JP2000304697A

JP2000304697A - 蛍光寿命測定方法および装置

Info

Publication number: JP2000304697A
Application number: JP11111157A
Authority: JP
Inventors: Shinji Osuga; 慎二大須賀; Akira Osugi; 晃大杉
Original assignee: BUNSHI BIOPHOTONICS KENKYUSHO; Bunshi Biophotonics Kenkyusho KK
Current assignee: BUNSHI BIOPHOTONICS KENKYUSHO; Bunshi Biophotonics Kenkyusho KK
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 1999-04-19
Publication date: 2000-11-02

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光の複数の成分それぞれの蛍光寿命または
蛍光減衰曲線を効率よく且つ簡易に測定することができ
る蛍光寿命測定方法および装置を提供する。【解決手段】励起光源部１０から出力されたパルス励
起光Ａの照射に伴い試料９０で発生した蛍光Ｂは、分光
器２０により複数の成分に分解されて光検出器３０に入
射する。光検出器３０のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂の
うち各成分に対応したアノード電極から電流パルス信号
が出力される。この電流パルス信号に基づいて蛍光光子
検出時間測定部４０により測定された蛍光光子検出時
間、ならびに、蛍光光子数測定部５０により測定された
蛍光光子の検出個数および複数の成分それぞれの蛍光光
子検出の有無に基づいて、複数の成分それぞれの蛍光寿
命または蛍光減衰曲線が推定される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、励起光が照射され
た蛍光物質から発生する蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰
曲線を測定する蛍光寿命測定方法および装置に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、試料に含まれる蛍光物質から
発生する蛍光の蛍光寿命の測定方法として時間相関単一
光子計数法による方法が知られている。この時間相関単
一光子計数法による測定では、パルス励起光の１パルス
照射当たりに検出される蛍光の平均光子数が１より充分
に小さい値（例えば、０．０１）となるような強度の弱
いパルス励起光を試料に照射し、パルス励起光が試料に
照射された時刻から最初に蛍光光子を検出した時刻まで
の蛍光光子検出時間を測定する。そして、試料にパルス
励起光を繰り返し照射して蛍光光子検出時間についての
ヒストグラムを生成し、そのヒストグラムに基づいて蛍
光の蛍光寿命を測定するものである。なお、蛍光光子の
検出には光電子増倍管が通常用いられている。

【０００３】また、蛍光物質から発生する蛍光が複数の
成分（例えば複数の波長帯）を有する場合に、従来の時
間相関単一光子計数法により蛍光の複数の成分それぞれ
の蛍光寿命を測定するためには、測定しようとする成分
の数だけ測定を繰り返すか、或いは、成分の数と同数の
蛍光光子検出時間測定部を用意することが必要となる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、時間相
関単一光子計数法による測定では、その原理上、パルス
励起光の１パルス照射当たりに検出される蛍光光子の個
数を非常に小さくし、パルス励起光の照射パルス数に対
して蛍光光子検出頻度を数％以下にする必要がある。そ
の結果、蛍光寿命の測定精度は悪く、充分な精度で蛍光
寿命を求めるには長時間の測定を必要とするという問題
点がある。

【０００５】また、蛍光の複数の成分（例えば複数の波
長帯）それぞれの蛍光寿命を測定するために成分の数だ
け測定を繰り返すとすれば、測定の手間が煩瑣になり、
測定に長時間を要するという問題点がある。また、成分
の数と同数の蛍光光子検出時間測定部を用意するとすれ
ば、装置が複雑になるという問題点がある。

【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、蛍光の複数の成分それぞれの蛍光寿命
または蛍光減衰曲線を効率よく且つ簡易に測定すること
ができる蛍光寿命測定方法および装置を提供することを
目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光寿命測
定方法は、パルス励起光が試料に照射されて発生した蛍
光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測
定方法であって、(1)パルス励起光を試料に繰り返し照
射して、パルス励起光の各パルス毎に、蛍光を複数の成
分に分解し、パルス励起光が試料に照射された時刻から
最初の蛍光光子が検出された時刻までの蛍光光子検出時
間を測定するとともに、蛍光光子の検出個数および複数
の成分それぞれの蛍光光子検出の有無を測定し、(2) パ
ルス励起光の各パルス毎に測定された蛍光光子検出時
間、蛍光光子の検出個数および複数の成分それぞれの蛍
光光子検出の有無に基づいて、複数の成分それぞれの蛍
光寿命または蛍光減衰曲線を推定する、ことを特徴とす
る。また、本発明に係る蛍光寿命測定方法では、蛍光を
複数の波長成分に分解して、複数の波長成分それぞれの
蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定することを特徴とす
る。

【０００８】本発明に係る蛍光寿命測定装置は、パルス
励起光が試料に照射されて発生した蛍光の蛍光寿命また
は蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測定装置であって、
(1)パルス励起光を出力し試料に照射する励起光源部
と、(2) 試料で発生した蛍光を複数の成分に分解する分
解光学系と、(3) 分解光学系により分解された蛍光を入
力し蛍光の光量に応じた個数の光電子を放出する光電変
換面と、光電変換面から放出された光電子を増倍して二
次電子を発生させる電子増倍部と、複数の成分それぞれ
について２以上設けられ二次電子の入力に応じて電流パ
ルス信号をそれぞれ出力する所定数のアノード電極と、
蛍光を透過させる入射窓を有し光電変換面、電子増倍部
および所定数のアノード電極を内部に含む真空容器と、
を有する光検出器と、(4) パルス励起光が試料に照射さ
れた時刻から最初の蛍光光子が光検出器により検出され
た時刻までの蛍光光子検出時間をパルス励起光の各パル
ス毎に測定する蛍光光子検出時間測定部と、(5) 所定数
のアノード電極のうち少なくとも１個の蛍光光子に対応
する電流パルス信号を出力したアノード電極の位置およ
び個数に基づいて、光検出器により検出された蛍光光子
の検出個数および複数の成分それぞれの蛍光光子検出の
有無をパルス励起光の各パルス毎に測定する蛍光光子数
測定部と、(6) 試料に繰り返し照射されたパルス励起光
の各パルス毎に蛍光光子検出時間測定部により測定され
た蛍光光子検出時間ならびに蛍光光子数測定部により測
定された蛍光光子の検出個数および複数の成分それぞれ
の蛍光光子検出の有無に基づいて、複数の成分それぞれ
の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命推定
部と、を備えることを特徴とする。

【０００９】この蛍光寿命測定装置によれば、励起光源
部から出力されたパルス励起光は試料に照射され、その
照射に伴い試料で発生した蛍光は分解光学系により複数
の成分に分解されて光検出器の光電変換面に入射する。
光検出器の所定数のアノード電極のうち各成分に対応し
たアノード電極から電流パルス信号が出力される。蛍光
光子検出時間測定部により、パルス励起光が試料に照射
された時刻から最初の蛍光光子が光検出器により検出さ
れた時刻までの蛍光光子検出時間がパルス励起光の各パ
ルス毎に測定される。また、蛍光光子数測定部により、
光検出器の所定数のアノード電極のうち少なくとも１個
の蛍光光子に対応する電流パルス信号を出力したアノー
ド電極の位置および個数に基づいて、光検出器により検
出された蛍光光子の検出個数、および、複数の成分それ
ぞれの蛍光光子検出の有無が、パルス励起光の各パルス
毎に測定される。そして、蛍光寿命推定部により、試料
に繰り返し照射されたパルス励起光の各パルス毎に得ら
れた蛍光光子検出時間、蛍光光子の検出個数および複数
の成分それぞれの蛍光光子検出の有無に基づいて、複数
の成分それぞれの蛍光寿命または蛍光減衰曲線が推定さ
れる。

【００１０】また、本発明に係る蛍光寿命測定装置で
は、分解光学系は、蛍光を複数の波長成分に分解し、蛍
光寿命推定部は、複数の波長成分それぞれの蛍光寿命ま
たは蛍光減衰曲線を推定する、ことを特徴とする。分解
光学系は、蛍光を複数の波長成分に分光してその分光し
た各波長成分を所定数のアノード電極の何れかに対応す
る光電変換面の領域に入射させる分光器を含むのが好適
であり、また、蛍光の複数の波長成分それぞれを互いに
異なる領域で透過させてその透過させた各波長成分を所
定数のアノード電極の何れかに対応する光電変換面の領
域に入射させる光学フィルタを含むのも好適である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明にお
いて同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を
省略する。

【００１２】図１は本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
の構成図である。この蛍光寿命測定装置１は、パルス励
起光Ａを出力して試料９０に照射する励起光源部１０
と、試料９０から発生した蛍光Ｂを波長別に分光する分
光器（分解光学系）２０と、波長別に分光された蛍光Ｃ
を検出して複数のアノード電極から電流パルス信号を出
力する光検出器３０と、パルス励起光Ａが試料９０に照
射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器３０により
検出された時刻までの蛍光光子検出時間をパルス励起光
Ａの各パルス毎に測定する蛍光光子検出時間測定部４０
と、光検出器３０の複数のアノードから出力される電流
パルス信号に基づいて光検出器３０により検出された蛍
光光子の検出個数および各波長成分別の蛍光光子の検出
の有無をパルス励起光Ａの各パルス毎に測定する蛍光光
子数測定部５０と、蛍光光子検出時間測定部４０により
測定された蛍光光子検出時間ならびに蛍光光子数測定部
５０により測定された蛍光光子の検出個数および各波長
成分別の蛍光光子の検出の有無に基づいて蛍光の各波長
成分それぞれの蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する
蛍光寿命推定部６０と、を備えて構成される。

【００１３】励起光源部１０は、パルスレーザ光源１
１、フォトダイオード１４および波高弁別器１５等を備
えている。パルスレーザ光源１１は、パルス励起光を繰
り返し出力する。反射鏡１２は、パルスレーザ光源１１
から出力されたパルス励起光を反射する。ビームスプリ
ッタ１３は、反射鏡１２により反射されたパルス励起光
の一部を反射させ、残部を透過させる。フォトダイオー
ド１４は、ビームスプリッタ１３により反射されたパル
ス励起光の部分を受光して、その光量に応じた電流信号
を出力する。波高弁別器１５は、フォトダイオード１４
から出力された電流信号を受けて、パルス励起光が出力
された時刻を示すタイミング信号を出力する。

【００１４】この励起光源部１０のビームスプリッタ１
３を透過したパルス励起光Ａは、バンドパスフィルタ８
４を透過したのちレンズ８１により集光され、試料９０
に照射される。そして、このパルス励起光Ａの照射に伴
い試料９０に含まれる蛍光物質から発生した蛍光Ｂは、
レンズ８２により平行光にされ、バンドパスフィルタ８
５を透過して励起光の散乱光等が除去された後、レンズ
８３により集光され、光ファイバ２３の一端に入射す
る。

【００１５】分光器２０は、反射集光鏡２１および分散
素子２２を備えている。反射集光鏡２１は、光ファイバ
２３の他端から出射し分光器２０に入射した蛍光Ｂを反
射させ、分散素子２２の位置に集光させる。分散素子２
２は、反射集光鏡２１により反射集光された蛍光Ｂを分
光し、その分光された蛍光Ｃを光検出器３０の入射窓３
２に入射させる。

【００１６】光検出器３０は、分光された蛍光Ｃを透過
させる入射窓３２を有する真空容器３１内に、入射した
光の光量に応じた個数の光電子を放出する光電変換面３
３、その光電子を順次増倍して多数の二次電子を発生さ
せる複数段（この図では７段）のダイノード３４からな
る電子増倍部、および、その二次電子を受けて電流パル
ス信号を出力する複数個（ここでは８行×４列で計３２
個）のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂を備えるものであ
る。電子増倍部は、多段の格子状ダイノードであっても
よいし、マイクロチャンネルプレートであってもよい。

【００１７】図１では表示を容易にするために、３２個
のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂を１列に展開して表示し
ている。アノード電極３５₀₁〜３５₃₂は、光電変換面３
３と平行な面内に２次元配列されており、各列の８個の
アノード電極は、蛍光の同じ波長範囲の光電子を受ける
ように配置される。別の列のアノード電極は、別の波長
範囲の光電子を受ける。ここでは、列数すなわち蛍光の
波長範囲の数を４としている。

【００１８】この光検出器３０において、光電変換面３
３がアノード電極３５₀₁〜３５₃₂に対して低電位とさ
れ、また、ダイノード３４の各段にも所定の電圧が印加
されているときに、分光された蛍光Ｃが入射窓３２を透
過して光電変換面３３に入射すると、その光量に応じた
個数の光電子が光電変換面３３から放出される。この光
電子が電子増倍部のダイノード３４の各段により増倍さ
れて、多数の二次電子が発生し、その二次電子は３２個
のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂のうちの何れかに到達す
る。

【００１９】このとき、電子増倍部における光電子の二
次電子増倍は、光電変換面３３上における蛍光光子入射
すなわち光電子放出の位置関係を保持したまま行われ
る。したがって、二次電子が到達して電流パルス信号を
出力するアノード電極は、分光された蛍光Ｃが光電変換
面３３に入射した位置に対応したものである。すなわ
ち、各列の８個のアノード電極が出力する電流パルス
は、同じ波長範囲の蛍光に対応したものである。

【００２０】蛍光光子検出時間測定部４０は、増幅器４
１、波高弁別器４２、時間振幅変換器４３および信号遅
延器４５を備えている。増幅器４１は、光検出器３０の
最終段のダイノード３４から出力される電流パルス信号
を入力し、この電流パルス信号を電圧パルス信号に変換
し、この電圧パルス信号を増幅して出力する。なお、こ
こで、ダイノード３４から出力される電流パルス信号を
１個の増幅器４１が増幅するのは、ダイノード３４が３
２個のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂に対して共通だから
である。

【００２１】波高弁別器４２は、増幅器４１から出力さ
れる電圧パルス信号を入力して、その電圧パルス信号の
波高値が所定の閾値電圧より高い場合にタイミング信号
を出力する。すなわち、この波高弁別器４２から出力さ
れるタイミング信号は、分光された蛍光Ｃが光検出器３
０により検出されたタイミングを示すものである。信号
遅延器４５は、波高弁別器１５から出力されたタイミン
グ信号を入力し、このタイミング信号を所定の時間だけ
遅らせて出力する。

【００２２】時間振幅変換器４３は、波高弁別器４２か
ら出力されたタイミング信号および信号遅延器４５から
出力されたタイミング信号に基づいて、これら２つのタ
イミング信号の時間差に応じた電圧信号を出力する。こ
の時間振幅変換器４３から出力される電圧信号は、パル
ス励起光Ａが試料９０に入射した時刻から波長別に分光
された蛍光Ｃの最初の光子が光検出器３０により検出さ
れた時刻までの蛍光光子検出時間に応じたものである。

【００２３】蛍光光子数測定部５０は、光検出器３０の
アノード電極３５₀₁〜３５₃₂と等しい数すなわち３２個
の増幅器５１₀₁〜５１₃₂、同じく３２個の波高弁別器５
２₀₁〜５２₃₂、および、３２個の波高弁別器５２₀₁〜５
２₃₂それぞれから出力される信号を処理する信号保持器
５３を備えている。アノード電極３５_jと増幅器５１_jと
は一対一で対応し、また、増幅器５１_jと波高弁別器５
２_jとも一対一で対応している（ｊ＝０１〜３２）。

【００２４】増幅器５１_jは、アノード電極３５_jから出
力された電流パルス信号を電圧パルス信号に変換し、そ
の電圧パルス信号を増幅して出力する（ｊ＝０１〜３
２）。波高弁別器５２_jは、増幅器５１_jから出力された
電圧パルス信号を受けて、その電圧パルス信号の波高値
が所定の閾値電圧よりも高い場合に論理パルス信号を出
力する（ｊ＝０１〜３２）。すなわち、波高弁別器５２
_jは、測定しようとする分光された蛍光Ｃの少なくとも
１個の蛍光光子に対応した波高値を有する電流パルス信
号がアノード電極３５_jから出力された場合にのみ論理
パルス信号を出力する（ｊ＝０１〜３２）。したがっ
て、３２個の波高弁別器５２₀₁〜５２₃₂のうち論理パル
ス信号を出力したものの数は、光検出器３０により検出
された蛍光Ｃの光子数に応じたものである。また、同じ
波長範囲の蛍光を受けるように置かれた一列のアノード
電極に対応する波高弁別器のうち論理パルス信号を出力
したものの数は、その波長範囲の蛍光光子の検出個数に
応じたものである。

【００２５】信号保持器５３は、３２個の波高弁別器５
２₀₁〜５２₃₂それぞれから出力された論理パルス信号
を、信号遅延器６７からのタイミング信号により指示さ
れるタイミングで読み込み、その論理状態（３２ビット
デジタル値）を所定の時間保持して出力し続ける。この
信号保持器５３により保持され出力される論理状態は、
光検出器３０により検出された蛍光光子の検出個数、お
よび、複数の成分それぞれの蛍光光子検出の有無を表
す。なお、信号遅延器６７は、波高弁別器１５から出力
されたタイミング信号を入力し、このタイミング信号を
一定時間だけ遅延させて出力するものである。

【００２６】蛍光寿命推定部６０は、ＡＤ変換器６１、
インターフェース部６２、記憶部６３、演算部６４およ
び測定制御部６５を備えている。ＡＤ変換器６１は、蛍
光光子検出時間測定部４０の時間振幅変換器４３から出
力された電圧信号を受けて、その電圧値に応じたデジタ
ル信号にＡＤ変換し、このデジタル信号を出力する。こ
のＡＤ変換器６１が出力するデジタル信号は、蛍光光子
検出時間を表わすものである。インターフェース部６２
は、蛍光光子数測定部５０の信号保持器５３から出力さ
れる信号の状態を読み込む。ＡＤ変換器６１におけるＡ
Ｄ変換およびインターフェース部６２における信号の読
み込みは、信号遅延器６６から出力されたタイミング信
号により制御される。なお、信号遅延器６６は、波高弁
別器１５から出力されたタイミング信号を入力し、この
タイミング信号を一定時間だけ遅延させて出力するもの
である。

【００２７】測定制御部６５は、ＡＤ変換器６１および
インターフェース部６２それぞれに対して所定回数のデ
ータの取り込みを指示し、パルス励起光Ａの各パルス毎
に、ＡＤ変換器６１からのデジタル値（蛍光光子検出時
間に相当しＡＤ変換器の分解能が１２ビットであれば２
バイト（１６ビット）のデジタル値）と、インターフェ
ース部６２からのデジタル値（検出された蛍光光子の検
出個数と波長成分別の蛍光光子の検出の有無に関する情
報とを含む３２ビットのデジタル値）とを、組にして記
憶部６３に保存する。演算部６４は、記憶部６３に保存
されたデータに基づいて、各波長成分それぞれの蛍光寿
命または蛍光減衰曲線を推定する。

【００２８】次に、本実施形態に係る蛍光寿命測定装置
１の作用とともに蛍光寿命推定部６０の演算部６４にお
ける処理内容について説明し、併せて、本発明に係る蛍
光寿命測定方法の一実施形態について説明する。

【００２９】励起光源部１０内のパルスレーザ光源１１
から繰り返し出力されたパルス励起光Ａは、反射鏡１
２、ビームスプリッタ１３、バンドパスフィルタ８４お
よびレンズ８１を順次に経て試料９０に照射される。こ
のパルス励起光Ａの照射に伴い試料９０内の蛍光物質か
ら発生した蛍光Ｂは、レンズ８２、バンドパスフィルタ
８５、レンズ８３および光ファイバ２３を順次に経て分
光器２０に入射する。分光器２０に入射した蛍光Ｂは、
反射集光鏡２１および分散素子２２により分光され、こ
の分光された蛍光Ｃが分光器２０より出射する。

【００３０】光検出器３０では、分光された蛍光Ｃが入
射窓３２を透過して光電変換面３３に入射すると、その
光量に応じた個数の光電子が光電変換面３３から放出さ
れ、複数段のダイノード３４からなる電子増倍部により
二次電子が増倍される。そして、その二次電子が複数の
アノード電極３５₀₁〜３５₃₂のうちの何れかに入射し、
二次電子が入射したアノード電極から電流パルス信号が
出力される。アノード電極３５_jから出力された電流パ
ルス信号は、当該アノード電極に対応する蛍光光子数測
定部５０内の増幅器５１_jにより、電圧パルス信号に変
換され、その電圧パルス信号が増幅され出力される（ｊ
＝０１〜３２）。

【００３１】増幅器５１_jから出力された電圧パルス信
号は、対応する波高弁別器５２_jにより弁別され、その
電圧パルス信号の波高値が所定の閾値電圧よりも高い場
合に論理パルス信号が出力される（ｊ＝０１〜３２）。
これらの波高弁別器５２₀₁〜５２₃₂それぞれが出力した
論理パルス信号は、信号遅延器６７からのタイミング信
号により指示されるタイミングで信号保持器５３により
読み込まれ、信号保持器５３により所定の時間保持され
出力され続ける。このとき、光検出器３０内に設けられ
ているアノード電極３５₀₁〜３５₃₂の個数３２と比較し
て、パルス励起光Ａの１パルス照射当たりにおける論理
パルス信号を出力する波高弁別器の個数が充分少なけれ
ば、論理パルス信号を出力した波高弁別器の個数は、光
検出器３０により検出された蛍光光子の個数に等しいも
のと考えてよい。

【００３２】一方、パルスレーザ光源１１から出力され
たパルス励起光の一部はビームスプリッタ１３により反
射されてフォトダイオード１４に入射して、フォトダイ
オード１４から電流信号が出力される。そして、フォト
ダイオード１４から出力された電流信号を受けた波高弁
別器１５から、パルス励起光が出力された時刻を示すタ
イミング信号が出力される。このタイミング信号は、信
号遅延器４５により所定時間だけ遅延される。また、光
検出器３０の最終段のダイノード３４から出力される電
流パルス信号に基づいて、光検出器３０により蛍光Ｃの
蛍光光子が最初に検出されたタイミングを示すタイミン
グ信号が、蛍光光子検出時間測定部４０の増幅器４１お
よび波高弁別器４２により生成される。そして、時間振
幅変換器４３により、波高弁別器４２から出力されたタ
イミング信号および波高弁別器１５から出力され信号遅
延器４５で遅延されたタイミング信号に基づいて、パル
ス励起光Ａが試料９０に入射した時刻から蛍光Ｃの最初
の光子が光検出器３０により検出された時刻までの蛍光
光子検出時間に応じた電圧信号が出力される。

【００３３】そして、パルスレーザ光源１１から繰り返
し出力されたパルス励起光Ａの各パルス毎に、波高弁別
器１５から出力され信号遅延器６６で遅延されたタイミ
ング信号により指示されるタイミングで、蛍光光子検出
時間測定部４０の時間振幅変換器４３から出力された電
圧信号はＡＤ変換器６１を介して蛍光寿命推定部６０に
入力され、蛍光光子数測定部５０の信号保持器５３の出
力の状態はインターフェース部６２を介して蛍光寿命推
定部６０に入力される。

【００３４】図２は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置の記憶部および演算部を説明する図である。記憶部６
３には、図２に示すように、時間振幅変換器４３から出
力された電圧信号がＡＤ変換器６１によりＡＤ変換され
て出力された１６ビットデジタル値、および、信号保持
器５３の出力の状態を示す３２ビットデジタル値が、パ
ルス励起光Ａの多数（以下ではＮとする）のパルス毎に
組にして記憶される。

【００３５】演算部６４において、インターフェース部
６２により読み込まれ記憶部６３に保存された３２ビッ
トデジタル値に基づいて、光検出器３０により検出され
た蛍光Ｃの光子の検出個数、および、各波長成分別に蛍
光光子が検出されたか否かを示すベクトル（以下では
「ヒットベクトル」という）が求められる。また、演算
部６４において、時間振幅変換器４３からの電圧信号が
ＡＤ変換器６１によりＡＤ変換されて記憶部６３に保存
された１６ビットデジタル値に基づいて、パルス励起光
Ａが試料９０に入射した時刻から分光された蛍光Ｃの最
初の光子が光検出器３０により検出された時刻までの蛍
光光子検出時間が求められる。

【００３６】演算部６４には、図２に示すように、パル
ス励起光ＡのＮパルスそれぞれについて、ヒットベクト
ルＷ_i、蛍光光子検出個数ｎ_iおよび蛍光光子検出時間Ｔ
_iが一組として記憶される（ｉ＝１〜Ｎ）。そして、演
算部６４では、Ｎ組のヒットベクトルＷ_i、蛍光光子検
出個数ｎ_iおよび蛍光光子検出時間Ｔ_i（ｉ＝１〜Ｎ）に
基づいて、分光された蛍光Ｃの各波長成分それぞれの蛍
光寿命または蛍光減衰曲線が以下のようにして推定され
る。なお、以下では、試料９０の蛍光物質から発生し分
光された蛍光Ｃの各波長成分それぞれの蛍光減衰曲線が
単一指数関数で表される場合について説明する。

【００３７】各波長成分（ここでは４成分）それぞれの
蛍光寿命を１／Γ₁、１／Γ₂、１／Γ₃および１／Γ₄と
する。これらパラメータΓ₁，Γ₂，Γ₃およびΓ₄それぞ
れは、その値が推定されるべきものである。また、パル
ス励起光Ａが試料９０に入射した時刻を基準（ｔ＝０）
として、時刻ｔから時刻ｔ＋ｄｔまでの微小時間ｄｔの
間に光検出器３０により波長成分ｋ（ｋ＝１〜４）の蛍
光光子が検出される確率ｐ_k(t)ｄｔは、

【００３８】

【数１】

【００３９】なる式で与えられるものとする。演算部６
４では、パラメータΓ₁，Γ₂，Γ₃およびΓ₄それぞれの
値の推定に先立ち、パルス励起光Ａの１パルス照射当た
りに光検出器３０の光電変換面３３から放出される各波
長成分それぞれの平均光電子数が以下の様に推定され
る。

【００４０】記憶部６３に記憶されている３２ビットの
デジタル値から３２個のアノード電極３５₀₁〜３５₃₂そ
れぞれのヒット総数を求める。すなわち、Ｎ回のパルス
励起光照射のうちの第ｉ番目のパルス励起光照射により
得られた３２ビットデジタル値を２進数表記で(ｂ₃₂ｂ
₃₁…ｂ₂ｂ₁)_iで表せば、アノード電極３５₀₁〜３５₃₂の
うちの第ｊ番目のアノード電極３５_jのヒット総数ｍ
_jは、

【００４１】

【数２】

【００４２】で与えられる（ｉ＝１〜Ｎ、ｊ＝１〜３
２）。

【００４３】そしてパルス励起光Ａの１パルス照射当た
りに検出される各波長成分それぞれの平均光電子数
μ₁，μ₂，μ₃およびμ₄それぞれは、

【００４４】

【数３】

【００４５】なる式で推定される。ただし、アノード電
極３５₀₁〜３５₀₈は第１の波長成分に対応し、アノード
電極３５₀₉〜３５₁₆は第２の波長成分に対応し、アノー
ド電極３５₁₇〜３５₂₄は第３の波長成分に対応し、ま
た、アノード電極３５₂₅〜３５₃₂は第４の波長成分に対
応している。

【００４６】そして、推定された平均光電子数μ₁，
μ₂，μ₃およびμ₄、ならびに、Ｎ組の蛍光光子検出時
間Ｔ_i、ヒットベクトルＷ_iおよび蛍光光子検出個数ｎ_i
（ｉ＝１〜Ｎ）に基づいて、パラメータΓ₁，Γ₂，Γ₃
およびΓ₄それぞれの値を推定する。ヒットベクトルＷ
は、アノード電極３５₀₁〜３５₃₂の列の数（ここでは４
個）すなわち分光された波長成分の数と同数の要素をも
つベクトル（ｗ₁，ｗ₂，ｗ₃，ｗ₄）とする。ヒットベク
トルＷの各要素ｗ_k（ｋ＝１〜４）は、第ｋ番目の波長
成分に対応するアノード電極の列において出力が少なく
とも一つあれば値１とし、一つも無ければ値０とする。

【００４７】図３は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置の光検出器のアノード電極における蛍光光子検出の一
例とヒットベクトルＷおよび蛍光光子検出個数ｎとの関
係を示す図である。この図における４×８個のマス目
は、３２個のアノード電極３５ ₀₁〜３５₃₂を表してい
る。４つの列（各列は８個のアノード電極を含む）それ
ぞれは、蛍光Ｃの波長成分λ₁〜λ₄に対応している。ま
た、黒く塗りつぶされたマス目は、蛍光光子を検出して
電流パルス信号を出力したアノード電極を表している。
この図に示す場合には、ヒットベクトルＷは（０，１，
０，１）であり、蛍光光子検出個数ｎは３である。

【００４８】演算部６４では、Ｎ組の蛍光光子検出時間
Ｔ_i、ヒットベクトルＷ_iおよび蛍光光子検出個数ｎ
_i（ｉ＝１〜Ｎ）に基づいて、

【００４９】

【数４】

【００５０】なる式で表わされる対数尤度が計算され
る。ここで、ｐ(Ｔ｜Ｗ,ｎ）は、ヒットベクトルＷおよ
び蛍光光子検出個数ｎが与えられたときに蛍光光子検出
時間がＴである条件付き確率密度関数であり、

【００５１】

【数５】

【００５２】で与えられる。

【００５３】また、ｐ(Ｔ｜Ｗ）は、ヒットベクトルＷ
＝（ｗ₁，ｗ₂，ｗ₃，ｗ₄）が与えられたときに時刻ｔに
蛍光光子が検出される条件付き確率密度関数であり、

【００５４】

【数６】

【００５５】なる式で与えられるものとする。Ｔ
_maxは、蛍光光子が蛍光光子数測定部５０により計数さ
れ得る最大の時間であり、パルス励起光Ａの各パルス毎
に発生する蛍光の殆どの光子が光検出器３０により検出
される時間に設定される。パルス励起光Ａが試料９０に
照射されてからＴ_maxまでの間に検出された蛍光光子の
数が蛍光光子検出個数となる。ΔＴは、ＡＤ変換器６１
から出力されるデジタル信号のビン幅に対応する実際の
時間幅である。

【００５６】そして、演算部６４では、上記(4)式で表
わされる対数尤度を最大化するパラメータΓ_k（ｋ＝１
〜４）の値が計算され、各波長成分それぞれの蛍光寿命
１／Γ_kの値が推定される。なお、対数尤度の最大化に
よる推定に際しては、準ニュートン法等の一般的な最適
化アルゴリズムが好適に用いられる。

【００５７】次に、蛍光寿命の推定に関するシミュレー
ション結果について説明する。以下では、４列のアノー
ド電極それぞれに対応する波長成分をλ₁，λ₂，λ₃お
よびλ₄とし、２つの蛍光成分を仮定した。図４は、シ
ミュレーションで仮定した蛍光の波長分布を示す図であ
る。第１の蛍光成分は、蛍光の波長範囲をλ₁およびλ₂
として、各々の波長で、１励起あたりの平均光電子数を
０．１５とし、蛍光寿命を１／（２．０×１０^-3）とし
た。また、第２の蛍光成分は、蛍光の波長範囲をλ₂，
λ₃およびλ₄として、各々の波長で、１励起あたりの平
均光電子数を０．１０とし、蛍光寿命を１／（４．０×
１０^-3）とした。

【００５８】シミュレーションで使用した時間単位は、
時間振幅変換器４３のフルスケールとＡＤ変換器６１の
分解能とで決まる値とした。すなわち、ＡＤ変換器６１
が１２ビットデジタル値を出力するものとして、時間単
位は、時間振幅変換器４３のフルスケールをＡＤ変換器
６１の分解能４０９６で除算したものとした、ここで仮
定した１励起あたりの平均光電子数の合計は０．６であ
り、この値は従来の時間相関単一光子計数法が適用され
る平均光電子数よりも１桁以上大きい。また、シミュレ
ーションでは、励起回数Ｎを１６０万回として１データ
セットを生成し、６０個のデータセットを生成した。そ
して、各データセットに基づいてパラメータΓ_k（ｋ＝
１〜４）を推定し、６０個のデータセットそれぞれで得
られたパラメータΓ_k（ｋ＝１〜４）の推定値の平均値
を算出した。

【００５９】図５は、シミュレーションに使用したパラ
メータと推定結果とを示す図表である。波長λ₁，λ₃お
よびλ₄それぞれにおいては、偏差２％未満の精度でシ
ミュレーションに使用したパラメータの値と推定値の平
均値とが一致した。二つの蛍光成分が混じった波長λ₂
においても、二つの蛍光成分の蛍光寿命の平均的な値が
得られた。

【００６０】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく、種々の変形が可能である。例えば、上記実施
形態に係る蛍光寿命測定装置では、蛍光を分光するのに
分光器を使用したが、バンドパスフィルタなどの光学フ
ィルタであってもよい。この場合、光学フィルタは、光
検出器３０の入射窓３２の前面に配置され、試料から到
達した蛍光の複数の波長成分それぞれを互いに異なる領
域で透過させて、その透過させた各波長成分を、アノー
ド電極３５₀₁〜３５₃₂の何れかに対応する光電変換面３
３の領域に入射させる。

【００６１】また、上記実施形態では蛍光を波長によっ
て４つに分けたが、波長ではなく空間的な位置によって
複数の成分に分解してもよい。また、上記実施形態では
アノード電極の配列を４列で各列８個としたが、８列で
各列４個、すなわち８個の成分に分解してもよいし、８
列で各列８個であってもよい。

【００６２】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、パルス励起光を試料に繰り返し照射して、パル
ス励起光の各パルス毎に、蛍光を複数の成分（波長成
分）に分解し、パルス励起光が試料に照射された時刻か
ら最初の蛍光光子が検出された時刻までの蛍光光子検出
時間を測定するとともに、蛍光光子の検出個数および複
数の成分それぞれの蛍光光子検出の有無を測定する。そ
して、パルス励起光の各パルス毎に測定された蛍光光子
検出時間、蛍光光子の検出個数および複数の成分それぞ
れの蛍光光子検出の有無に基づいて、複数の成分それぞ
れの蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する。

【００６３】このようにして複数の成分それぞれの蛍光
寿命または蛍光減衰曲線を推定することにより、パルス
励起光の１パルス照射当たりに検出される蛍光光子の個
数が多くても正確に蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定
することができる。また、従来の時間相関単一光子計数
法による測定の場合と比較して蛍光光子検出頻度を１桁
以上大きくすることができるので、蛍光寿命または蛍光
減衰曲線を短時間に効率よく測定することができる。さ
らに、蛍光光子検出時間測定部が１個であるにも拘わら
ず、蛍光を複数の成分に分解して各蛍光成分それぞれの
蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定できるので、装置を
複雑にしないで複数の成分の測定をすることができ、ま
た、１回の測定で複数の成分の測定をすることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置の構成図で
ある。

【図２】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置の記憶部お
よび演算部を説明する図である。

【図３】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置の光検出器
のアノード電極における蛍光光子検出の一例とヒットベ
クトルＷおよび蛍光光子検出個数ｎとの関係を示す図で
ある。

【図４】本実施形態に係る蛍光寿命測定方法を説明する
ために行なったシミュレーションで仮定した蛍光の波長
分布を示す図である。

【図５】本実施形態に係る蛍光寿命測定方法を説明する
ために行なったシミュレーションに使用したパラメータ
と推定結果とを示す図表である。

【符号の説明】

１…蛍光寿命測定装置、１０…励起光源部、１１…パル
スレーザ光源、１２…反射鏡、１３…ビームスプリッ
タ、１４…フォトダイオード、１５…波高弁別器、２０
…分光器、２１…反射集光鏡、２２…分散素子、２３…
光ファイバ、３０…光検出器、３１…真空容器、３２…
入射窓、３３…光電変換面、３４…ダイノード、３５₀₁
〜３５₃₂…アノード電極、４０…蛍光光子検出時間測定
部、４１…増幅器、４２…波高弁別器、４３…時間振幅
変換器、４５…信号遅延器、５０…蛍光光子数測定部、
５１₀₁〜５１₃₂…増幅器、５２₀₁〜５２₃₂…波高弁別
器、５３…信号保持器、６０…蛍光寿命推定部、６１…
ＡＤ変換器、６２…インターフェース部、６３…記憶
部、６４…演算部、６５…測定制御部、６６，６７…信
号遅延器、８１，８２，８３…レンズ、８４，８５…バ
ンドパスフィルタ、９０…試料、Ａ…パルス励起光、Ｂ
…蛍光、Ｃ…分光された蛍光。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】パルス励起光が試料に照射されて発生し
た蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿
命測定方法であって、前記パルス励起光を前記試料に繰り返し照射して、前記
パルス励起光の各パルス毎に、前記蛍光を複数の成分に
分解し、前記パルス励起光が前記試料に照射された時刻
から最初の蛍光光子が検出された時刻までの蛍光光子検
出時間を測定するとともに、蛍光光子の検出個数および
前記複数の成分それぞれの蛍光光子検出の有無を測定
し、前記パルス励起光の各パルス毎に測定された前記蛍光光
子検出時間、前記蛍光光子の検出個数および前記複数の
成分それぞれの蛍光光子検出の有無に基づいて、前記複
数の成分それぞれの前記蛍光寿命または前記蛍光減衰曲
線を推定する、ことを特徴とする蛍光寿命測定方法。
【請求項２】前記蛍光を複数の波長成分に分解して、
前記複数の波長成分それぞれの前記蛍光寿命または前記
蛍光減衰曲線を推定する、ことを特徴とする請求項１記
載の蛍光寿命測定方法。
【請求項３】パルス励起光が試料に照射されて発生し
た蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿
命測定装置であって、前記パルス励起光を出力し前記試料に照射する励起光源
部と、前記試料で発生した蛍光を複数の成分に分解する分解光
学系と、前記分解光学系により分解された蛍光を入力し前記蛍光
の光量に応じた個数の光電子を放出する光電変換面と、
前記光電変換面から放出された光電子を増倍して二次電
子を発生させる電子増倍部と、前記複数の成分それぞれ
について２以上設けられ前記二次電子の入力に応じて電
流パルス信号をそれぞれ出力する所定数のアノード電極
と、前記蛍光を透過させる入射窓を有し前記光電変換
面、前記電子増倍部および前記所定数のアノード電極を
内部に含む真空容器と、を有する光検出器と、前記パルス励起光が前記試料に照射された時刻から最初
の蛍光光子が前記光検出器により検出された時刻までの
蛍光光子検出時間を前記パルス励起光の各パルス毎に測
定する蛍光光子検出時間測定部と、前記所定数のアノード電極のうち少なくとも１個の蛍光
光子に対応する電流パルス信号を出力したアノード電極
の位置および個数に基づいて、前記光検出器により検出
された蛍光光子の検出個数および前記複数の成分それぞ
れの蛍光光子検出の有無を前記パルス励起光の各パルス
毎に測定する蛍光光子数測定部と、前記試料に繰り返し照射された前記パルス励起光の各パ
ルス毎に前記蛍光光子検出時間測定部により測定された
蛍光光子検出時間ならびに前記蛍光光子数測定部により
測定された蛍光光子の検出個数および前記複数の成分そ
れぞれの蛍光光子検出の有無に基づいて、前記複数の成
分それぞれの前記蛍光寿命または前記蛍光減衰曲線を推
定する蛍光寿命推定部と、を備えることを特徴とする蛍光寿命測定装置。
【請求項４】前記分解光学系は、前記蛍光を複数の波
長成分に分解し、前記蛍光寿命推定部は、前記複数の波長成分それぞれの
前記蛍光寿命または前記蛍光減衰曲線を推定する、こと
を特徴とする請求項３記載の蛍光寿命測定装置。
【請求項５】前記分解光学系は、前記蛍光を複数の波
長成分に分光してその分光した各波長成分を前記所定数
のアノード電極の何れかに対応する前記光電変換面の領
域に入射させる分光器を含む、ことを特徴とする請求項
４記載の蛍光寿命測定装置。
【請求項６】前記分解光学系は、前記蛍光の複数の波
長成分それぞれを互いに異なる領域で透過させてその透
過させた各波長成分を前記所定数のアノード電極の何れ
かに対応する前記光電変換面の領域に入射させる光学フ
ィルタを含む、ことを特徴とする請求項４記載の蛍光寿
命測定装置。