JP2006300632A - 蛍光分光光度計における励起スペクトル補正方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】蛍光分光光度計Aの励起分光器2の波長範囲を包含する波長範囲を有する分光器15を中心に構成した分光モニターBと、波長強度特性が既知のタングステン標準ランプCを用いて、まずタングステン標準ランプCのスペクトルで分光モニターBの波長特性を求め、次に、励起分光器2からの光を分光モニターBで測定しながら、両者を同期スキャンし、得られたスペクトルを用いて、励起系の波長特性を求める。最後に、タングステン標準ランプCのスペクトルを蛍光分光器7で測定することにより、蛍光系の波長特性を求める。
【選択図】 図1
Description
測定によって得られた見かけの励起スペクトルφEx(λ)は、その物質の真の励起スペクトルΦEx(λ)に比例するが、同時に、光源1の強度波長特性および励起分光器2の波長透過特性に比例する。光源1の波長特性と励起分光器2の波長特性を総合した励起系の波長特性をPEx(λ)とすると、この関係は次式で表すことができる。(λは波長を示す。)
φEx(λ)=ΦEx(λ)×PEx(λ)
変形すれば、
ΦEx(λ)=φEx(λ)/PEx(λ)・・・(1)
よって、真の励起スペクトルΦEx(λ)は、別途求められたPEx(λ)で見かけの励起スペクトルφEx(λ)を除算してはじめて得ら
れる。
また、測定によって得られた見かけの蛍光スペクトルφEm(λ)は、真の蛍光スペクトルをΦEm(λ)とし、蛍光分光器7の波長透過特性と検出器8の波長感度特性を総合した蛍光系の波長特性をPEm(λ)とすると、上記と同様の推論に従って、次の式で表される。
φEm(λ)=ΦEm(λ)×PEm(λ)
変形すれば
ΦEm(λ)=φEm(λ)/PEm(λ)・・・(2)
この場合も、真の蛍光スペクトルΦEm(λ)は、別途求められたPEm(λ)よってφEm(λ)を除算してはじめて得られる。
光源1と励起分光器2の波長特性を総合した励起系の波長特性PEx(λ)を求めるために、ローダミンB溶液を試料5として用い、ローダミンB溶液からの蛍光6を蛍光分光器7に入射させる。蛍光分光器7の設定波長を640nmに固定し、励起分光器2の波長を200nmから600nmまで走査して励起スペクトルを測定する。こうして得られた見かけの励起スペクトルをφExR(λ)とし、ローダミンB溶液の真の励起スペクトルをΦExR(λ)とすると、(1)式から、
φExR(λ)=ΦExR(λ)×PEx(λ)・・・(3)
ローダミンBの量子収率は200nmから600nmに亘ってほぼ一定であることが知られているため、真の励起スペクトルΦExR(λ)はこの波長全域において均しい。便宜上この値を1と置けば、(3)式から
φExR(λ)=PEx・・・(4)
つまり、測定によって得られたローダミンB溶液の励起スペクトルは、光源1の特性と励起分光器2の波長特性を総合した励起系の波長特性PExに等しい。よって、φExR(λ)を装置内に記憶しておき、見かけの励起スペクトルを記憶されたφExR(λ)で除算することにより、真の励起スペクトルを得る。
図3(a)で示すような円形の凹部を持つガラス製のパウダーホルダー10を準備し、この凹部に硫酸バリウム粉末11を充填し、カバーグラス12で覆い、図3(b)のように垂直に装置の試料室4内に設置し、励起光3が硫酸バリウム粉末11の表面に45度の角度で入射し、反射光13が蛍光分光器7に入射するように配置する。この状態で、励起分光器2および蛍光分光器7を、両者の波長を互いに等しく保ちながら、200nmから600nmの波長範囲を同時に波長走査して同期スペクトルを求める。この同期スペクトルをφSync(λ)とし、硫酸バリウム粉末11の反射波長特性をφBa(λ)とすると、φSync(λ)は次式で表すことができる。
φSync(λ)=PEx(λ)×φBa(λ)×PEm(λ)・・・(5)
硫酸バリウムの反射特性は広い波長範囲でほぼ一定であるため、φBa(λ)は便宜的に1とみなすことができる。また、式(4)を用いて式(5)を変形すると次式を得る。
PEm(λ)=φSync(λ)/φExR(λ)・・・(6)
つまり、蛍光分光器7の波長特性と検出器8の波長特性を総合した蛍光系の波長特性PEm(λ)は、測定によって得られた同期スペクトルφSync(λ)を、やはり測定によって得られたローダミンB溶液の励起スペクトルφExR(λ)で除算して求めることができる。また、式(6)を用いて式(2)を変形すると、次式を得る
ΦEm(λ)=φEm(λ)×φExR(λ)/φSync(λ)・・・(7)
測定で得られたφExR(λ)とφSync(λ)を記憶しておき、見かけの蛍光スペクトルφEm(λ)に(7)式の計算を行って、真の蛍光スペクトルΦEm(λ)を求めることができる。
従来法において標準物質として使用されるローダミンBは、200nmから600nmの範囲において均一の量子収率を示すが、それ以外の波長においては量子収率は変動する。したがって、ローダミンBを用いて励起スペクトルを補正することのできる波長範囲は200nmから600nmの間に限定される。600nm以上の波長領域で均一の量子収率をもつ適当な物質が無いため、従来法を広い波長範囲を持つ蛍光分光光度計に適用することができない。また、従来法において蛍光分光器の波長特性と検出器の波長特性を求めるために必要な、励起分光器と蛍光分光器の同時波長走査による同期スペクトル測定は、励起分光器の波長可変範囲が蛍光分光器の波長可変範囲と同一か、あるいは前者が後者を包含している場合にのみ可能であり、両者の波長範囲が互いに一致しない場合には、この方法を使用することができない。
φW1(λ)=ΦW1(λ)×PW1(λ)・・・(8)
次に、光ファイバー14を破線の位置に配置し、励起分光器2の出射光を分光器15に導入する。この状態で、励起分光器2の波長と分光器15の波長を互いに等しく保ちながら、300nmから1000nmまで励起分光器2と分光器15同時に走査して、得られるスペクトルφSync(λ)を測光・制御部9に記憶する。
光源1の波長特性と励起分光器2の波長特性を総合した励起系の波長特性をPEx(λ)とすると、φSync(λ)は(9)式で表される。
φSync(λ)=PEx(λ)×PMon(λ)・・・(9)
次に、図1の分光モニターBの光ファイバー14を試料室4から除去し、タングステン標準ランプCの光を蛍光分光器7に導入する。この状態で、蛍光分光器7の波長を900nmから1600nmまで走査し、得られるスペクトルφW1’(λ)を記憶する。蛍光分光器7の波長特性と検出器8の波長特性を総合した蛍光系の波長特性をPEm(λ)とするとφW1’(λ)は、次式で表される。
φW1’(λ)=ΦW1(λ)×PEm(λ)・・・(10)
PEx(λ)=φSync(λ)×ΦW1(λ)/φW1(λ)・・・(11)
また、式(10)より
PEx(λ)=φW1’(λ)/ΦW1(λ)・・・(12)
式(11)および(12)の右辺において、φSync(λ)は同期スペクトルとして、また、φW1(λ)およびφW1’(λ)はタングステン標準ランプCの見かけのスペクトルとして共に測定され記憶されており、ΦW1(λ)はタングステン標準ランプCの真の波長強度特性として既知である。蛍光分光光度計Aの測光・制御部9は式(11)および(12)の右辺を計算することにより、光源1の波長特性と励起分光器2の波長特性を総合した励起系の波長特性PEx(λ)、および蛍光分光器7の波長特性と検出器8の波長特性を総合した蛍光系の波長特性をPEm(λ)を求め、記憶する。
本実施例のスペクトル補正方法において、分光モニターBとして必ずしも専用のシステムを製作する必要はなく、たとえば一般の紫外・可視・近赤外領域に用いられる吸光分光光度計の分光器と検出器を流用することも可能である。また本発明の蛍光分光光度計Aの補正方法は、上記ならびに図示された例に限定されるものではなく、種々の変形例を含む。たとえば、使用される標準光源はタングステン標準ランプCだけではなく、予め波長強度特性が値付けされたものであれば、利用可能である。また、分光モニターBへの光導入手段も、光ファイバー14に限定されるものではなく。ミラーやレンズを用いた光学系を利用することも可能である。
2 励起分光器
3 励起光
4 試料室
5 試料
6 蛍光
7 蛍光分光器
8 検出器
9 測光・制御部
10 パウダーホルダー
11 硫酸バリウム粉末
12 カバーグラス
13 反射光
14 光ファイバー
15 分光器
16 検出器
17 n個の補正された蛍光スペクトル
18 未補正の励起スペクトル
A 蛍光分光光度計
B 分光モニター
C タングステン標準ランプ
Claims (1)
- 蛍光分光光度計の励起分光器の波長可変範囲を包含する波長可変範囲を有する分光器と該分光器の出力を検出する検出器と該分光器に入射光を導入する手段とによって構成される分光モニターに、既知の波長強度特性を有する標準光源の出力光を導入し、前記分光モニターの波長を走査して得られる第1のスペクトルを測定する工程と、前記蛍光分光光度計の励起分光器の出力光を前記分光モニターに導入し、前記励起分光器の波長と前記分光モニターの分光器の波長を互いに等しく保ちながら、同時に波長走査して得られる第2のスペクトルを測定する工程と、前記標準光源の出力光を前記蛍光分光光度計の蛍光分光器に導入し、前記蛍光分光器の波長を走査して得られる第3のスペクトルを測定する工程と、前記第1、第2、第3のスペクトルと前記標準光源の既知の波長強度特性を用いて前記蛍光分光光度計の励起系の波長特性および前記蛍光分光光度計の蛍光系の波長特性を計算によって求める工程と、前記励起系の波長特性および蛍光系の波長特性を用いて励起スペクトルおよび蛍光スペクトルの補正を行う工程からなることを特徴とする蛍光分光光度計のスペクトル補正方法。
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- 2005-04-19 JP JP2005120799A patent/JP4710393B2/ja active Active
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