JP2006133164A - カルモデュリンの構造変化を検出する方法、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カルモデュリンよりなる試料膜に、活性を検出するべき被験物質を作用させ、上記被験物質を作用させる前と比べた試料膜の張力及び/または弾性の変化をメカノケミカル式センサーで検出することにより、上記被験物質が有するカルモデュリンの構造変化を誘導または阻害する活性をリアルタイムに短時間で測定できる方法が提供された。
【選択図】なし
Description
ウシ脳由来カルモデュリン(Sigma)を2 mg/mLの濃度で純水に溶解し、その溶液を特表2002-511792号公報に記載された静電噴霧を行う装置、あるいは特開2003-136005号公報に記載された固定化装置を用いて乾燥空気中で噴霧し、縦400μm横800μmの孔をもつマスクを透過させ、静電噴霧法(ESD法)により1.2%ポリビニルピロリドン上に膜を作成した。この膜を、メカノケミカル式センサーを有する特表2002-503332号公報あるいは米国特許US6033913号公報に記載されている装置上に配置し、0.1 M NaClを含む10 mM Hepes pH7.4緩衝液(以下、緩衝液と略す)中に浸した。緩衝液を、検出装置上に存在する膜上に0.1から0.2 mL/minの流速で流し、張力を安定させた。その後、同じ流速で、上記緩衝液中に溶解したCaCl2溶液を流し、張力および弾性の変化を検出した(図1)。
実施例1と同一の材料および方法で作成したカルモデュリン膜を、0.1M KCl、10mM EGTA を含む10mM MOPS 緩衝液 pH7.2中に浸した。遊離カルシウムイオン濃度が151nM、352nM、1360nMのカルシウムバッファー溶液を作成し、それら単独あるいは50μMのカルモデュリン阻害剤W-7を加えた溶液を流し、張力および弾性の変化を検出した(図2)。
実施例1と同一の材料および方法で作成したカルモデュリン膜を、0.1M KCl、10mM EGTA を含む10mM HEPES 緩衝液 pH7.2中に浸した。そしてカルシウム依存性プロテインキナーゼIIのカルモデュリン結合部位断片を含む溶液を作成し、これをカルモデュリン膜と接触させて張力および弾性の変化を検出した(図3)。
Claims (13)
- カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化を検出する方法。
- 前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項1記載の方法。
- 基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項1記載の方法。
- 前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項3記載の方法。
- カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法。
- 前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項5記載の方法。
- 基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項5記載の方法。
- 前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項7記載の方法。
- カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルシウム/カルモデュリンが関与する細胞内情報伝達経路に変化が生じる疾患の診断薬または治療薬を探索する方法。
- 前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項9記載の方法。
- 基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項9記載の方法。
- 前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項11記載の方法。
- カルモデュリン蛋白質からなる試料膜。
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