JP4710393B2 - 蛍光分光光度計における励起スペクトル補正方法 - Google Patents

Description

蛍光分光光度計、特に近赤外領域において使用される蛍光分光光度計に関する。

蛍光分光光度計は一般的に図２に示す構成を有している。光源１には、広い波長範囲に亘って強い光を発するキセノンランプなどが用いられる。光源１からの光のうちのある波長成分が励起分光器２によって抽出され、励起光３となって試料室４の内部に置かれた試料５を照射する。試料５に蛍光性を有する成分が含まれていると、その成分は励起光３の波長がその成分固有のある波長に一致した時に励起されて、成分固有の波長の蛍光６を発する。蛍光６は蛍光分光器７に入射し、蛍光分光器７によって選択された波長の光が検出器８によって検出され、測光・制御部９に送られる。測光・制御部９は、測定目的に応じて検出信号の計算処理や測定結果の表示を行うと共に、励起分光器２および蛍光分光器７の波長の設定あるいは波長走査の制御を行う。測光・制御部９としてしばしばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）が利用される。

一般的な蛍光分光光度計の測定方法として、まず、蛍光分光器７をある波長に固定し、励起分光器２の波長を走査して、この励起光波長走査による蛍光強度の変化を記録する。これを励起スペクトルと称する。次に蛍光分光器７の波長をある値だけ変化した位置に固定して、上記と同様に励起スペクトルを測定する。この操作を繰り返すことによって多数の蛍光波長における一組の励起スペクトル群が得られる。一方、励起分光器２をある波長に固定し、このときの励起光３によって惹起される蛍光６のスペクトルを蛍光分光器７の波長を走査して測定、記録することができる。これを蛍光スペクトルと称する。励起分光器２の固定波長を順次変化させ、それぞれの励起波長における蛍光スペクトルを測定して、一組の蛍光スペクトル群を得ることができる。上記の励起スペクトル群あるいは蛍光スペクトル群から、試料５の蛍光特性を解析することが可能となり、その組成の判断、量子収率評価、個々の成分定量時の最適励起波長と最適蛍光波長の決定などに利用される。

上述した蛍光特性の解析において、測定データの３次元表示方法がしばしば利用される。励起分光器２の固定波長を順次変化させ、それぞれの励起波長における蛍光スペクトルを測定して得られた蛍光スペクトル群を３次元的に表示した例を図４に示す。図４の（ａ）は蛍光スペクトルをそれぞれの励起波長の位置に配置して、全体を３次元的に表示する例であり、同図の（ｂ）は、（ａ）と同じデータを用いて、励起波長を縦軸に、蛍光波長を横軸にとり、蛍光強度を等高線で表すものである。（ｂ）の方法では、等高線以外に、色の濃度や色相の差によって蛍光強度を表す方法も利用される。これら３次元表示方法によって、試料５の蛍光特性を全波長領域に亘って一目で俯瞰することが可能である。

しかしながら、ある物質を測定して得られる励起スペクトルおよび蛍光スペクトルは、以下の理由によって、その物質の真の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルとは完全には一致しない。したがって、図４に示したような蛍光特性の３次元表示も、物質の真の蛍光特性を表すものではない。
測定によって得られた見かけの励起スペクトルφ_Ex（λ）は、その物質の真の励起スペクトルΦ_Ex（λ）に比例するが、同時に、光源１の強度波長特性および励起分光器２の波長透過特性に比例する。光源１の波長特性と励起分光器２の波長特性を総合した励起系の波長特性をＰ_Ex（λ）とすると、この関係は次式で表すことができる。（λは波長を示す。）

φ_Ex（λ）＝Φ_Ex（λ）×Ｐ_Ex（λ）
変形すれば、
Φ_Ex（λ）＝φ_Ex（λ）／Ｐ_Ex（λ）・・・（１）

よって、真の励起スペクトルΦ_Ex（λ）は、別途求められたＰ_Ex（λ）で見かけの励起スペクトルφ_Ex（λ）を除算してはじめて得ら
れる。
また、測定によって得られた見かけの蛍光スペクトルφ_Em（λ）は、真の蛍光スペクトルをΦ_Em（λ）とし、蛍光分光器７の波長透過特性と検出器８の波長感度特性を総合した蛍光系の波長特性をＰ_Em（λ）とすると、上記と同様の推論に従って、次の式で表される。

φ_Em（λ）＝Φ_Em（λ）×Ｐ_Em（λ）
変形すれば
Φ_Em（λ）＝φ_Em（λ）／Ｐ_Em（λ）・・・（２）

この場合も、真の蛍光スペクトルΦ_Em（λ）は、別途求められたＰ_Em（λ）よってφ_Em（λ）を除算してはじめて得られる。

上述の励起系の波長特性Ｐ_Ex（λ）と蛍光系の波長特性Ｐ_Em（λ）を求めるために、従来以下の方法が一般的に用いられている。
光源１と励起分光器２の波長特性を総合した励起系の波長特性Ｐ_Ex（λ）を求めるために、ローダミンＢ溶液を試料５として用い、ローダミンＢ溶液からの蛍光６を蛍光分光器７に入射させる。蛍光分光器７の設定波長を６４０ｎｍに固定し、励起分光器２の波長を２００ｎｍから６００ｎｍまで走査して励起スペクトルを測定する。こうして得られた見かけの励起スペクトルをφ_ExR（λ）とし、ローダミンＢ溶液の真の励起スペクトルをΦ_ExR（λ）とすると、（１）式から、

φ_ExR（λ）＝Φ_ExR（λ）×Ｐ_Ex（λ）・・・（３）

ローダミンＢの量子収率は２００ｎｍから６００ｎｍに亘ってほぼ一定であることが知られているため、真の励起スペクトルΦ_ExR（λ）はこの波長全域において均しい。便宜上この値を１と置けば、（３）式から

φ_ExR（λ）＝Ｐ_Ex・・・（４）

つまり、測定によって得られたローダミンＢ溶液の励起スペクトルは、光源１の特性と励起分光器２の波長特性を総合した励起系の波長特性Ｐ_Exに等しい。よって、φ_ExR（λ）を装置内に記憶しておき、見かけの励起スペクトルを記憶されたφ_ExR（λ）で除算することにより、真の励起スペクトルを得る。

蛍光分光器７の波長特性と検出器８の波長特性を総合した蛍光系の波長特性Ｐ_Em（λ）は以下の方法で求められる。
図３（ａ）で示すような円形の凹部を持つガラス製のパウダーホルダー１０を準備し、この凹部に硫酸バリウム粉末１１を充填し、カバーグラス１２で覆い、図３（ｂ）のように垂直に装置の試料室４内に設置し、励起光３が硫酸バリウム粉末１１の表面に４５度の角度で入射し、反射光１３が蛍光分光器７に入射するように配置する。この状態で、励起分光器２および蛍光分光器７を、両者の波長を互いに等しく保ちながら、２００ｎｍから６００ｎｍの波長範囲を同時に波長走査して同期スペクトルを求める。この同期スペクトルをφ_Sync（λ）とし、硫酸バリウム粉末１１の反射波長特性をφ_Ba（λ）とすると、φ_Sync（λ）は次式で表すことができる。

φ_Sync（λ）＝Ｐ_Ex（λ）×φ_Ba（λ）×Ｐ_Em（λ）・・・（５）

硫酸バリウムの反射特性は広い波長範囲でほぼ一定であるため、φ_Ba（λ）は便宜的に１とみなすことができる。また、式（４）を用いて式（５）を変形すると次式を得る。

Ｐ_Em（λ）＝φ_Sync（λ）／φ_ExR（λ）・・・（６）

つまり、蛍光分光器７の波長特性と検出器８の波長特性を総合した蛍光系の波長特性Ｐ_Em（λ）は、測定によって得られた同期スペクトルφ_Sync（λ）を、やはり測定によって得られたローダミンＢ溶液の励起スペクトルφ_ExR（λ）で除算して求めることができる。また、式（６）を用いて式（２）を変形すると、次式を得る

Φ_Em（λ）＝φ_Em（λ）×φ_ExR（λ）／φ_Sync（λ）・・・（７）

測定で得られたφ_ExR（λ）とφ_Sync（λ）を記憶しておき、見かけの蛍光スペクトルφ_Em（λ）に（７）式の計算を行って、真の蛍光スペクトルΦ_Em（λ）を求めることができる。

なお、蛍光分光光度計における励起スペクトル補正方法に関する先行技術分権情報を調査したが発見されなかった。

従来技術では、上述した方法で見かけの励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルを補正して、真の励起スペクトルあるいは蛍光スペクトルを求めているが、これには以下のような問題点がある。
従来法において標準物質として使用されるローダミンＢは、２００ｎｍから６００ｎｍの範囲において均一の量子収率を示すが、それ以外の波長においては量子収率は変動する。したがって、ローダミンＢを用いて励起スペクトルを補正することのできる波長範囲は２００ｎｍから６００ｎｍの間に限定される。６００ｎｍ以上の波長領域で均一の量子収率をもつ適当な物質が無いため、従来法を広い波長範囲を持つ蛍光分光光度計に適用することができない。また、従来法において蛍光分光器の波長特性と検出器の波長特性を求めるために必要な、励起分光器と蛍光分光器の同時波長走査による同期スペクトル測定は、励起分光器の波長可変範囲が蛍光分光器の波長可変範囲と同一か、あるいは前者が後者を包含している場合にのみ可能であり、両者の波長範囲が互いに一致しない場合には、この方法を使用することができない。

本発明は、上記の問題点を解決し、広い波長範囲に適用できると共に、励起分光器と蛍光分光器の波長可変範囲が互いに大きく異なる蛍光分光光度計にも適用可能なスペクトル補正方法を提供するものであり、励起分光器の波長可変範囲を包含する波長可変範囲を有する分光器と該分光器の出力を検出する検出器と該分光器に入射光を導入する手段とによって構成される分光モニターに、既知の波長強度特性を有する標準光源の出力光を導入し、前記分光モニターの波長を走査して得られる第１のスペクトルを測定する工程と、前記蛍光分光光度計の励起分光器の出力光を前記分光モニターに導入し、前記励起分光器の波長と前記分光モニターの分光器の波長を互いに等しく保ちながら、同時に波長走査して得られる第２のスペクトルを測定する工程と、前記標準光源の出力光を前記蛍光分光光度計の蛍光分光器に導入し、前記蛍光分光器の波長を走査して得られる第３のスペクトルを測定する工程と、前記第１、第２、第３のスペクトルと前記標準光源の既知の波長強度特性を用いて前記蛍光分光光度計の励起系の波長特性および前記蛍光分光光度計の蛍光系の波長特性を計算によって求める工程と、前記励起系の波長特性および前記蛍光系の波長特性を用いて励起スペクトルおよび蛍光スペクトルの補正を行う工程からなることを特徴とする。

本発明にかかる蛍光分光光度計のスペクトル補正方法は、適用可能な波長範囲が広く、下記実施例に示すタングステン標準ランプを用いる場合には３００ｎｍから１６００ｎｍまで適用することが可能である。また、従来法では不可能な、互いに波長可変範囲の異なる励起分光器と蛍光分光器を持つ蛍光分光光度計にも適用できる。このため、励起分光器の波長可変範囲が３００ｎｍ〜１０００ｎｍ、蛍光分光器の波長可変範囲が９００ｎｍ〜１６００ｎｍであるような近赤外領域用蛍光分光光度計に対して極めて有用である。

本発明にかかる蛍光分光光度計のスペクトル補正方法は、従来のローダミンＢを用いる方法では不可能なより広い波長範囲に適用でき、更に、蛍光分光光度計の励起分光器と蛍光分光器の波長可変範囲が互いに大きく異なる場合にも適用できる特徴を有する。このため、補正に使用される装置は、広い波長範囲に亘って光強度を持つタングステン標準ランプと、３００ｎｍ〜１０００ｎｍを含む波長可変範囲を持つ分光モニターで構成される。また、その補正手順は、まずタングステン標準ランプを用いて分光モニターの波長特性を求め、次の励起分光器と分光モニターを同期させて波長走査して、励起系の波長特性を求め、最後にタングステン標準ランプで蛍光系の波長特性を求める構成になっている。

以下に本発明の蛍光分光光度計のスペクトル補正方法の１実施例を、図１を用いて説明する。図１は、図２に示したものと同形の蛍光分光光度計Ａに、分光器１５と検出器１６光ファイバー１４で構成された分光モニターＢ、および標準光源として、波長強度特性が知られているタングステン標準ランプＣを設置した例を示す。本実施例においては、蛍光分光光度計Ａの励起分光器２の波長可変範囲は３００ｎｍ〜１０００ｎｍ、蛍光分光器７の波長可変範囲は９００ｎｍ〜１６００ｎｍである。また、分光モニターＢの分光器１５の波長可変範囲は３００ｎｍ〜１０００ｎｍを包含する。分光モニターＢに光を導入する光ファイバー１４は蛍光分光光度計Ａの試料室４内に挿入されて、実線で示したタングステン標準ランプＣの光を受光する位置と、破線で示した励起分光器２の出射光を受光する位置のいずれかとることができる。更に、分光モニターＢの検出器１６の出力は蛍光分光光度計Ａの測光・制御部９に接続されている。

まず、光ファイバー１４を実線の位置に設置し、タングステン標準ランプＣの光を分光器１５に導入する。この状態で分光器１５の波長を３００ｎｍから１０００ｎｍまで走査して、得られたタングステン標準ランプＣの見かけのスペクトルφ_W1（λ）を測光・制御部９に記憶する。タングステン標準ランプＣの真の波長強度特性をΦ_W1（λ）とし、光ファイバー１４の波長透過特性と分光器１５の波長透過特性と検出器１６の波長感度特性とを総合した分光モニターＢ全体の波長特性をＰ_Mon（λ）とすると、見かけのスペクトルφ_W1（λ）は次式で表すことができる。

φ_W1（λ）＝Φ_W1（λ）×Ｐ_W1（λ）・・・（８）

次に、光ファイバー１４を破線の位置に配置し、励起分光器２の出射光を分光器１５に導入する。この状態で、励起分光器２の波長と分光器１５の波長を互いに等しく保ちながら、３００ｎｍから１０００ｎｍまで励起分光器２と分光器１５同時に走査して、得られるスペクトルφ_Sync（λ）を測光・制御部９に記憶する。
光源１の波長特性と励起分光器２の波長特性を総合した励起系の波長特性をＰ_Ex（λ）とすると、φ_Sync（λ）は（９）式で表される。

φ_Sync（λ）＝Ｐ_Ex（λ）×Ｐ_Mon（λ）・・・（９）

次に、図１の分光モニターＢの光ファイバー１４を試料室４から除去し、タングステン標準ランプＣの光を蛍光分光器７に導入する。この状態で、蛍光分光器７の波長を９００ｎｍから１６００ｎｍまで走査し、得られるスペクトルφ_W1’（λ）を記憶する。蛍光分光器７の波長特性と検出器８の波長特性を総合した蛍光系の波長特性をＰ_Em（λ）とするとφ_W1’（λ）は、次式で表される。

φ_W1’（λ）＝Φ_W1（λ）×Ｐ_Em（λ）・・・（１０）

式（８）および（９）から次の関係式を得る。

Ｐ_Ex（λ）＝φ_Sync（λ）×Φ_W1（λ）／φ_W1（λ）・・・（１１）

また、式（１０）より

Ｐ_Ex（λ）＝φ_W1’（λ）／Φ_W1（λ）・・・（１２）

式（１１）および（１２）の右辺において、φ_Sync（λ）は同期スペクトルとして、また、φ_W1（λ）およびφ_W1’（λ）はタングステン標準ランプＣの見かけのスペクトルとして共に測定され記憶されており、Φ_W1（λ）はタングステン標準ランプＣの真の波長強度特性として既知である。蛍光分光光度計Ａの測光・制御部９は式（１１）および（１２）の右辺を計算することにより、光源１の波長特性と励起分光器２の波長特性を総合した励起系の波長特性Ｐ_Ex（λ）、および蛍光分光器７の波長特性と検出器８の波長特性を総合した蛍光系の波長特性をＰ_Em（λ）を求め、記憶する。

従来法の記述において示した式（１）および式（２）は、本実施例においても成立している。測光・制御部９において、式（１１）および（１２）で求めたＰ_Ex（λ）およびＰ_Em（λ）を用いて、式（１）および式（２）に従い、測定された見かけの励起スペクトルφ_Ex（λ）および見かけの蛍光スペクトルφ_Em（λ）を補正して、真の励起スペクトルΦ_Ex（λ）および蛍光スペクトルΦ_Em（λ）を得る。

本実施例のスペクトル補正方法をスペクトルの３次元表示に適用する例を図５に示す。３００ｎｍから１０００ｎｍの間のｎ個の励起波長における見かけの蛍光スペクトルを蛍光波長９００ｎｍから１６００ｎｍに亘って測定し、蛍光スペクトルのグループφ_Em1（λ）、φ_Em2（λ）、…φ_Emn（λ）を得る。次にこれらの蛍光スペクトルのそれぞれを（１２）式で求めた蛍光系の波長特性Ｐ_Em（λ）で除算して、補正された蛍光スペクトルのグループΦ_Em1（λ）、Φ_Em2（λ）、…Φ_Emn（λ）を得る。図５に示すように、これらの補正された励起スペクトルを蛍光波長軸に平行にそれぞれの励起波長の位置に３次元的にプロットする。次に、図５に示すように、ある蛍光波長λｅｍにおける前記のｎ個の補正された蛍光スペクトル１７上のポイントを結ぶ曲線を想定し励起波長の数ｎを十分多数とれば、この曲線は、蛍光波長をλｅｍに設定した場合の未補正の励起スペクトル１８φ_Ex（λ）を構成するとみなすことができる。よって、このφ_Ex（λ）を（１１）式で求めた励起系の波長特性Ｐ_Ex（λ）によって除算すれば、蛍光波長λｅｍにおける真の励起スペクトルΦ_Ex（λ）が得られる。この計算を全ての蛍光波長について実行し、得られる多数の励起スペクトルΦ_Ex（λ）をプロットすることのより、励起波長、蛍光波長の全域に亘る真の蛍光特性を得る。この方法によって実際に得られた３次元表示スペクトルを図６に示す。同図（ａ）は俯瞰的な３次元表示を、また、同図（ｂ）は色の濃度による３次元表示を示している。この方法により、従来法では困難であった、励起波長範囲と蛍光波長範囲が互いに異なる近赤外蛍光分光光度計における蛍光特性の３次元表示が可能となる。
本実施例のスペクトル補正方法において、分光モニターＢとして必ずしも専用のシステムを製作する必要はなく、たとえば一般の紫外・可視・近赤外領域に用いられる吸光分光光度計の分光器と検出器を流用することも可能である。また本発明の蛍光分光光度計Ａの補正方法は、上記ならびに図示された例に限定されるものではなく、種々の変形例を含む。たとえば、使用される標準光源はタングステン標準ランプＣだけではなく、予め波長強度特性が値付けされたものであれば、利用可能である。また、分光モニターＢへの光導入手段も、光ファイバー１４に限定されるものではなく。ミラーやレンズを用いた光学系を利用することも可能である。

本発明は蛍光分光光度計、特に近赤外蛍光分光光度計のスペクトル補正方法に関する。

本発明にかかる蛍光分光光度計のスペクトル補正方法の概念図である。 蛍光分光光度計の一般的な構成を示す図である。 従来のスペクトル補正方法に使用される硫酸バリウム粉末の保持方法を示す図である。 蛍光特性の３次元表示の模式図である。 本発明のスペクトル補正方法の３次元表示への適用方法を示す模式図である。 本発明のスペクトル補正方法の３次元表示への実施例を示す写真である。

符号の説明

１ 光源
２ 励起分光器
３ 励起光
４ 試料室
５ 試料
６ 蛍光
７ 蛍光分光器
８ 検出器
９ 測光・制御部
１０ パウダーホルダー
１１ 硫酸バリウム粉末
１２ カバーグラス
１３ 反射光
１４ 光ファイバー
１５ 分光器
１６ 検出器
１７ ｎ個の補正された蛍光スペクトル
１８ 未補正の励起スペクトル
Ａ 蛍光分光光度計
Ｂ 分光モニター
Ｃ タングステン標準ランプ

Claims (1)

1. 蛍光分光光度計の励起分光器の波長可変範囲を包含する波長可変範囲を有する分光器と該分光器の出力を検出する検出器と該分光器に入射光を導入する手段とによって構成される分光モニターに、既知の波長強度特性を有する標準光源の出力光を導入し、前記分光モニターの波長を走査して得られる第１のスペクトルを測定する工程と、前記蛍光分光光度計の励起分光器の出力光を前記分光モニターに導入し、前記励起分光器の波長と前記分光モニターの分光器の波長を互いに等しく保ちながら、同時に波長走査して得られる第２のスペクトルを測定する工程と、前記標準光源の出力光を前記蛍光分光光度計の蛍光分光器に導入し、前記蛍光分光器の波長を走査して得られる第３のスペクトルを測定する工程と、前記第１、第２、第３のスペクトルと前記標準光源の既知の波長強度特性を用いて前記蛍光分光光度計の光源と励起分光器の波長特性を総合した励起系の波長強度特性および前記蛍光分光光度計の蛍光分光器と検出器の波長特性を総合した蛍光系の波長強度特性を計算によって求める工程と、前記励起系の波長強度特性および蛍光系の波長強度特性を用いて測定によって得られた励起スペクトルおよび測定によって得られた蛍光スペクトルの補正を行う工程からなることを特徴とする蛍光分光光度計のスペクトル補正方法。