JP4249103B2

JP4249103B2 - 蛍光寿命測定装置

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Description

本発明は、蛍光寿命の被測定試料に励起光を照射し、該試料から発する蛍光を測定して蛍光寿命を算出し、蛍光寿命を特定する蛍光寿命測定装置に関するものである。

従来、励起光を試料に照射して励起し、この試料から放出される蛍光光子数を測定し、蛍光寿命を算出する方法が知られている。特に、生物化学分野においては、蛍光寿命の値の分布画像を作成すると生体の微細構造が解明できるため、パルス励起光を用いた蛍光寿命測定装置が注目されている。蛍光寿命を算出する方法として、試料にパルス励起光を照射し、蛍光光子が受光されるまでの時間を測定する時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ：Time Correlated Single Photon Counting）法が知られている（特許文献１参照）。

また、試料にパルス励起光を照射し、試料から放出される蛍光光子を複数の時間帯である時間ゲートを設定して測定し、この複数の時間ゲートで測定された蛍光光子数から蛍光寿命を算出する時間ゲート法が知られている。

ところで、ＴＣＳＰＣ法は、その測定原理から１回のパルス励起光に対して放出される蛍光光子数が約０．０１個程度と極めて少ない場合にのみ適応できるため、蛍光寿命の算出を１回行うため、最低数万回のパルス励起光の照射が必要となり、蛍光寿命の算出に多大な時間を要する。

特開２００２−１０７３００号公報

時間ゲート法は、パルス励起光を有効に使うことができる一方、複数の時間ゲートを適正に設定しないと、算出される蛍光寿命に大きな誤差が生じるという問題点があった。すなわち、蛍光寿命の誤差を小さくするには時間ゲートを適正に設定する必要があるため、未知の試料に対して時間ゲートを固定して蛍光寿命を算出すると、設定した時間ゲートが適正でない場合、蛍光寿命の誤差を低減することが困難であるという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な方法によって短時間に高精度の蛍光寿命が算出できる蛍光寿命測定装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、請求項１にかかる蛍光寿命測定装置は、試料に励起光を照射し、該励起光によって励起された前記試料から発する蛍光光子数を複数の時間帯である複数のゲート長で測定し、該複数のゲート長で測定された各ゲート蛍光光子数をもとに前記試料の蛍光寿命を演算して確定する蛍光寿命測定装置において、前記蛍光光子数の測定開始直後から前記ゲート蛍光光子数を測定する前記ゲート長である開始ゲート長を少なくとも変更するゲート長変更手段と、前記蛍光光子数の測定開始時から測定終了時までの時間である全ゲート長を変更する全ゲート長変更手段と、前記開始ゲート長と該開始ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数を含む複数の前記ゲート蛍光光子数とをもとに前記蛍光寿命を演算する演算手段と、前記蛍光寿命が所定の条件を満足していない場合、前記ゲート長変更手段および前記全ゲート長変更手段に対し、前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを変更させる制御を行う制御手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記所定の条件は、前記蛍光寿命と前記開始ゲート長と前記全ゲート長との関係を示す前記蛍光寿命の関数で表されることを特徴とする。

また、請求項３にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記関数は、前記蛍光寿命τ、前記開始ゲート長は、該複数の時間ゲートの開始時間差を表し、これをゲート遅延時間ｔ１とし、前記全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とした場合、１≦（ｔ１／τ）≦２、（ｔ１＋ｔ２）／τ≧４であることを特徴とする。

また、請求項４にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記蛍光寿命の値に対応した前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを記憶する記憶手段をさらに備えたことを特徴とする。

また、請求項５にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記励起光の照射後、前記試料から発する前記蛍光光子が所定数以下になるまで前記蛍光光子数の測定の開始時を遅延する遅延時間を設けることを特徴とする。

また、請求項６にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、試料に励起光を照射し、該励起光によって励起された前記試料から発する蛍光光子数を複数の時間帯である複数のゲート長で測定し、該複数のゲート長で測定された各ゲート蛍光光子数をもとに前記試料の蛍光寿命を演算して確定する蛍光寿命測定装置において、前記蛍光光子数の測定開始直後から前記ゲート蛍光光子数を測定する前記ゲート長である開始ゲート長を少なくとも変更するゲート長変更手段と、前記蛍光光子数の測定開始時から測定終了時までの時間である全ゲート長を変更する全ゲート長変更手段と、前記開始ゲート長と該開始ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数を含む複数の前記ゲート蛍光光子数とをもとに前記蛍光寿命を演算する演算手段と、前記複数のゲート蛍光光子数の比が所定の条件を満足しない場合、前記ゲート長変更手段および前記全ゲート長変更手段に対し、前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを変更させる制御を行う制御手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項７にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記所定の条件は、２つの前記ゲート長である第１ゲート長と第２ゲート長との時間長を同一とし、前記第１ゲート長が前記第２ゲート長よりも先に前記ゲート蛍光光子数の測定を開始する場合、前記第２ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に対し、前記第１ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数が、約２．７２倍以上、約７．３９倍以下であることを特徴とする。

また、請求項８にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、２つの前記ゲート長である第１ゲート長と第２ゲート長とは重複する時間部分を有し、前記第１ゲート長の開始時と前記第２ゲート長の開始時との時間差を前記ゲート遅延時間とすることを特徴とする。

また、請求項９にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記第２ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に対する前記第１ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に関する前記所定の条件を記憶する記憶手段をさらに備えたことを特徴とする。

また、請求項１０にかかる蛍光寿命測定装置は、上記の発明において、前記励起光の照射後、前記試料から発する前記蛍光光子が所定数以下になるまで前記蛍光光子数の測定の開始時を遅延する遅延時間を設けることを特徴とする。

本発明にかかる蛍光寿命測定装置によれば、算出した蛍光寿命をもとに適正な時間ゲートを設定し、簡易な方法によって短時間に高精度の蛍光寿命が算出できるという効果を奏する。

以下、本発明にかかる蛍光寿命測定装置の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１にかかる蛍光寿命測定装置１００の概要構成を示すブロック図である。蛍光寿命測定装置１００は、制御部１と、光学部２と、測定部３と、演算処理部４とを有している。

制御部１は、蛍光光子数を測定する開始から終了までの全時間帯である全ゲート長を変更制御する全ゲート長制御部１ａと、この全ゲート長内を分割し、複数の時間帯である複数のゲート長を変更制御するゲート長制御部１ｂと、算出された蛍光寿命の値が所定の条件を満足しているか否かを判断して蛍光寿命を確定させる確定判定部１ｃとを有している。

また、光学部２は、パルス励起光を出射するレーザ発振器２ａと、パルス励起光を試料５に集光するレンズ２ｂと、試料５から放出された蛍光光子を光電変換器に集光させるレンズ２ｃと、光電変換器である光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）２ｄとを有している。

まず、制御部１は、レーザ制御信号Ｓを光学部２に出力する。光学部２は、レーザ制御信号Ｓを入力すると、レーザ発振器２ａからパルス励起光を出射させる。パルス励起光は、レンズ２ｂを介して試料５に集光し、試料５を励起させる。励起された試料５から蛍光光子が放出され、蛍光光子は、レンズ２ｃを介しＰＭＴ２ｄに集光する。ＰＭＴ２ｄは入射した蛍光光子を電気信号Ｅに変換して測定部３に出力する。測定部３は、制御部１からゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２を入力して各ゲート長を制御し、各ゲート長における蛍光光子数を測定する。測定部３は、各ゲート長で測定した蛍光光子数に対応した測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２を演算処理部４に出力する。演算処理部４は入力した測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２をもとに蛍光寿命τを算出し、制御部１に出力する。

図２は、測定部３の概要構成を示すブロック図である。測定部３は、アンプ３ａとスイッチＳＷ１，ＳＷ２と波高分別器Ｈ１，Ｈ２とデジタルカウンタＣ１，Ｃ２とを有している。アンプ３ａは、ＰＭＴ２ｅから入力した電気信号Ｅを増幅してスイッチＳＷ１，ＳＷ２に分岐する。スイッチＳＷ１，ＳＷ２は、ゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２によって制御され、ゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２が「ＯＮ」の時にスイッチＳＷ１，ＳＷ２は、閉じられアンプ３ａで増幅された電気信号Ｅが波高分別器Ｈ１，Ｈ２に出力されるようになっている。波高分別器Ｈ１，Ｈ２は、入力した信号を所定の値で２値化して「０」「１」信号に変換し、カウンタＣ１，Ｃ２に出力する。カウンタＣ１，Ｃ２は、入力した「１」信号の数をカウントし、蛍光光子数である測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２を演算処理部４に出力する。

図３にレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２とのタイミングチャートを示す。図３に示すように、レーザ制御信号Ｓが「ＯＮ」から「ＯＦＦ」になった時刻をＴ０とすると、ゲート制御信号Ｓ１は、時間ｔ１（時刻Ｔ０〜Ｔ１）で「ＯＮ」となり、ゲート制御信号Ｓ２は、時間ｔ２（時刻Ｔ１〜Ｔ２）で「ＯＮ」となる。つまり、第１ゲート長はｔ１であり、第２ゲ−ト長はｔ２であり、全ゲート長は（ｔ１＋ｔ２）となる。

ところで、試料５から放出される蛍光光子数の放出確率は、ポアソン分布にしたがうため放出開始とともに時間に対して自然対数特性にしたがって減衰する。図４は、蛍光光子数が所定の減衰定数によって減衰することを示す特性図である。

ここで、蛍光寿命τは、蛍光光子数の減衰定数の逆数と定義されるので、時刻Ｔ０での蛍光光子数をＩ₀とした場合、蛍光光子数Ｉは、時間ｔの関数として以下の式（１）によって示される。

また、第１ゲート長ｔ１で測定された蛍光光子数をＩ₁とし、第２ゲート長ｔ２で測定された蛍光光子数をＩ₂とした場合、Ｉ₁とＩ₂との比Ｉ₂／Ｉ₁は以下の式（２）によって示される。

また、Ｉ₁とＩ₂との比Ｒとして（式（３）参照）、比Ｒを式（２）に代入すると、Ｔ２が十分に大きい場合、蛍光寿命τは、以下の式（４）によって近似される。

したがって、演算処理部４は、制御部１が設定した第１ゲート長ｔ１と測定部３が測定した蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂をもとに式（４）を演算して蛍光寿命τを算出し、制御部１に出力する。

制御部１は、演算処理部４から入力した蛍光寿命τと第１ゲート長ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とから演算処理部４が算出した蛍光寿命τが適正な誤差範囲に入っているか否かを判断し、蛍光寿命τが適正な誤差範囲に入っていない場合、第１ゲート長ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定し、蛍光寿命τを再演算する。

ここで、制御部１が判断する判断基準について説明する。図５は、蛍光寿命τで規格化された第１ゲート長ｔ１に対する標準偏差σ／τを示した特性図である。図５に示すように、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）／τごとの特性が示されている。なお、この特性は、光子数を２５０個としてモンテカルロ法によって５０００回の繰返し計算で蛍光寿命τを求めた結果であり、誤差σは、以下の式（５）によって定義される。

標準偏差σ／τを誤差σの指標とした場合、高精度の蛍光寿命τは、標準偏差σ／τが０．１以下であるとされている。図５に示すように、標準偏差σ／τが０．１以下である場合は、規格化された第１ゲート長ｔ１／τは、条件（１≦ｔ１／τ≦２）を満足し、規格化された全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）／τは、条件（４≦（ｔ１＋ｔ２）／τ）を満足している。そこで、制御部１は、以下の条件式（６），（７）を判断基準とする。

図６は、この２つの条件式（６），（７）によって特定された領域Ｒを示した図である。図６に示すように、ｔ２／τは、ｔ１／τの関数Ｌ（ｔ２／τ＝４―ｔ１／τ）によって表される。さらに、上述した２つの条件式（１≦ｔ１／τ≦２、４≦（ｔ１＋ｔ２）／τ）で特定された領域Ｒは、斜線部になる。

したがって、確定判定部１ｃは、演算処理部４から入力した蛍光寿命τをもとにｔ２／τ、ｔ１／τが領域Ｒに入っている場合、蛍光寿命τを確定して演算を終了させ、ｔ２／τ、ｔ１／τが領域Ｒに入っていない場合、第１ゲート長ｔ１および全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）を再設定する。

図７は、蛍光寿命τが確定されるまでの動作を示すフローチャートである。まず、ゲート長制御部１ｂは、第１ゲート長ｔ１を設定し、全ゲート長制御部１ａは、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）を設定する（ステップＳ１０１）。制御部１は、レーザ制御信号Ｓを光学部２に出力するとともに制御信号Ｓ１，Ｓ２を測定部３に出力し、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の測定を行う（ステップＳ１０２）。測定部３は、測定した蛍光光子数である測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２を演算処理部４に出力し、演算処理部４は、測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２をもとに蛍光寿命τを演算し（ステップＳ１０３）、確定判定部１ｃに出力する。確定判定部１ｃは、入力した蛍光寿命τが領域Ｒ内にあるか否かを判断し（ステップＳ１０４）、蛍光寿命τが領域Ｒ内にある場合（ステップＳ１０４，ＹＥＳ）、蛍光寿命τを確定する（ステップＳ１０５）。また、蛍光寿命τが領域Ｒ内にない場合（ステップＳ１０４，ＮＯ）、ゲート長制御部１ｂは、条件（τ≦ｔ１≦２τ）を満足する第１ゲート長ｔ１を設定し（ステップＳ１０６）、設定された第１ゲート長ｔ１をもとに全ゲート長制御部１ａは、条件（ｔ１＋ｔ２≧４τ）を満足する全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）を設定する（ステップＳ１０７）。なお、第１ゲート長ｔ１の設定（ステップＳ１０６）と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）の設定（ステップＳ１０７）とを同時に行ってもよい。

図８は、測定部３が測定した蛍光光子数に対する標準偏差σ／τの関係を示す特性図である。図８に示すように、蛍光光子測定数が１８５個で標準誤差σ／τが０．１以下になっている。従来は、標準偏差σ／τを０．１以下にするために蛍光光子測定数が２５０個以上必要であった。したがって、従来に比して約３／４以下の蛍光光子測定数で同程度の誤差の蛍光寿命τの算出ができる。

この実施の形態１では、蛍光寿命τを算出した後、この蛍光寿命τをもとにｔ１／τとｔ２／τとが領域Ｒに入っているか否かを判断し、蛍光寿命τを確定し、あるいは第１ゲート長ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定するようにしている。この結果、短時間に高精度の蛍光寿命τが算出できる。

なお、この実施の形態１では、測定部３のゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２が第１ゲート長ｔ１と第２ゲート長ｔ２とを個別に制御していたが、図９に示すタイミングチャートのように、ゲート制御信号Ｓ１が第１ゲート長ｔ１を制御し、ゲート制御信号Ｓ２が全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）を制御するようにしてもよい。

さらに、試料５の蛍光光子の放出確率が高い場合に対応して、図１０に示す測定部３Ａのような構成にしてもよい。測定部３Ａは、アンプ３ａ，３ｂ，３ｃと、スイッチＳＷ１，ＳＷ２と積分器Ｉ１，Ｉ２と、アナログデジタル変換器（Ａ／Ｄ変換器）ＡＤ１，ＡＤ２とを有している。測定部３Ａに入力した電気信号Ｅは、アンプ３ａ、スイッチＳＷ１，ＳＷ２を経由し、さらにアンプ３ｂ，３ｃを経由して積分器Ｉ１，Ｉ２に入力する。電気信号Ｅは、積分器Ｉ１，Ｉ２で積分され、Ａ／Ｄ変換器ＡＤ１，ＡＤ２によってサンプリングされてデジタル信号に変換される。測定部３Ａは、Ａ／Ｄ変換器ＡＤ１，ＡＤ２から出力されたデジタル信号を蛍光光子数の測定信号Ｃｔ１，Ｃｔ２とする。このようにすると、試料５の蛍光光子の放出確率が高く、電気信号Ｅがパルス状にならない場合においても、Ａ／Ｄ変換器ＡＤ１，ＡＤ２が１光子に対応してサンプリングするため正確な蛍光光子数を測定できる。

また、試料５の蛍光光子の放出確率が高い場合にも小さい場合にも対応できるように、図１１に示す測定部３Ｂのような構成にしてもよい。図１１に示す測定部３Ｂは、図２に示す測定部３の構成と図１０に示す測定部３Ａの構成とを合体させている。このようにすると、演算処理部４は、試料５の蛍光光子の放出割合に応じて蛍光光子数の測定値信号Ｃ１，Ｃ２を選別することができる。また、演算算処理部４は、２通りの蛍光寿命τを算出し、適当な蛍光寿命τを選択出力できる。

つぎに、この発明の実施の形態１の変形例について説明する。図１２は、この実施の形態１の変形例である蛍光寿命測定装置１００Ａの概要構成を示すブロック図である。図１２に示すように、蛍光寿命測定装置１００Ａは、記憶部６を有し、この記憶部６は、制御部１Ａに接続されている。この記憶部６は、実施の形態１の図５に示す、第１ゲート長ｔ１に対する標準偏差σ／τの特性図をテーブルとして格納しており、演算処理部４が蛍光寿命τを出力すると、制御部１Ａは、記憶部６に格納されたテーブルから適正なｔ１／τと（ｔ１＋ｔ２）／τとを入力し、入力した蛍光寿命τが適正か否かを判断するようにしている。このようにすると、ｔ１／τと（ｔ１＋ｔ２）／τとを演算する時間が省略でき、より短時間に高精度の蛍光寿命τが確定できる。

（実施の形態２）
つぎに、実施の形態２について説明する。実施の形態１では、パルス励起光の照射直後から蛍光光子数の測定を行っていたが、実施の形態２では、蛍光光子数の測定開始前に遅延時間を設け正確な蛍光光子数が測定できるようにしている。

図１３は、この実施の形態２である蛍光寿命測定装置１００Ｂの概要構成を示すブロック図である。図１３に示すように、制御部１Ｂは、全ゲート長制御部１ａ、ゲート長制御部１ｂ、確定判定部１ｃの他に遅延時間制御部１ｄを有している。遅延時間制御部１ｄは、励起光の照射後、蛍光光子の放出がＰＭＴ２ｄの受光感度の範囲に入るまで蛍光光子の測定を遅延するようにゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２を設定している。

励起された試料から放出される蛍光光子の放出確率は、ポアソン分布にしたがうため、蛍光光子の放出数は、励起光の照射直後に最大となり、ＰＭＴ２ｄの受光感度を上まわる場合がある。このような場合、正しい蛍光光子数が測定されず、算出された蛍光寿命τも大きな誤差σを伴う。そこで、遅延時間制御部１ｄは、適当な遅延時間を設けて正確な蛍光光子数が測定できるようにしている。

図１４は、ＰＭＴ１ｄの受光感度の限界が蛍光光子数ｎ₀であることを示す減衰特性図である。この場合、遅延時間制御部１ｄは、蛍光光子数がｎ₀に減衰するまでの遅延時間ｔ０（時刻Ｔ０〜Ｔ０´）を設け、蛍光光子数がｎ₀に減衰するのを待って蛍光光子数を測定するようにしている。図１５にレーザ制御信号Ｓとゲート長制御信号Ｓ１，Ｓ２とのタイミングチャートを示す。

図１５に示すように、第１ゲート長ｔ１は、時刻Ｔ０´〜Ｔ１の時間となり、第２ゲート長ｔ２は、時刻Ｔ１〜Ｔ２の時間となり、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）は、時刻Ｔ０´〜Ｔ２の時間となる。したがって、第１ゲート長ｔ１で測定された蛍光光子数をＩ₁とし、第２ゲート長ｔ２で測定された蛍光光子数Ｉ₂とした場合、Ｉ₁とＩ₂との比Ｉ₂／Ｉ₁は以下の式（２）´によって示される。

そこで、実施の形態１で説明した式（２）を上述の式（２）´に置換えれば、蛍光寿命τを算出することができる。

この実施の形態２では、蛍光光子の放出後に遅延時間を設けることによって、正確な蛍光光子数を測定し、蛍光寿命τが短時間に収束するようにしている。なお、この実施の形態２では、遅延時間をＰＭＴ１ｄの受光感度に応じて設定するようにしていたが、試料５の蛍光光子の放出確率、装置全体の蛍光光子数に対する分解能に合わせて設定するようにしてもよい。

（実施の形態３）
つぎに、実施の形態３について説明する。実施の形態１，２では、演算処理部４が蛍光寿命τを演算出力し、確定判定部１ｃがこの蛍光寿命τをもとにゲート遅延時間ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが適正な範囲内にあるか否かを判断していたが、この実施の形態３では、第１ゲート長と第２ゲート長とを同一の時間長に設定し、第１ゲート長の開始時と第２ゲート長の開始時との時間差をゲート遅延時間ｔ１としている。そして、測定部３から出力される測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２によってゲート遅延時間ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが適正な範囲内にあるか否かを判断し、無駄な蛍光寿命τの演算を省略するようにしている。

図１６は、実施の形態３である蛍光寿命測定装置１００Ｃの概要構成を示すブロック図である。図１６に示すように、測定部３は、電気信号Ｅを入力して蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂を測定し、測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２を制御部１Ｃと演算処理部４とに出力する。制御部１Ｃは、全ゲート長制御部１ａ、ゲート長制御部１ｂ、遅延時間制御部１ｄの他に、判定部１ｅと、演算指示部１ｆとを有し、判定部１ｅは、入力した測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２をもとにゲート遅延時間ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが適正な範囲内にあるか否かを判断し、適正な範囲内にない場合は、ゲート遅延時間ｔ１と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定し、適正な範囲内にある場合、演算指示部１ｆは、演算処理部４に蛍光寿命τを演算指示を出力している。

図１７にレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２とのタイミングチャートを示す。図１７に示すように、ゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２の「ＯＮ」時間がｔ２となり、第１ゲート長ｔ２と第２ゲート長ｔ２とは同一の長さになっている。また、ゲート長制御信号Ｓ１が「ＯＮ」するタイミングから時間ｔ１遅れてゲート制御信号Ｓ２が「ＯＮ」するため、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）となる。

このように第１ゲート長ｔ２と第２ゲート長ｔ２とが同じ長さであり、各ゲート長で測定された蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂である場合、蛍光寿命τは以下の式（４）´によって示される。

また、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）は、実施の形態１で説明した条件式（６）を変形した以下の条件式（６）´で示される。

一方、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の比（Ｉ₁／Ｉ₂）は、同様に実施の形態１で説明した条件式（７）を変形した以下の条件式（７）´で示される。

また、条件式（７）´で示された自然対数の底ｅに近似値（ｅ≒２．７２）を代入すると、条件式（７）´は、以下の条件式（７）´´によって近似される。

したがって、判定部１ｅは、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂に対応した測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２から蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の比（Ｉ₁／Ｉ₂）が条件式（７）´´を満足しているか否かを判断する。蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の比（Ｉ₁／Ｉ₂）が条件式（７）´´を満足している場合、演算指示部１ｆは、演算処理部４に対して蛍光寿命τの演算指示を出力し、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂が条件式（７）´´を満足していない場合、判定部１ｅは、第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定する。

図１８は、蛍光寿命τが確定するまでの動作を示すフローチャートである。まず、ゲート長制御部１ｂは、第１ゲート長ｔ２を設定し、全ゲート長制御部１ａは、全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）を設定する（ステップＳ２０１）。つぎに測定部３は、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の測定を行う（ステップＳ２０２）。測定部３は、蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂に対応した測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２を制御部１Ｃに出力し、制御部１Ｃ内の判定部１ｅは、測定値信号Ｃｔ１，Ｃｔ２をもとに蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の比（Ｉ₁／Ｉ₂）が条件式（７）´´を満足するか否かを判断する（ステップＳ２０３）。比（Ｉ₁／Ｉ₂）が条件式（７）´´を満足している場合（ステップＳ２０３，ＹＥＳ）、演算指示部１ｆは、演算処理部４に対して蛍光寿命τを演算させ（ステップＳ２０４）、比（Ｉ₁／Ｉ₂）が条件式（７）´´を満足しない場合（ステップＳ２０３，ＮＯ）、判定部１ｅは、第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定する。

第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とを再設定する場合、第１ゲート長ｔ２を適当に決めておき、第１ゲート長ｔ２と第２ゲート長ｔ２とは変更せず、条件式（７）´をもとにゲート遅延時間ｔ１のみを変更するようにしてもよい。このようにすると、変更する部分が少ないため、より短時間で適正な第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが設定できる。

この実施の形態３では、第１ゲート長ｔ２と第２ゲート長ｔ２とを同一の長さにし、第１ゲート長ｔ２と第２ゲート長ｔ２とで測定された蛍光光子数Ｉ₁，Ｉ₂の比（Ｉ₁／Ｉ₂）が具体的数値による条件式を満足するか否かを判断することによって、容易に第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが適正であるか否かが判断できる。したがって、第１ゲート長ｔ２と全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とが適正であると判断された場合に限り蛍光寿命τを演算するようにすると、無駄な蛍光寿命τの演算を省略でき、高速で高精度の蛍光寿命τの確定を行うことができる。

なお、上述した実施の形態１〜３では、複数のゲート長を第１ゲート長ｔ１と第２ゲート長ｔ２との２つに設定するようにしていたが、３以上のゲート長を設定するようにしてもよい。

この発明の実施の形態１である蛍光寿命測定装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態１である測定部の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態１であるレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」のタイミングを示すタイムチャートである。この発明の実施の形態１である蛍光光子数の減衰特性を示すグラフである。この発明の実施の形態１である規格化されたゲート遅延時間に対する標準偏差の特性を示すグラフである。この発明の実施の形態１である領域Ｒを示すグラフである。この発明の実施の形態１である蛍光寿命τが確定されるまでの動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態１である効果を示すグラフである。この発明の実施の形態１であるレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」のタイミングを示すタイムチャートである。この発明の実施の形態１である測定部の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態１である測定部の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態１の変形例である蛍光寿命測定装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態２である蛍光寿命測定装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態２である蛍光光子数の減衰特性を示すグラフである。この発明の実施の形態２であるレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」のタイミングを示すタイムチャートである。この発明の実施の形態３である蛍光寿命測定装置の概要構成を示すブロック図である。この発明の実施の形態３であるレーザ制御信号Ｓとゲート制御信号Ｓ１，Ｓ２の「ＯＮ」，「ＯＦＦ」のタイミングを示すタイムチャートである。この発明の実施の形態３である蛍光寿命τが算出されるまでの動作を示すフローチャートである。

符号の説明

１制御部
１ａ全ゲート長制御部
１ｂゲート長制御部
１ｃ確定判定部
１ｄ遅延時間制御部
１ｅ判定部
１ｆ演算指示部
２光学部
２ａレーザ発振器
２ｂ，２ｃレンズ
２ｄＰＭＴ
３，３Ａ，３Ｂ測定部
３ａ，３ｂ，３ｃアンプ
４演算処理部
５試料
６記憶部
ＳＷ１，ＳＷ２スイッチ
Ｈ１，Ｈ２波高分別器
Ｃ１，Ｃ２デジタルカウンタ
Ｉ１，Ｉ２積分器
ＡＤ１，ＡＤ２Ａ／Ｄ変換器
１００，１００Ａ，１００Ｂ，１００Ｃ蛍光寿命測定装置

Claims

試料に励起光を照射し、該励起光によって励起された前記試料から発する蛍光光子数を複数の時間帯である複数のゲート長で測定し、該複数のゲート長で測定された各ゲート蛍光光子数をもとに前記試料の蛍光寿命を演算して確定する蛍光寿命測定装置において、
前記蛍光光子数の測定開始直後から前記ゲート蛍光光子数を測定する前記ゲート長である開始ゲート長を少なくとも変更するゲート長変更手段と、
前記蛍光光子数の測定開始時から測定終了時までの時間である全ゲート長を変更する全ゲート長変更手段と、
前記開始ゲート長と該開始ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数を含む複数の前記ゲート蛍光光子数とをもとに前記蛍光寿命を演算する演算手段と、
前記蛍光寿命が所定の条件を満足していない場合、前記ゲート長変更手段および前記全ゲート長変更手段に対し、前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを変更させる制御を行う制御手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光寿命測定装置。
前記所定の条件は、前記蛍光寿命と前記開始ゲート長と前記全ゲート長との関係を示す前記蛍光寿命の関数で表されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光寿命測定装置。
前記関数は、前記蛍光寿命τ、前記開始ゲート長は、該複数の時間ゲートの開始時間差を表し、これをゲート遅延時間ｔ１とし、前記全ゲート長（ｔ１＋ｔ２）とした場合、１≦（ｔ１／τ）≦２、（ｔ１＋ｔ２）／τ≧４であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光寿命測定装置。
前記蛍光寿命の値に対応した前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを記憶する記憶手段をさらに備えたことを特徴とする請求項３に記載の蛍光寿命測定装置。
前記励起光の照射後、前記試料から発する前記蛍光光子が所定数以下になるまで前記蛍光光子数の測定の開始時を遅延する遅延時間を設けることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の蛍光寿命測定装置。
試料に励起光を照射し、該励起光によって励起された前記試料から発する蛍光光子数を複数の時間帯である複数のゲート長で測定し、該複数のゲート長で測定された各ゲート蛍光光子数をもとに前記試料の蛍光寿命を演算して確定する蛍光寿命測定装置において、
前記蛍光光子数の測定開始直後から前記ゲート蛍光光子数を測定する前記ゲート長である開始ゲート長を少なくとも変更するゲート長変更手段と、
前記蛍光光子数の測定開始時から測定終了時までの時間である全ゲート長を変更する全ゲート長変更手段と、
前記開始ゲート長と該開始ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数を含む複数の前記ゲート蛍光光子数とをもとに前記蛍光寿命を演算する演算手段と、
前記複数のゲート蛍光光子数の比が所定の条件を満足しない場合、前記ゲート長変更手段および前記全ゲート長変更手段に対し、前記開始ゲート長と前記全ゲート長とを変更させる制御を行う制御手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光寿命測定装置。
前記所定の条件は、２つの前記ゲート長である第１ゲート長と第２ゲート長との時間長を同一とし、前記第１ゲート長が前記第２ゲート長よりも先に前記ゲート蛍光光子数の測定を開始する場合、前記第２ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に対し、前記第１ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数が、約２．７２倍以上、約７．３９倍以下であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光寿命測定装置。
２つの前記ゲート長である第１ゲート長と第２ゲート長とは重複する時間部分を有し、前記第１ゲート長の開始時と前記第２ゲート長の開始時との時間差を前記開始ゲート長とすることを特徴とする請求項６に記載の蛍光寿命測定装置。
前記第２ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に対する前記第１ゲート長の間に測定された前記ゲート蛍光光子数に関する前記所定の条件を記憶する記憶手段をさらに備えたことを特徴とする請求項７または８に記載の蛍光寿命測定装置。
前記励起光の照射後、前記試料から発する前記蛍光光子が所定数以下になるまで前記蛍光光子数の測定の開始時を遅延する遅延時間を設けることを特徴とする請求項６〜９のいずれか一つに記載の蛍光寿命測定装置。