CN102042961B - 一种光纤反射式微纳体系分光光度计及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光纤反射式微纳体系分光光度计。本发明提供的分光光度计，包括如下元件：激发光源、一端与激发光源相连的发射光纤、光谱仪以及一端与光谱仪相连的接收光纤；在此基础上，所述发射光纤的另一端和所述接收光纤的另一端组合成联合接口；在所述联合接口的端面的对侧设置一具光反射面的光反射装置；所述联合接口的端面与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。采用以上技术方案，待测样品只需被压缩而不必被拉伸成为液柱，即可达到所需的测量光程。此种方式相比现有技术中采用的透射式单倍光程样品吸收方案，测量精度和重复性更好，所需的样品用量可以更少，而且液滴光程保持部分的结构得到简化，仪器的成本更低。

Description

一种光纤反射式微纳体系分光光度计及其应用

技术领域

本发明涉及分光光度检测仪器领域，特别涉及一种光纤反射式微纳体系分光光度计及其应用。

背景技术

光谱分析法是指通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。紫外-可见-红外分光光度法是基于分子内电子跃迁、分子振动产生的吸收光谱进行分析测定的一种仪器分析方法，被广泛用于有机化合物的定量分析中。紫外-可见-红外分光光度计常见的用途包括但不限于核酸、蛋白、离子、元素和混合物等的溶液的浓度测定和纯度分析。

传统的紫外-可见-红外分光光度计使用10mm×10mm的石英比色皿，虽然具有较高的测量灵敏度，但是具有以下缺点：1)待测样品用量多，一般测量溶液体积要达到几百微升；2)测量范围窄，需要先稀释后测量，操作繁琐；3)每测量一种样品后，清洗比色皿困难；4)仪器的体积大、结构复杂。

以上这些问题，使得传统的分光光度计并不适用于微量珍贵生物样品的高通量检测。为此，美国的Nanodrop公司申请了一项专利(WO 01/4855，US 2002/0140931)，原理上依然是采用传统的透射式单光程样品吸收方案，但样品用量很少，2微升左右。它利用液体表面张力在两个固体表面间形成待测液滴，两表面之一可以相对另一个运动，达到以下三种位置：1)相距较远的加样位置，方便添加样品和使用之后的擦拭；2)距离最近的压缩位置，使得液滴与两个表面均相互接触；3)液滴被拉伸的测量位置，此时液滴由于表面张力形成液柱，从而达到测量所需的光程。在此专利基础上，该公司又申请了两项国际专利，一项是荧光光谱检测装置(WO2006/086459)，另一项是八个检测头的并行检测装置(WO 2007/111838)。

类似上述的微型分光光度计仍然存在着很多问题，如测量精度较低，重复性不好，仪器的结构比较复杂而且原件成本昂贵，由此产生了对新型的用于微量液体样品检测的紫外-可见-红外分光光度计的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光纤反射式微纳体系分光光度计。

本发明提供的光纤反射式微纳体系分光光度计，包括如下元件：激发光源、一端与激发光源相连的发射光纤、光谱仪以及一端与光谱仪相连的接收光纤，在此基础上，所述发射光纤的另一端和所述接收光纤的另一端组合成联合接口；在所述联合接口的端面的对侧设置一具光反射面的光反射装置；所述联合接口的端面与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

上述光反射装置可以是一反射镜，在本发明中，只要光反射装置的光反射面可以较好地反光即可，具体可以是各种镀膜反射面，也可以是非镀膜但具有较好光反射能力的固体表面。

上述容置待测样品的液滴容置间隙是指待测样品在检测时的厚度，该厚度介于被压缩至最短厚度和被拉伸至最长厚度之间。

为了保护上述联合接口的端面，在所述联合接口的端面处可设置有用来保护联合接口的端面的石英平板保护层A，该石英平板保护层A与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

为了保护光反射面，在所述光反射面处可设置有用来保护光反射面的石英平板保护层B，所述石英平板保护层B与所述联合接口的端面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

为了同时保护上述联合接口的端面和光反射面，在所述联合接口的端面处可设置有用来保护联合接口的端面的石英平板保护层A，在所述光反射面处设置有用来保护光反射面的石英平板保护层B，所述石英平板保护层B与所述石英平板保护层A之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

采用上述分光光度计，具有大于2倍待测样品厚度d的光程，这样有利于减少样品的用量，提高检测灵敏度。测量光程可以根据所测样品的种类和浓度不同而做出相应的改变。

为了将激发光源发出的光准直成平行光射入待测样品，可在所述光反射面和所述联合接口的端面之间设置一光纤耦合准直镜；所述光纤耦合准直镜与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。所述联合接口的端面正好位于所述光纤耦合准直镜的焦平面。

在一实施例中，可在所述石英平板保护层B与所述联合接口的端面之间设置有光纤耦合准直镜；所述光纤耦合准直镜与所述石英平板保护层B之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。所述联合接口的端面正好位于所述光纤耦合准直镜的焦平面。

采用上述分光光度计，具有2倍待测样品厚度d的光程，这样可以简化吸光度与被测样品含量的计算，提高光能量利用率。

在一实施例中，为了保护光纤耦合准直镜，可在所述光纤耦合准直镜的端面设置一用来保护光纤耦合准直镜的石英平板保护层C，所述石英平板保护层C与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

在另一实施例中，在所述光纤耦合准直镜的端面设置有一用来保护光纤耦合准直镜的石英平板保护层C，所述石英平板保护层C与所述所述石英平板保护层B之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

任一上述的石英平板保护层均可根据现有技术换成透明保护材料。

任一上述的容置待测样品的液滴容置间隙的垂直距离可以是0.05-2mm。

上述发射光纤和接收光纤组成的光纤组件可包括一根中心光纤和至少一根周围光纤。

中心光纤的芯径可以与周围光纤的芯径相同，也可以不同。

在一种情况下，如图6a所示，上述中心光纤为发射光纤，上述周围光纤为接收光纤。

在另一种情况下，如图6b所示，所述中心光纤为接收光纤，所述周围光纤为发射光纤。

本发明的光纤组件的内部结构还可以是通过先进的光纤分叉技术，由两根分支光纤通过端面直接耦合合成一根光纤输出的结构形式。

上述分光光度计还包括一与所述反射装置固定连接的可调节的定位装置。定位装置用于固定反射镜保证光线能被镜面反射回来，并且可以根据使用需要通过电机自动控制或手动实现直上直下平行移动反射镜，或绕一固定轴旋转移动反射镜，还可以是一个手柄通过手工自由移动反射镜，以便利用移液枪添加被测样品，或在完成检测后清理干净检测装置中被测样品的接触表面。

上述激发光源是单色光源或复色光源。

上述单色光源可以是激光或单色LED；所述复色光源可以是白光LED、氘灯、卤钨灯、氙灯或白炽灯。

上述光谱仪可接收紫外光、可见光或红外光，该光谱仪安装好信号提取与分析软件后，要求具有紫外光、可见光和红外光等三种波段范围中的一种或多种波段的光谱测量功能，并且可以对光谱吸收信号进行分析处理，计算吸光度与待测样品的含量。本发明的光谱仪可换成任何一种光探测器，只要能测量特定波长光线的光强均可，可以选用与滤光片配合使用的光电倍增管、光电池等元件。

系统结构中还可以采用滤光片分束镜与其它光电探测器组合的形式对反射回来的光进行接收，然后进行分析处理，计算吸光度与被测样品的含量。

任一上述分光光度计的容置待测样品的上下两个表面实现以下两种状态：

1)一表面与另一表面之间形成的间隙大于所述容置待测样品的液滴容置间隙，此种状态是使两个表面的相对距离分开较远，适合进行待测样品的加样和测量完成后的清洁擦拭；

2)一表面与另一表面之间形成的间隙是所述容置待测样品的液滴容置间隙，此种状态是使两个表面的相对距离处在较近的测量位置，实现测量光程0.05mm-2mm，达到微纳升体系样品溶液的吸光度测量要求。

本发明的另一目的在于提供利用上述分光光度计进行分光光度测量的方法。

本发明提供的分光光度测量的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品滴在所述容置待测样品的液滴容置间隙里；

2)调节所述光反射装置，使得光反射装置的光反射面向待测样品运动，并接触所述待测样品；

3)打开激发光源，读取光谱仪上显示的数据，并计算出吸光度变化与所对应的样品含量浓度。

上述步骤1)中，容置待测样品的液滴容置间隙的垂直距离是0.05-2mm。

上述步骤2)中，调节所述反射装置可以通过上述的定位装置来实现。

本发明的待测样品可以处在被压缩状态下进行测量，并不要求必须是通过样品溶液表面张力形成液柱的状态。

本发明通过上述的设计，对于单链DNA溶液可以达到的具体性能指标如下：

1、系统适应的微量样品检测范围为1nL-2μL。

2、系统的检测灵敏度1ng/1μL。

3、系统的动态检测范围1-3000ng/μL。

由于使用的是反射式测量的光学系统，溶液中的测量光程是两个固体表面之间距离的二倍。这意味着待测的微量液体，只需被压缩而不必被拉伸成为液柱，就可以达到所需的测量光程。此种方式相比现有技术中采用的透射式单倍光程样品吸收方案，测量精度和重复性更好，所需的样品用量可以更少，而且液滴光程保持部分的结构得到简化，仪器的成本更低。

附图说明

图1是实施例1中待测样品直接光纤接触检测的一个示意图。

图2是实施例2中待测样品光纤耦合准直检测的一个示意图。

图3是本发明中待测样品检测其它实施例的示意图，a是实施例3的示意图；b是实施例4的示意图。

图4是实施例1中待测样品在测量位置的局部放大示意图(a)和被测样品二倍光程增强吸收的光路示意图(b)。

图5是实施例1中的反射式照明与反射光收集光纤组件结构的示意图。

图6是本发明中周围光纤和中心光纤的位置示意图，其中a：中心光纤为发射光纤，周围光纤为接收光纤；b：中心光纤是接收光纤，周围光纤是发射光纤。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、光纤反射式微纳体系分光光度计

本实施例提供的分光光度计，如图1所示，包括以下元件：一个反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13、一个激发光源11，一个光谱仪12以及安装在与光谱仪12相联的计算机上的信号提取与分析软件。

反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13的内部结构如图5所示，有1根中心光纤和7根周围光纤。中心光纤的上端与7根周围光纤的上端紧密排列组合而成的联合接口53，联合接口53的端面可放置待测样品；中心光纤的下端做成接口51，该接口51接入激发光源11(图6a)，该中心光纤作为发射光纤；7根周围光纤的下端紧密排列组合而成接口52，接口52接入光谱仪12(图6a)，所述周围光纤作为接收光纤。反射式照明与反射吸收光收集光纤13对紫外光、可见光和红外光均有良好的透射效率。

本实施例提供的分光光度计还包括一个反射镜15，其表面对紫外光、可见光或红外光具有良好的反射效率。该反射镜15位于所述反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13的联合接口53端面的对侧，与联合接口53端面相互平行，所述反射镜15与所述联合接口53端面之间形成的间隙是容置待测样品的液滴容置间隙。在使用时，可以将待测样品滴在该容置待测样品的液滴容置间隙里。该反射镜15的一端固定连接一反射镜定位装置16。反射镜定位装置16用于固定反射镜15，保证光线能被镜面反射回来，使被测样品的厚度达到合适的检测光程0.05mm至2mm，并且可以根据使用需要通过电机自动控制实现直上直下平行移动反射镜。

使用过程如下：

将一滴待测样品14滴在上述容置待测样品的液滴容置间隙中，具体操作如下：将待测样品14滴在反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13的联合接口53的端面上，电动调节反射镜定位装置16，使反射镜15下压，直至接触下压待测样品14，此时，联合接口53的端面与所述反射镜间之间的间隙是容置待测样品的液滴容置间隙，该间隙的垂直距离也即待测样品14的厚度d可调至0.05mm至2mm，此时待测样品14处于压缩状态，如图4(a)所示。

然后打开激发光源11，激发光源11发出的入射光通过反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13的中心光纤进入待测样品14，光线在待测样品14中的传播如图4(b)所示，光线以一个微小的角度在待测样品14中传播，然后被反射镜15反射折回再次经过待测样品14，最后被反射式照明与反射吸收光收集光纤组件13的周围光纤接收并被输入光谱仪12，由与光谱仪配套的信号提取与分析软件进行处理后计算吸光度与被测样品的含量。

采用本实施例提供的分光光度计，具有大于2倍待测样品14厚度d的光程，这样有利于减少样品的用量，提高检测灵敏度。

实施例2、光纤反射式微纳体系分光光度计

本实施例的分光光度计如图2所示，与实施例1的区别在于：在所述反射镜15和所述联合接口53的端面之间设置一光纤耦合准直镜21(联合接口53的端面位于光纤耦合准直镜21的焦平面)。光纤耦合准直镜21的作用是将激发光源发出的光线准直成平行光在待测样品中传播，然后被反射镜反射折回再次经过待测样品，具有2倍待测样品厚度d的光程，这样可以简化吸光度与被测样品含量的计算，提高光能量利用率。

使用过程如下：

将一滴待测样品14滴在容置待测样品的液滴容置间隙中，具体操作如下：滴一滴待测样品14于光纤耦合准直镜21的端面上，电动调节反射镜定位装置16，使反射镜15下压待测样品14，此时光纤耦合准直镜21的端面与所述反射镜之间的间隙是容置待测样品的液滴容置间隙，该间隙的垂直距离也即待测样品14的厚度d可调至0.05mm至2mm。然后打开激发光源其余步骤与实施例1相同。

实施例3、光纤反射式微纳体系分光光度计

本实施例的分光光度计如图3a所示，其与实施例2的区别在于：在所述光纤耦合准直镜21与所述反射镜15之间还设置有一用来保护光纤耦合准直镜21的石英板保护层22(石英保护层22与下面的光纤耦合准直镜21是紧密接触)。

使用过程如下：

将一滴待测样品14滴在容置待测样品的液滴容置间隙中，具体操作如下：滴一滴待测样品14于石英平板保护层22的端面上，调节反射镜定位装置16，使反射镜15下压待测样品14，此时石英平板保护层22的端面与所述反射镜之间的间隙是容置待测样品的液滴容置间隙，该间隙的垂直距离也即待测样品14的厚度d可调至0.05mm至2mm。然后打开激发光源其余步骤与实施例1相同。

实施例4、光纤反射式微纳体系分光光度计

本实施例的分光光度计如图3b所示，其与实施例3的区别在于：在反射镜15和石英平板保护层22之间还设置有一用来保护所述反射镜15的石英板保护层23(石英板保护层23与上面的反射镜15是紧密接触)。

将一滴待测样品14滴在容置待测样品的液滴容置间隙中，具体操作如下：滴一滴待测样品14于石英平板保护层22的端面上，调节反射镜定位装置16，使反射镜15下方的石英板保护层23下压待测样品14，此时石英平板保护层22的端面与所述石英板保护层23之间的间隙是容置待测样品的液滴容置间隙，该间隙的垂直距离也即待测样品14的厚度d可调至0.05mm至2mm。然后打开激发光源其余步骤与实施例1相同。

实施例5、本发明的光纤反射式微纳体系分光光度计的性能检测

按照实施例1中所述的光纤反射式微纳体系分光光度计的实现方案进行单链DNA溶液浓度测量实验，从而进行性能检测。具体步骤如下：

1、使用单链DNA引物(Invitrogen，Bejing)和TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)配置0.5-2000ng/μL的一系列浓度值的单链DNA溶液。

2、用现有技术中的仪器Nanodrop ND-1000测量该系列单链DNA溶液的浓度值，结果见下表中“Nanodrop”测量结果列，其中0.5和1ng/μL低于Nanodrop ND-1000的检测限，所以非测量值，而是理论值。

3、取1μL单链DNA溶液，在所述光纤反射式微纳体系分光光度计上测量浓度。下表中1-9号溶液的厚度d为0.5mm，10-14号溶液的厚度d为0.1mm。重复测量5次，结果见下表。

4、计算该系列单链DNA溶液的浓度值，和5次实验的标准差，结果见下表。

由实验结果可知，实施例1中所述的光纤反射式微纳体系分光光度计的线形范围是1-2000ng/μL，线形相关系数为0.999；低浓度检测限低于1ng/μL；由计算可知，在测量2ng/μL以上浓度时相对标准差小于±2％。因此，可以得出结论，实验证明所述的光纤反射式微纳体系分光光度计可以达到动态检测范围宽、检测限低、重复性好的性能特点。

Claims (19)

1.一种光纤反射式微纳体系分光光度计，包括如下元件：激发光源、一端与激发光源相连的发射光纤、光谱仪以及一端与光谱仪相连的接收光纤，其特征在于：

所述发射光纤的另一端和所述接收光纤的另一端组合成联合接口；

在所述联合接口的端面的对侧设置一具光反射面的光反射装置；

所述联合接口的端面与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙；

所述发射光纤和接收光纤组成的光纤组件包括一根中心光纤和至少一根周围光纤；

所述分光光度计还包括一与所述反射装置固定连接的可调节的定位装置。

2.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：在所述联合接口的端面设置有用来保护联合接口的端面的石英平板保护层A，所述石英平板保护层A与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

3.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：在所述光反射面上设置有用来保护光反射面的石英平板保护层B，所述石英平板保护层B与所述联合接口的端面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

4.根据权利要求2所述的分光光度计，其特征在于：在所述光反射面上设置有用来保护光反射面的石英平板保护层B，所述石英平板保护层B与所述石英平板保护层A之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

5.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：在所述光反射面和所述联合接口的端面之间设置有光纤耦合准直镜；所述光纤耦合准直镜与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

6.根据权利要求3所述的分光光度计，其特征在于：所述石英平板保护层B与所述联合接口的端面之间设置有光纤耦合准直镜；所述光纤耦合准直镜与所述石英平板保护层B之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

7.根据权利要求5或6所述的分光光度计，其特征在于：所述联合接口的端面位于所述光纤耦合准直镜的焦平面。

8.根据权利要求5所述的分光光度计，其特征在于：在所述光纤耦合准直镜的端面设置有一用来保护光纤耦合准直镜的石英平板保护层C，所述石英平板保护层C与所述光反射面之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

9.根据权利要求6所述的分光光度计，其特征在于：在所述光纤耦合准直镜的端面设置有一用来保护光纤耦合准直镜的石英平板保护层C，所述石英平板保护层C与所述所述石英平板保护层B之间形成的间隙为容置待测样品的液滴容置间隙。

10.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述容置待测样品的液滴容置间隙的垂直距离是0.05-2mm。

11.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述中心光纤为发射光纤，所述周围光纤为接收光纤。

12.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述中心光纤为接收光纤，所述周围光纤为发射光纤。

13.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述激发光源是单色光源或复色光源。

14.根据权利要求13所述的分光光度计，其特征在于：所述单色光源是激光或单色LED；所述复色光源是白光LED，卤钨灯，氘灯，氙灯或白炽灯。

15.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述光谱仪接收紫外光、可见光、红外光中三种波段范围中的一种或多种波段的光强和波长信息。

16.根据权利要求1所述的分光光度计，其特征在于：所述分光光度计的容置待测样品的上下两个表面实现以下两种状态：

1)一表面与另一表面之间形成的间隙大于所述容置待测样品的液滴容置间隙；

2)一表面与另一表面之间形成的间隙是所述容置待测样品的液滴容置间隙。

17.一种利用权利要求1-16任一所述的分光光度计进行分光光度测量的方法，包括以下实施步骤：

1)将待测样品滴在所述容置待测样品的液滴容置间隙里；

2)调节所述光反射装置，使得光反射装置的光反射面向待测样品运动，并接触所述待测样品；

3)打开激发光源，读取光谱仪的数据，并计算出吸光度变化与所对应的样品含量浓度。

18.根据权利要求17的方法，其特征在于：所述步骤1)中，容置待测样品的液滴容置间隙的垂直距离是0.05-2mm。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，调节所述反射装置是通过调节所述定位装置来实现的。

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