ）の光を照射する。そして、分析者は入力装置４２を用いて光検出器制御部４１ｂを制御することにより、光検出器３２からの蛍光波長λｅｍ２（例えば２１０ｎｍ）の光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ２，λｅｍ２）を取得する。このようにして照射部制御部４１ａの励起波長λｅｘと、光検出器制御部４１ｂの蛍光波長λｅｍとを互いに等しく保ちながら、例えば２００ｎｍから６００ｎｍまでの波長範囲を波長走査して同期スペクトルを取得する。
次に、ステップＳ５０３の処理において、分析者は、前記の式（８）に基づいて、「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」として「（Ｉｅｍ’（λ，λ）×Ｆｒｅｆ（λ））／Ｆｅｘ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ５０３の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
次に、ステップＳ５０３の処理において、分析者は、前記の式（８）に基づいて、「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」として「（Ｉｅｍ’（λ，λ）×Ｆｒｅｆ（λ））／Ｆｅｘ（λ）」をメモリ４４に記憶させる。
そして、ステップＳ５０３の処理が終了したときには、本フローチャートを終了させる。
（５）試料Ｓを分析する場合
本発明の分光蛍光光度計１による分析方法の一例について、図７のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ６０１の処理において、分析者は、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ６０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、試料Ｓに対して励起波長Λｅｘ（例えば３５０ｎｍ）の光を照射する。このとき、リファレンス光検出器１４からの励起波長Λｅｘの光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）を取得する。
本発明の分光蛍光光度計１による分析方法の一例について、図７のフローチャートを用いて説明する。
まず、ステップＳ６０１の処理において、分析者は、試料Ｓが収納された１０ｍｍキュベットセルを試料室２０にセットする。
次に、ステップＳ６０２の処理において、分析者は入力装置４２を用いて照射部制御部４１ａを制御することにより、試料Ｓに対して励起波長Λｅｘ（例えば３５０ｎｍ）の光を照射する。このとき、リファレンス光検出器１４からの励起波長Λｅｘの光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）を取得する。
次に、ステップＳ６０３の処理において、光検出器制御部４１ｂは、凹面回折格子３１を回転させながら、光検出器３２からの光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ）を蛍光波長範囲λｅｍ１〜λｅｍ２（例えば３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ）で取得する。
次に、ステップＳ６０４の処理において、分析部４１ｃは、光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ２）と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とに基づいて、下記式（９）に示す真の蛍光スペクトルＢ（Λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｂ（Λｅｘ，λｅｍ２）を作成するとともに、光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）と「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」とリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）とに基づいて、下記式（１０）に示す真の励起スペクトルＡ（Λｅｘ）を作成することで、蛍光スペクトルＩ（λｅｍ１）〜Ｉ（λｅｍ２）を作成する。
Ｂ（Λｅｘ，λ）＝Ｉｅｍ（Λｅｘ，λ）／Ｆｅｍ（λ） ・・・（９）
Ａ（Λｅｘ）＝Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）×Ｆｒｅｆ（Λｅｘ） ・・・（１０）
次に、ステップＳ６０４の処理において、分析部４１ｃは、光強度Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉｅｍ（Λｅｘ，λｅｍ２）と「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）」とに基づいて、下記式（９）に示す真の蛍光スペクトルＢ（Λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｂ（Λｅｘ，λｅｍ２）を作成するとともに、光強度Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）と「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）」とリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）とに基づいて、下記式（１０）に示す真の励起スペクトルＡ（Λｅｘ）を作成することで、蛍光スペクトルＩ（λｅｍ１）〜Ｉ（λｅｍ２）を作成する。
Ｂ（Λｅｘ，λ）＝Ｉｅｍ（Λｅｘ，λ）／Ｆｅｍ（λ） ・・・（９）
Ａ（Λｅｘ）＝Ｉｒｅｆ（Λｅｘ）×Ｆｒｅｆ（Λｅｘ） ・・・（１０）
以上のように、本発明の分光蛍光光度計１によれば、追加された補助機能により、濃度管理を必要とするローダミンＢ溶液Ｓａの準備や、標準光源Ｓｃを含むユニットの取付作業を行うことなく、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」や「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ’（λ）」を作成することができる。すなわち、分光蛍光光度計１の構成部品（リファレンス光検出器１４）を用いて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」や「蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ’（λ）」を容易に作成することができる。
本発明は、分光蛍光光度計等に好適に利用できる。
１ 分光蛍光光度計
１０ 照射部
１１ 光源
１２ 凹面回折格子
１４ リファレンス光検出器
１６ ビームスプリッタ
２０ 試料室
３０ 検出部
３１ 凹面回折格子
３２ 光検出器
４１ ＣＰＵ（制御部）
４４ メモリ（記憶部）
１０ 照射部
１１ 光源
１２ 凹面回折格子
１４ リファレンス光検出器
１６ ビームスプリッタ
２０ 試料室
３０ 検出部
３１ 凹面回折格子
３２ 光検出器
４１ ＣＰＵ（制御部）
４４ メモリ（記憶部）
Claims (4)
- 白色光を出射する光源と、当該白色光を波長分解し励起波長λｅｘの光を試料に対して照射する回折格子と、前記励起波長λｅｘの光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）を検出するリファレンス光検出器と、前記励起波長λｅｘの光をリファレンス光検出器と試料とに分割して出射するビームスプリッタとを備える照射部と、
前記試料が配置される試料室と、
前記試料から放出される蛍光を波長分解し蛍光波長λｅｍの光を光検出器に対して出射する回折格子と、蛍光波長λｅｍの光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ）を検出する光検出器とを備える検出部と、
前記照射部における光強度の波長分光特性を示す励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）、前記検出部における光強度の波長分光特性を示す蛍光側スペクトル補正関数Ｆｅｍ（λ）及び前記光検出器で検出された蛍光波長領域λｅｍ１〜λｅｍ２の光強度Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉｅｍ（λｅｘ，λｅｍ２）に基づいて、蛍光スペクトルＩ（λｅｘ，λｅｍ１）〜Ｉ（λｅｘ，λｅｍ２）を作成する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、
前記リファレンス光検出器における光強度の波長分光特性を示すリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を記憶した記憶部を備えることを特徴とする分光蛍光光度計。 - 請求項１に記載の分光蛍光光度計に用いられるリファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成する補正関数作成方法であって、
励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ（λ）を前記記憶部に記憶させるステップと、
前記光源から出射された光の励起波長λｅｘを走査しながら、前記リファレンス光検出器からの光強度Ｉｒｅｆ（λｅｘ）を取得するステップと、
下記式（５）に基づいて、リファレンススペクトル補正関数Ｆｒｅｆ（λ）を作成するステップとを含むことを特徴とする補正関数作成方法。
Ｉｒｅｆ（λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５） - 請求項１に記載の分光蛍光光度計を用いて、前記励起側スペクトル補正関数Ｆ ｅｘ （λ）を更新する際に用いる励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）を作成する補正関数作成方法であって、
前記照射部における前記光源及び／又は前記回折格子を交換するステップと、
前記光源から出射された光の励起波長λｅｘを走査しながら、前記リファレンス光検出器からの光強度Ｉｒｅｆ’（λｅｘ）を取得するステップと、
下記式（５’）に基づいて、「励起側スペクトル補正関数Ｆｅｘ’（λ）」を作成するステップとを含むことを特徴とする補正関数作成方法。
Ｉｒｅｆ’（λ）＝Ｆｅｘ’（λ）×Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（５’） - 請求項１に記載の分光蛍光光度計において積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）を作成する補正関数作成方法であって、
前記試料室に積分球を配置するステップと、
前記光源から出射された光の励起波長λｅｘと前記光検出器に出射される光の蛍光波長λｅｍとを等しく保ちながら走査することで、前記光検出器からの光強度Ｉｅｍ’（λｅｘ，λｅｍ）を取得するステップと、
下記式（８）に基づいて、「積分球使用時蛍光側スペクトル補正関数Ｆｓｐｈ（λ）」を作成するステップとを含むことを特徴とする補正関数作成方法。
Ｉｅｍ’（λ，λ）＝Ｆｅｘ（λ）×Ｆｓｐｈ（λ）／Ｆｒｅｆ（λ） ・・・（８）
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