JP2003522946A

JP2003522946A - 蛍光強度及び寿命分布分析

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Publication number: JP2003522946A
Application number: JP2001558718A
Authority: JP
Inventors: ペートカスク; パロカウポ; ライフブラント; カルシュテンガール
Original assignee: エボテックオーアーイーアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2000-02-10
Filing date: 2001-02-10
Publication date: 2003-07-29
Anticipated expiration: 2021-02-10
Also published as: ATE381013T1; JP4776854B2; AU2001239258A1; DE60131837T2; WO2001059436A3; WO2001059436A2; US20020063863A1; ES2298221T3; US6690463B2; EP1254362A2; DE60131837D1; DK1254362T3; EP1254362B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、以下の段階を含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法に関する：−一連の励起パルスによって蛍光を放射するために測定容量中の粒子を励起する段階、−検出手段を用いて、光子カウントのシーケンスを検出することによって、放射された蛍光をモニターする段階、−所定幅のカウント時間間隔における光子カウントの数を決定する段階、−前記カウント時間間隔において、対応する励起パルスに対する光子カウントの検出遅延時間を決定する段階、−前記検出遅延時間の関数を決定する段階、−少なくとも２つの独立変数の確率関数【数１】を決定する段階、ここで、少なくとも１つの独立変数は、光子カウントの数であり、別の独立変数は、検出遅延時間の前記関数である、及び−前記確率関数【数２】から、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布を決定する段階、ここで、１つの独立変数は、粒子の比明度又はその測度であり、別の独立変数は、粒子の蛍光寿命又はその測度である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法及び前記方法の適用に関す
る。

【０００２】蛍光の利用は、様々な科学的適用において、高い感度を示すため、過去数十年
の間に急速に進歩している。器械工学（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、デ
ータ分析、プローブ及び使用における新たな開発の結果、約１５０年前に発見さ
れた現象に基づく技術は、高い評価を得た（ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）、Ｐｈ
ｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．１４２，４６３−５６
２，１８５２）。物理化学、生物学及び医学（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）における多
数の適用において、蛍光は、希薄溶液中の化学的結合反応の高感度検出手段とし
て使用される。薬剤スクリーニング及び薬学的アッセイの開発は、この種の適用
分野の例である。

【０００３】全体の強度又は異方性のような顕微鏡でしか判別できない蛍光特性における変
化の検出に基づく古典的な方法のほかに、ここ１０年の間に、単一分子に特有な
性質に基づいて種を区別する、多数の異なる変動法（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ）が開発された。単一分子の感度を用いる最も複雑な蛍光技術の
１つは、まず第一に、異なる並進拡散係数に基づき、異なる種を区別し得る蛍光
相関顕微鏡法（ＦＣＳ）である（マグデ（Ｍａｇｄｅ）ら，Ｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｖ．Ｌｅｔｔ．２９，７０４−７０８，１９７２；エルソン（Ｅｌｓ
ｏｎ）ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１３，１−２７，１９７４；リグ
ラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２２，１６
９−１７５，１９９３）。最近、異なる蛍光種を、それらの比明度によって識
別する蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）が、この蛍光変動法と同等なものであるこ
とが見出された（カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１３７５６−１３７６１，１９９９）。“比
明度”という語は一般に、試料中のある位置、通常は、明度プロファイル（ｐｒ
ｏｆｉｌｅ）変動の値が単一である位置に置かれた所定の種の粒子によって発せ
られる光からの、検出器の平均カウント速度（ｍｅａｎｃｏｕｎｔｒａｔｅ
）を意味する。

【０００４】単一の特異的物性に基づいて種を区別する、ＦＣＳやＦＩＤＡのような方法の
ほかに、蛍光の異なる偏光成分又は放射バンドをモニターする２つの検出器を用
いる二次元法が開発されている。特に、蛍光相互相関（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅ
ｌａｔｉｏｎ）分析及び二次元蛍光強度分布分析（２Ｄ−ＦＩＤＡ）は、２つの
タイプの比明度に基づき種を認識する方法である（カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５，２１３−２２０，１９８９；シュウィル（
ＳｃｈｗｉｌｌｅＩ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７２，１８７８−１８
８６，１９９７；カスク（Ｋａｓｋ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８，
２０００）。

【０００５】ＦＣＳ、ＦＩＤＡ及び上記二次元法は、変動分光学の統計学的な方法であるの
に対し、個々の分子を同定することを目的とする、別の幅広い分野の研究も行わ
れている。多くの適用は、分子の直接的な環境のあらゆる変化に反応する固有の
（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）分子の性質として、蛍光寿命を利用する。しかし、上記
の変動法と違い、蛍光寿命分析（ＦＬＡ）は、基本的に顕微鏡的な技術であり、
モニターされる試料容量における分子数変動を必要とせずに、異なる蛍光遅延（
ｄｅｃａｙ）時間を識別することができる。従って、蛍光寿命の測定は、高試料
濃度のキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅｓ）において通常行われる。しかし、この手
段の欠点は、遅延時間ヒストグラムを検出するために実験的に集められた励起光
（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）が、区別するのが困難な異なる種からの寄与を受ける
ことである。また、ＦＬＡは、低い耐久性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）しかもたず
、わずかに誤った仮定により、大きく誤った結果がもたらされる。

【０００６】それに対し、寿命実験も、非常に低い平均粒子数に適用されている。古典的な
ＦＬＡと対比されるこのアプローチは、破裂積算（ｂｕｒｓｔｉｎｔｅｇｒａ
ｔｅｄ）蛍光寿命分析（ＢＩＦＬ）として紹介された（ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）
ら，ＡｐｐｌｉｅｄＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ５０，１２Ａ−３２Ａ，
１９９６）。ＢＩＦＬは、ある閾値強度以上の単一分子からの蛍光破裂（ｂｕ
ｒｓｔｓ）を調べる。その欠点は、測定容量当たりの濃度が１粒子よりもはるか
に低いときにしか適用できないため、比較的長いデータ収集時間を必要とするこ
とである。

【０００７】蛍光寿命実験が、時間相関単一光子カウント（ｔｉｍｅｃｏｒｒｅｌａｔｅ
ｄｓｉｎｇｌｅｐｈｏｔｏｎｃｏｕｎｔｉｎｇ）（ＴＣＳＰＣ）とともに
時間領域において行われる場合、単一光子の遅延時間ｔを検出するための励起は
、ヒストグラムにまとめて記録される。蛍光寿命を得るために、理論分布Ｐ（ｔ
）を、これらの実験データに対して補正する（ｆｉｔｔｅｄ）。通常、Ｐ（ｔ）
は、それぞれの器具応答関数（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ）（ＩＲＦ）に関連する単一又は多数の指数遅延関数（ｅｘｐｏｎ
ｅｎｔｉａｌｄｅｃａｙｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって示される。この種の分
析により、試料の構成物質の特徴付けが、それらの個々の寿命τによって行われ
得るのに対し、それらの濃度ｃ、及び比明度ｑの決定はできず、その積ｑｃのみ
が決定され得る。

【０００８】従って、本発明の目的は、個々の粒子の特徴付けを、それらの蛍光粒子に基づ
いて行い得る、高い精度及び耐久性を有する方法を提供することである。

【０００９】本発明によれば、以下の段階を含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法
が提供される。まず最初に、測定容量中の粒子が、一連の励起パルスによって励
起され、放射された蛍光が、光子カウントのシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
を検出することによってモニターされる。この目的のために、共焦点エピイルミ
ネーテッド（ｅｐｉ−ｉｍｍｕｍｉｎａｔｅｄ）顕微鏡が、高反復速度（例えば
１００ＭＨｚ）のレーザーパルス励起光と組み合わせて使用されることが好まし
い。所定幅のカウント時間間隔における光子カウントの数、並びに対応する励起
パルスに対する光子カウントの検出遅延時間が決定される。以下に詳述するよう
に、前記検出遅延時間の関数が得られ、次の段階として、少なくとも２つの独立
変数（ａｒｇｕｍｅｎｔｓ）の確率関数

【数８】が決定される。式中、１つの独立関数は、光子カウントの数であり、別の独立関
数は、検出遅延時間の前記関数である。その後、前記確率関数

【数９】に基づき、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布が決定される。
式中、一つの独立変数は粒子の比明度（またはその測度（ｍｅａｓｕｒｅ））で
あり、別の独立変数は、粒子の蛍光寿命（又はその測度）である。蛍光強度及び
寿命分布分析（ＦＩＬＤＡ）と呼ばれる本発明による方法は、完全な濃度、即ち
、従来のＦＬＡでは直接得られない量を決定することができる。本発明によるこ
のような相関法において使用される場合、組み合わされた情報（ｃｏｍｂｉｎｅ
ｄｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により、ＦＩＤＡ及び蛍光寿命分析のみと比較し
て、大幅に向上した精度が得られる。ある閾値強度以上の単一分子からの蛍光破
裂を調べるＢＩＦＬと比較して、ＦＩＬＤＡは、好ましくは、全てのデータの連
続（ｗｈｏｌｅｄａｔａｓｔｒｅａｍ）の相対的な変動を分析するので、異
なる分子からの同時光子放射の可能性を明らかにする。従って、本発明は、ＢＩ
ＦＬよりも、はるかに高濃度において使用することもできる。

【００１０】以下に、基本的な理論並びに好ましい態様を詳述し、シミュレーションされた
実験的データへ適用する。異なる種の区別における顕著な能力が、カルモデュリ
ン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）のペプチドリガンドへの結合の定量化によって示さ
れ、生命科学における幅広い利用可能性が約束される。

【００１１】先に略述したように、本発明は、少なくとも二次元の方法に基づき、試料中の
異なる蛍光粒子種が、比明度並びに寿命値によって、お互いに区別される。しか
し、いくつかの場合には、異なる色又は偏光の蛍光をモニターする２つの異なる
光子検出器に関して、更なる粒子の性質、例えばそれらの拡散カウント又は明度
を考慮することが有利なこともある。これらの場合には、本発明の方法は、二次
元だけよりもさらに高次元であり、確率関数の式中で点によって示される。しか
し、分かりやすくするために、以下の説明のほとんどが、二次元の場合において
詳述される。

【００１２】本発明により、試料の異なる種を、そられの寿命τ、明度値ｑによって識別し
、並びにそれらの完全な濃度ｃを決定するのに適した方法が開発された。重要な
点（ｋｅｙ）は、理論的に表された予想される分布Ｐ（ｎ，ｔ）を適用し、検出
された光子カウントの数ｎ、及び積算遅延時間ｔの測定された二次元ＦＩＬＤＡ
分布

【数１０】を分析することである。以下に、測定された二次元ＦＩＬＤＡ分布を補正し得る
、迅速かつ効率的なアルゴリズムが得られる、ＦＩＤＡの理論の拡張（カスク（
Ｋａｓｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９
６，１３７５６−１３７６１，１９９９）を示す。生成関数の表現を用いて
、問題は、まず単一種のものに低減される。単一種の場合、Ｐ（ｎ，ｔ）は、光
子カウント数分布Ｐ（ｎ）及び光子カウントｎにおける積算遅延時間Ｐ（ｔ｜ｎ
）という、２つの因子の積として表される。Ｐ（ｎ）は、ＦＩＤＡの理論によっ
て算出され、Ｐ（ｔ｜ｎ＝１）＝Ｐ（ｔ）は、ＦＬＡの理論によって算出される
ので、Ｐ（ｔ｜１）からＰ（ｔ｜ｎ）を算出することだけが更に必要である。

【００１３】本発明によるＦＩＬＤＡ理論の主な好ましい構成部は、生成関数の概念である
。確率分布Ｐ（ｎ，ｔ）の生成関数は、

【数１１】と定義される。

【００１４】各光子の検出遅延時間ｔは、不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）間隔において表さ
れる。この定義において、生成関数の独立関数ζ及びηを、ｅⁱφの形で選択す
ることが都合がよい。この選択のため、Ｇ（ζ，η）及びＰ（ｎ，ｔ）は、迅速
なアルゴリズムによって算出され得る二次元フーリエ変換によって相互に関係付
けられる（ブリハム（Ｂｒｉｇｈａｍ），ＴｈｅＦａｓｔＦｏｕｒｉｅｒ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ
），エングウッド・クリフス（ＥｎｇｗｏｏｄＣｌｉｆｆｓ），ＮＪ，
１９７４）。

【００１５】Ｐ（ｎ，ｔ）及びＧ（ζ，η）に含まれる寄与がどの程度異なるかを比較する
と、生成関数を表すことが都合がよい理由が、明らかになる。例えば、別々に分
布Ｐ₁（ｎ，ｔ）及びＰ₂（ｎ，ｔ）をもたらし得る２つの独立した蛍光種を有す
るならば、得られる分布は、

【数１２】というたたみ込み（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）として表されるのに対し、生成関
数の表現では、この関係は、

【数１３】という簡単な積として表される。

【００１６】たたみ込みの計算は、非常に時間がかかるが、積の計算は、迅速かつ簡単であ
る。更に、２より多い種に対する式３の一般化は、簡単である。式３は、積によ
るこの説明を、数種の成分の場合に簡単に拡張するので、単一種の理論的な説明
の知識で、既に十分である。従って、以下において、単一種の場合について考察
する。

【００１７】各光子の検出遅延時間の確率分布は、あらかじめ放出又は検出された光子の数
や光子を放出する分子の座標のいずれにも依存しない、所定の種を特徴付ける関
数として考察され得る。これは、Ｐ（ｎ，ｔ）が

【数１４】Ｐ（ｎ，ｔ）＝Ｐ（ｎ）Ｐ（ｔ｜ｎ），（４）として得られ得ることを意味する。ここで、Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ個の光子の積算
検出遅延時間の確率分布であり、Ｐ（ｎ）は、所定のカウント時間間隔内にｎ個
の光子を検出するための確率関数である。Ｐ（ｔ｜ｎ）は、ｎ倍のたたみ込みに
よってＰ（ｔ｜１）から計算されるので、Ｐ（ｔ｜ｎ）の一次元生成関数は、Ｐ
（ｔ｜１）の生成関数のｎ倍である：

【数１５】

【００１８】式４及び式５を式１に置換すると、以下の式が得られる：

【数１６】

【００１９】式６によれば、所定のη値に対応するＧ（ζ，η）−マトリックスの各カラム
は、関数Ｐ（ｎ）［Ｇ（η｜１）］ⁿの一次元フーリエ変換であり、一方、式７
によれば、Ｇ（ζ，η）−マトリックスの各成分は、ζＧ（η｜１）点における
Ｐ（ｎ）のフーリエイメージとして表され得る。

【００２０】Ｇ（η｜１）は、特別な種から生じる光子の予想される検出遅延時間分布の生
成関数Ｐ（ｔ｜１）（ここでは、一次元フーリエ変換）である。関数Ｐ（ｔ｜１
）は、ＩＲＦ及び所定の種を特徴付ける遅延時間との指数関数の周期的なたたみ
込みである。

【００２１】どのようにＰ（ｎ）を算出するかという問題は、カスク（Ｋａｓｋ）らによっ
て説明されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９６，１３７５６−１３７６１，１９９９；この内容は、本明細書に開示
として援用される）。Ｐ（ｎ）は、その生成関数によって（ｗｉｔｈｔｈｅ
ｈｅｌｐｏｆ）算出され、単一種の場合には、

【数１７】として表される。ここで、Ｂ（ｒ）は、空間（ｓｐａｔｉａｌ）明度関数であり
、ｑは、見掛けの（ａｐｐａｒｅｎｔ）比明度であり、Ｔは、カウント時間間隔
の幅であり、ｃは、見掛けの濃度であり、ｄＶは、容量成分である。式８の右辺
の積分は、数字によって（ｎｕｍｅｒｉｃａｌｌｙ）算出され得る。空間明度と
対応する容量成分との関係（式８の右辺の計算に必要とされる）は、好ましくは
、３つの補正パラメーター、ａ₁、ａ₂、及びａ₃の経験から得られた式によって
表される。

【数１８】ここで、ｕ＝ｌｎ［Ｂ（０）／Ｂ（ｒ）］であり、Ａ₀は、容量の単位を選ぶ
ために使用される係数である。但し、空間明度Ｂ及び容量要素ｄＶの関係は、

【数１９】によっても表され得る。真の濃度と見掛けの濃度との関係及び真の比明度と見掛
けの比明度との関係は、ＦＩＭＤＡの理論において得られる（パロ（Ｐａｌｏ）
ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９，２８５８−２８６６，２０００：こ
の内容は、本明細書に開示として援用される）。

【００２２】以下に、ｃ_app及びｑ_appがどの程度Ｔに依存するかを予想する理論を示す。単
一種の場合を研究し、式３に対応する分布の第一及び第二階乗キュムラントを算
出する。階乗キュムラントは、

【数２０】として定義され、

【数２１】が得られる。ここで、一般化条件

【数２２】が使用される。（注；式９ｂ及び９ｃは、キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅ
ｌｓｏｎ）の式と完全に一致する（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５７：３７５−
３８０，１９９０）。式９ｂから、

【数２３】という結論が得られる。ここで、

【数２４】は、平均カウント速度であり、Ｔの選択に依存しない。カウント数分布Ｐ（ｎ；
Ｔ）の第二キュムラント及び蛍光強度の自己相関関数

【数２５】との以下の関係

【数２６】を用いることにより進められるであろう。

【００２３】

【数２７】という表記を導入することにより、式９ｇ及び９ｃから、

【数２８】が得られる。

【００２４】式９ｆ及び９ｉから、

【数２９】が得られる。

【００２５】Ｐ（ｎ，ｔ）の生成関数Ｐ（ｎ，ｔ）の理論式を得る最後の段階として、式７
及び式８を組み合わせて

【数３０】を得る。

【００２６】式１０は、コンパクトな理論式である。Ｇ（ζ，η）の蛍光寿命への依存は、
関数Ｇ（η｜１）のみによって表される。しかし、２つの一次元分布Ｐ（ｎ）及
びＰ（ｔ｜１）は、単一種に対してＧ（ζ，η）の結果を完全に決定することは
、式１０からよりも、式６からの方がより明確であり得る。多数の種に対し、式
３及び１０から、

【数３１】が得られる。ここで、下付き文字iは、異なる種を意味する。

【００２７】不連続なフーリエ変換アルゴリズムは、確率分布から生成関数を算出する場合
、またはその逆の場合に使用され得る。これは、生成関数が、周期的な独立変数
の関数として人為的に（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ）考慮されていることを意味
する。従って、周期が規定されるべきである。カウント数の大きさ（ｄｉｍｅｎ
ｓｉｏｎ）では、ｎ値での期間を規定することが都合がよい。ここで、Ｐ（ｎ）
は、実際はゼロに低下する。検出遅延時間の大きさでは、２つの異なる期間の値
が考慮されるべきである。

【００２８】Ｐ（ｔ｜１）を計算する場合、選ばれた周期は、レーザー励起期間と一致すべ
きである。ここで、蛍光遅延変動は、パルス期間Ｎ_lの間、ゼロになる必要がな
いことが考慮される。連続励起パルス０＜ｔ≦Ｎ_lの間に、Ｐ（ｔ｜１）が算出
されると、その後、間隔Ｎ_l≦ｔ≦Ｎ_tにおいて、関数はゼロに引き伸ばされる（
ｐａｄｄｅｄｂｙｚｅｒｏｓ）。ここで、Ｎ_tは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）
の周期の値を意味する。Ｎ_tの値は、分布Ｐ（ｎ，ｔ）が実際にゼロになるとこ
ろに選択される。その後、式６は、Ｐ（ｎ，ｔ）のフーリエイメージの計算に適
用される。

【００２９】上記に説明したように、Ｐ（ｔ｜１）及びその生成関数を計算するとき、選択
された確率分布の期間は、レーザー励起期間と当然一致すべきである。パルス期
間を幅ΔのＮ_l検出遅延時間間隔に分割するとすると、δ−励起に対応する、理
想的な区分された（ｐｅｒｉｏｄｉｚｅｄ）確率分布は、間隔０＜ｔ≦Ｎ_lにお
いて、

【数３２】として表される。τは、蛍光寿命を示す。（同様に区分された関数である）時間
応答関数Ｒ（ｔ）による、Ｐδ（ｔ）のたたみ込みの最も簡単な計算方法は、フ
ーリエ変換による、

【数３３】である。

【００３０】正確さのために、Ｐ（ｔ｜１）は、高時間分解能で計算され得る。後述の実験
２で行われたように、例えば、ここでは８倍高い分解能を使用し得る。間隔０＜
ｔ≦Ｎ_lにおいてＰ（ｔ｜１）を計算し、その後、間隔Ｎ_l≦ｔ＜Ｎ_tにおいて一
連のゼロによって、関数を補正する。ここで、Ｎ_tは、ｔ次元でのＰ（ｎ，ｔ）
の区分の値を示す。

【００３１】補正の加重値（ＷｅｉｇｈｔｓｏｆＦｉｔｔｉｎｇ）単純化のために、連続したカウント時間間隔におけるカウント数は独立してい
ると推定され得る。分子座標は少しのカウント間隔において大きく相関するので
、この推定は、厳密には正しくないが、所定の対（ｐａｉｒ）（ｎ，ｔ）を有す
るイベント数は、平均付近で二項分布している。ここで、Ｍは実験当たりのカウ
ント時間間隔の数である。これにより、これにより、最小二乗の式（ｌｅａｓｔ
ｓｑｕａｒｅｓｐｒｏｂｌｅｍ）

【数３４】の加重値Ｗ（ｎ，ｔ）に関する以下の式が得られる：

【数３５】ここで、χ²は、最小二乗パラメーターであり、

【数３６】は、測定されたＦＩＬＤＡヒストグラムであり、Ｐ（ｎ，ｔ）は、理論分布であ
る。

【００３２】式３の加重値Ｗ（ｎ，ｔ）は、補正に対して非常に良好であるが、この目的の
ために使用されると、過小評価された（ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｄ）統計的
誤差が生じるであろう。従って、ＦＩＬＤＡの統計的誤差は、一連の実験的なシ
ミュレーションされたデータから決定された。

【００３３】より一般的な態様における本発明に戻ると、確率関数の第二独立変数は、各光
子の単なる個々の検出遅延時間であるだけでなく、むしろ所定のカウント時間間
隔において検出された光子全てに対する積算検出遅延時間のような、その関数で
ある。但し、分子は、単一の励起パルスから２つの光子をほとんど放出すること
ができないが、以下に示す実施例において、カウント時間間隔当たり１０，００
０励起パルスがあり、それにより、この時間中、単一分子からの数１０個の光子
を検出することができる理由が説明される。第二独立変数の有利な選択は、特に
、測定容量当たり１分子よりわずかに低いだけである、本方法を実施するための
光学濃度が使用されるならば、短い時間間隔において測定される一連の光子は、
単一分子によって放出されそうであるという、蛍光の性質に関連する。古典的な
寿命分析では、この情報はない。この理由により、試料中に存在する２つの粒子
種の比明度値が同じであるとしても、本発明による方法は、より正確な分析方法
であることがわかる。

【００３４】好ましい態様では、検出遅延時間の前記関数は、同じカウント時間間隔におい
て検出される光子カウントの検出遅延時間の次数（ｏｒｄｅｒ）に関して不変で
ある。好ましくは、検出時間の前記関数は、合計又は平均である。各光子の検出
遅延時間、即ち、対応する励起パルスに対する光子カウントの検出時間は、検出
時間との既知の関係を有する整数によって表され得る。この関係は、理想的には
、擬似線形（ｑｕａｓｉ−ｌｉｎｅａｒ）である。検出遅延時間の関数は、好ま
しくは前記整数の合計又は平均である。

【００３５】更に好ましい態様では、粒子の分布関数は、対応する理論的な確率関数Ｐ（ｎ
，ｔ，．．．）によって実験的に決定された確率関数

【数３７】を補正することによって決定される。この理論分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）は、好
ましくはその生成関数

【数３８】によって算出される。単一の検出器の場合には、上記に説明したように、実験的
に決定された確率関数は、二次元関数である；故に、対応する理論的な確率関数
Ｐ（ｎ，ｔ）によって実験的に決定される確率関数

【数３９】を補正することによって、粒子の前記分布関数を決定することが好ましい。後者
は、好ましくは、その生成関数

【数４０】によって算出される。

【００３６】光子カウントの数（ｎ）、好ましくは積算検出遅延時間（ｔ）の測定された二
次元分布を補正することによって本発明が行われる限り、基本的な問題は、理論
的な確率分布Ｐ（ｎ，ｔ）の計算式である。確率分布の両独立変数は、加法的（
ａｄｄｉｔｉｖｅ）変数の典型的な例である：例えば、１つの分子が積算検出遅
延時間ｔ₁のｎ₁光子を放出し、別の分子が積算検出遅延時間ｔ₂のｎ₂光子を放出
すると、それらは、積算検出遅延時間ｔ₁＋ｔ₂のｎ₁＋ｎ₂光子を一緒に放出する
。この場合、上述のように、対象となる確率分布を表す場合に生成関数の表現を
選択することが適当である。

【００３７】理論分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）の計算において考慮されるべき実験器具の時間
（ｔｅｍｐｏｒａｌ）応答関数を決定することが更に好ましい。この時間応答関
数は、分離実験から決定され得る。

【００３８】さらに好ましい態様において、前記幅のカウント時間間隔の一組の異なる値が
使用され、前記幅は、前記確率関数のもう１つの独立変数である。この特別な場
合には、粒子の拡散カウント（又はその測度）は、有利に決定され得る。その結
果、それは、粒子の前記分布関数の第三独立変数になる。本発明のこの態様は、
蛍光強度寿命多重分布分析（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ
ＬｉｆｅｔｉｍｅＭｕｌｔｉｐｌｅＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＡｎａｌｙ
ｓｉｓ）（ＦＩＬＭＤＡ）と呼ばれる。

【００３９】カウント時間間隔は、連続した時間であることもあり、重なり合っていること
もある。

【００４０】上記のように、測定容量当たりの粒子濃度を、約１分子以下に選択することが
好ましい。測定容量当たり１粒子よりもはるかに低い濃度で行われる場合、デー
タ収集時間のほとんどは待ち時間に、即ち測定容量に粒子がない状態で費やされ
るので、実験による意味のある情報の取得はゆっくり行われる。これは、ハイス
ループットスクリーニング（ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉ
ｎｇ）実験において特に好ましくない状態であろう。

【００４１】前記検出手段として、１つ、２つ又はそれ以上の光子検出器、好ましくはアバ
ランシェ・フォトダイオード又は光電子増倍管が使用される。少なくとも２つの
光子検出器は、例えば、異なる色又は偏光の蛍光をモニターするために使用され
得る。

【００４２】本発明による方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイの実施、アッ
セイ開発及び診断目的に特に適している。しかし、それは、生命科学及び関連す
る技術に幅広く適用することができる。

【００４３】本発明によれば、変動する蛍光強度のモニターには、共焦点技術が特に適して
いる。上記に略述したように、それらは、生体臨床医学などのような、幅広い適
用分野に適用され得る。接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）焦点（共焦点）技術は、試
料上の回折制限（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ）スポットに鋭く焦
点を合わせられる光の点光源の使用に基づいている。放射された光は、観察範囲
を、照明スポットと正確に一致する範囲に単離する空間フィルター（ピンホール
）によって観察される。従って、照明穴及び検出穴は、お互いに光学的にに接合
されている。対物レンズの光の他に焦点面から生じる光が拒絶され、それにより
、非常に小さな深さの場（ｆｉｅｌｄ）が効率的に提供される。従って、本発明
の特に好ましい態様では、蛍光強度のモニターのために、共焦点顕微鏡が使用さ
れる。高いシグナル−ノイズ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ−ｒａｔｉｏ
）を得るためには、励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｒａｄｉａｔｉｏｎ）（１
４）を提供するための光源（１２）、測定容量（２６）へ励起光（１４）の焦点
を合わせるための対物レンズ（２２）、測定容量（２６）から逆らって進む（ｓ
ｔｅｍｓ）放射光（ｅｍｉｓｓｉｏｎｒａｄｉａｔｉｏｎ）（３０）を検出す
るための検出器（４２）、及び放射光（３０）又は励起光（１４）の中心部を消
去するために放射光（３０）又は励起光（１４）の経路（３２）に位置する不透
明手段（４４）を含む装置を用いて蛍光をモニターすることが有用である。図６
に詳述した光学装置を使用することが特に好ましいこともある。

【００４４】ヒストグラム（又は確率関数）の第二確率変数が、所定のカウント時間間隔に
おいて測定される光子数における検出遅延時間に対する励起光の合計又は平均で
あることが好ましいので、既知の多次元蛍光変動法と比べて、本発明による方法
は、非常に特別である。単独で用いる場合、どのような値であっても、この変数
は非常に小さい。それは、光子カウントの数と関連する場合にのみ、その意味を
持つ。明度及び寿命分析を組み合わせる場合、２つの変数の直接的な選択は、光
子カウントの数及び検出遅延時間に対する個々の励起光である；しかし、本発明
の選択により、直接的な選択よりもはるかに正確な方法が得られる。この特別な
選択の成功の別の理由は、ヒストグラム（又は確率関数）の補正関数が、そのフ
ーリエ変換により、即ち、生成関数の表現を用いて、迅速に算出され得ることで
ある。

【００４５】本発明は、以下の図及び実施例によって説明されるが、これらは本発明の範囲
を限定するものではない。

【００４６】図１：（Ａ）Ｔ＝２ｓのデータ収集時間でのボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３
０／６５０溶液からのＦＩＬＤＡヒストグラム。（Ｂ）（Ａ）のＦＩＬＤＡヒス
トグラムに対する式１０の補正の加重残差（ｗｅｉｇｈｔｅｄｒｅｓｉｄｕａ
ｌｓ）（式１２により加重）。補正により、ｃ＝２．３、ｑ＝２３．２ｋＨｚ、
τ＝３．３ｎｓ、及びχ²＝１．１の値が得られた。

【００４７】図２：ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従来技術
）のＣＶ’ｓの蛍光種濃度への依存状態。３つの方法それぞれに対する１００個
のランダムヒストグラムを、２０秒のデータ収集時間において、２つの蛍光種の
１：１混合物に対してシミュレーションした。シミュレーションのための入力パ
ラメーターは、濃度ｃ₁＝ｃ₂（ｘ軸）、明度ｑ₁＝３０ｋＨｚ、及びｑ₂＝１５ｋ
Ｈｚ、寿命τ₁＝３．０ｎｓ、及びτ₂＝１．５ｎｓであった。全てのパラメータ
ー（ＦＩＬＤＡにおけるｃ₁、ｃ₂、ｑ₁、ｑ₂、τ₁、τ₂；ＦＩＤＡにおけるｃ₁
、ｃ₂、ｑ₁、ｑ₂及びＦＬＡにおけるｃ₁ｑ₁、ｃ₂ｑ₂、τ₁、τ₂）は、補正され
た。第二（弱い方の）成分の濃度値ｃ₂のＣＶを、このグラフにプロットする。
１００個のヒストグラムの分析により、標準誤差の７．１パーセントの精度が得
られる。

【００４８】図３：ＦＩＬＤＡのＣＶ’ｓのデータ収集時間Ｔ（上方ｘ軸）への依存状態。
以下の入力パラメーターを有する１：１色素混合物の１００個のシミュレーショ
ンされたヒストグラムにおいて、分析を行った：濃度ｃ₁＝ｃ₂＝０．２、明度ｑ ₁ ＝３０ｋＨｚ、及びｑ₂＝１５ｋＨｚ、寿命τ₁＝３．０ｎｓ、及びτ₂＝１．５
ｎｓ。１００個のヒストグラムの分析により、標準誤差の７．１パーセントの精
度が得られる。線形依存状態を明らかにするために、下方ｘ軸に、Ｔ^-1/2を示す
。

【００４９】図４：ＦＩＬＤＡ（データ収集時間Ｔ＝２ｓ、１０回繰り返された測定の平均
からの誤差バー）によってモニターした、ラベルされたターゲットペプチドＨ−
ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ₂のカルモデュリンへの結合。データの双曲線補
正から、実線が得られ、それにより結合定数Ｋ_D＝３８±３ｎＭが得られる。

【００５０】図５：実験２のヒストグラムの強度グラフの説明。Ｘ軸は、光子遅延時間に対
して平均化されたパルスであり、ｙ軸は、光子カウントの数である。濃色部の（
ｄａｒｋｅｒ）強度は、高いイベント数に対応する。

【００５１】図６は、本発明による方法の実施において使用される装置の一態様を示す。装
置１０は、可干渉性単色励起光１４の束によって試料を照らすための光源として
働くレーザー１２を含む。励起光１４は、レンズ１６によって平行にされ、二色
性鏡２０に到達する。好ましくは、光学軸１８と二色性鏡２０の間の角度は４５
°である。二色性鏡２０は、試料容量２６内で、焦点２４を有する対物レンズ２
２の方向へ励起光１４を反射する。試料容量２６及び対物レンズ２２は、透明カ
バーガラス２８によって、例えば試料に設置される市販のマイクロタイタープレ
ート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）の底部によって、お互いに分離さ
れることが好ましい。試料は、蛍光ラベルされた分子又は他の粒子を含むことが
好ましい。適当な励起光１４による励起により、試料中に存在する分子又は他の
粒子は、光３０を放射する。放射光３０は、対物レンズ２２を通り、励起光３０
を通す二色性鏡２０に達する。その後、放射光は、光学軸３２上のフィルター３
４及びコリメーターレンズ３６を通る。ピンホール３８は、コリメーターレンズ
３６の焦点に置かれる。ピンホール３８を通った放射光３０は、更なるレンズ４
０に達し、その後、光検出器４２によって検出される。放射光３０の経路内、特
に二色性鏡２０と光検出器４２との間に、放射光３０の中心部を通すことができ
ない不透明手段４４が設けられる。この放射光３０の中心部は、励起光１４の焦
点２４の前又は後ろにある光学軸３２上の範囲から逆らって進む。焦点２４又は
その直接近接する部分から逆らって進む放射光３０は、ピンホール３８を通り、
光検出器４２に達する。不透明手段４４を放射光３０の経路内に置く代わりに、
励起光１４の経路も、不透明手段４４を設置するのに適している。特に、不透明
手段４４は、レーザー１２と二色性鏡２０との間に置くことができる。ここで詳
述したように、本発明による方法における不透明手段４４の使用により、シグナ
ル−ノイズ比が向上する。

【００５２】

【実施例】実験１材料及び方法実験装置蛍光相関顕微鏡法（リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｊ．２２，１６９−１７５，１９９３；コッペル（Ｋｏｐｐｅｌ
）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１６，１３１５−１３２９，１９７６）
において使用されるように、標準のエピイルミネーテッド共焦点顕微鏡（コンフ
ォコル（ＣｏｎｆｏＣｏｒ）；エボテックバイオシステムズ（ＥＶＯＴＥＣ
ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）及びカールツァイス（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）、ドイツ
）は、本発明による、このＦＩＬＤＡ実験の中心光学部である。ＦＩＬＤＡは、
連続的な比明度と時間によって決まる（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光寿命
分析の両方を組み合わせるので、励起のために、高速パルス（ｆａｓｔｐｕｌ
ｓｅｄ）レーザーダイオード（クリスタル社（ＣｒｙｓｔａｌＧｍｂＨ）、ベ
ルリン、ドイツ、６３５ｎｍ、１ｍＷ）を使用する。１００ＭＨｚの反復速度で
は、それは、強度変動検出に対して、ある程度（ｑｕａｓｉ）連続した波として
現れるのに対して、１．５ｎｓのパルス幅において、１０ｎｓの一致した（ａｃ
ｃｏｒｄｉｎｇ）パルス距離でも、使用される色素の蛍光寿命の十分正確な試験
が可能である（Ｃｙ５，オキサジン色素ＭＲ１２１，オキサジン色素ＥＶＯ
ｂｌｕｅ３０，ボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／６５０）。

【００５３】蛍光の励起のために、レーザー光をビーム伸張器に通し、二色性鏡（６３５Ｌ
Ｐ，クロマ（Ｃｈｒｏｍａ），ブラトレボロ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ），
ＶＴ，ＵＳＡ）によって、顕微鏡対物レンズ（Ｕａｐｏ／３４０，４０ｘ
，Ｎ．Ａ．１．１５，オリンパス光学株式会社（ＯｌｙｍｐｕｓＯｐｔｉ
ｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，東京、日本）に向ける。二色性鏡、スペクト
ル帯域フィルター（６７０ＤＦ４０，オメガ（Ｏｍｅｇａ），ブラトレボロ
（Ｂｒａｔｔｌｒｂｏｒｏ），ＶＴ，ＵＳＡ）を介して同じ対物レンズによ
って蛍光を集め、焦点を外れた光を拒絶するために働く共焦点ピンホールに焦点
を合わせる。７０μｍのピンホールを通る光を、ケイ素光子カウントアバランシ
ェダイオード（ＳＰＣＭ−ＡＱ−１３１，ＥＧ＆Ｇオプトエレクトロニクス
（Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ），ボードロイル（Ｖａｕｄｒｅｕｉｌ）
，ケベック（Ｑｕｅｂｅｃ），カナダ）によって検出する。

【００５４】検出器パルス並びにレーザートリガーパルスは、コンピューター差込み式カー
ドに通される。エボテック（ＥＶＯＴＥＣ）製のこのカードは、２つのサブユニ
ットからなり、その一方は、時間相関単一光子カウント（ＴＣＳＰＣ）モジュー
ルである。このモジュールは、付随するレーザーパルスに対する光子カウントの
遅延時間を検出している。時間をデジタル化する変換器（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｄｉ
ｇｉｔａｌｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＤＣ）は、７０ｐｓの分解能及び２ＭＨ
ｚの変換速度で、この時間情報を定量化する。他方のサブユニットは、首尾よく
検出された光子カウントの全ての対の間の時間の不足（光子間隔時間）を得るた
めの、５０ｎｓの時間分解能の内部時計を用いる電子カウンターである。従って
、検出される光子カウント毎に、２つの独立した時間、即ち、蛍光寿命情報を含
む、一致したレーザーパルスに対する光子カウントの顕微鏡でしか判別できない
遅延時間（ｎｓ）、並びに蛍光強度及び変動情報をコードする顕微鏡でしか判別
できない光子間隔時間（μｓ〜ｍｓ）が同時に記録される。これらの蛍光から、
生データの２つの一次元ヒストグラム、即ち、（ｉ）１００μｓのカウント時間
間隔において収集された光子カウント数分布（ＦＩＤＡ）、及び（ｉｉ）遅延時
間分布（ＦＬＡ）が算出される。更に、１００μｓのカウント時間間隔にわたっ
て積算された光子カウント数及び遅延時間の両方を含む二次元ＦＩＬＤＡヒスト
グラムが、本発明によって確立される。

【００５５】ＦＣＳ測定から、蛍光色素ＭＲ１２１、ＥＶＯｂｌｕｅ３０及びボディピィ（
Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／６５０の平均拡散時間は、２００μｓに決定された。Ｄ
＝３×１０^-6ｃｍ²／ｓの拡散定数において、これにより、０．５μｍの動径１
／ｅ²−半径が得られる（リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｊ．２２，１６９−１７５，１９９３）。対物レンズ下の時間
（ｔｉｍｅ−ａｖｅｒａｇｅｄ）平均レーザービームパワーは、２００μＷであ
った。

【００５６】実験手順装置を評価する（ｇａｇｅ）ために、４つの異なるキャリブレーション（ｃａ
ｌｉｂｒａｔｉｏｎ）測定、即ち、（ｉ）ＴＤＣの不均一なチャンネル幅に対す
るデータを集めるための光子のランダム光源としての日光、（ｉｉ）装置のＩＲ
Ｆを決定するための純粋なバッファー又は水試料からの付随するレーザーの散乱
光、（ｉｉｉ）式９の空間明度パラメーターを決定するための純粋な色素溶液、
及び（ｉｖ）暗色（ｄａｒｋ）散乱ラマンカウント速度の独立した評価を得るた
めの純水における測定を行った。後者は、既に存在する２つの“種”と見なされ
る。それらはいずれも、ポアソニアン（Ｐｏｉｓｓｏｎｉａｎ）カウント数分布
を有するが、大きく異なる遅延時間分布を有する。

【００５７】一例として、図１Ａは、約１ｎＭのボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／６５
０溶液の、得られたＦＩＬＤＡヒストグラムを示す。ｘ軸は、遅延時間の合計を
表すのに対し、ｙ軸は、上記のような光子カウント数を表す。このヒストグラム
のためのデータを２秒間収集した。式１１のフーリエ変換に対してこの二次元ヒ
ストグラムを補正することにより、測定容量中の分子の濃度又は平均数ｃ＝２．
３、比明度ｑ＝２３．２ｋＨｚ、並びに、ＦＩＤＡ及びＦＬＡのみによって決定
される値（データは示されていない）、及び先に記したボディピィ（Ｂｏｄｉｐ
ｙ）６３０／６５０に対する寿命と一致する蛍光寿命τ＝３．３ｎｓが得られる
。補正の良さを判断するために、図１Ｂは、χ²＝１．１の最小二乗値において
、加重残差

【００５８】

【数４１】を示す。

【００５９】データシミュレーション慎重に（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅｌｙ）選択されたパラメーター（明度及び蛍光
寿命値）を示す分子の混合物を含む実際の試料は、調製することが困難である。
従って、ある評価は、シミュレーションデータを用いて行われる。ＦＩＬＤＡ（
本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）に対する多数のヒス
トグラム組は、他に詳述されたアルゴリズムによってシミュレーションされた（
パロ（Ｐａｌｏ）ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９，２８５８−２８６６
，２０００；この内容は、本明細書に開示として援用される）。このアルゴ
リズムは、個々の分子のランダムウォーク（ｒａｎｄｏｍｗａｌｋ）及び明度
積分（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｉｎｔｅｇｒａｌｓ）のランダムカウント数への
変換を含む。このアルゴリズムの修正として、所定の種の寿命に依存するランダ
ム検出遅延時間が、各光子に対して更に定められ、シミュレーションで使用され
るＩＲＦは、実際の実験と同一に選択された。得られたランダムカウント数及び
検出遅延時間は、その後、ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡに対するヒストグラ
ムを計算するために使用された。

【００６０】シミュレーションは、得られたパラメーターの統計的誤差を評価するために適
したツールであると考えられる。この目的のために、典型的には、所定の分子パ
ラメーター組を用いる４０〜１００回の実際の実験（Ｎ＝４０−１００ｒｅａ
ｌｉｚａｔｉｏｎｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）がシミュレーションされ
た。

【００６１】補正実験的な、又はシミュレーションされたＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従
来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）分布を、標準マークオート（Ｍａｒｑｕａｒ
ｄｔ）アルゴリズムを用いて補正した。ＦＩＤＡのために設計された補正プログ
ラムは、基本的には式８を使用するのに対し、ＦＩＬＤＡのためのものは、式１
１に基づいている。ＦＬＡのための補正曲線は、上記のように、Ｐ（ｔ｜１）の
計算のみによるため、ＦＩＬＤＡの場合よりもはるかに簡単である。

【００６２】生化学的システム：カルモデュリン−ペプチド相互作用カルモデュリン（ＭＷ１６．７ｋＤａ）は、様々なＣａ²⁺依存性細胞シグナ
ル経路に関連する調節蛋白質である（クリー（Ｋｌｅｅ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ２７，６６４５−６６５３，１９８８）。微小な（ａｔｏｍｉｃ
）分解能における構造は、溶液中のカルモデュリンに対し、可撓性リンカーによ
って結合する（イクラ（Ｉｋｕｒａ）ら，ＣｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ１３，
３９１−４００，１９９２）２つのＣａ²⁺結合部位をそれぞれ有する２つの
同様のドメインを同定した（バブ（Ｂａｂｕ）ら，Ｎａｔｕｒｅ３１５，
３７−４０，１９８５；バブ（Ｂａｂｕ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２０４，１９１−２０４，１９８８；チャトパドヒアヤ（Ｃｈａｔｔ
ｏｐａｄｈｙａｙａ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８，１１７７
−１１９２，１９９２；ウィルマン（Ｗｉｌｍａｎｎ）ら，ＣｅｌｌＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ，４６，８８３−８９
４，２０００）。Ｃａ²⁺の結合において、ほとんどのターゲット蛋白質に対し
て結合部位を形成するそれら残基は、溶媒にさらされる。ターゲットペプチドの
１つからの関連するペプチド配列（例えば、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ、ｓｍ
−ＭＬＣＫ）は、ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡであり、ターゲットペプチドとして選択
された。Ｃ末端において、色素（例えばＭＲ１２１）によってＣ末端をラベルす
るために、更なるリシンが導入された。ターゲットペプチドの優勢な（ｐｒｅｄ
ｏｍｉｎａｎｔ）相互作用部位（両方のカルモデュリンドメインと相互作用する
）は、Ｃ末端及びＮ末端として同定されたので（メドール（Ｍｅａｄｏｒ）ら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，１２５１−１２５５，１９９２；メドール（
Ｍｅａｄｏｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，１７１８−１７２１，１９
９２）、色素の分子環境は、結合において変化すべきである。従って、蛍光寿命
、分子強度、並びにＦＩＬＤＡデータは、結合イベントを示すべきである。

【００６３】カルモデュリンは、ＢＩＯＭＯＬから購入した（ウシ脳由来、ＬＯＴ＃Ｐ４６
３９ｃ、１ｍｇ、凍結乾燥）。ｐＨ８の２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌに蛋白質を
溶解し、４℃でアリコートに貯蔵した。ペプチド（Ｈ−ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ
−ＮＨ₂）は、エボテック（ＥＶＯＴＥＣ）で合成され、Ｃ末端のリシンにおい
て、オキサジン色素ＭＲ１２１（吸収極大（Ａｂｓ．ｍａｘ．）＝６６１ｎｍ）
でラベルされた。全ての実験で使用したバッファーは、ｐＨ８の２５ｍＭＴｒ
ｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１００ｍＭＫＣｌ、及び０．０５％のプ
ルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）を含んでいた。カルモデュリン及び蛍光ラベル
されたペプチドは、測定前に１０分間、インキュベートされた。

【００６４】蛍光色素及びプローブの取り扱い使用した色素は、ボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／６５０（モレキュラー
・プローブズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ），Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ
，ＵＳＡ）、シアニン５（Ｃｙ５）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク
（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ），Ｕｐｐｓａｌ
ａ，スウェーデン）、ＭＲ１２１（ロシュ・ディアグノスティクス（Ｒｏｃｈ
ｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，ドイツ）、及びＥＶＯ
ｂｌｕｅ（エボテックバイオシステムズ（ＥＶＯＴＥＣＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
）ＡＧ，ハンブルグ、ドイツ）であった。これらはすべて、６３５ｎｍ付近
に励起極大を有する。色素溶液は、超純水中で調製した。

【００６５】試料として、１ｎＭの付近の濃度で蛍光プローブを調製した。ガラス表面へ分
子が吸着する可能性があるので、希釈率から、それらの濃度値を決定することは
適当ではない。さらに良好な評価は、ＦＩＬＤＡそのものによって得られる。な
ぜなら、この方法により、完全な濃度が得られるからである。全ての実験は、２
２℃の室温において行われた。

【００６６】結果新たな方法は、シミュレーションされたデータから、又は同じ装置及び同じ光
子カウントシーケンスを利用する、簡単なテスト実験から得られる統計的誤差に
基づいて、既知の方法と比較される場合も、最も良好に評価される。従って、本
発明による方法（ＦＩＬＤＡ）は、最初の段階において、異なる色素溶液及び混
合物に適用され、結果は、ＦＬＡ及びＦＩＤＡのものと比較された。

【００６７】テスト実験及びデータシミュレーションまず、総色素濃度約１ｎＭのＥＶＯｂｌｕｅ^TM３０及びＭＲ１２１の２：１色
素混合物における一連の４０回の測定を行い、ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡ
のデータを並行して収集した。この一連の実験は、それぞれＴ_c＝２ｓの継続期
間で、同様の分子パラメーターを用いて、シミュレーション中繰り返された。全
てのデータは、それぞれの色素溶液における実験から、あらかじめ決定された様
々な数の固定された（ｆｉｘｅｄ）パラメーターによって補正された。３つの方
法全てにおいて評価したパラメーターを、表１にまとめる。単一種の特別な場合
では、ＦＩＬＤＡは、ＦＩＤＡとＦＬＡとの簡単な組み合わせよりも、統計的に
より正確なことは決してない。全ての分子は同じであり、個々の分子の破裂によ
る遅延時間のグループ化から得ることはできないので、このことが予想され得る
。しかし、２つの色素の混合物に関して、全てのデータ組における補正の結果、
方法及びフリーのパラメーターの数に依存して、共焦点容量当たりの分子数ｃ₁
及びｃ₂、それらの明度値ｑ₁及びｑ₂、並びに寿命τ₁及びτ₂の異なる平均値及
び統計的誤差が得られる。表１では、これら誤差は、標準偏差の平均値に対する
比として、括弧内に示されている（偏差の係数、ＣＶ）。なお、もう一度言うと
、従来技術ＦＬＡのみが、ｃ₁及びｃ₂の代わりに、積ｃ₁ｑ₁及びｃ₂ｑ₂を示す。
Ｃ₁及びＣ₂が、補正されるたった２つのパラメーターであるならば、即ち、明度
及び／又は寿命値の両方が、表１からあらかじめ決定される値に固定されるなら
ば、ＦＩＬＤＡ及びＦＬＡは、精度がほとんど同じであるのに対し、ＦＩＤＡは
、より高いＣＶ値を有する。このストラテジーは、例えば、一方が蛍光性である
２つの分子の結合をモニターする、多数の生物学的アッセイに適用され得る。こ
こで、フリーの、及び結合している状態の蛍光性化合物の特異的な量を、実際に
あらかじめ決定し、２つの濃度のみを補正することができる。しかし、非常に頻
繁に、このスキームは、使用することができないが、より多数のパラメーターが
補正されなければならない。これは、関連する多数の結合部位があり、複合体（
ｃｏｍｐｌｅｘ）の比明度が、結合の大きさに依存するため、固定され得ないと
いう事実によるものであり得る。別の例は、薬剤スクリーニングにおいて行われ
、そこでは、ある化学的、又は天然の化合物は、生物学的ターゲットに対して試
験される。それら化合物は、主として非蛍光性であると推定されるが、いくつか
の場合には、自己蛍光性であることが分かる。これらの試料は、自己蛍光性化合
物を特徴付けるが、前もって知られていない更なるパラメーターを用いて、２＋
１成分モデルに対して補正され得る。

【００６８】ここで、本発明のＦＩＬＤＡの優位性（ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ）が明らかに
なる。４つのフリーのパラメーターがあるならば、例えば、２つの寿命パラメー
ターが、同様に補正される場合、ＦＬＡと比較したＦＩＬＤＡの統計的誤差は、
約１／２に（ｂｙａｆａｃｔｏｒｏｆａｂｏｕｔ２）減少する。統計
的誤差がＦＩＤＡからのもの及びフリーの作動（ｒｕｎｎｉｎｇ）明度値と比較
される場合、この除数（ｆａｃｔｏｒ）は、さらに大きい。更に、６個の補正さ
れたパラメーターの場合、ＦＩＬＤＡは、低いＣＶ値において、やはり説得力の
ある（ｃｏｎｖｉｎｃｉｎｉｇ）結果をもたらす。

【００６９】

【表１】表１：２秒のデータ収集時間での、ＭＲ１２１とＥＶＯｂｌｕｅ３０との色素混
合物における、ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従
来技術）の可変性の係数（ＣＶ’ｓ）：実験的データとシミュレーションされた
データとの比較４０回の繰り返し測定において、ＣＶ’ｓを測定した。実験データの分析の平均
の結果は、シミュレーションアルゴリズムに対するインプットとして使用された
：濃度ｃ₁＝０．２４及びｃ₂＝０．４４、明度ｑ₁＝１７．５ｋＨｚ及びｑ₂＝７
．５ｋＨｚ、寿命τ₁＝１．７２ｎｓ及びτ₂＝０．５４ｎｓ。（ａ）：ＦＬＡにより、ｃ₁及びｃ₂よりもむしろｃ₁ｑ₁及びｃ₂ｑ₂が得られる；
ｘ：分析により５０％以上のＣＶ’ｓが得られた；（）：シミュレーションされたデータにおける分析のＣＶ’ｓ；＃：最もよく知られた値に固定した。

【００７０】しかし、実用上の観点から、ＦＩＬＤＡは、この高い精度を幅広い範囲の濃度
にわたり維持するか否かという問題がある。従って、異なる濃度の２つの蛍光種
の１：１混合物において、一連の１００個のヒストグラムを、ＦＩＬＤＡ（本発
明）、ＦＩＤＡ（従来技術）、及びＦＬＡ（従来技術）に対してシミュレーショ
ンし、結果を再度比較した。両方の種に対して、２倍異なる比明度（ｑ₁＝３０
ｋＨｚ及びｑ₂＝１５ｋＨｚ）並びに寿命（τ₁＝３．０ｎｓ及びτ₂＝１．５ｎ
ｓ）を選択したが、拡散時間は同じ（２００μｓ）にした。補正された全てのパ
ラメーターを有する２つの成分モデルに対して、全てのヒストグラムを補正した
。非常に低い濃度、並びに非常に高い濃度において、全ての方法は、データ獲得
時間Ｔ_c＝２ｓにおいて、明確に種を区別することが困難であったので、この時
間を、Ｔ_c＝２０ｓに延長した。図２は、最も弱いシグナルのＣＶ値によって表
される蛍光色素濃度ｃ₂における、３つの方法全ての統計的誤差の依存性を示す
。測定容量当たりの濃度ｃ＜５分子の範囲内では、ＦＩＬＤＡは、最も低い誤差
を示すのに対し、はるかに高い濃度においてのみ、ＦＬＡは、統計的により正確
である。ＦＬＡは、濃度と線形的に比例する検出された光子の数にのみ依存する
ので、このことは、驚くべきことではない。それに対して、ＦＩＬＤＡ及びＦＩ
ＤＡは、∝ｃ^-1/2に応じて減少する蛍光シグナルの相対的な変動を感知する。極
めて低い濃度では、蛍光シグナルは、基本的に、２０秒のデータ収集時間中は結
局検出され得ない稀な（ｒａｒｅ）単一分子イベントからなる。しかし、より長
い獲得時間では、これら稀なイベントは、従来のＦＬＡよりも、ＦＩＬＤＡのよ
うな変動方によって、はるかに良好に得ることができる（ａｐｐｒｏａｃｈａｂ
ｌｅ）。

【００７１】Ｔ_c ^-1/2における異なるＦＩＬＤＡパラメーターの統計的誤差の線形依存性を
、図３に示す。プロットされたＣＶは、上記と同じシミュレーションスキームか
ら得られるが、単一濃度はｃ₁＝ｃ₂＝０．２である。パラメーターを固定しなく
ても、即ち、事前の情報を用いなくても、正当な（ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ）ＣＶ
値は、１０秒のデータ獲得時間で既に得られ得ることを、明らかに知ることがで
きる。

【００７２】生化学的システムＦＩＬＤＡの実験的利用を、先に紹介したカルモデュリン−ペプチド相互作用
の結合定数の決定よって示す。この目的のために、ラベルされたペプチド（Ｈ−
ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ₂（ＭＲ１２１））濃度を２．５ｎＭで一定に保
ちつつ、滴定実験を行い、一方、カルモデュリンを滴定した（０、０．０１ｎＭ
、０．１ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、０．１μＭ、０．３μＭ
、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ）。同じ条件下、即ち、同じバッファー、同じ励
起パワー、及び測定当たり２秒の同じデータ獲得時間において、全ての実験を行
い、試料当たり１０回繰り返した。

【００７３】最初の段階として、純粋なペプチド溶液に適用された単一成分分析から、寿命
τ_free＝１．９０±０．０２ｎｓ及び比明度ｑ_free＝６．５±０．３ｋＨｚを決
定した。２．５ｎＭのペプチドへ過剰なカルモデュリン（５０μＭ）を加えると
、大部分のペプチドがカルモデュリンに結合された試料が得られた。色素の分子
環境の変化（例えば、極性の低下）を示すフリーのペプチドと比較して、複合体
は、より長い蛍光寿命τ_bound＝３．００±０．０１ｎｓ及びより高い比明度ｑ_b _ound ＝１５．０±０．６ｋＨｚの両方を特徴とする。この混合物は、その後、方
法によって、τ_free及び／又はｑ_freeを固定して、２成分補正を用いて、３つの
方法全て（ＦＩＬＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＬＡ）によって分析された。

【００７４】次の段階として、全ての（ｗｈｏｌｅｓｅｒｉｅｓｏｆ）カルモデュリン
濃度に対して、二成分分析を適用した。これらの研究において、結合又は非結合
ペプチドに対して、寿命及び比明度を、上記の値に固定した。このように、ＦＩ
ＬＤＡは、結合ペプチド、即ちカルモデュリン−ペプチド複合体の濃度ｃ_bound
、及び非結合、即ちフリーのペプチドの濃度ｃ_unboundを決定する。これにより
、結合ペプチドの割合ｆ_bound＝（ｃ_bound／（ｃ_bound＋ｃ_unbound）を計算する
ことができ、これを、図４において、添加されたカルモデュリンの濃度に対して
プロットした（黒点、１０回の測定の平均からエラーバーを得る）。実線は、デ
ータに対する双曲線補正を示し、カルモデュリン−ペプチド相互作用の結合定数
Ｋ_D＝３８±３ｎＭが得られる。１７±１ｎＭ及び２９±４ｎＭという類似のＫ_D 値をそれぞれ有するＦＬＡおよびＦＩＤＡ（データは示していない）によって、
類似の（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）結合曲線が得られた。これらの値は、文献（バ
ース（Ｂａｒｔｈ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２１７４
−２１８３，１９９８）に報告されているアフィニティーとよく一致し、ＦＩ
ＬＤＡが、生化学的システムの反応性をモニターするのに適した方法であること
を示す。

【００７５】可能な薬剤スクリーニング適用に関するこの実験の統計的精度についてのいく
つかの情報を得るために、結合曲線のＺ’−値が算出され得る。これは、結合ペ
プチド溶液（５０μＭカルモデュリン、ｈｉｇｈ）及び純粋なペプチド溶液（０
カルモデュリン、ｌｏｗ）の２成分分析から得られる結合ペプチドの割合ｆ_boun _d の平均値ｆ_high及びｆ_low、並びにそれらの標準偏差ｓｔｄｅｖ（ｆ_high）及び
ｓｔｄｅｖ（ｆ_low）に対してそれぞれ行われる。

【数４２】

【００７６】Ｚ’−値は、ｆ_boundの決定の、その動的範囲（ｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅ
）に対する統計的誤差を説明する。従って、それは、結合度、又は一般的には生
化学的システムの何らかの反応度を確認するための、ある読み出し及び分析方法
の実現可能性及び有効性を判断するための非常に重要な統計的パラメーターであ
る。その最大値は、Ｚ’＝１．０であり、一方、一般に、薬剤スクリーニング適
用では、Ｚ’＞０．５の前提条件（ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ）が必要とされる
。

【００７７】図４から、本発明の方法及び２秒のデータ獲得時間を用いて、カルモデュリン
−ペプチド相互作用に対して、０．９７±０．０１のＺ’−値が得られる。比較
のため、従来技術のＦＬＡ及び従来技術のＦＩＤＡの適用は、０．９２±０．０
２及び０．７３±０．０７のＺ’−値をそれぞれ示す。１に近いＺ’−値では、
全ての方法は、薬剤スクリーニングにおいて非常に良好に使用可能である。

【００７８】しかし、薬剤スクリーニング適用では、できるだけ読み出し時間を最短化しよ
うとしている。従って、カルモデュリン−ペプチド相互作用のＦＩＬＤＡのＺ’
−値は、データ獲得時間を短くして決定された；Ｔ：Ｚ’（Ｔ＝１ｓ）＝０．８
５±０．０４、Ｚ’（Ｔ＝０．５ｓ）＝０．８１±０．０５、Ｚ’（Ｔ＝１００
ｍｓ）＝０．５４±０．１１、及びＺ’（Ｔ＝５０ｍｓ）＝０．３５±０．１６
（１００ｍｓ以下のデータ獲得時間において、ＦＩＬＤＡは、マイナスのＺ’−
値を示すため、適用可能ではなくなる）。従って、本発明の“ＦＩＬＤＡ”は、
１ｓ〜１００又は５０ｍｓ以下の読み出し時間でも、効率的な薬剤スクリーニン
グのための前提条件を満たす方法である。

【００７９】実験２装置の基本的な部分として、パルスレーザー、時間を振幅に変換する変換器（
ｔｉｍｅｔｏａｍｐｌｉｔｕｄｅｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）（ＴＡＣ）及びデ
ータ獲得カードと組み合わせて、エピイルミネーテッド共焦点顕微鏡を使用する
。検出された各光子について、２つの時間間隔、即ち、先の光子カウントから通
された時間及び光子検出とその結果生じるレーザーパルスとの間の時間間隔、を
同時に決定して節約した（ｓａｖｅｄ）。ＴＡＣの時間分解能を７０ｐｓにして
、最初の時間間隔を、５０ｎｓのカードクロック（ｃａｒｄｃｌｏｃｋ）期間
の単位で測定する。生データから、所定幅のカウント時間間隔（通常１００μｓ
）及び遅延時間の所定の分解能値（２８０又は５６０ｐｓ）において、ＦＩＤＡ
（従来技術）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＬＤＡ（本発明）に対して、一次
元又は二次元分布を算出した。一連の測定において、ＴＡＣのチャンネル幅が一
定でない場合の他のデータを修正するために、光子のランダム光源として日光を
モニターする検出器を用いて、少なくとも１つの測定を行った。白濁した（ｍｉ
ｌｋｙ）試料からの付随するレーザーの散乱光をモニターする検出器を用いて別
の測定を行い、装置の点拡張機能（ｐｏｉｎｔｓｐｒｅａｄｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ）を決定した。また、常に存在する２つの“種”と考えられている暗色散乱ラ
マンカウント速度の独立した評価を得るためには、純水における測定が有用であ
った。それらは、いずれもポアソニアンカウント数分布を有するが、非常に異な
る遅延時間分布を有する。

【００８０】１０^-9Ｍ付近の濃度の一連の水性の純粋な色素溶液、並びに約１：１の濃度比
のそれらの混合物を、試料として調製した。色素がガラス表面に吸着する可能性
があるので、希釈率から色素の濃度値を決定することは適当ではない；はるかに
良好な評価は、ＦＩＬＤＡそのものである。使用された色素は、ボディピィ（Ｂ
ｏｄｉｐｙ）６３０、Ｃｙ５、及びＵＲ１２１であった。室温で実験を行った。

【００８１】図５は、本実験の測定されたヒストグラムの強度グラフを示す。Ｘ軸は、光子
遅延時間に対する平均化されたパルスである；ｙ軸は、光子カウントの数であり
、高強度は高イベント数に対応する。図５では、強度グラフとして、測定された
分布

【数４３】の３つの例を示す。２つの例は単一種に対するものであり、３つ目の例は、それ
らの混合物に対するものである（Ｍは、実験当たりのカウント時間間隔の総数で
ある）。データ点（ｎ，ｔ）＝（１，０）及び（１，１）（励起パルスの上端（
ｒａｉｓｉｎｇｅｄｇｅ）の最も低い部分に相当）が、標準偏差の５単位まで
補正曲線からしばしば外れることを除き、補正の加重残差（示されていない）は
、無作為に分散している。上方のグラフは、Ｃｙ５溶液（３つの色素の中で寿命
が最も短い）において測定された分布＃１２を視覚化し、中間のグラフは、ボデ
ィピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０溶液（寿命が最も長い）において測定された分布
＃７であり、一番下のグラフは、これら色素の混合物に対応する分布＃３０であ
る。実際は、技術的に補正される関数のｘ−独立変数は、平均遅延時間よりもむ
しろ合計であるが、平均遅延時間の分布関数は、視覚的により有益に見える。

【００８２】この実験の応答関数の最大値の半分における全幅（Ｆｕｌｌｗｉｄｔｈａ
ｔｈａｌｆｍａｘｉｍｕｍ）（ＦＷＨＭ）は、約２ｎｓであり、１０ｎｓの
パルス期間の場合と比較してもはるかに幅広く、３つの色素の中の２つの色素の
寿命を超えているが、それは、二倍の寿命の違いがある２つの成分を区別するた
めに、依然として適用可能である。水からの暗色散乱カウント速度は、それぞれ
０．２０及び０．２９ｋＨｚに決定され、蛍光試料からのデータを補正する場合
のこれらの値に固定された。

【００８３】本発明によって、単一種におけるデータから、空間調節パラメーターａ₁及び
ａ₂の値を評価することができるが、低いパワーのパルスレーザーによって得ら
れ得るｑの完全な値は比較的低いので、対応する統計的誤差は高く、約２０パー
セントである。しかし、その後の分析の結果は、調節パラメーターの正確な値に
は、ほんのわずかしか依存しない。従って、連続レーザー励起において、ＦＩＤ
Ａによって決定されたおよその（ｒｏｕｎｄｅｄ）値におけるａ₁及びａ₂、ａ₁
＝−０．４０及びａ₂＝０．０８は、簡単に固定された。

【００８４】暗色散乱カウント速度及び空間パラメーターの値を固定した後、補正のパラメ
ーターは、各種当たりの濃度（ｃ）、比明度（ｑ）及び寿命（τ）のみである。
実際に、単一種と仮定すれば、単一種から得られた分布を、良好に補正できたの
に対して、二成分混合物から得られた分布は、無作為に分布した残差（ｒａｎｄ
ｏｍｌｙｓｃａｔｔｅｒｅｄｒｅｓｉｄｕａｌｓ）を得るためには、ニ成分
分析が必要であった。示された新しい蛍光変動法は、２つの蛍光成分の分離、そ
れらの濃度の決定並びに蛍光の比明度及び寿命におけるそれらの特徴付けのため
の高感度法として使用され得ることが、最初のテスト実験後、既に示された。但
し、あらかじめ決定された値にさらに多くのパラメーターを固定することにより
、統計的誤差を、大きく低減することができる；これは、薬剤スクリーニングに
おける標準的な理解（ｇｒｉｐ）である。

【００８５】実験３式１２の加重値を用いて、多数の選択された場合における、本発明の理論的な
誤差を算出し、蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）及び蛍光寿命分析（ＦＬＡ）の対
応する誤差と比較した。二成分の場合のいくつかの結果を、表２に示す。本発明
による方法は、ＦＩＤＡ又はＦＬＡ（２つの特異的な量であるｑ及びτによって
種が認識される場合）よりも質的に強力な方法であるだけでなく、その最適濃度
範囲内で、その統計的誤差がより低いことを指摘する価値がある。ＦＩＬＤＡ及
びＦＩＤＡが、本質的に変動法として、それらの能力を失うが、ＦＬＡは失わな
い、極めて高い濃度値においてのみ、ＦＬＡは、３つの方法の中で統計的に最も
正確である。

【００８６】

【表２】表２ニ成分ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＩＤＡ（従来技術）及びＦＬＡ（従来技
術）の統計的誤差全ての場合に、Ｔ＝１００μｓ、ｃ₁＝ｃ₂、ｑ₁＝５０ｋＨｚ、ｑ₂＝２５ｋＨ
ｚ、τ₁＝３ｎｓ、τ₂＝１．５ｎｓ、暗色カウント速度０．２ｋＨｚ、散乱カウ
ント速度１ｋＨｚ、継続時間２０ｓ。

【００８７】

【表３】表３本発明によるＦＩＬＤＡ実験の結果示した誤差値は、理論的加重値に対応する統計的誤差である。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｔ＝２ｓのデータ収集時間でのボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）６３０／
６５０溶液からのＦＩＬＤＡヒストグラム（Ａ）、及び（Ａ）のＦＩＬＤＡヒス
トグラムに対する式１０の補正の加重残差（式１２により加重）（Ｂ）を示す。

【図２】ＦＩＬＤＡ（本発明）、ＦＬＡ（従来技術）、及びＦＩＤＡ（従来技
術）のＣＶ’ｓの蛍光種濃度への依存状態を示す。

【図３】ＦＩＬＤＡのＣＶ’ｓのデータ収集時間Ｔ（上方ｘ軸）への依存状態
を示す。

【図４】ＦＩＬＤＡ（データ収集時間Ｔ＝２ｓ、１０回繰り返された測定の平
均からの誤差バー）によってモニターした、ラベルされたターゲットペプチドＨ
−ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＫ−ＮＨ₂のカルモデュリンへの結合を示す。

【図５】実験２のヒストグラムの強度グラフの説明である。

【図６】本発明による方法の実施において使用される装置の一態様を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブラントライフドイツ連邦国、デー42899 レムシャイト、パウルフィッゲシュトラーセ５ (72)発明者ガールカルシュテンドイツ連邦国、デー27616 ルネシュテット、シュールシュトラーセ 23 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 AA03 BA16 DA02 DA06 EA01 FA02 FA03 FA06 HA01 HA09 JA03 KA09 LA01 LA02 【要約の続き】から、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布を決定する段階、ここで、１つの独立変数は、粒子の比明度又はその測度であり、別の独立変数は、粒子の蛍光寿命又はその測度である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を含む、蛍光粒子を有する試料を特徴付ける方法： −測定容量中の粒子を励起して一連の励起パルスによって蛍光を放射する段階、 −検出手段を用いて、光子カウントのシーケンスを検出することによって、放射
された蛍光をモニターする段階、 −所定幅のカウント時間間隔における光子カウントの数を決定する段階、 −前記カウント時間間隔において、対応する励起パルスに対する光子カウントの
検出遅延時間を決定する段階、 −前記検出遅延時間の関数を決定する段階、 −少なくとも２つの独立変数の確率関数【数１】を決定する段階、ここで、少なくとも１つの独立変数は、光子カウントの数であ
り、別の独立変数は、検出遅延時間の前記関数である、及び −前記確率関数【数２】から、少なくとも２つの独立変数の関数として、粒子の分布を決定する段階、こ
こで、１つの独立変数は、粒子の比明度又はその測度であり、別の独立変数は、
粒子の蛍光寿命又はその測度である。
【請求項２】前記検出時間の前記関数が、同じカウント時間間隔において検出
される光子カウントの検出遅延時間の次数に関して不変である、請求項１に記載
の方法。
【請求項３】前記検出遅延時間の前記関数が、合計又は平均である、請求項１
又は２に記載の方法。
【請求項４】対応する励起パルスに対する光子カウントの前記検出遅延時間が
、検出遅延時間と既知の関係、特に擬似線形関係を有する整数によって表される
、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記検出遅延時間の関数が、前記整数の合計又は平均である、請
求項４に記載の方法。
【請求項６】前記粒子の分布関数が、実験的に決定された確率関数【数３】を、対応する理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）によって補正することによ
って決定される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】理論的な分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）が、その確率関数【数４】によって計算される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記粒子の分布関数が、実験的に決定された確率関数【数５】を、好ましくはその生成関数【数６】によって計算される、対応する理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ）によって補正する
ことによって決定される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】理論的な確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）の計算において、光学的
な空間明度関数Ｂ（ｒ）が、空間明度Ｂと容量要素ｄＶとの間の別々に決定され
た関係によって明らかになる、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】空間明度Ｂと容量要素ｄＶとの間の関係が、【数７】という関係により、変数ｕ＝ｌｎ（Ｂ₀／Ｂ）によって表される（ここで、Ｂ₀は
最大明度であり、Ａ₀、ａ₁、ａ₂及びａ₃は、空間明度関数の経験から得られたパ
ラメーターである）、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】理論的な分布Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）の計算において、分離実験
から好ましくは決定される、実験装置の時間応答関数を考慮する、請求項１〜１
０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】各確率関数が、異なる幅のカウント時間間隔において決定され
る光子カウントの数に依存する、異なる確率関数Ｐ（ｎ，ｔ，．．．）の一組を
決定する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記カウント時間間隔が連続した時間である、請求項１〜１２
のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記カウント時間間隔が重なり合っている、請求項１〜１２に
いずれかに記載の方法。
【請求項１５】拡散係数、又は何らかの他の拡散の測度が、前記粒子の分布関
数の別の独立変数である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】粒子の濃度が、測定容量当たり約１粒子以下に選択される、請
求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】好ましくはアバランシェフォトダイオード又は光電子増倍管の
いずれかである、１つ、２つ又はそれ以上の光子検出器が、前記検出手段として
使用される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】少なくとも２つの光子検出器が、異なる波長又は偏光の蛍光を
モニターする前記検出手段として使用される、請求項１〜１７のいずれかに記載
の方法。
【請求項１９】前記蛍光粒子が、単色蛍光アッセイを適用して特徴付けられる
、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】診断、ハイスループット薬剤スクリーニング、分子の性質の最
適化及び特異的な細胞群の同定に使用するための、請求項１〜１９のいずれかに
記載の方法。
【請求項２１】 −励起光（１４）を提供するための光源（１２）、 −測定容量（２６）へ励起光（１４）の焦点を合わせるための対物レンズ（２２
）、 −測定容量（２６）から逆らって進む放射光（３０）を検出するための検出器（
４２）、及び −放射光（３０）又は励起光（１４）の中心部を消去するための、放射光（３０
）又は励起光（１４）の経路（３２）に位置する不透明手段（４４）を好ましくは含む共焦点装置の、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法を実施
するための使用。