JP2003202292A

JP2003202292A - 蛍光寿命測定装置および方法

Info

Publication number: JP2003202292A
Application number: JP2001401146A
Authority: JP
Inventors: Shinji Osuga; 慎二大須賀
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2003-07-18

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光寿命を高精度かつ高効率に測定すること
ができる蛍光寿命測定装置および方法を提供する【解決手段】平均検出光子数推定手段としての演算部
８０は、メモリ７０により生成された波形積分値の分布
に基づいて、パルス励起光Ｌ₁のパルス照射１回当たり
に試料２から放出され光検出器２０により検出された蛍
光光子の平均検出個数を推定する。蛍光寿命推定手段と
しての演算部８０は、メモリ７０により生成されたピー
ク波高値の分布、および、上記の推定された蛍光光子の
平均検出個数に基づいて、試料２から放出された蛍光Ｌ
₂の寿命を推定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、励起光が照射され
た試料から放出される蛍光の寿命を測定する蛍光寿命測
定装置および方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、蛍光性物質等を含む試料から放出
される蛍光の寿命を測定するに際しては、一般的に時間
相関単一光子計数法が用いられていた。この測定方法に
おいては、試料にパルス励起光を照射した時点から試料
より放出された蛍光光子が検出される時点までの時間間
隔が測定される。そして、パルス励起光照射を複数回行
ってこの時間間隔の分布を求め、その分布に基づいて蛍
光寿命を算出している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところで、上記従来の
測定方法においては、パルス励起光照射１回当たりに検
出される蛍光光子の個数が平均０．０２個程度でなけれ
ば、蛍光寿命を高精度に測定ができない。このような状
況では、蛍光寿命を算出するに足りるデータを取得する
ためには、パルス励起光照射を多数回繰り返し行わなけ
ればならず、そのため測定に長い時間がかかり、測定効
率が低いという問題点があった。

【０００４】本発明は、上記の問題点を解決するために
なされたもので、蛍光寿命を高精度かつ高効率に測定す
ることができる蛍光寿命測定装置および方法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光寿命測
定装置は、パルス励起光を試料に照射し、この試料から
放出される蛍光の寿命を測定する蛍光寿命測定装置であ
って、(1) 試料に対してパルス励起光を照射する光源
と、(2) パルス励起光が照射された試料から放出される
蛍光光子を検出して、その検出に応じた出力パルスを出
力する光検出器と、(3) パルス励起光の照射１回毎に光
検出器から出力される出力パルスの波形積分値およびピ
ーク波高値それぞれを出力する波形処理手段と、(4) 波
形処理手段から出力される波形積分値の分布に基づい
て、パルス励起光の照射１回当たりに試料から放出され
光検出器により検出される蛍光光子の平均検出個数を推
定する平均検出光子数推定手段と、(5) 波形処理手段か
ら出力されるピーク波高値の分布、および、平均検出光
子数推定手段により推定された蛍光光子の平均検出個数
に基づいて、試料から放出される蛍光の寿命を推定する
蛍光寿命推定手段と、を備えることを特徴とする。

【０００６】本発明に係る蛍光寿命測定方法は、パルス
励起光を試料に照射し、この試料から放出される蛍光の
寿命を測定する蛍光寿命測定方法であって、(1) 試料に
対してパルス励起光を照射し、(2) パルス励起光が照射
された試料から放出される蛍光光子を光検出器により検
出して、その検出に応じた出力パルスを光検出器より出
力させ、(3) パルス励起光の照射１回毎に光検出器から
出力される出力パルスの波形積分値およびピーク波高値
それぞれを求め、(4) 求められた波形積分値の分布に基
づいて、パルス励起光の照射１回当たりに試料から放出
され光検出器により検出される蛍光光子の平均検出個数
を推定し、(5) 求められたピーク波高値の分布、およ
び、推定された蛍光光子の平均検出個数に基づいて、試
料から放出される蛍光の寿命を推定する、ことを特徴と
する。

【０００７】本発明によれば、蛍光分子を含む試料にパ
ルス励起光が繰り返し照射され、その試料から放出され
る蛍光光子が光検出器により検出され、その検出に応じ
た出力パルスが光検出器より出力される。パルス励起光
の照射１回毎に光検出器から出力される出力パルスの波
形積分値およびピーク波高値それぞれが求められ、波形
積分値およびピーク波高値それぞれの分布が求められ
る。そして、求められた波形積分値の分布に基づいて、
パルス励起光の照射１回当たりに試料から放出され光検
出器により検出される蛍光光子の平均検出個数が推定さ
れる。さらに、求められたピーク波高値の分布、およ
び、推定された蛍光光子の平均検出個数に基づいて、試
料から放出される蛍光の寿命が推定される。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明にお
いて同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を
省略する。

【０００９】図１は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置１の構成図である。この図に示される蛍光寿命測定装
置１は、蛍光分子を含む試料２にパルス励起光Ｌ₁を照
射し、この試料２から放出される蛍光Ｌ₂の寿命を測定
するものである。蛍光寿命測定装置１は、光源１０、光
検出器２０、増幅器３０、積分回路４１、ピークホール
ド回路４２、マルチプレクサ５０、Ａ／Ｄ変換器６０、
メモリ７０、演算部８０および制御部９０を備えてい
る。

【００１０】光源１０は、試料２に対して照射すべきパ
ルス励起光Ｌ₁を繰り返し出力するものであり、例え
ば、パルスレーザ光源が好適に用いられる。光源１０と
試料２との間に設けられたレンズ１１は、光源１０から
出力されたパルス励起光Ｌ₁を試料２に集光照射する。
試料２と光検出器２０との間に設けられたレンズ１２お
よびレンズ１３は、パルス励起光Ｌ₁が照射された試料
２から放出された蛍光Ｌ₂を光検出器２０の受光面上に
集光する。

【００１１】光検出器２０は、試料２から放出されレン
ズ１２，１３を経て到達した蛍光Ｌ ₂を受光し、その受
光した蛍光Ｌ₂の光子を検出して、その蛍光光子の検出
に応じた出力パルスを出力するものである。増幅器３０
は、光検出器２０より出力された出力パルスを一定利得
で増幅し、その増幅した出力パルスを積分回路４１およ
びピークホールド回路４２それぞれに対して出力する。

【００１２】積分回路４１は、試料２へのパルス励起光
Ｌ₁のパルス照射１回毎に、光検出器２０より出力され
増幅器３０により増幅された出力パルスを入力し、この
出力パルスの波形を積分して波形積分値を出力する。ピ
ークホールド回路４２は、試料２へのパルス励起光Ｌ₁
のパルス照射１回毎に、光検出器２０より出力され増幅
器３０により増幅された出力パルスを入力し、この出力
パルスのピーク波高値を求め、このピーク波高値を一定
時間保持するとともに出力する。このように、積分回路
４１およびピークホールド回路４２は、請求項の記載中
にある波形処理手段として作用する。

【００１３】マルチプレクサ５０は、積分回路４１より
出力される波形積分値と、ピークホールド回路４２より
出力されるピーク波高値とを入力する。そして、マルチ
プレクサ５０は、制御部４０による制御の下に、試料２
へのパルス励起光Ｌ₁のパルス照射１回毎に、波形積分
値およびピーク波高値を順に出力する。Ａ／Ｄ変換器６
０は、マルチプレクサ５０より順に出力される波形積分
値およびピーク波高値を入力し、これらをデジタル値に
変換して出力する。

【００１４】メモリ７０は、積分回路４１より出力され
Ａ／Ｄ変換器６０によりデジタル値とされた波形積分値
を入力し、この波形積分値の頻度の分布を生成する。ま
た、このメモリ７０は、ピークホールド回路４２より出
力されＡ／Ｄ変換器６０によりデジタル値とされたピー
ク波高値を入力し、このピーク波高値の頻度の分布を生
成する。

【００１５】演算部８０は、メモリ７０により生成され
た波形積分値の分布に基づいて、パルス励起光Ｌ₁のパ
ルス照射１回当たりに試料２から放出され光検出器２０
により検出された蛍光光子の平均検出個数を推定する。
さらに、演算部８０は、メモリ７０により生成されたピ
ーク波高値の分布、および、上記の推定された蛍光光子
の平均検出個数に基づいて、試料２から放出された蛍光
Ｌ₂の寿命を推定する。このように、演算部８０は、請
求項の記載中にある平均検出光子数推定手段および蛍光
寿命推定手段の双方として作用する。

【００１６】制御部９０は、蛍光寿命測定装置１の全体
の動作を制御するものである。制御部９０は、光源１０
がパルス励起光Ｌ₁をパルス出力するタイミングを指示
する信号を光源１０より受け取り、このタイミングに同
期して積分回路４１、ピークホールド回路４２、マルチ
プレクサ５０およびＡ／Ｄ変換器６０それぞれが動作す
るよう、これらを制御する。また、制御部９０は、光源
１０がパルス励起光Ｌ ₁を所定回数だけパルス出力した
後に、演算部８０に対して上記の処理を行うよう指示す
る。

【００１７】図２は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置１の光検出器２０の断面図である。この図に示される
光検出器２０は、パルス状の入射光束Ａを受光し、その
入射光束Ａの光量に応じた光電子数分布に従った個数の
光電子Ｂを放出し、その光電子Ｂを増倍して電流信号を
出力するものである。この光検出器２０は、アバランシ
ェフォトダイオード（以下「ＡＰＤ」という。）を利用
したものである。

【００１８】この光検出器２０は、内部が真空に保たれ
ている真空容器２１の一部に入射窓２２が設けられてお
り、入射光束Ａは、その入射窓２２を透過して、光電変
換面２３に到達する。光電変換面２３には、ＡＰＤ２５
のアノード２６に対して例えば−１０ｋＶないし−１５
ｋＶの高電圧が印加されており、入射光束Ａが光電変換
面２３に入射すると、その入射光束Ａの光量に応じた光
電子数分布に従った個数の光電子Ｂが放出される。そし
て、その光電子Ｂは、光電変換面２３とＡＰＤ２５との
間の電界によって加速され、中央部に開口を有し所定電
位に設定された集束電極２４によって集束されて、ＡＰ
Ｄ２５に入射する。

【００１９】このＡＰＤ２５は、アノード２６とカソー
ド２７との間に逆バイアス電圧（例えば、＋１４５Ｖ）
が印加され、且つ、光電変換面２３に対向するアノード
２６の電位は光電変換面２３の電位よりも高電位に設定
されている。このＡＰＤ２５に光電子Ｂが衝突すると、
電離作用により光電子がＡＰＤ２５中で失ったエネルギ
３．６ｅＶ当たり１対の電子および正孔が生成され、そ
して、この電子・正孔対は、ＡＰＤ２５内で、逆バイア
ス電圧に応じたアバランシェ増倍率でアバランシェ増倍
され、アノード端子２６ａおよびカソード端子２７ａの
間に電流信号として出力される。ただし、光電子がＡＰ
Ｄ２５内で失うエネルギは一定値ではなく或る分布に従
うので、また、ＡＰＤ２５の増倍率も一定値ではなく或
る増倍率分布に従うので、１個の光電子の入射により出
力される電流信号の大きさも或る分布を有する。

【００２０】したがって、光検出器２０が一定光量の光
束を多数回測定すると、光電変換面２３で放出される光
電子の個数分布（光電子数分布）は、光量に応じた或る
平均値の周りに広がった分布となり、光検出器２０から
出力される電流信号は、光電子１個によりＡＰＤ２５か
ら出力される電子・正孔対の個数の分布に従って更に広
がりのある分布となる。このＡＰＤ２５を利用した光検
出器２０は、光電子増倍管と同様に単一光子をも計数で
き、さらに、光電子増倍管と比較して増倍雑音が小さい
ので、一定光量の光束を多数回測定して得られる電流信
号の波高分布において、ｋ-光子事象（光電変換面２３
から放出された光電子の個数がｋ個（ｋ=１，２，３，
…）である事象）それぞれに対応するピークを識別する
ことができるという優れた特徴を有する。このような特
徴を有することから、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置１に用いるに好適なものである。

【００２１】次に、本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
１の演算部８０における処理の内容について説明すると
ともに、本実施形態に係る蛍光寿命測定方法についても
説明する。

【００２２】図３は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置１の演算部８０における処理の内容の概要を説明する
図である。この図に示されるように、演算部８０は、平
均検出光子数推定手段および蛍光寿命推定手段それぞれ
として作用する。平均検出光子数推定手段としての演算
部８０は、メモリ７０により生成された波形積分値の分
布に基づいて、パルス励起光Ｌ₁のパルス照射１回当た
りに試料２から放出され光検出器２０により検出された
蛍光光子の平均検出個数を推定する。蛍光寿命推定手段
としての演算部８０は、メモリ７０により生成されたピ
ーク波高値の分布、および、上記の推定された蛍光光子
の平均検出個数に基づいて、試料２から放出された蛍光
Ｌ₂の寿命を推定する。以下では、演算部８０における
平均検出光子数推定処理および蛍光寿命推定処理それぞ
れの内容について詳細に説明する。

【００２３】次に、本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
１の演算部８０における平均検出光子数推定処理の内容
について詳細に説明する。

【００２４】初めに、演算部８０は、単一光子事象の場
合にメモリ７０で生成される単一光子事象波形積分値分
布を取得する。ここで、単一光子事象とは、パルス励起
光Ｌ ₁のパルス照射１回当たりに光検出器２０の光電変
換面２３から放出される光電子の個数が１個である事象
をいい、単一光子事象波形積分値分布とは、その事象が
発生した場合にメモリ７０で生成される波形積分値分布
である。すなわち、単一光子事象波形積分値分布は、光
電変換面２３で放出された１個の光電子がＡＰＤ２５に
入射したことによりＡＰＤ２５から出力される電子・正
孔対の個数の分布を表すものである。

【００２５】この単一光子事象波形積分値分布は以下の
ようにして求められる。すなわち、光電変換面２３へ入
射する光束の強度を、単一光子事象が発生する確率が圧
倒的に支配的となるように極めて微弱にして、その光束
を光検出器２０に入射させる。このときに積分回路４１
より出力されＡ／Ｄ変換器６０によりデジタル値に変換
された波形積分値の分布がメモリ７０により生成され
る。このようにして得られた波形積分値分布が、単一光
子事象波形積分値分布である。この単一光子事象波形積
分値分布を、波形積分値ｈの関数としてｍ₁(ｈ)で表
す。ｈは、Ａ／Ｄ変換器６０から出力されるデジタル値
であり、積分回路４１から出力される波形積分値（アナ
ログ値）と対応している。

【００２６】なお、このｍ₁(ｈ)の低波高部には増幅器
系のノイズが重畳しているので、実データを使用するこ
とができない。そこで、低波高部では実データを用いる
ことなく、ノイズが重畳していない隣接した波高域のデ
ータから外挿して求める。また、ｍ₁(ｈ)は、

【００２７】

【数１】なる式で規格化しておく。ｈ_maxは、波形積分値をデジ
タル値に変換するＡ／Ｄ変換器６０のビット数で決まる
最大値である。

【００２８】続いて、演算部８０は、ｋ-光子事象波形
積分値分布、すなわち、パルス励起光Ｌ₁のパルス照射
１回当たりに光検出器２０の光電変換面２３から放出さ
れる光電子の個数がｋ個である場合の波形積分値分布ｍ
_k(ｈ)を、

【００２９】

【数２】なるコンボリューション計算によって漸化的に算出する
（ｋ＝２，３，…，Ｋ）。Ｋは２以上の整数である。

【００３０】光子数分布を推定する際に任意の分布を仮
定する場合には、ｍ₁(ｈ)のピーク値を与える積分波形
値をｈ_peak1として、Ｋ＝ｈ_max／ｈ_peak1とする。ｈ_max
＝４０９５、ｈ_peak1＝４００であれば、Ｋは１０程度
である。また、光子数分布としてポアソン分布を仮定す
る場合には、Ｋは、ｈ_max／ｈ_peak1の２ないし３倍程
度、すなわち、ｈ_max＝４０９５、ｈ_peak1＝４００であ
れば、Ｋは３０程度にする。なお、以上のようにして波
形積分値分布ｍ_k-1(ｈ)とｍ₁(ｈ)とのコンボリューショ
ン計算から波形積分値分布ｍ_k(ｈ)を求めることができ
ることの根拠は、光電変換面２３で放出されＡＰＤ２５
に入射したｋ個の光電子が、それぞれ独立に電子・正孔
対をアバランシェ増倍することに基づく。

【００３１】なお、光検出器２０、増幅器３０および積
分回路４１それぞれにおいて発生するノイズに起因する
波形積分値分布の広がりが無視できない場合には、波形
積分値分布ｍ₁(ｈ)からそのノイズの影響をデコンボリ
ューション計算によって取り除いたものに基づいて、
（２）式で波形積分値分布ｍ_k(ｈ)それぞれを算出し、
その後、波形積分値分布ｍ_k(ｈ)それぞれにノイズの影
響をコンボリューション計算によって重畳しておく（ｋ
＝２，３，…，Ｋ）。

【００３２】以上のようにして、ノイズの影響を考慮し
た波形積分値分布ｍ_k(ｈ)（ｋ＝１，２，３，…，Ｋ）
を、蛍光測定に先立って用意しておく。図４は、このよ
うにして求められたｋ-光子事象の積分波形値分布ｍ
_k(ｈ)それぞれを示す図である。なお、この図では、Ｋ
＝８としてある。

【００３３】そして、演算部８０は、光源１０よりパル
ス励起光Ｌ₁が試料２に繰り返しパルス照射されること
でメモリ７０により生成された波形積分値分布ｍ
_meas(ｈ)を取得する。演算部８０は、この波形積分値分
布ｍ_meas(ｈ)および上述した単一光子事象およびｋ-光
子事象それぞれ場合の波形積分値分布ｍ_k(ｈ)（ｋ＝
１，２，３，…，Ｋ）に基づいて、試料２から放出され
て光電変換面２３に入射した蛍光Ｌ₂の光子の平均検出
個数を、以下の要領で推定する。

【００３４】この波形積分値分布ｍ_meas(ｈ)は、規格化
する必要はなく、メモリ７０に蓄積されたままの値でよ
い。すなわち、波形積分値分布ｍ_meas(ｈ)は、波形積分
値ｈが得られた事象の分布を表す。光検出器２０の光電
変換面２３から放出された光電子の個数の分布（検出さ
れた光子数の分布）の推定に際しては例えば最尤法を用
いる。すなわち、ｋ-光子事象それぞれが生起する確率
をｑ_k（ｋ＝１，２，３，…，Ｋ）として、

【００３５】

【数３】なる式で表される対数尤度が最大になるｑ_kの値を求
め、これを推定検出光子数分布とする。

【００３６】ここで、Ｎは測定回数であり、ｈ_minは解
析に使用できる最小の波形積分値ｈである。波形積分値
ｈが小さい場合には、光検出器２０や増幅器３０などに
因るノイズが重畳されているので解析には使用できない
ので、波形積分値ｈ_min以上についてのみ解析する。ま
た、ｍ(ｈ)およびｍ_NDは、

【００３７】

【数４】

【００３８】

【数５】なる式で表される。このｍ(ｈ)は、ｋ-光子事象（ｋ＝
１，２，３，…，Ｋ）それぞれの生起確率ｑ_k（光子数
分布）をも考慮した波形積分値ｈの発生確率分布を表
す。（３）式の対数尤度を最大とするｑ_kの値を求める
には、例えば最適化問題に対して使われる準ニュートン
法等の数値計算法を適用する。

【００３９】検出された光子数の分布としてポアソン分
布を仮定する場合には、ｋ-光電子事象それぞれが生起
する確率ｑ_k（ｋ＝１，２，３，…，Ｋ）は、

【００４０】

【数６】で表される。ここで、λは、光電変換面２３から放出さ
れる光電子の、すなわち検出された蛍光光子の平均検出
個数である（平均検出光子数）。この場合、対数尤度を
最大とする検出された光子数の分布を求めることは、対
数尤度を最大とするλ値を求めることであり、例えば黄
金分割法等の数値計算により求めることができる。以下
では、検出された光子数の分布としてポアソン分布を仮
定する。図５は、蛍光Ｌ₂を光検出器２０で受光してメ
モリ７０に生成された波形積分値分布（破線）と、最尤
法で推定されたλ値に基づいて計算された波形積分値分
布（実線）との１例を示す図である。両者は、波形積分
値ｈ_min（＝１５０）以上の範囲で良い一致を示してい
る。なお、このとき推定された蛍光光子の平均検出個数
λは１．０３であった。

【００４１】次に、本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
１の演算部８０における蛍光寿命推定処理の内容につい
て詳細に説明する。この蛍光寿命推定処理は、上述した
平均検出光子数推定処理の後に行われる。

【００４２】初めに、演算部８０は、単一光子事象の場
合にメモリ７０で生成される単一光子事象ピーク波高値
分布を取得する。ここで、単一光子事象ピーク波高値分
布とは、単一光子事象が発生した場合にメモリ７０で生
成されるピーク波高値分布である。この単一光子事象ピ
ーク波高値分布は以下のようにして求められる。すなわ
ち、光電変換面２３へ入射する光束の強度を、単一光子
事象が発生する確率が圧倒的に支配的となるように極め
て微弱にして、その光束を光検出器２０に入射させる。
このときにピークホールド回路４２より出力されＡ／Ｄ
変換器６０によりデジタル値に変換されたピーク波高値
の分布がメモリ７０により生成される。このようにして
得られたピーク波高値分布が、単一光子事象ピーク波高
値分布である。この単一光子事象ピーク波高値分布を、
ピーク波高値ｈの関数としてｎ(ｈ)で表す。ｈは、Ａ／
Ｄ変換器６０から出力されるデジタル値であり、ピーク
ホールド回路４２から出力されるピーク波高値（アナロ
グ値）と対応している。

【００４３】このｎ(ｈ)は増幅器３０およびピークホー
ルド回路４２のノイズの影響を受けているので、ｎ(ｈ)
からデコンボリューションによってノイズの影響を除去
し、このノイズの影響を除去したものを単一光子事象ピ
ーク波高値分布Ｎ(ｈ)とする。さらに、この単一光子事
象ピーク波高値分布Ｎ(ｈ)に基づいて、単一光子事象に
ついてのピーク波高値の確率関数ｐ(ｈ｜１)を、

【００４４】

【数７】なる式で求める。

【００４５】また、適当な間隔で蛍光寿命の系列
｛τ₁，τ₂，τ₃，…｝を選択する。そして、各τ_jにつ
いて、上記の確率関数ｐ(ｈ｜１)と、蛍光減衰が単一指
数関数で表されるとした場合のパルス励起光照射時刻か
ら蛍光光子検出時刻までの時間の分布とから、ｍ個の蛍
光光子を検出した場合のピーク波高値の確率関数ｐ_j(ｈ
｜ｍ)を以下の手順で計算する（ｊ＝１，２，３，
…）。

【００４６】手順１では、確率関数ｐ(ｈ｜１)に従うｍ
個の乱数ｈ₁，ｈ₂，…，ｈ_mを生成する。また、平均値
がτ_jである指数分布に従うｍ個の乱数ｔ₁，ｔ₂，…，
ｔ_mを生成する。

【００４７】手順２では、光検出器２０から出力される
出力パルスの減衰時定数をＴとして、パルス励起光照射
時刻から時間ｔ_k経過時における波高値ｆ(ｔ_k)を、

【００４８】

【数８】なる式で求める（ｋ＝１，２，…，ｍ）。ここで、ｘ
は、増幅器３０およびピークホールド回路４２から出力
されるノイズ成分であり、平均値０で標準偏差σの正規
分布に従う乱数で与えられる。標準偏差σは、パルス発
振器から出力される一定波高値のパルス信号を増幅器３
０に入力してピークホールド回路４２から出力されるピ
ーク波高値の分布から予め求めておく。

【００４９】さらに、

【００５０】

【数９】なる式で表されるピーク波高値ｈを求め、また、

【００５１】

【数１０】なる式で表される波形積分値ｖをも求める。個々の蛍光
光子の検出による波高値の和を波形積分値に変換する関
数Φは、ｔ₁〜ｔ_mの各値が減衰時定数Ｔより充分に小さ
い光源（例えば、短パルス発光ダイオード）の発光を光
検出器２０により測定して、波形積分値分布とピーク波
高値分布とを比較することにより求めることができる。

【００５２】以上の手順１および手順２を多数回繰り返
して、（１０）式で求めた波形積分値ｖが予め定めた範
囲（ｖ_LLD≦ｖ≦ｖ_ULD）にある事象について、（９）式
で求めたピーク波高値ｈの分布を求め、これによりピー
ク波高値ｈの条件付確率関数ｐ_j(ｈ｜ｍ)を求める。

【００５３】上述した平均検出光子数推定処理において
推定された値λ（パルス励起光Ｌ₁のパルス照射１回当
たりに光検出器２０により検出された蛍光光子の平均検
出個数の推定値）を用い、また、パルス励起光Ｌ₁のパ
ルス照射１回当たりに光検出器２０により検出される蛍
光光子の個数が平均値λのポアソン分布に従うと仮定す
る。

【００５４】このとき、蛍光寿命がτ_jであるとした場
合のピーク波高値の確率関数ｐ_j(ｈ)は、

【００５５】

【数１１】なる式で表される。ここで、Ｑ_mは、パルス励起光Ｌ₁の
パルス照射１回当たりに光検出器２０によりｍ個の蛍光
光子が検出される事象の波形積分値ｖ（上記（１０）
式）が予め定めた範囲（ｖ_LLD≦ｖ≦ｖ_ULD）にある確率
である。また、Ｍは、計算に採り入れるべきｍの上限値
である。

【００５６】そして、実際の蛍光Ｌ₂の測定により得ら
れたピーク波高値分布ｇ(ｈ)に対する、蛍光寿命がτ_j
であるとした場合のピーク波高値の確率関数ｐ_j(ｈ)の
適合度は、

【００５７】

【数１２】なる式で表される対数尤度logＬ_jを指標として表され
る。

【００５８】この対数尤度logＬ_jを適当な補間法（例え
ばスプライン補間）によりτ_jについて補間して、蛍光
寿命τを変数とする関数としての対数尤度logＬ(τ)を
求める。そして、この対数尤度logＬ(τ)が最大となる
蛍光寿命τの値を求め、この値を試料２から放出される
蛍光Ｌ₂の寿命の推定値とする。

【００５９】次に、本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
１および蛍光寿命測定方法について模擬実験を行った結
果を説明し、これにより本測定方法の有効性を示す。こ
の模擬実験では、試料２より放出される蛍光Ｌ₂に替え
て、パルス駆動された発光ダイオードから出力されるパ
ルス光を模擬蛍光として用い、この模擬蛍光の寿命を推
定した。平均検出光子数推定処理において求められた模
擬蛍光光子の平均検出個数の推定値λは２．７６であっ
た。

【００６０】図６は、模擬実験の蛍光寿命推定処理にお
いて求められた波形積分値ｖ（上記（１０）式）の分布
を示す図である。この図で、波形積分値（Ａ／Ｄ変換器
６０からの出力値）ｖがｖ_LLD（＝２００）以上である
事象は、発光ダイオードの１パルス出力当たりに光検出
器２が複数個の光子を検出した事象であり、模擬蛍光の
寿命を推定する際に利用できる事象である。

【００６１】図７は、模擬実験の蛍光寿命推定処理にお
いて求められたピーク波高値ｈ（上記（９）式）の分布
を示す図である。この図には、波形積分値ｖが所定範囲
（ｖ _LLD≦ｖ≦ｖ_ULD）にある事象についてピーク波高値
分布が示されている。

【００６２】図８は、模擬実験の蛍光寿命推定処理にお
いて求められたピーク波高値ｈの条件付確率関数ｐ_j(ｈ
｜ｍ)を示す図である。ここでは、ｍ＝２〜８とし、発
光ダイオードから出力される模擬蛍光の減衰時定数（蛍
光寿命に相当）を２００ｎｓとして条件付確率関数ｐ
_j(ｈ｜ｍ)を求めた。また、模擬蛍光の減衰時定数を２
００ｎｓとしただけでなく、適当な間隔で１４０ｎｓ〜
２６０ｎｓの間の各減衰時定数（１４０ｎｓ，１６０ｎ
ｓ，１７０ｎｓ，１８０ｎｓ，１９０ｎｓ，２００ｎ
ｓ，２１０ｎｓ，２２０ｎｓ，２３０ｎｓ，２４０ｎ
ｓ，２６０ｎｓ）についても条件付確率関数ｐ_j(ｈ｜
ｍ)を求めた。

【００６３】そして、これらの模擬蛍光の各減衰時定数
についての条件付確率関数ｐ_j(ｈ｜ｍ)と、平均検出光
子数推定処理において求められた模擬蛍光光子の平均検
出個数の推定値λ（＝２．７６）とに基づいて、ピーク
波高値の確率関数ｐ_j(ｈ)（上記（１１）式）を求め、
さらに、対数尤度logＬ_j（上記（１２）式）を求めた。

【００６４】図９は、模擬実験の蛍光寿命推定処理にお
いて求められた対数尤度logＬ_jと、補間により得られた
関数としての対数尤度logＬ(τ)とを示す図である。こ
の図に示される対数尤度logＬ(τ)の曲線から判るよう
に、減衰時定数τが１８５ｎｓであるときに対数尤度lo
gＬ(τ)が最大値となる。すなわち、発光ダイオードか
ら出力される模擬蛍光の寿命の推定値として１８５ｎｓ
が得られた。

【００６５】なお、従来の時間相関単一光子計数法に拠
る測定によれば、この模擬実験で用いた発光ダイオード
から出力されるパルス光の減衰時定数の測定値は、単一
指数関数的な減衰を仮定した場合、１７０ｎｓであっ
た。上記模擬実験の平均検出光子数推定処理において求
められた模擬蛍光光子の平均検出個数の推定値λは２．
７６であり、この値は、時間相関単一光子計数法が適用
可能な平均検出個数より２桁程度大きい。それにも拘わ
らず、上記模擬実験により推定された模擬蛍光の寿命の
推定値１８５ｎｓは、時間相関単一光子計数法に拠り測
定された値１７０ｎｓとの差が１０％以下であった。こ
のことから、本測定方法の有効性が確認された。

【００６６】本測定方法では、発光ダイオードからのパ
ルス出力１回当たりに光検出器２０により検出された模
擬蛍光光子の平均検出個数が２．７６である場合に、模
擬蛍光光子の寿命の推定に用いられた事象の数は、発光
ダイオードからのパルス出力の総数の６７％程度であっ
た。一方、従来の時間相関単一光子計数法に拠る測定で
は、その測定において有効な事象の数は、発光ダイオー
ドからのパルス出力の総数の数％程度であった。両者を
対比して判るように、従来の時間相関単一光子計数法と
比較して、本測定方法では高効率の蛍光寿命測定が可能
である。

【００６７】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、蛍光分子を含む試料にパルス励起光が繰り返し
照射され、その試料から放出される蛍光光子が光検出器
により検出され、その検出に応じた出力パルスが光検出
器より出力される。パルス励起光の照射１回毎に光検出
器から出力される出力パルスの波形積分値およびピーク
波高値それぞれが求められ、波形積分値およびピーク波
高値それぞれの分布が求められる。そして、求められた
波形積分値の分布に基づいて、パルス励起光の照射１回
当たりに試料から放出され光検出器により検出される蛍
光光子の平均検出個数が推定される。さらに、求められ
たピーク波高値の分布、および、推定された蛍光光子の
平均検出個数に基づいて、試料から放出される蛍光の寿
命が推定される。このようにすることにより、蛍光寿命
を高精度かつ高効率に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置１の構成図
である。

【図２】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置１の光検出
器２０の断面図である。

【図３】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置１の演算部
８０における処理の内容の概要を説明する図である。

【図４】ｋ-光子事象の波形積分値分布ｑ_k(ｈ)を示す図
である。

【図５】蛍光Ｌ₂を光検出器２０で受光してメモリ７０
に生成された波形積分値分布（破線）と、最尤法で推定
されたλ値に基づいて計算された波形積分値分布（実
線）との１例を示す図である。

【図６】模擬実験の蛍光寿命推定処理において求められ
た波形積分値ｖの分布を示す図である。

【図７】模擬実験の蛍光寿命推定処理において求められ
たピーク波高値ｈの分布を示す図である。

【図８】模擬実験の蛍光寿命推定処理において求められ
たピーク波高値ｈの条件付確率関数ｐ_j(ｈ｜ｍ)を示す
図である。

【図９】模擬実験の蛍光寿命推定処理において求められ
た対数尤度logＬ_jと、補間により得られた関数としての
対数尤度logＬ(τ)とを示す図である。

【符号の説明】

１…蛍光寿命測定装置、２…試料、１０…光源、１１〜
１３…レンズ、２０…光検出器、３０…増幅器、４１…
積分回路、４２…ピークホールド回路、５０…マルチプ
レクサ、６０…Ａ／Ｄ変換器、７０…メモリ、８０…演
算部、９０…制御部。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】パルス励起光を試料に照射し、この試料
から放出される蛍光の寿命を測定する蛍光寿命測定装置
であって、前記試料に対して前記パルス励起光を照射する光源と、前記パルス励起光が照射された前記試料から放出される
蛍光光子を検出して、その検出に応じた出力パルスを出
力する光検出器と、前記パルス励起光の照射１回毎に前記光検出器から出力
される出力パルスの波形積分値およびピーク波高値それ
ぞれを出力する波形処理手段と、前記波形処理手段から出力される波形積分値の分布に基
づいて、前記パルス励起光の照射１回当たりに前記試料
から放出され前記光検出器により検出される蛍光光子の
平均検出個数を推定する平均検出光子数推定手段と、前記波形処理手段から出力されるピーク波高値の分布、
および、前記平均検出光子数推定手段により推定された
蛍光光子の平均検出個数に基づいて、前記試料から放出
される蛍光の寿命を推定する蛍光寿命推定手段と、を備えることを特徴とする蛍光寿命測定装置。
【請求項２】パルス励起光を試料に照射し、この試料
から放出される蛍光の寿命を測定する蛍光寿命測定方法
であって、前記試料に対して前記パルス励起光を照射し、前記パルス励起光が照射された前記試料から放出される
蛍光光子を光検出器により検出して、その検出に応じた
出力パルスを光検出器より出力させ、前記パルス励起光の照射１回毎に前記光検出器から出力
される出力パルスの波形積分値およびピーク波高値それ
ぞれを求め、求められた波形積分値の分布に基づいて、前記パルス励
起光の照射１回当たりに前記試料から放出され前記光検
出器により検出される蛍光光子の平均検出個数を推定
し、求められたピーク波高値の分布、および、推定された蛍
光光子の平均検出個数に基づいて、前記試料から放出さ
れる蛍光の寿命を推定する、ことを特徴とする蛍光寿命測定方法。