CN101706434A - 能检测光吸收或光透射的荧光光度计 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能检测光吸收或光透射的荧光光度计，该设备在原有荧光光度计基础上进行改进，将荧光检测与光吸收(光透射)检测结合，达到既能检测样品荧光(包括三维荧光、同步荧光)光谱又能检测样品对光的吸收光谱(例如吸光度或透光率等)的目的，同时，该光度计能够方便的实现对三维荧光光谱的矫正。本发明在现有荧光光度计的基础上，通过简单的添加反射系统或增加新的检测器的方式，使该荧光光度计能够对透过样品池的透射光进行检测，实现本发明的发明目的。

Description

能检测光吸收或光透射的荧光光度计

技术领域

本发明保护一种能检测光吸收或光透射的荧光光度计。该荧光光度计属于一种联合检测仪，所述检测仪包括紫外/可见分光光度计和荧光光度计两个部分，该检测仪能够实现紫外/可见分光光度计和荧光光度计的两种功能。同时，该光度计能够方便的实现对三维荧光光谱的矫正。

背景技术

三维荧光光谱是20世纪80年代在荧光光谱分析的基础上发展起来的一种新的分析技术，获取三维荧光数据的方法一般是在不同激发波长位置上连续扫描发射光谱，并可利用各种绘图软件将其以等角三维荧光投影图(Ex-Em-If)或等高线图(Ex-Em)等形式图像化表现。应用荧光光谱技术研究荧光类物质是基于其结构中含有大量带有各种官能团的芳香环结构以及未饱和脂肪链(物质之所以具有荧光是由于其结构中具有低能量∏→∏^*跃迁的芳香结构或共轭生色团)。相对红外、核磁共振等研究方法，荧光光谱法研究天然有机物结构特征具有灵敏度高(10^-9数量级)、选择性好，不破坏样品结构、需要的样品量少(只需少量低浓度，通常＜20mg/L的水样)、样品不需特殊分离、快速而简便等优点，被用于有机质或腐殖质结构和官能团的定性或定量描述，以及有机质的来源和水监测研究中。

然而，在荧光检测中，通常由于溶液的内过滤作用和自吸收现象，而导致所测得的荧光减弱，使得荧光强度和峰型都发生变化。特别随着样品浓度的增加，溶液的内过滤作用和自吸收现象严重，以至于荧光检测出现较大偏差。大连工业大学的王雅娜，崔励，徐同宽，栾强等在“三维荧光光谱的应用研究”(分析试验室，2008-5，V27增刊，第59-62页)一文中就指出，在用三维荧光对罗丹明B检测时，“可能因为高浓度时产生荧光自吸收及荧光熄灭显现，从而导致荧光谱的短波长光(蓝光)的损失，导致荧光谱形的变化，即罗丹明B的3DEEM谱形会受质量浓度影响”

溶液中若存在着能吸收激发或荧光物质发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生所谓“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。

荧光量子产率

定义为荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。即：

而荧光强度(If)应该与溶液吸收的光强度(Ia)及该物质的荧光量子产率

有关，即荧光强度I_f正比于吸收的光强度Ia与荧光量子产率

T为透射率，I₀为入射光强度，It为透射光强度；

因为：A＝εlc A＝-lgT＝lg1/T＝lg I₀/It T＝10^-A＝e^-2.3εlc

所以：

ε是摩尔吸光系数，l是样品池的光程，c是样品浓度；

e^-2.3εlc＝1-2.3εlc-(2.3εlc)²/2！-(2.3εlc)³/3！-......

当εlc≤0.05时，可省略第二项后各项，即：e^-2.3εlc＝1-2.3εlc

当入射光强度I₀与l一定，可简写为：I_f＝Kc

即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当εlc≤0.05时才成立，对于较浓的溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不呈线性关系。可见，不同的荧光物质具有不同的荧光特征和出现特征荧光的浓度范围，但是当浓度高的时候，就会出现内滤光(inner filtering.)和自吸收(reabsorbance)现象，而导致荧光强度降低。因此在三维荧光光谱检测时，有必要进行内过滤和自吸收矫正。

在本申请人之前的专利申请中(申请号200910157790.3)，已经公开保护了一种三维荧光光谱矫正方法，本发明提供了可方便实现三维荧光光谱校正功能的荧光检测仪。该检测仪实质上是一种能检测光吸收(光透射)和荧光光度计。

发明内容

本申请提供一种能检测光吸收(光透射)的荧光光度计，该设备在原有荧光光度计基础上进行改进，将荧光检测与光吸收(光透射)检测结合，达到既能检测样品荧光(包括三维荧光、同步荧光)光谱又能检测样品对光的吸收光谱(例如吸光度或透光率等)的目的。本申请的荧光光度计在原有的荧光光度计基础上，增加一些配件，使该荧光光度计能够对透过样品的透射光进行检测，以达到检测样品对光吸收的目的，这是本发明的创新点所在。

在本发明中，激发光是指由光源发射、用于激发样品的光。发射光是样品受到激发而发射的光。透射光是指激发光穿过样品池后的，沿着激发光方向透射的光。反射光是指透射光经过反射系统反射后得到的光。

而本申请公开的其中一种方案是：在现有荧光光度计的基础上，增加一个透射光反射系统，将通过样品的透射光反射进入检测器，达到检测样品对光吸收状况的目的，其组成结构参见说明书附图图1所示。而现有的荧光光度计通常包括光源、激发光单色器、样品池、发射光单色器，检测器等部分。

本申请第一方案中所述的荧光光度计包括光源、激发光单色器、样品池、发射光单色器、检测器和透射光反射系统，其中，透射光反射系统将透射光反射进入检测器，可用于检测透射率。进一步，该光度计还包括发射狭缝(发射光要经过的狭缝)和反射狭缝(反射光要经过的狭缝)。

分光光度计的检测范围由荧光光度计的光源波长范围确定，一般波长为200-900nm，该波长范围一般认为包括紫外/可见光范围，因此，本发明中提及的分光光度计的检测范围也为通常使用的200-900nm波长的范围。

当检测者的目标是为了得到荧光光谱数据时，可设定反射系统部分的狭缝为0(即关闭狭缝，避免透射光透过)，然后按照正常的荧光光度计的操作得到相应的荧光光谱数据。

当检测者的目标是得到样品的紫外/可见光光谱数据时，就设置样品发射出荧光要通过的发射狭缝为0，只让透射光进入检测器，以便检测样品对光的透射率(吸收度)，得到吸收光谱数据.

当检测者的目标是为了得到矫正的三维荧光检测结果时，需设定反射系统部分的狭缝为0(即关闭狭缝，避免透射光透过)，测定三维荧光数据后，再设置样品发射出荧光要通过的发射狭缝为0(即关闭狭缝，避免荧光透过)，通过反射系统，仅让透射光进入检测器，就可以检测样品对光的透射率(吸光度)，并将数据传给数据处理器。由数据处理器对荧光光谱进行矫正，得到校正后荧光数据，矫正方法为荧光光谱各发射波长的荧光强度除以相同波长的样品对光的透射率(I_f/T)。

该反射系统可以是任何能够实现将透射光反射到原检测器的装置。可以是简单的具有反射功能的平面镜、球面镜、多棱镜等；或者是能够实现反射功能的一组反射镜(球面反射镜或平面反射镜)，或一种多棱镜组等。

本申请公开的另一种方案是，在现有荧光光度计基础上，在透射光的方向上增加另一个检测器，检测样品对光的吸收状况(透射率)。经过改造后，该荧光光度计能够实现荧光和紫外/可见分光光度计联合检测的功能，或带有矫正功能的荧光光度计。

所述的荧光光度计包括光源、激发光单色器、样品池、发射光单色器、检测器A(原荧光光度计的检测器)和在透射光方向设置的另一检测器B。其中，检测器A用于检测发射光，也称为发射光检测器，而检测器B用于透射光的检测，可称为透射光检测器。透射光可通过透镜进入检测器B，检测器B用于检测样品对光的透射率。

当检测者的目标是为了得到荧光光谱数据时，用发射光检测器A，按照常规的荧光光度计的操作得到相应的荧光光谱数据。

当检测者的目标是得到样品对光的吸收或透射数据时，则让透射光通过透镜进入透射光检测器B，用检测器B检测样品对光的透射率(吸光度)。

当检测者的目标是为了得到矫正的三维荧光检测结果时，按照常规的方法用检测器A检测得到三维荧光数据。之后，让透射光通过透镜进入检测器B，用检测器B检测样品对光的透射率(吸光度)，并将数据传给数据处理器(原荧光光度计内的数据处理器)。由数据处理器对荧光光谱进行矫正，得到校正后荧光光谱数据。矫正方法为荧光光谱各发射波长对应的荧光强度除以相同波长的样品对光的透射率(I_f/T)。

附图说明

图1带反射系统的能检测光吸收或光透射的荧光光度计。

图2带双检测器的能检测光吸收或光透射的荧光光度计：

具体实施方式

如图1公开的荧光光度计。该荧光光度计包括光源(一般为波长200-900nm的氙灯或高压汞灯)、激发光单色器、入射狭缝、样品池、发射狭缝、发射光单色器、检测器、放大器、记录仪、反射狭缝和透射光反射系统。透射光反射系统将透射光反射进入检测器，以便检测透射率。该透射光反射系统可能是简单的反射镜、反射棱镜，也可以是反射镜组或反射棱镜组。具体透射光反射系统的位置和设置根据具体的荧光光度计设置而定，最简单的方式是仅通过反射镜组，调整其安置角度将透射光反射进入光检测器，达到检测光吸收(光透射)的目的。

图1中在反射光处设置反射狭缝，当调节反射狭缝为0(即关闭狭缝)时，反射光也将不再进入检测器。而关闭发射狭缝，可将荧光光度计变成紫外/可见分光光度计。

如图2公开的荧光光度计。该荧光光度计包括光源(一般为波长200-900nm的氙灯或高压汞灯)、激发光单色器、入射狭缝、样品池、透射镜、发射狭缝、检测器A、透镜、检测器B、放大器、记录仪。其中，检测器B位于透射光方向，能够直接检测样品对光的透射率，透射光通过透镜进入检测器B。

对于图1和图2所述设备，将荧光光谱各发射波长对应的荧光强度除以相同波长的透射率T就得到矫正后荧光光谱，实现对荧光光谱的矫正。

本申请公开的能检测光吸收(光透射)的荧光光度计，能够实现方便的同时检测荧光光谱和紫外/可见光谱，也能够方便的得到经过紫外/可见光透射率矫正的三维荧光光谱数据。

Claims (7)

1.一种能检测光吸收的荧光光度计，其特征在于在现有荧光光度计中，增加能够实现对透射光进行检测的装置，使该荧光光度仪能够对透过样品池的透射光进行检测，所述装置是一种反射系统或者新增加的透射光检测系统。

2.一种能检测光吸收的荧光光度计，其特征在于，在现有荧光光度计中增加一个反射系统，该反射系统用于将通过样品的透射光反射回原荧光光度计检测器，以检测样品对光的透射率。

3.根据权利要求2所述的荧光光度计，所述反射系统是一个平面反射镜、球面反射镜、反射棱镜、一个反射镜组、一个反射棱镜组，或者上述反射镜的组合，反射镜的设置根据具体的荧光光度计的设置确定。

4.如权利要求2或3的荧光光度计，进一步包括反射狭缝，即反射光要经过的狭缝，所述狭缝能够打开或关闭。

5.一种能检测光吸收的荧光光度计，其特征在于，在现有荧光光度计中，在样品的透射光方向，增加另一个透射光检测器，用于对透射率的检测。

6.如权利要求5所述的荧光光度计，其特征在于，所述透射光通过透镜后进入透射光检测器。

7.一种基于权利要求1-6的光度计的三维荧光光谱矫正方法，所述方法使用权利要求1-6的荧光光度计，检测样品对与荧光相同发射波长的可见/紫外光的吸光度或透射率，再使用荧光各发射波长对应的荧光强度I_f除以所测的样品同波长对光的透射率T，以此矫正荧光光谱。

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