CN103649726B - 用于荧光和吸收率分析的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于分析样品的系统或方法，包括一个输入光源、一个被定位成用于从该输入光源接收光并用多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品的双减色单色仪、一个被定位成用于接收并基本同时检测该样品对该多个激发波长中的每一个激发波长发射的多个光波长的多通道荧光检测器、一个被定位成用于接收并检测穿过该样品的光的吸收检测器、以及一个与该单色仪、该荧光检测器及该吸收检测器通信的计算机，该计算机控制该单色仪用该多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品，同时基于从该荧光和吸收检测器接收到的多个信号测量该样品的吸收和荧光。

Description

用于荧光和吸收率分析的系统和方法
技术领域
本披露总体上涉及使用荧光和吸收率测量进行样品的定量和/或定性分析。
背景技术
光谱分析(包括吸收光谱和荧光光谱)可以用来识别和测量或定量在样品内出现的不同类型的悬浮的和溶解的有机和/或无机物质或化合物。这些类型的分析具有在化学、食品学科、生物学、药理学、材料/纳米技术中的广泛应用，及在例如不同环境、地质学、水文学、海洋学/湖泊学、及土壤学应用中的水质分析。分光光度测量可以用于对包括生色团(吸收具有波长分别大约例如700-200nm之间的可见紫外光(VIS-UV)范围内的光)的化合物进行检测和定量。所吸收的光能的量总体上随着化合物的浓度和行进通过该化合物的距离而变化。同样地，可以基于与有色或发色物质相关联的特征性荧光对一些化合物进行识别和定量，即，较短波长的激发光能量的吸收和较长波长(及较低能量)发射光能量的重发射。
吸收和荧光光谱已经用于水质分析应用以识别和测量有色或发色溶解的有机物质(CDOM)，该有机物质可以包括多种化合物，例如腐殖和灰黄霉酸、叶绿素、蛋白质和氨基酸、核酸、污水、细菌、化肥、农药等。一种现有技术策略是用相应的仪器执行单独的荧光和吸收率测量。可以使用不同的可商购软件应用对产生的数据进行关联和/或校正。然而，单独测量要求转换该样品和数据以便进行期望的分析和荧光光谱校正。另外，使用具有单通道检测器(通常，光电倍增管(PMT))的扫描激发和发射单色仪的荧光计通常具有30-90分钟或更长的扫描时间，并且有可能不能准确地检测和定量会随着时间和/或暴露在激发光中而降级的不稳定的化合物。类似地，使用这种长时间扫描所获得的结果的准确性可能受到溶解的气体、PH、聚合、沉淀、及其他化学过程中的基于时间的变化的不利影响。长时间扫描结合相对有限的拉曼(Raman)信噪比可能导致协调的吸收率和荧光读数的不确定性和统计不准确度。
为了处理上述一些问题，开发了多种可商购的荧光仪器以便于荧光和吸收率的并行读数。然而，即使这种方法也不提供用于荧光和吸收率重校正的近乎同时的吸收率和发射数据收集。另外，通用仪器可以具有不同折中设计以使吸收率和荧光测量值都得到调节。
发明概述
一种用于分析样品的系统或方法，包括一个输入光源、一个被定位成用于从该输入光源接收光并用多个波长中的每一个波长循序地该样品的双减色单色仪、一个被定位成用于接收并检测该样品对该多个激发波长中的每一个激发波长发射的多个光波长的多通道荧光检测器、一个被定位成用于接收并检测穿过该样品的光的吸收检测器、以及一个与该单色仪、该荧光检测器及该吸收检测器通信的计算机，该计算机控制该单色仪用该多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品，同时基于从该荧光和吸收检测器接收到的多个信号测量该样品的吸收和荧光。
根据本披露的不同实施例包括一种用于分析样品的方法，该方法包括：以来自一个双减色单色仪的多个激发波长照亮该样品，通过检测穿过该样品的光测量该样品的吸收率并通过使用一个多通道检测器检测该样品对各激发波长发射的光的一个发射光谱测量该样品的荧光，以及用该吸收率测量值校正该荧光测量值。该方法还还可以包括：基于一个参考检测器检测到的光强度调整这些吸收率和荧光测量值中的至少一个，该参考检测器被定位成用于从该单色仪接收一部分光。
在一个实施例中，一种用于分析水样品的系统包括一个单色激发源，该激发源具有的输入由一个UV增强的氙灯实施。来自此灯的光穿过一个双光栅单色仪，该双光栅单色仪具有两个凹面全息光栅，这两个全息光栅安排在一个减色配置中以提供趋近零的色散并减少未选择波长的杂散光，同时保持准确的波长追踪。灯输出可以用一个参考二极管以激发扫描的各个波长增量来测量/监控，并可以用于对这些吸收和/或荧光测量值进行校正或归一化。转向荧光测量的激发光束使用多个快速光学器件，这些光学器件具有一个为增加的通量选择的数值孔径。可以包括一个光电二极管、二极管阵列、或光谱仪，以基于来自穿过该样品和一个孔径的该激发光束的基本准直的光提供吸收测量，其中，这些吸收率检测器光学器件具有的F/数小于这些激发光学器件，即在一个实施例中，该激发光学器件的特征可以在于大约为F/3的F/数，而这些吸收率检测器光学器件的特征可以在于大约为F/11的F/数。与这些较慢的光学器件相关联的准直的光会增强吸收率读数的准确性和线性度。与该样品的荧光或发光相关联的光由被定位成与该激发光束总体上垂直的关联快速光学器件引导到一个光谱仪，该光谱仪具有一个冷却的多通道检测器(例如CCD检测器)以便于用低暗噪声进行快速光谱收集。与该荧光检测器光学器件相关联的F/数可以小于该吸收率检测器光学器件。在一个实施例中，该荧光检测器光学器件的F/数大约为F/3。计算机和/或控制器可以收集一个完整的发射光谱，该光谱由该参考光电二极管所测量的激发光束强度归一化，其中，基于来自该单个/公共照明源的光的相应吸收数据透射过该样品。
根据本披露不同实施例的系统和方法除上述的优点之外还提供了多种优点。例如，根据本披露的多种实施例促进了以期望的速度、准确度、和精确度对水样品中溶解的和/或悬浮的有机和无机物质进行定性和定量分析。根据本披露的多种仪器和方法快速并同时获取仪器校正过的荧光激发发射光谱图(EEM)和吸收率光谱。不同实施例可以包括一个专用协同获取和分析软件包以促进吸收率和荧光测量分析。单个仪器中的吸收率和荧光数据的获取会减少或消除由不同仪器进行的测量之间与样品中的时间相关的光学和化学改变相关联的不精确相关性。此外，除了提供大量关于溶解和悬浮有机和无机化合物的独立数据之外，可以用基本同时地获得的吸收率数据对荧光光谱信息进行相关和校正。由根据本披露的实施例提供的激发和发射光束的自动过滤消除了光栅级衍射。
不同实施例除了透射光谱图之外还可以用来生成荧光激发波长、发射波长、和强度光谱的完全校正的三维光谱。可以通过对比相应空位和未知样品、以及应用荧光EEM和透射光谱之间的随后处理来操作实施例，以便提供校正的EEM和吸收率/透射比光谱信息。可以用多种已知技术来进一步分析EEM数据，包括例如多种类型的多元分析、主分量分析、并行因数分析、和/或双卷积积分法，以识别和/或量化与吸收/荧光测量相关联的样品成分。
不同的设计策略(例如用一个多通道检测器和较慢光学器件将快速光学器件用于进行荧光测量以便为例如单通道吸收检测器提供准直光和从较长到较短波长的激发扫描)减少了消除对样品材料的光感应变化或损害需要的测量时间以提高定量分析。类似地，单独光谱组件的识别促进了多元分析技术的光谱库使用。在相同仪器中使用公共激发源进行吸收和荧光测量促进了内部过滤效应的荧光光谱校正。
本披露的以上优点及其他优点和特征将从以下优选实施例联系附图的详细说明中非常明显。
附图简要说明
图1是一个简化的框图，展示了根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法中的核心元件的功能关系；
图2是一个简化的框图，展示了根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法中的控制和数据信号的功能通信；
图3是一个示意图，展示了根据本披露的一个实施例的一种用于分析样品的系统或方法的操作；
图4是图1中展示的实施例的透视图；
图5是用于根据本披露的多种实施例的一种用于分析样品的系统或方法的减色双单色仪的透视图；
图6是一个示意图，展示了根据本披露的另一实施例的一种用于分析样品的系统或方法的操作；
图7是一个示意图，展示了根据本披露的多种实施例的一种使用用相应的吸收率检测器照亮样品和空位的双光束安排来分析样品的系统或方法的操作；
图8是一个示意图，展示了根据本披露的多种实施例的一种使用用单吸收率检测器和关联斩波器来照亮样品和空位的双光束安排分析样品的系统或方法的操作；
图9是一个示意图，展示了根据本披露的多种实施例的一种使用在吸收路径中的直接照明和用于吸收率检测的光谱仪来分析样品的系统或方法的操作；
图10展示了根据本披露的多种实施例的一种用于分析样品的系统或方法的代表性吸收率测量；
图11A和图11B展示了在根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法中获得代表性吸收率和荧光测量的可选操作模式；以及
图12是一个流程图，展示了根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法的操作。
详细说明
对根据本披露的系统和方法的各种代表性实施例做了详细介绍。然而，应当理解为，这些代表性实施例仅作是示例性的，且可以用各种可替代的形式体现根据本披露的系统和方法。附图不一定按比例，且一些特征可以被放大或最小化从而示出特定组件的细节。因此，在此披露的特定结构和功能细节不应被解释为限制性的，而是仅仅为用于传授本领域的普通技术人员多方面地使用本发明的一个代表性基础。
本领域普通技术人员将理解的是，如参照这些图中的任何一个展示和说明的，本披露的不同特征可以结合其他一个或多个图中展示的特征以产生本披露未明确展示或说明的实施例。所展示的特征的组合为典型应用提供了多个代表性实施例。然而，对于具体应用和实施，可能期望这些特征与本披露的教导一致的各种组合和修改。
在图1中示出了一个简化的框图，展示了一种用于分析样品的系统或方法的不同组件之间的功能关系。系统20包括一个输入光源22，该光源提供一个波长在例如约240-2500nm之间的一个广谱输入光。在一个实施例中，输入光源22由一个150W的UV增强的无臭氧氙弧灯实施。当然，输入光源的选择通常会随着应用和实现方式而变化。输入光源22可以包括多个关联光学器件以将光总体地引导到一个激发单色仪24的输入以提高系统能量效率。在根据本披露的不同实施例中，激发单色仪24由一个双减色单色仪实施。根据本披露将一个双减色单色仪作为激发源使用，提供了趋近于零的色散，增强了波长追踪准确度，并减少了未选择波长的杂散光以增加相对于不同现有技术策略的仪器灵敏度。双减色单色仪24被定位成用于从输入光源22接收光，并用多个波长中的每一个波长循序地照亮样品和/或空位28。本领域普通技术人员已知的是，可以控制单色仪(比如单色仪24)从一个广谱输入光源22选择一个窄波长带，以提供一个窄带或基本单色的输出。例如，在一个实施例中，一个双减色单色仪24提供了一个选定波长大约为5nm的激发带通或带宽，并被控制以指定增量(比如1nm)从开始波长约1100nm到结束波长约220nm进行扫描。由于UV辐射的吸收可能将样品内的CDOM“漂白”，降低其光密度和吸收容量，令人期望的是限制为暴露于从杂散光或持久的测量周期的较短波长光。为减少样品内的漂白或光感应反应，可以根据本披露的不同实施例从较长波长到较短波长进行激发扫描。
在一个实施例中，用一个由硅光电二极管实施的参考检测器26测量/监测来自源22的灯输出。在单色仪24的激发扫描的各波长增量处的测量可用于校正或归一化吸收率或吸收检测器30和多通道荧光检测器32的吸收和/或荧光测量值。如这些图中所示，使用关联光学器件34将从单色仪24射出的激发光引导通过样品和/或空位28，这些光学器件的特征可以在于通常由F/N1表示的一个关联数值孔径或F/数。总体上直接通过样品和/或空位28的光被至少一个光学元件38引导到一个吸收率或吸收检测器30，该光学元件的特征可以在于通常由F/N2表示的一个数值孔径或F/数。总体上与来自单色仪24的激发光成直角或垂直发射的光被一个关联光学器件36引导到一个多通道荧光检测器32，该光学器件的特征可以在于与通常由F/N3表示的光学器件34相似或相同的一个关联数值孔径或F/数。在不同的实施例中，快速光学器件用于将光引导到样品/空位28和荧光检测器32，其中，较慢光学器件用于为吸收率检测器30提供基本准直的光，这样使得N2大于N1。例如，在一个实施例中，光学器件34、36是特征在于F/数为F/3的快速光学元件，并被定位成用于将光从单色仪24和样品28以高通量引导到荧光检测器32，同时光学器件38包括至少一个光学元件以将光从样品/空位28进行引导并将一个基本准直的光束提供给特征在于F/数为F/11的吸收检测器30。这样，在此实施例中，N1＝N3<N2。然而，如本文中更加详细说明的，不同实施例的F数可以是N2>N1和N1>＝N3。总体上，选择并定位多个光学组件以提供特征在于F/数大于(或慢于)激发光学器件的F/数的吸收率光学器件会提高吸收率检测的线性度和准确性。同样，选择并定位多个光学组件以提供特征在于F/数大于荧光光学器件的F/数的吸收率光学器件会提供敏感度更强的荧光检测(其中，荧光信号的通量更高)。
多通道荧光检测器32被定位成用于接收并检测由样品和/或空位28对单色仪24所选的多个激发波长(或波长带)中的每一个激发波长发射的多个波长。使用多通道检测器32同时检测光的多个波长会减少数据收集时间(否则该数据收集时间会与单通道扫描检测器的使用相关联)。扫描时间的减少还会减少暴露到激发波长的时间(否则会导致样品的光感应变化)。当然，可以根据具体应用和实现方式使用单通道扫描检测器。
如还在图1中展示的，参考检测器26、吸收率检测器30、和荧光检测器32可以在关联数据通道上为图2中所展示的一个或多个计算机和处理器提供信号。在一个实施例中，参考检测器26提供一个数据信号“R”，吸收率检测器30提供一个数据信号“I”，而荧光检测器“32”在相应的数据通道上为中央处理器或计算机提供一个数据信号“S”。
图2是一个框图，展示了根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统中的不同组件的功能连接。组件20通过一个或多个端口42连接到至少一个处理器或计算机40上。在一个实施例中，计算机40包括通过USB端口42和电子电路/硬件50、52与不同组件20通信的数据处理、分析、和控制软件。电子设备50、52可以提供不同的信号过滤、处理、调节、格式化等，以转换来自于或发送给关联致动器/传感器的信号以便通过端口42与计算机40通信。在一个实施例中，一个外部触发信号44还可提供给电子设备50以启动不同仪器功能。类似地，触发输入/输出信号可以在电子设备50、52之间通信以协调不同仪器组件20的控制。
如图2所示，由计算机50上的软件和/或硬件实施的控制逻辑可以用于通过I/O端口42和电子设备50(例如快门60，激发单色仪62，检测器数据通道64、66、68，样品转换器70，和滤光盘72)发送/接收相应数据/控制信号。类似地，可以通过电子设备52用一个第二I/O端口42将相应数据/控制信号传递到与荧光光谱仪相关联的CCD照相机74。快门控制60可以用于控制相对于样品/空位28位于上游的快门，以便选择性地照亮样品/空位28并限制其暴露，同时允许光源22在试验或测量之前稳定。来自计算机40的信号可以用于通过关联激发控制62控制单色仪24，以控制开始和结束扫描波长、波长增量等。在图2中展示的实施例中，辅助“A”通道64可以用于控制可选组件。数据通道66传递与吸收率检测器30相关联的数据信号“I”，而数据通道68传递与参考检测器26相关联的数据信号“R”。可以可选地提供样品转换器控制70以便对关联样品室内的一个或多个样品进行自动定位，如本文进行的更详细的展示和说明。可以可选地提供滤光盘控制72以当激发扫描行进经过期望激发波长范围时自动定位适当的滤光器以减少或消除不想要的光级。在图2展示的实施例中，通过关联数据通道74提供的荧光检测器数据从与荧光光谱仪相关联的多通道成像CCD照相机穿过电子设备52和第二端口42到计算机/处理器40。
如在图1和图2中总体展示的，根据本披露的用于分析样品的系统的各种实施例包括：一个输入光源22、被定位成用于从输入光源22接收光并用单色仪24选定的多个波长中的每一个波长循序地照亮样品(和/或空位)28的多重或多相减色单色仪24。该系统包括一个多通道荧光检测器32，该多通道荧光检测器被定位成用于接收并基本同时地检测该样品对该多个激发波长中的每一个激发波长发射的多个光波长。吸收检测器30被定位成用于接收并检测穿过样品/空位28的光。计算机40通过电子设备50、52和端口42与单色仪24、荧光检测器32、和吸收检测器30通信。计算机40包括控制逻辑，该控制逻辑用于控制单色仪24用选定的多个波长中的每一个波长循序地照亮样品/空位28，同时基于分别从该荧光和吸收检测器32、30接收到的信号来测量样品/空位28的吸收和荧光。参考检测器26通过电子设备50和端口42与计算机40通信并与一个被定位成用于将一部分来自单色仪24的光引导到参考检测器26的关联分束器(图3)合作。计算机40可以基于来自参考检测器26的一个信号调整吸收和荧光测量值中的至少一个。
图3是一个示意性平面图，并且图4是一个透视图，展示了为根据本披露的用于分析样品的系统或方法的一个实施例而定位的组件。系统20包括一个输入光源22，该输入光源带有一个或多个用于集中或聚集灯泡、电子管或LED发出的光以提高系统效率的关联光学元件或组件80、82。在所展示的实施例中，光源22包括一个凹面镜或反射镜80和背面反射镜82以将来自灯泡的光引导到期望的输出方向。来自输入源22的光被反射镜82引导到单色仪输入镜84，该输入镜将光引导到双减色单色仪24的输入90。单色仪24包括总体上垂直对齐的(在图5中最好地示出)第一和第二凹光栅92、94。响应于一个控制信号选择性地定位光栅92、94以照亮输出狭缝96，该输出狭缝与单色仪输入90总体上垂直地对齐，其中衍射光具有相应选定的激发波长带。可以将一个快门104集成到单色仪24中或定位到该仪器内任何方便的位置以仅在扫描测量期间控制或限制样品28的照明，同时允许输入光源28到达一个合适的操作温度并稳定下来。
将至少一个光学元件定位成用于将光从单色仪24的输出96引导到样品28。在所展示的实施例中，一个平面单色仪输出反射镜98将发散光从单色仪24引导到一个凹面或圆环反射镜100(在一个实施例中的特征在于F/数大约为F/3)。将来自圆环反射镜100的会聚光引导到一个分束器102，该分束器被定位成用于将入射光的一个第一部分从单色仪24向参考检测器26引导，并将该入射光的一个第二部分引导到样品28。参考检测器26可以由例如一个硅光电二极管实施。可以对参考检测器26进行定位，这样测量值可以用于将吸收和荧光检测器都归一化。
穿过分束器102的光进入样品室110并在测量扫描期间照亮样品和/或空位28。总体上直接穿过样品28的光射出样品室110并在照亮吸收检测器30之前穿过孔径112。在一个实施例中，确定孔径112的大小以便对吸收检测器30提供基本准直的光(其特征在于F/数为F/11)，该孔径可以通过一个单通道检测器(比如硅光电二极管)实施。将较慢光学器件用于吸收检测器30增强了吸收率检测的准确性和线性度。这样，根据本披露的不同实施例使用比吸收率测量光学器件快的激发和荧光测量光学器件以便为样品照明和荧光发射的相对较低强度光的测量提供更高的光通量，同时限制透射过样品到吸收检测器的光的光强度以提高基本同时的吸收测量的线性度和准确性。其他的实施例可以使用单通道检测器(比如光电二极管阵列(PDA))以获得吸收率测量。虽然这可能减少扫描时间，但并不利于基本同时的测量以获得3D光谱。如在本文中更详细说明的，一些实施例可以用光谱仪实施吸收检测器30以提供吸收率测量。
总体上与穿过分束器102的激发光垂直的由样品28发射的光通过一个关联孔径射出样品腔110，并被凹面或圆环反射镜114和平面反射镜116反射到多通道荧光检测器32。在所展示的实施例中，多通道荧光检测器32由一个具有一个凹光栅120的成像光谱仪实施，该凹光栅对输入光进行衍射以使其组件频率/波长覆盖在冷却的CCD检测器122上。使用多通道荧光检测器32促进了与双减色单色仪24的各激发波长相关联的荧光光谱的基本同时测量，以相对于使用单通道扫描荧光检测器的仪器显著减少测量获取时间。
图5是一个透视图，展示了用于根据本披露的各种实施例的一种用于分析样品的系统或方法的一个双减色单色仪24的组件。单色仪24包括第一和第二凹面衍射光栅92、94，将这些光栅选择性地定位成用于用具有相应选定激发波长带的衍射光照亮输出狭缝96。在操作中，来自输入光源的光从输入孔径90进入并入射到一个第一凹面衍射光栅92上。来自光栅92的衍射光被第一反射镜136反射到第二反射镜138，然后到第二个光栅94，然后到出口96。第一和第二凹面衍射光栅92、94安排在一个减色配置中，这样使得第一凹面衍射光栅92的输出作为到第二凹面衍射光栅94的输入，以使出射激发光束在出口96产生的色散趋近零，同时减少杂散光(即波长未选定的光)的振幅。杂散光的减少会从样品的照明中减少或消除不想要的(更易受散射影响的)UV光以减少漂白，同时还促进了更高的光谱分辨率。类似地，当光谱随机混合时吸收测量可能会更精确。
当然，多种其他单色仪配置可以用于满足对具体应用或实现方式所期望的性能规范。例如，可以使用具有一个或多个单独光栅/反射镜而不是一个集成凹面光栅的单色仪配置。类似地，当色散性能为次要时，减色配置可能就不必要了。同样，可以在多重单色仪中结合两个以上相位以进一步减少杂散光和/或实现多种其他性能要求。总体而言，可以用具有安排在一个减色配置中的至少两个凹面光栅的多重单色仪提供期望的杂散光抑制和适合不同应用的趋近于零的色散。
图6是一个简化的示意图，展示了根据本披露的用于分析样品的系统或方法的另一实施例。系统200包括一个输入光源202，该输入光源带有由椭圆反射镜204向双减色单色仪208引导的输入光。来自反射镜204的光从平面反射镜206下方或后面穿过，到达单色仪208的输入孔径220。第一凹面衍射光栅210将输入光衍射到偏转反射镜212、214和前面描述的第二凹面衍射光栅216。可以将光栅210、216选择性地定位以选择期望的激发波长，其中关联的光在平面反射镜206的高度处通过出射孔径222射出单色仪。平面反射镜206将选定波长的发散激发光引导到数值孔径对应于F/3的圆环反射镜230。圆环反射镜230将会聚光引导到分束器232，该分束器将一部分入射光引导到参考光电二极管234，同时将剩下一部分透射到样品236。穿过样品236的光入射在遮光板238上，该遮光板具有一个孔径以相对于吸收光电二极管240提供对应于F/11的数值孔径。遮光板/孔径238可操作以准直提供给吸收光电二极管240的光。
由数值孔径对应于F/3的第二圆环反射镜250收集样品236发射的总体上垂直于激发光的任何光。圆环反射镜250将一个会聚光束中总体上发散的光通过光束偏转反射镜252朝成像光谱仪260的输入引导。成像光谱仪包括一个像差校正光栅262，该像差校正光栅将输入光分离为其组件波长用于在冷却的CCD264上成像，这样可以为双单色仪208供给的多个激发波长中的每一个激发波长收集多个波长谱。冷却的CCD检测器264的使用会减少黑噪声并提高信噪比(SNR)以增大仪器灵敏度，这样使得仪器适用于多种多样的应用，尤其是这些涉及例如水质分析和关联CDOM测量的应用。
图7是一个示意图，展示了根据本发明的多种实施例的一种用于使用双光束安排来用公共激发光束照亮样品和空位以分析样品的系统或方法的操作。系统280类似于图6中展示的安排，包括一个输入光源202、椭圆反射镜204、平的或平面反射镜206和双单色仪208。同样，将来自单色仪208的激发光引导到圆环反射镜230。定位一个附加的光束偏转反射镜282以将该激发光束重新引导到一个可移除的分束器284，该分束器通过将一部分光反射到偏转反射镜286然后通过空位288以产生一个双激发光束。穿过空位288的光入射在遮光板/孔径290上，其中总体上准直的光穿过到达一个关联空位吸收率检测器292。
如之前所述的，分束器232将穿过可移除的分束器284的一部分光重新引导到参考光电二极管234。偏转反射镜294将分束器232透射的光重新引导通过样品236。穿过样品236的光入射到遮光板/孔径238上，其中一部分光落到吸收率光电二极管240上。
通过图7中展示的双光束安排，可以基本同时地为空位288和样品238收集吸收率测量值。在样品236的荧光测量期间可以手动地或自动地将可移除的分束器284移除或重新定位，以提供增大的激发光束强度以提高样品236的荧光测量的灵敏度。类似于之前描述的实施例，圆环反射镜250将样品236发射的总体上垂直于激发光束的光引导到一个多通道荧光检测器260，这可以由具有一个冷却的CCD的成像光谱仪实施以如之前描述地提供期望的仪器特性。
图8是一个示意图，展示了根据本发明的多种实施例的一种用于使用双光束安排来用单吸收率检测器和关联斩波器照亮样品和空位以分析样品的系统或方法的操作。关于相同编号元件的结构和功能，图8的安排与图7的安排类似。然而，在图8的实施例中，反射镜306将从空位288穿过遮光板/孔径290的光重新引导到斩波器308。类似地，反射镜312将从样品236穿过遮光板/孔径238的光重新引导到斩波器308。斩波器308选择性地将或者来自空位288的光或者来自样品236的光引导到吸收率检测器310，这样单吸收率检测器可以用于空位288和样品236二者的吸收率测量。可以控制斩波器308，这样循序地但几乎同时地获取来自空位288和样品236的相应测量值。
图9是一个示意图，展示了根据本发明的多种实施例的一种用于使用在吸收路径中直接照明和用于吸收率检测的光谱仪分析样品的系统或方法的操作。系统360包括具有如前面关于相同编号元件描述的结构和功能的不同组件。在图9的实施例中，来自输入光源202的一部分光用于直接照亮空位288以便进行吸收率测量。分束器320将一部分光从光源202重新引导通过元件322。圆环反射镜324形成被偏转反射镜326重新引导并在照亮空位288之前穿过遮光板/孔径290的会聚光束。圆环反射镜330将穿过空位288的光朝吸收率检测器340反射，在本实施例中由一个光谱仪实施。
用光谱仪350从样品236在相对于激发光束的直角发射的光获取荧光测量值。波长选定的光射出双单色仪208并被平面反射镜206、圆环反射镜230和平面反射镜342重新引导通过分束器或窗口232到样品236。如之前所述的窗口或分束器232将一部分入射光引导到参考光电二极管234。圆环反射镜250收集从样品236发射的光并重新引导到光谱仪360。在本实施例中，将样品舱配置成旋转以使样品池236和空位池288交替。
图10展示了根据本披露的多种实施例的一种用于分析样品的系统或方法的代表性吸收率测量。如之前所述，不同实施例包括一个与双减色单色仪、多通道荧光检测器、吸收检测器、和参考检测器通信的计算机(图2)以控制激发扫描以及所产生的用于随后分析的数据获取。如在图10中总体展示的，该计算机可以包括以软件和/或硬件实施的控制逻辑以执行空位和样品的吸收率测量。框400代表通过将空位定位在测量室内并执行一系列测量为一个空位获取吸收率光谱，这一系列测量可以包括在快门关闭且无激发光照亮空位的情况下的基线暗读数。通过控制单色仪进行测量以提供一个第一选定波长，同时计算机存储来自吸收率检测器的关联“I”数据和来自参考检测器的“R”数据。计算机可以使用参考数据对吸收率数据进行校正和归一化。对每个波长增量重复此过程直到达到期望的结束波长。如在404处表示的，可以存储激发扫描的输出以用于后续测量，其中该空位在如框402表示的测量位置。
对于具有上述存储数据的空位，如框400表示的，用户可以检索相应数据文件而不是进行新的激发扫描。然后可以如框406表示完成样品的测量。将样品放置于(指定了对应空位文件)测量室内的位置中。对单色仪选定的各波长以类似方式进行测量，从吸收率检测器和参考检测器获取结果数据并(如在408处指示的)校正和归一化，即I＝Ic/Rc。根据％T＝(I样品/I空位)*100计算透射(T)，并根据Abs＝-log(I样品/I空位)计算吸收率。结果可以根据例如在410处指示的激发波长绘制。当然，可以取决于具体应用和实施使用多种其他数据获取和分析技术。
图11A和图11B展示了在根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法中获得代表性吸收率和荧光测量值的可选运行模式。如之前描述的，根据本披露的多种实施例包括具体适合水质分析和CDOM定量的特征。例如，在本实施例中，如上面参照图9展示和描述的，将样品舱配置成旋转以使样品池和空位池交替。这样，对于水质分析应用描述了以下代表性操作方式。对其他应用可以执行类似的方式或测量。
如框500表示的，CDOM样品池和空位池定位在样品舱内。如框502表示的，用户然后选择一种扫描类型。在所展示的实施例中，如框510表示的，操作模式或扫描类型包括EEM(吸收率)测量504、发射(荧光)测量506、吸收率测量508、和动力学(流动池/色谱图)分析。EEM(吸收率)测量504对空位520和样品522以相似的方式进行。如之前描述的，可以从上述存储的文件(如果可获得)得到与具体空位相关联的数据。否则，在本示例中，通过用多个240nm到600nm之间的多个激发波长将空位照亮来获得空位测量数据。用之前描述的吸收率检测器和参考检测器信号为各激发波长确定透射强度数据。为各激发波长收集多通道CCD荧光检测器测量的发射光谱数据。然后对该数据进行校正以用于激发、发射和强度。在一个实施例中，该数据被校正以消除内部过滤效应(将在下文中更详细描述)。如框524表示的，来自空位和样品的数据被用来计算透射(T)、吸收率(A)和EEM。该软件使用户可以选择期望的方法自动地分析数据，并显示测量的和分析的数据以便减少获取时间并为用户减少或消除手动数据分析。
如框530表示的，发射测量506的选择以与EEM测量504类似的方式进行，并为空位收集数据。然而，如框530中所指示的，选择了一个单激发波长而不是从开始到结束波长自动循序地扫描。同样地，如框532中所指示的，为样品选择了一个单激发波长。然后，如框534所表示的，使用校正的空位和样品数据确定透射(T)、吸收率(A)、和EEM以减少或消除内部过滤效应。
如也在图11中所展示的，以与EEM测量504类似的方式选择吸收率测量508，并为空位(如框540表示的)和样品(如框542表示的)收集数据。如框540展示的，从选定的开始波长到选定的结束波长(比如在本示例中从1100nm到240nm)扫描激发波长。对于各激发波长，基于吸收检测器信号收集透射强度并基于至少一个相应的参考检测器信号对其进行校正。然后，如框544表示的，用空位和样品数据计算透射(T)和吸收率(A)。
配备有流动池的仪器(如框510所表示的)可以执行动力学分析，并为空位(如框550表示的)和样品(如框552所表示的)收集类似测量值。除了激发波长之外还对测量整合时间和增量做了选择。然后为选定的激发波长收集透射强度数据。还从多通道荧光检测器收集发射光谱数据(多个波长)，并对该数据进行校正以用于激发、发射、和强度以便消除内部过滤效应。然后如框554所表示的，根据时间用空位数据和样品数据对透射(T)、吸收率(A)和发射数据进行绘图。
根据本披露的实施例提供了一种台式分析研究仪器，该仪器调整荧光激发发射图(EEM)和吸收率分析，该分析尤其适合悬浮和溶解的有机和无机材料的水质分析，但也适合食品科学及其他需要具有有利定性和定量分析的EEM和吸收率检定的应用。除了上述的测量/计算之外，不同实施例提供了将数据转化成/出多个可商购的多元分析软件包(比如MatLab和Eigenvetor)的能力，以便促进并行因子分析(PARAFAC)，有时称作标准分解、主成分分析(PCA)等。
图12是一个流程图，展示了根据本披露实施例的一种用于分析样品的系统或方法的操作。如框600所表示的，该系统或方法包括以双减色单色仪发射的多个激发波长循序地照亮样品和/或空位。如框602表示的，该系统或方法还包括通过检测穿过样品的光测量样品/空位的吸收率并通过使用多通道检测器检测样品对各激发波长发射的光的发射光谱来测量样品的荧光。可以用相同或公共激发光束测量吸收率和荧光，这样使得可以基本同时地获得两个测量值。如框604所表示的，该系统和方法还可以包括使用吸收率测量值校正荧光测量值。例如，在一个实施例中，可以使用如下方程式：
F理想＝F观察*exp((OD激发+OD发射)/2)
其中，F理想代表没有内部过滤效应时的理想荧光信号谱，F观察代表观察到的荧光，OD激发和OD发射代表在EEM的各激发和发射波长坐标测得的吸收率值。另外，如框606所表示的，该系统或方法可以包括基于参考检测器检测到的光强度调整吸收率测量值，其中，该参考检测器被定位成用于从单色仪接收一部分光。
如之前所述的代表性实施例所展示的，根据本披露的用于样品分析的系统和方法提供了吸收和荧光的同时测量以便以期望的速度、准确度和精确度对水样品中的溶解和/或悬浮的有机和无机物进行定性和定量分析。单个仪器中的吸收率和荧光数据的同时获取会减少或消除测量之间与样品中的时间相关的光学和化学改变相关联的不精确相关性。此外，除了提供大量关于溶解和悬浮有机和无机化合物的独立数据，同时获得的吸收率数据可以用于对荧光光谱信息进行相关和校正。激发和发射光束的自动过滤会消除光栅级衍射。
结合一个多光栅激发单色仪的系统和方法提供了瑞利散射和具有深UV敏感度的光栅级的优异杂散光抑制。对激发监测和校正使用参考二极管提供了荧光激发光谱的可追踪光学校正并补偿了任何输入光漂移。使用容纳样品、空位和流动池的模块化样品舱促进了空位校正(减色)和用于自动取样和在线监测的流，同时减少或消除了污染。用于荧光测量的高速光学器件会提高荧光灵敏度的通量和水拉曼散射的SNR。将冷却的CCD作为荧光发射光谱仪的成像检测器使用提供了具高UV-VIS检测灵敏度和低黑噪声的高速数据获取。同时吸收测量促进了比各种各样现有技术仪器实施的吸收率测量更好地校正样品内的内部过滤效应导致的重吸收的荧光信号。类似地，适当带孔的吸收光学器件提供了用于提高的线性度和准确度的准直光束，并促进了低成本硅光电二极管检测器的使用。
虽然以上描述了多个示例性实施例，但并不意指这些实施例描述了根据本披露的用于分析样品的系统或方法的所有可能形式。而是，在本说明书中使用的语言是描述性而非限制性的语言，并且应理解的是可以在不背离本披露的精神和范围的情况下做出不同改变。如上面描述的，可以用未明确展示或描述的方式将各种代表性实施例的特征结合以形成更多的实施例。虽然不同实施例对于一种或多种期望的特性可能被描述为提供了优点或优选于其他实施例，如本领域普通技术人员理解的，可以根据特定应用和实施将一种或多种特性加以折中以实现期望的系统属性。这些属性包括但不限于：成本、强度、耐用性、生存期成本、可销售性、外观、包装、大小、可服务性、重量、可制作性、组装容易度、操作等。本文中任何描述为对于一种或多种特性较其他实施例或现有实施方式不可取的实施例不在本披露的范围内，而可能对于具体应用是可取的。

Claims (17)

1.一种用于分析样品的系统，包括：
一个输入光源；
一个双减色单色仪，该双减色单色仪被定位成用于从该输入光源接收光并循序地用多个波长中的每一个波长照亮该样品；
一个多通道荧光检测器，该多通道荧光检测器被定位成用于接收并检测该样品对该多个波长中的每一个波长发射的多个光波长；
一个吸收检测器，该吸收检测器被定位成用于接收并检测穿过该样品的光；
一个参考检测器；
一个分束器，该分束器被定位成用于将一部分光从该双减色单色仪引导到该参考检测器；以及
一个与该双减色单色仪、该多通道荧光检测器、该参考检测器及该吸收检测器通信的计算机，该计算机控制该双减色单色仪用该多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品，同时基于从该参考检测器、该多通道荧光检测器和该吸收检测器接收到的多个信号测量该样品的吸收和荧光，其中该计算机基于来自该参考检测器的一个信号调整这些吸收和荧光测量值中的至少一个，该计算机配置为同时触发该参考检测器、该多通道荧光检测器和该吸收检测器。
2.如权利要求1所述的系统，其中，该计算机使用多个同时获得的吸收测量值校正多个荧光测量值。
3.如权利要求1所述的系统，其中，该吸收检测器包括至少一个光电二极管。
4.如权利要求1所述的系统，进一步包括至少一个光学元件，该至少一个光学元件被定位成用于将光从该双减色单色仪引导到该样品，并提供从该样品到该吸收检测器的一个基本准直的光束，同时向该多通道荧光检测器提供高通量。
5.如权利要求4所述的系统，其中，该至少一个光学元件包括一个凹面镜，该凹面镜具有关联的F/数以提供比与该吸收检测器相关联的光学器件更快的光学器件，其中，与该吸收检测器相关联的该光学器件包括一个具有一个孔径的遮光板，该遮光板定位于该吸收检测器前面。
6.如权利要求1所述的系统，其中，该计算机控制该双减色单色仪从波长较长的光开始到波长较短的光循序地照亮该样品。
7.如权利要求1所述的系统，其中，该多通道荧光检测器包括一个像差校正光栅，该像差校正光栅被定位成用于将输入光衍射到与该计算机通信的一个冷却的电荷耦合元件阵列上。
8.如权利要求1所述的系统，进一步包括：
至少一个光学元件，该至少一个光学元件被定位于该双减色单色仪与该样品之间以将一个第一部分的光从该双减色单色仪引导到该样品并将一个第二部分的光从该双减色单色仪引导到一个空位。
9.如权利要求8所述的系统，其中，透射过该空位的光被选择性地引导到该吸收检测器。
10.如权利要求8所述的系统，进一步包括一个第二吸收检测器，该第二吸收检测器被定位成用于检测透射过该空位的光。
11.如权利要求8所述的系统，其中，该至少一个光学元件包括一个可移除分束器。
12.如权利要求1所述的系统，其中该吸收检测器包括：
一个衍射光栅；以及
一个多通道检测器，该多通道检测器被定位成用于检测该衍射光栅衍射的光。
13.一种用于分析样品的系统，该系统包括：
一个单色仪，该单色仪具有至少两个光栅，这些光栅被定位成用于输出选定的激发波长带；
一个第一凹面镜，该第一凹面镜被定位成用于将光从该单色仪引到向一个样品；
一个参考光电二极管；
一个分束器，该分束器被定位成用于将一部分光从该第一凹面镜引导到该参考光电二极管并将一个第二部分的光从该第一凹面镜引导到该样品；
一个吸收检测器，该吸收检测器被定位成用于接收透射过该样品的光；
一个具有一个孔径的遮光板，该遮光板被定位在该吸收检测器与该样品之间；
一个第二凹面镜，该第二凹面镜被定位成用于将该样品发射的光引导到一个第一检测器光栅；
一个多通道成像检测器，该多通道成像检测器被定位成用于同时为各激发波长带检测来自该第一检测器光栅的多级衍射光；以及
一个处理器，该处理器与该单色仪、该参考光电二极管、该吸收检测器、及该多通道成像检测器通信以同时检测对于多个激发波长带中的每一个该样品的吸收率和荧光。
14.如权利要求13所述的系统，其中，该第一和第二凹面镜具有多个关联F/数以提供比与该吸收检测器相关联的光学器件更快的光学器件。
15.如权利要求13所述的系统，其中，该吸收检测器包括一个光谱仪，该光谱仪具有一个衍射光栅和一个光检测器矩阵，该光检测器矩阵被定位成用于同时检测输入光的多个衍射级。
16.如权利要求13所述的系统，其中，该处理器使用与一个公共激发波长带相关联的多个吸收率测量值同时调整多个荧光测量值。
17.如权利要求13所述的系统，其中，该处理器控制该单色仪在较短的波长带之前使用较长波长带循序地照亮该样品。
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