JPH05508079A - 哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするdna - Google Patents

哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするdna

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
rIl乳類ホスホジェステラーゼをコードするDNAjこの出願は、1991年 4月19EIに出願された我々の係属中の米国特許出願No、 07/688. 356の一部継続出願である。 員匪(2)買置 本発明は、哺乳類Ca”/カルモジュリン刺激ホスホジェステラーゼ(CaM− PDEs)およびサイクリック−GMP−刺激ホスホジェステラーゼ(cGs− PDEs)をコードする新規の精製され、単離されたヌクレオチド配列に関する 。 また、前記ヌクレオチド配列に対応する組み換え発現物質、該物質に特異的 に反応する免疫学的試薬、およびかような発現物質の酵素活性を**する化合物 を同定するための方法も提供される。 サイクリック・ヌクレオチドは、生物化学的刺激物質を多種多様の細胞性反応に 介在するとして知られている。 サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジェステ ラーゼ(PDEs)は、サイクリック・アデノシン・モノホスフェート(cAM P)や、サイクリック・グアノシン・モノホスフェート(cGMP)などの3’ 、5’サイクリツク・ヌクレオチドの、対応する5′−ヌクレオチド・モノホス フェートへの加水分解を触媒し、従って、サイクリック・ヌクレオチドの細胞性 濃度のi11節において重要である。 一方、PDEsは、トランスメンブラン ・シグナルもしくはカルシウム・イオン(Ca”)あるいはcGMPなどの第二 メツセンジャー物質により**される。 そして、PDEsは、細胞外ホルモン 、神経伝達物質、あるいはメツセンジャーとしてサイクリック・ヌクレオチドを 用いる他のシグナルからの情報の流れをI!Ijl!Iする際の中心的役割を果 たす。 PDEsは、大きく、複雑な酵素の集団である。 それらは、はとんどの真核生 物の細胞および組織全体に分布しているが、普通は、微量でしか存在していない 。 少なくとも五つの異なる科が、基質特異性、動力学的特性、細胞性*m条件 、大きさ、ある場合には、選択的阻害剤による調整、などの特徴を基にして記さ れている。 [Beavo、 Adv、 in 5econd Mess、 a nd Prot。 by別匠」は14ん−1−38(1988)]。 この五つの科とは、次のもの を含む。 各科には、密接に関連したPDEsの複数の形態がある。 販虹lie Nuc leotide Phos hodiesterase: 5tructure 、 Re ulationand Dru Action、 Beavo、 J 、 and Houslay、 M、D、、 Eds、; JohnWiley  & 5ons、 New York (1990)にある、Beavo、 ” MultiplePhosphodiesterase Isozymes B ackground、 Numenclature andImplicati ons’″、 pp、 3−15; Wang et al、、 ’Ca1mo dulin−Stimulated Cyclic Nucleotide P hosphodiesterases”、 pp、19−59、およびMang anjello et al、、 ”Cyclic GMP−Stimulat edCyclic Nucleotide Phosphodiesteras es”、 pp、62−85を参照のこと。 Ca”/カルモジュリン依存性PDEs (CaM−PDEs)は、cAMPお よび/またはcGMPの細胞内濃度の減少をもたらす細胞内カルシウムに対する 反応により特徴付けられる。 cGMP−刺激ホスホジェステラーゼ(cGs− PDEs)に特有の特徴は、cAMP加水分解においてcGMPにより刺激され る能力である。 In vitro研究では、試験した哺乳類組織のほとんどすべて、ならびにキ イロショウジョウバエ、タマホコリカビ、および睡眠病病原虫での、Ca”/カ ルモジュリンに対する増大したPDE活性が見られた。 組織、細胞性および亜 細胞性区画でのCaM−PDEのレベルは、多様に変化する。 はとんどの細胞 は、脳、特に、シナプス領域において、最も高い組織レベルで、少量のCaM− PDE活性を含む。 Greenberg et al、、 Neuro ha rmaeol。 17: 737−745 (1978)およびKinca司et al、、 ヒ ■釘℃坦す−,84:1118−1122 (1987)。 ムスカリン刺激に 応答するアストロチトーム細胞でのcAMPの減少は、CaM−PDE活性での カルシウム依存性の増大によるものと思われる。 Tanner et al、 、 Mo1. Pharmacol、、 29: 455−480 (1986 )。 また、CaM−PDEは、甲状腺組織におけるcAMPの重要な11m器 であろう。E!rneuX et al、。 Mo1. Ce11. Endocrinol、、 43: 123−134  (1985)。 初期の研究では、独特のCAM−PDESの組織特異性イソ酵素があることを示 唆していた。 CaM−PDE科のいくつかが、ウシ心臓から単離した59kD aのイソ酵素、およびウシ脳から単離した61および63kDaのイソ酵素を含 むことが記されている。 LaPorteet al、、 肛匹匝1旺■、 1 8:2820−2825 (1979); Hansen et al、。 Proc、 Natl、 Acad、 Sei、 USA、 79: 2788 −2792 (1982);およびSharma et al、、 J、 Bi ol、 Chem、、 261: 14160−14166 (198B)。 ウシの59および61kDaイソ酵素の相似物が、ラットの組織からも単離され ており、)Iansen et al、、 J、 Biol、 Chem、、  261:14636−14645 (1986) 、これら二つのイソ酵素が他 の哺乳動物種においても発現されうることを示唆している。 分子量指標に加えて、他の証拠が、イソ酵素のCaM−PDE科での類似性およ び相違性双方を支持している。 例えば、59kDa心臓イソ酵素および61k Da脳イソ酵素CaM−PDEsは、5DS−PAGEでの移動度およびDEA Eクロマトグラフィーでの溶出位置において相違し、59kDaイソ酵素は、カ ルモジュリンよりも少なくとも1(1−20倍高い親和性を有している。 胎盤 および形質転換した細胞において非常に高い濃度で存在する胎児/オンコカルシ ウム結合タンパク質であるオンコモシュリンも、61kDa酵素よりも高い親和 性で59kDa酵素と結合する。 しかしながら、61kDa脳イソ酵素および 59kDa心臓イソ酵素共に、単一モツクローナル抗体によって認識される。  この抗体は、PDE単独の場合よりも100倍高い親和性で、Ca”/CaM− PDE複合体に結合する。 Hansen et al、、 19862懇1坦。 59および61kDaイ ソ酵素は、はとんど同一の基質特性ならびに動力学定数を有している。 臓59kDaタンパク質が脳81kDaイソ酵素のタンパク質分解形態であると 示唆している。 83kDaウシ脳イソ酵素は、59および61kDaイソ酵素とは実質的に相違 する。 63kDa酵素は、59および61kDa酵素に結合するモノクロ−カ ル抗体によって認識されない。Hansen et al、。 1986、sMXL、81kDaタンパク質が燐酸化されるのに対し、63kD aタンパク質は、cAMP依存性依存性タンパク−キナーゼてin vjtro では燐酸化されない。 そして、63kDaタンパク質は、CaM−キナーゼ■ によつてのみin vitroで燐酸化される。Sharmaet al、、  Proc、 Natl、 Aead、 Sci、USA)、 82:2603− 2607 (1985):およびHashimoto et al、、 J、  Bjol、 Chem、、 26虹10884−10887(1989)。 し かしながら、ウシ脳からの61および63kDa CaM−PDE!イソ酵素は 、同様のCaM−結合親和性を有するように思われる。 5taphyloeoccal V8プロテアーゼで限界タンパク分解して調製 したペプチド地図、Sharma et al、、 J、 Biol、 Che m、、 25敗9248 (1984)は、61および63kDaタンパク質は 異なるアミノ酸配列を有することを示唆している。 cGMP−1m激PDEs(cGs−PDEs)は、cGMPによるcAMP加 水分解を刺激する、非触媒作用、cGMP−特異性部位を有するものと提案され た。 5toop et al、、 J、 Biol、 Chem、、 26虹 13718 (1989)。 この酵素は、生理学的サイクリック・ヌクレオチド濃度にて、eAMPの向上し た加水分解によって、高められたcGMP濃度に応答する。 そして、cGs− PDEは、cAMP−介在反応をIntrもしくは阻害するために、cGMP濃 度の上昇を許容する。 本出願の発明者との共同執筆に係る最近の、LeTro ng et al、、 Bi匹画1社■。 別: 10280 (1990)に載せられた主要配列は、11!+11特性な らびにこの酵素の領域基礎構造を理解し、および異なるシグナルに応答する他の PDEイソ酵素と比較するための分子骨格が提供されている。 この文献は、c Gs−PDEをコードする2、 2kbウシ副腎皮質cDNA断片のクローニン グも述べている。 ラット褐色細胞腫細胞からのrType II PDE J のクローニングを報告しているThompson et al、、 FASEB  J、、 5(6):A1592 (Abstract No、 7092)も 参照のこと。 多数の異なるPDEsおよび細胞内シグナルにおけるその重要な役割の発見に伴 い、特異性PDEイソ酵素を選択的に活性化あるいは阻害する薬剤の発見に努力 が払われてきた。 細胞性PDB活性に影響を及ぼし、そして細胞性eAMPを 改変する薬剤は、広範な疾患および生理学的条件を制御するために積極的に使用 できる。 PDEsを阻害することによりcAMPレベルを向上するい(つかの 薬品が使用されているが、一般的には広範な非特異的阻害剤として機能し、目的 としない型の組織および細胞におけるcAMP活性に関して心身に有害な副作用 を呈する。 従って、選択されたPDEイソ酵素に特異的な薬剤が必要とされて いたのである。 特異的PDEイソ酵素の選択的阻害剤は、強心薬剤、抗抑制薬 、抗高愈圧、抗血栓症、および他の薬剤として有用であろう。 しかしながら、 特定の分析用調製物中に存在する特定のPDEイソ酵素を同定することの困難さ がために、作用薬/拮抗薬のスクリーニング研究は複雑なものであった。 さら に、すべてのPDEsが同じ基礎反応を触媒し、すべてのPDEsの基質特異性 が重複しており、および、すべてのPDEsが微量でしか存在しない。 PDEs間の区別化が、いくつかの異なる方法によりて試みられてきた。 各新 規イソ酵素を単離および研究する古典的な酵素学的方法は、精製技術の限界なら びにイソ酵素の完全な分離がなされたか否かを正確に評価できないことによって 、妨げられている。 第二の方法は、ひとつのイソ酵素に寄与し、他の酵素への 寄与を最小限にする、イソ酵素特異的分析条件を同定するものであった。 他の 方法は、免疫学的同定および科集団および/または各イブ酵素への分離であった 。 疑いのない同定および特定のイソ酵素の研究のためのこれら各方法には、時 間を費やし、ある場合には、技術的に非常に困難な確立する必要のある多数の識 別基準という問題がある。 その結果、はとんどの研究では、−個より以上のイ ソ酵素を含むであろう部分的にのみ純粋なPDE I1m!物を用いて行われで いた。 さらに、はとんどの組織における多くのPDEsは、限定タンパク質分 解に非常に感受的であり、その親物質とは異なる動力学的、M節約、および生理 学的特性を有するであろう活性タンパク質分解生成物を容易に形成する。 新規で、特異的PDE−II節剤の開発は、組み換え手段による大量の組織特異 性PDEsを単離する能力によって、大きく促進される。 比較的わずかなPD E遺伝子が今日までクローニングされており、クローニングされたこれらのほと んどが、ホスホジェステラーゼのcAMP特異性(cAMP−PDEs)の科に 属している。 Cclie Nucleotide Phos hodiesterases:  5tructure、 Re ula−tion and Dru Acti on、 Beavo、 J and Houslay、 M、D、、 Eds。 John Wiley & 5ons、New York; 1990 の D avis、”Mo1ecularGenetics of the Cycli c Nucleotide Pho−5phodiesterases’″。 pp、 227−241を参照のこと。Faure、 et al、、 晋醪Ω 針)、 8旺8076 (1988)−D、 djscoideum; 5as s et al、、 Δ醪建錆)、 8鉦9303 (1986)−3,eer evisiae; PDE2と称するPDE class IV:Nikawa  et al、、 Mo1. Ce11. Biol、、 7:3629 (1 987)−3,cerev−js屡PDEI と称する; Wilson et  al、、 Mo1. Ce11. Biol、、 8:505 (198g) −S、 cerevjsiae: 5RA5 と称する; Chen et a l、。 PNAS(USA)、 83:9313 (1986)−D、 melano  aster dnc” と称する;Ovchjnnikow et al、、  FBBS、 22針169 (1987)−ウシ網膜、GMPPDEと称する+  Davis et al、、 PNAS(IJSA)、 86:3604 ( 1989)−ウサギ肝臓、rat dnc−1と称する; Co11celli  酊−1工、 ハ酪什臥)。 86:3599 (1989)−ウサギ脳、rat DPDと称する; 5w1 nnen etal、、 −青情影エシu、 86:5325 (1989)− ラット精巣、rat PDPI、PDE2、PDE3およびPDF!4;および Livi et al、、 Mo1. Ce1l。 肛o1..10:2678 (1990)−ヒト単球、hPDEl と称するも 参照のことo LeTrong et al、、遅1坦およびThompson  et al、、 」世Flも参照のこと。 相補性スクリーニングが、PDEsのあるタイプをコードする哺乳類cDNAク ローンを検出し、単離するために用いられてきた。 CoHcelli et al、、 PNAS(USA)、 8紅3599 ( 1989)には、鉦」虹revisiae発現ベクターでのラット脳cDNAラ イブラリーの構築、該ライブラリーからの酵母においてRAS2”l′@の表現 型効果を抑制するよう機能する能力がある遺伝子の単離、ヒトHRAS遺伝子の 発癌変異体に対するRAS2遺伝子類似体の変異体を報告している。 クローニ ングされ、DPD (ラットdunce様ホスホジェステラーゼ)と称されたc DNAは、酵母株TK161−R2V (A、T、C,C。 74050)t、:js6活性化RAs2””” ト関連する生長amの欠tx 、ならびに酵母PD8遺伝子座(pde−’、pde−”)双方にて欠陥のある 酵母変異株10DAB (A、T、C;C,74049)の生長I[節表現型の 類似体欠陥を相補あるいは「救済」する能力を有している。 高親和性cAMP 特異性ホスホジェステラーゼをコードする遺伝子のアミノ酸配列は、prc窮狙 l釦−呼ユ彰用跡幻ILの剋旺虹座によりてコードされるcAMP特異性ホスホ ジェステラーゼと高い相同性を示す。 本出願の親出願である米国特許出願No、 07/688.356の出願日まで 、哺乳類Cai (−/カルモジュリン刺激またはeGMP刺激PDEs(PD E科Iおよび■)のいずれもコードするDNA配列のクローニングおよび発現は 報告されておらず、従って、当該分野においては、引き続き、これらPDEsの 完全なヌクレオチド配列情報が要望されているのである。 木員悲□□□讐単芽徂1 本発明は、哺乳類種(例えば、ヒトおよびウシ) Ca”/カルモジュリン刺激 サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジェステラーゼおよびcGMPN激サイク クサイクリックオチド・ホスホジェステラーゼ・ポリペプチドの発現をコードす る新規に精製され、単離したポリヌクレオチド配列(例えば、センスおよびアン チセンス鎖を含むDNAおよびRNA )を提供する。 本発明によって提供さ れたゲノミックおよびeDNA配列は、メツセンジャーRNA ヘのin vi voおよびin vitroでの転写を許容する、プロモーター、オペレーター 、レギュレーター、ターミネータ−などの同種あるいは異種発現tlimDNA 配列、そして、機能性ホスホジェステラーゼおよび関連ポリペプチドを大量に調 製するためのmRNA5の転写に関連があるものと思われる。 本発明によって特に得られるものは、米国特許出願庁およびブダペスト条約の規 定に従って、1991年4月11および15日ならびに1992年4月14EI の、American Type Cu1ture Co11ection。 12301 Parklawn Drive、 Roekville、 Mar yland 20852 ヘの寄託の対象となった細菌プラスミドおよびウィル ス・ベクターでの哺乳類DNA挿入体として存在する、ホスホジェステラーゼお よびその断片をコードする哺乳類DNA配列である。 本発明に関連して寄託し たDNA5には、下記のものを含む。 1 、61kDa CaM−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿入体 を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68576)中のプラスミド pCAM−40; 2、63kDa CaM−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿入体を 含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68577)中のプラスミドp 12.3A: 3、81kDa CaM−PDPイソ酵素を断片的にコードするヒト海馬cDN A挿入体を含むバクテリオファージλCaM H6a (A、T、C,C。 受託No、 75000); 4、61kDa CaM−PDEイソ酵素をコードする混成ヒトcDNA挿入体 を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 88963)中のプラスミド pHcao+6l−6N−7; 5 、61kDa CaM−PDEに相同な新規のPDEをコードするヒト海馬 cDNA挿入体を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68964) 中のプラスミドpcaml(38F ; 6 、61kDa CaM−PDEに相同な新規のPDEをコードするヒト心臓 cDNA挿入体を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68965) 中のプラスミドpcamHella+ 7. cGs−PDEイソ酵素をコードするウシ副腎cDNA挿人体を含む大腸 菌(A、 T、 C,C,受託No、 68579)中のプラスミド93cGs −5:8、 cGs−PDEイソ酵素断片をコードするウシ脳cDNA挿入体を 含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68578)中のプラスミドp BBcGsPDE−5; 9、 cGs−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNAを含む大腸菌(A、  T、 C,C,受託No、 68580)中のプラスミドpBBcGsPD8 −7 ;10、 cGs−PDt!イソ酵素断片をコードするヒト心臓cDNA を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 88583)中のプラスミド pGsPDEQ、、 1 ;11、 cGs−PDPイソ酵素断片をコードする ヒト海鳥cDNA挿入体を含む大腸菌(A、 T、 C,C,受託No、 68 585)中のプラスミドpGSPDε7.】;および 12、 cGs−PDPイソ酵素断片をコードするヒト海馬cDNA挿入体を含 むプラスミドpGSPDE!9.2 (A、 T、 C,C,受託No、 68 584)。 13、 cGS−PDEをコードするヒトeDNA挿入体を含む大腸菌(A、  T、 C,C,受託No、 88962)中のプラスミドpt(cgs6n 。 本発明によりて特に提供されるものは、ウシ59kDa CaM−PDEをコー ドするヌクレオチドを含み、配列番号:16および17のDNA配列およびアミ ノ酸配列で特徴付けられるウシcDNA配列である。 関連する態様において、本発明は、それぞれ酵素もしくは酵素断片の発現のため に操作的に連繋した、転写プロモーターを含むDNA構築物、PDEあるいはそ の断片をコードするDNA配列、および転写ターミネータ−に関する。 構築物 は、宿主細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳類もしくは酵母細胞を 形質転換あるいは形質変換するために用いるのが好ましい。 大量生産の目的で、発現したPDEは、例えば、免疫親和的精製により細胞から 単離できる。 標準的形質転換手法および形質変換手法によって、原核および真核宿主細胞への 、適切なりNAおよびRNAウィルスベクターおよび環状DNAプラスミドベク ターを含む、DNA配列の組み込みも本発明の範嗜にあり、今まで自然界から多 量の入手ができなかった有用なタンパク質の提供も期待される。 本発明によっ て提供されたシステムは、上述したものを含んだ形質転換した大腸菌細胞、なら びに、酵母および哺乳類細胞を含んだ他の形質転換した真aHE胞を含む。 哺 乳類宿主細胞は、本発明の組み換え発現物質に関する至適生物学的活性を参照す る必要に迫られることから、翻訳後の修飾(例えば、先端削除、脂質化、および チロシン、セリン、もしくはスレオニン燐酸化)への使用が予想される。 本発明の新規タンパク生成物は、上記核酸配列の発現生成物、およびCaM−P DEの一次構造配座(すなわち、アミノ酸配列)を有するポリペプチド、および cGS−PDBタンパク質ならびにそのペプチド断片、および、複製するよう組 み立てられた、そのアミノ酸配列の合成ペプチドを含む。 本発明のタンパク質 、タンパク質断片、および合成ペプチドは、治療、診断、および予後での用途を 含む多(の用途を意図しており、本発明のタンパク質と特異的に免疫反応するモ ノクローナルおよびポリクローナル抗体の基礎を提供するであろう。 本発明のタンパク質、その断片およびペプチドに高い免疫特異性で結合し、他の タンパク質と共通しない独特のエピトープを認識する能力によって特徴付けられ る(ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、−末鎖抗体などを 含む)抗体基質が、本発明によってさらに提供される。 本発明のモノクローナ ル抗体は、CaM−PDEsおよびcGs−FDBSの親和的精製、例えば、■ ansen et al、、 Meth、 Enn期壮、、 159:543  (1988)、に使用できる。 CaM−PDEsならびにcGs−PDEsの正常、不正常、もしくは変異形態 、およびそれに関連した核酸(例えば、DNAおよびmRNA)の検出および/ または定量のための新規の手法が、本発明によってさらに提供される。 例示的 に、本発明の抗体は、流体および組織標本中のこれらタンパク質、および適切に 標識付けされ、これらタンパク質をコードするmRNAの定量検出のために用い られるであろう本発明のDNA配列の定量検出のための公知の免疫学的手法にお いて用いられるであろう。 それ故、本発明の数々の態様の中には、(a)ポリヌクレオチド配列をコードす る新規のCaM−PDEおよびcGs−PDE 、(b)本明細書に記載した条 件とほぼ同等、あるいはそれより寛容なハイブリダイゼーション条件下で、新規 のCaM−PDEおよびcGs−PDBをコードする配列とハイブリダイズする 哺乳類CaM−PDEあるいは哺乳類cGS−PDEの活性を有するポリペプチ ドをコードし、本発明のcDNAsの初期単離に用いられたポリヌクレオチド配 列、および(C)少なくとも部分的に、変性コドンを使用する時に、同じもの( もしくは、対立性変異体もしくは類似体ポリペプチド)をコードするポリヌクレ オチド配列がある。 ポリヌクレオチド配列および該ポリヌクレオチド配列なら びにベクターで形質転換あるいは形質変換された原核および真核宿主細胞に組み 込まれたウィルスDNAおよびRNAベクターあるいは環状プラスミドDNAベ クター、ならびに、これら宿主の培養成長によるこれらタンパク質の組み換え生 成のための新規の方法、および宿主あるいはその培地からの発現タンパク質の単 離が、対応して提供される。 さらに他の実施態様において、本発明は、PDE活性をlInできる化合物を同 定するための組成物と方法を提供する。 そのような方法は、組み換えPDEポ リペプチドを発現する真核細胞で1’DE 8節活性が評価される化合物をイン キュベートし、遺伝子発現によってもたらされるホスホジェステラーゼ活性に関 する該化合物の効果を決定することを含む。 この方法は、全細胞あるいは細胞 溶解調製物のいずれでも効果的である。 好ましい態様において、真核細胞は、 酵母細胞もしくは内因性ホスホジェステラーゼ活性が欠けている哺乳類細胞であ る。 ホスホジェステラーゼ活性に関する化合物の効果は、cAMPおよび/ま たはcGMPの加水分解を観察する生物化学的分析法、あるいは組み換えPDE ポリペプチドの有無に51J1!する真核細胞の表現型特性の改変に関する化合 物の効果を追跡することにより、決定することができる。 本発明の他の態様および利点は、本発明の実用での数々の例示的実施例を含む下 記の本発明の詳細な説明、図面に関する記載を考慮すれば明確になるであろう。 図1には、61kDa(ウシ脳)イソ酵素の完全配列と共に並べた、単離した5 9kDa(ウシ心臓)および63kDa(ウシ脳)CaM−FDPタンパク質の アミノ酸配列決定の結果を示している。 61kDaイソ酵素に対する59およ び63kDaタンパク賀の同一部分を下線で示した。 仮想同一部を半行下がり で示し、およびハイフンは、未同定残基を示している。 リシルペプチドでブロ ックしたアミノ末端の組成物からメチオニルペプチド(mDDHVT IRRK )を除去することで決定される、59kDaイソ酵素のN−末端を括弧で示した 。 黒塗枠を、61および59kDaイソ酵素で同定したCaM−結合部位中の残基 上に置いた。 杢3μトリ書町T叉吸 下記実施例に、本発明の実例を示した。 実施例工は、ウシ脳からの61kDa  CaM−PDEの単離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞での その発現に関する。 実施例■は、ウシ肺からの59kDa CaM−PDBの 単離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその発現に関する。  実施例■は、ウシ脳からの63kDa CaM−PDEの単離、精製、および 配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその発現に関する。 実施例■は、ウシ 副腎皮質からのeGs−PDP eDNAの単離、精製、および配列決定、なら びに哺乳類宿主細胞での開Aの発現に関する。 実施例Vは、ウシ脳からのcG s−PDE cDNAの単離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞 でのその発現に関する。 実施例■は、ヒトeGs−PDP cDNAの取得、 およびcGs−PDEをコードするヒトcDNAの開発のための、CGS−PD Eウシ副腎cDNAの使用に関する。 実施例■は、ヒトCab−PDE61k Da cDNAおよび新規構造の関!cDNAの取得のための、CaM−PDE  61kDaウシ脳cDNAの使用に関する。 実施例■は、酵母表現型欠陥の 相補性および発現生成物のホスホジェステラーゼ活性のS認のための、ウシおよ びヒトPDB cDNAの発現に関する。 実施例■は、ノザン分析および本発 明のポリヌクレオチド(特に、eDNAsおよびアンチセンスRNA5)を用い たRNアーゼ保護研究を含む組織発現研究に関する。 冗長なオリゴヌクレオチドの構成を本明細書で称する場合、ν」I↓」呻、−1 苑起13−17 (1986)にて報告された、下記表1の一文字表記を、不明 瞭なヌクレオチド配列のために用いることを勧める。 泉−1 ウシ脳からの61kDa CaM−PDE cDNAの単離、精 、および配列 法 この実施例では、タンパク質のアミノ末端をコードする81kDaウシ脳CaM −PDEの遺伝子部分に相当するcDNA配列が、ウシ脳mRNAから調製した 第一鎖状cDNAsのコレクションからPCHによって単離された。 PCR− IN製した断片は、全長ウシ脳CaM−PDE配列を単離するために用いられた 。 全RNAが、Chomezynski et al、、 Anal、 Bioc hem、、 墨156−159 (1987)の方法を用いて、ウシ心臓から調 製され、そしてmRNAが、Po1y (A) Quick (登録商標) m RNA精製キットを用いて、その使用説明書に従って選択された。 第一鎖状c DNAは、50mMTris HCI(pH8,3,42℃) 、10mM M gC1*、10mMジチオトレイトール、0.5mM(それぞれ)デオキシヌク レオチド三燐酸、50mM塩化カリウム、2.5mMナトリウムピロ燐酸、5μ gデずキシチミジル酸オリゴマー(12−18塩基)および65℃で15分間か けて変性した5μgウシ心臓mRNAを含む反応混合物(最終体積40μl)に 、AMV逆転写酵素の80単位を加えることによって合成された。 第一鎖状cDNA合成物を定量するために、[”P]−ラベルした1μmのdC TP(3000Ci/mmol)が混合された。 反応物は、42℃で60分間 インキュベートした。 反応物は、フェノール/′塩化メチル抽出され、エタノ ール沈澱された。 核酸ベレットが、1゜mM Tris −HCI(pH7, 5)10、ff1mM BDTAの50μlに、最終濃度が、15ng/μmに なるよう再懸濁した。 図1にある61kDaペプチド配列に対応する冗長なセンスおよびアンチセンス ・オリゴマーは、目的鋳型に特異的にハイブリダイズするに充分な長さにまで、 最小限の冗長になるようにデザインされている。 CaM PCR−2Sと称する、最初の23塩基オリゴマーを、App1ied Biosystems社製のDNA合成機で合成した。 そのオリゴマーは、下 記アミノ酸配列: に特異的な下記配列を有していた。 CaM PCR−3ASと称する、下記アミノ酸配列:に対応する下記配列の二 番目の23塩基オリゴマーが合成された。 612bp CaM PDEcDNA断片が、PCRI11!11℃用いて、5 0mM塩化カリウム、10mM Tris−HCI (pH9,0)、1.5m M MgC1*、0.01%ゼラチン、0.IX Triton X−100, 012mM (それぞれ)デオキシヌクレオチド三燐酸、1μM(それぞれ)、  CaM PCR2SおよびCaMPCR−3ASオリゴマー、およびTher mus a uaticus DNAポリメラーゼの2.5単位を含む反応混合 物に、15ngの第一鎖状cDNAを加えることによって合成された。 反応物 は、90’Cで1分間、50℃で2分間、および72℃で2分間の、30サイク ルでインキュベートした。 反応生成物は、0.5μg/mlエチジウムプロミ ドを含んだ0.04M Tris=酢酸10.OOIM EDTA緩衝液を用い た1%アガロースゲルにて精製した。 DNA生成物は、紫外線で視覚化され、 カミソリ刃でゲルからていねいに切り出され、Geneclean11試薬キッ トを用いて精製され、そして、EcoRVで切り出されたpB1uescrip tベクターDNAに繋がれた。 PCR増幅生成物が、CaM PDE cDNAであるかを決定するために、サ ブクローニングしたPCRDNA生成物を、T3およびT7プロモーターブライ マー、および5equenaseあるいはTaqポリメラーゼ配列決定キットの いずれかを用いて、末端から配列決定を行った。 DNAのこの断片の各末端か ら約250塩基が配列決定され、図1の59および61kDa CaM−PDt isのアミノ酸配列と対応するcDNAからの推定アミノ酸配列が、PCRDN A生成物はCaM PDB eDNAの一部であることを確認した。 (Ronald B、 Diehl、Merck、5harp & Dohme から提供された)ラムダZAPベクターで構築されたウシ脳cDNAライブラリ ーは、PCI増幅により得られた放射ラベルした815bp CaM−PDti  eDNAでスクリーニングした。 プローブは、Feinberg et a l、。 Anal、 Biochem、、 137:266−267 (1984)の方 法を用いて調製し、[”PI−ラベルしたDNAは、Elutip−D(登録商 標)カラムを用イて精製した。 円形フィルターに結合したプラーク(12−1 50mmプレート上での700.000プラーク)を、50%ホルムアミド、2 0mM Tris−HCI (pH7,5)、IX Denhardt溶液、1 0%デキストラン硫酸、Q、 1% SDSおよび10@cpm/mlの[”P I−ラベルしたプローブ(10”cpm/μg)を含む溶液中で、42℃で、終 夜ハイブリダイズした。 フィルターハ、室温テ、15分間、2X 5SC10 ,1% SDS テ三度洗浄b、次イテ、45℃で、15分間、0. IX 5 SC10,1% SDS テ二度洗浄した。 フィルターは、終夜X線フィルム に曝された。 [0P1−ラベルしたプローブとハイブリダイズした46個のプラークの内、任 意に選択した8個のクローンを、再培養およびスクリーニングを数回行うことに より精製し[Maniatis et al、。 Mo1ecular C1onin : A Laborator Manua l 545pp、 Co1d SpringHarbor Laborator y、 Co1d Spring Harbour、 N、Y、、 (1982) ]、挿入cDNAは、製造者が勧めているように、in vivo削除[5ho rtet al、、 Nuc、 Ac1ds Res、、韮7583−7599  (1988)]により、pB1ueseript 5K(−)にサブクローニ ングされた。 各クローンの培地から調製されたプラスミドDNAは、[!coRIを用いた制 限分析に供した。 適切な長さの二つのクローンが、Taq TaK(登録商標 )および5equenase(登録商標)配列決定キットを用いた配列解析のた めに選択された。 その二つのクローンとは、pCAM−40(2,3kb)と pCAM−34(2,7kb)である。 この方法からの配列情報は、pCAM −40の挿入が、ウシ脳61kDa CaM−PDEの全長をコードすることを 確認した。 このクローンの配列、およびそこから推定されたアミノ酸配列を、 配列番号=5および6に示した。 CO5−7細胞(A、T、C,C,CRL 1651)での61kDa CaM −PDE eDNAの過渡発現を下記のようにして、行った。 大腸菌宿主細胞 MC1061−p3中のベクターpCDM8 [5eed、 Nature、  32敗840−843(1987)]は、マサチューセッツ州、ボストンのマサ チューセッツ総合病院のBr1an 5eed博士より提供を受けた。 このベ クターは、Invitrogen社(カリフォルニア州、サンジエゴ)からも入 手できる。 プラスミドpCAM−40は、H5ndlllおよびNotlで消 化され、肛ndlllおよびNotlで消化されたCDM8ベクターDNAに繋 がれる2、 3kb断片を産生じた。 得られたプラスミドは、MC1061− p3細胞にて増殖された。 プラスミドDNAは、Au5ubel et al 、、 eds、、 Current Protocols in Molecu lar敗吐」L」:1.7.1 (John l!1ley k 5ons、  New York、 1989)のアルカリ溶解法を用いて調製され、Qiag en−Tip 500力ラムCQiagen社、カリフォルニア州、チャッツワ ース)を用いて、使用説明書に従って精製した。 CO5−7細胞は、Au5ubel et al、、 践肛Lat に9.2」 L胆りのDEAEデキストラン法を用いて、p−CAM−40/CDM8構築物 (あるいは、CDM8ベクターのみで形質変換したモデル)で形質変換された。  具体的には、エタノール沈澱したDNAの10℃gを80μITBS Il衝 液液再懸濁し、10% NuSerumを補ったDMEMの4ml中の50%融 合性CO5−7細胞の100mプレートに、10mg/ml Df!AEデキス トランの160μmを滴下して加え、渦巻攪拌して混合した。 細胞は、水飽和、7%二酸化炭素雰囲気下で、37℃で、3−4時間インキュベ ートした。 培地を取り除き、細胞を直ちに、PBS中の10%DMSOで1分 間処理した。 この処理の後、細胞はPBS、次いでDMEMで洗浄され、そし て最終的に、10%胎児ウシ血清ならびに抗生物質(50℃g/mlストレプト マイシン硫酸)を補ったDMEMにて、7%二酸化炭素インキュベーターで、3 6時間培養した。 CO8細胞は、プレートから掻き取られ、40mM Trjs−HCI (pH =7.5)、5mM EDTA 、15[0Mベンズアミジン、15mMβ−メ ルカプト・エタノール、1[+11当たり1μgのペプスタチンA、および1m l当たり1μgのロイペプチンを含む緩衝液(100mmプレート当たり1m1 )にて、Dounceホモジエナイザーで均質化した。 均質化物は、基質として[”H]cGMPを用いて、Hanson et al 、。 な匹ユ勺田↓−に回ユぶl。U、 S、 A、 、ユ2788−2792 (1 982)の方法に従って、PDE活性について分析された。 20mM Tri s−MCI(pH=7.5)、20mMイミダゾール(pH=7.5)、3mM MgC1*、15(0M酢酸マグネシウム、1ml当たり0.2mgのBSA  、および2mM BGTAもしくは0.2mM塩化カルシウムを伴う1μM ” H−cAMP 、および1ml当たり4μgのCaMを含む緩衝液にて、30℃ で、10分間反応を行った。 分析は、90℃の水浴で試験管を1分間インキュ ベートすることで終了した。 冷却後、1ml当たり2.5mgのヘビ毒10μ mを各分析物に添加し、37°Cで、5分間インキュベートした。 試料は、2 0mM Tris−MCI (pH=7.5)の250μmで希釈され、直ちに 0.7ml A−25イオン交換カラムに適用された。 カラムは20m5I Trjs−MCI (pH=7.5)の0.5mlで三鷹 洗浄され、シンチレーション瓶に回収された。 試料は、シンチレーション計測 器Packard Model 1600TRを用いて、1分間計測した。 特異的サイクリック・ヌクレオチド加水分解活性が、1mgタンパク質当たりの 1分当たりに加水分解されたcAMPあるいはcGMPのピコモルとして表現さ れる。 タンパク質濃度は、標準としてBSAを用いた、Bradford、  Anal、 Biochem、、 72:248−254(1976)の方法に 従って見積もった。 模擾的に形質変換した細胞と比較して、pCAM−40c DNAで形質変換した細胞の抽出物は、EGTAの存在下で、非常に大きなeA MPおよびcGMP加水分解活性を有していた。 カルシウムおよびCaMの存 在下での、pCAM−40eDNA形質変換細胞の分析は、cAMPおよびcG MP加水分解の刺激を示す結果となった。 寒朧五l ウシ肺からの59kDa CaM−PDEの単離、精製、および 判決t−−− − ウシ心臓59kDa CaM−FDPからアミノ酸配列に対応する完全に変性し たセンス・オリゴヌクレオチドが合成された。 このオリゴヌクレオチドのヌク レオチド配列は、の配列を有するアミノ酸配列 に対応する、ウシ脳61kDa CaM−PDEの図1の配列から、アンチセン ス・オリゴヌクレオチドがデザインされた。 プライマ一対が、鋳型として(実施例工で調製したような)ウシ心臓第一鎖状c DNAを用いたPCR反応を起こすために使われた。 この反応では、59kDa配列独特の75bp、54bp、ならびに59kDa と61kDaイソ酵素との間で共有される21bpのPCR生成物が予想される 。 PCR生成物は、アガロースゲル電気泳動を篩うことによって分析され、7 5bpに泳動しているバンドをゲルから削り取った。 DNAはpBluescript KS+にサブクローニングされ、青/白選択 法による陽性コロニーが、ベクター配列に対抗するプライマーを使用したPCH によってスクリーニングされた。 適当な大きさの挿入体を有するコロニーが選 択され、これらの一つ(pcaM59/75゜14)が配列決定のために選抜さ れた。 Qujagen P20ブツシュ・カラムを用いて、プラスミドDNA が調製され、ジデオキシ法を用いた配列決定での鋳型として用いられた。 PC R生成物の配列は配列の分析では、得られた配列と予想していた配列との間に二 つのコドンの相違が認められた。 センス・オリゴヌクレオチドブライマー配列 の再検討は、二つのコドンのふとした転位が、オリゴヌクレオチドのデザインに おける誤りを導くことを示していた。 59および61kDaイソ酵素との重複 が最小限である54bp生成物と思われる二番目のオリゴヌクレオチドPCRプ ライマー対に加えて、最初のセンス・プライマーのデザインでの誤りが訂正され た第二センス・プライマーが調製された。 センス・オリゴヌクレオチドは、配 列 を有しており、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列二のプライマー対は 、鋳型としてウシ心臓第一鎖状cDNAを用いたPCR反応を起こすために用い られ、PCR生成物は上記したように、サブクローニングされ、正確にスクリー ニングされた。 二つのクローン(pCaM59154.9およびpCaM59 154.10)が挿入体の大きさを基にして、配列決定のために選択され、上記 したように配列決定され、双方のクローンが、アミノ酸配列が予想される、予想 された配列 の54bp挿入体を含んでいた。 cDNAライブラリーがウシ肺mRNAから構築され、ウシ副腎皮質ライブラリ ーのスクリーニングに関する、工に、実施例■に記載された手法を用いてスクリ ーニングした。 約1.2X10”プラーク形成単位が、1ap−ラベルしたp CAM−40cDNAの1.6kb EcoR1制限エンドヌクレアーゼ開裂生 成物でプローブ検定された。 この最初のスクリーニングで、四つの推定59k Da CaM−PDE cDNAクローンが生成した。 予備的な配列解析にて 、p59KCAMPDE!−2と称する、一つのクローンが、推定59kDa  CaM−FDPの完全なコード配列を含んでいることを示した。 一連の入れ子 状欠失が、p59KcAMPDE−2プラスミド[Sonnenburg et  al、、J、 Biol、 Chem、、 266 (26):17655\ −17661(1991)参照]から構築され、得られた鋳型の配列決定をAa q DyeDeoxy (登録商標)ターミネータ−・サイクル・配列決定キッ トおよびApplied Biosystems Model 373A DN A配列決定システムを用いて行った。 DNAと推定アミノ酸配列を、配列番号 :16および17にそれぞれ示した。 cDNAにある大きな読取枠が、アミノ 末端18残基を除く、61kDa CaM−1’DBアミノ酸配列とほぼ同一の 約59キロダルトンの推定分子量を伴う515残基ポリペプチドをコードする。  さらに、p59KCAMPD[!−2読取枠の予想されたアミノ酸配列は、ウ シ心臓から精製された59kDa CaM−PDPの利用可能な配列、Nova ck、 et al、、 Bjochemist■、 30: 7940−79 47 (1991)と同一である。 これら結果は、p59KCAMPDE−2 eDNAが、59kDaCaM−PDEをコードするmRNA種であることを意 味している。 59kDaウシ肺PDEの一過性の発現は、実施例工でのように達成された。  具体的には、2.66kbの、p59KcAMPDE−2eDNAの匡飢I/プ ラント・エンドした断片が、Xholで消化され、およびプラント・エンドされ たpCDM8にサブクローニングされた。 p59KcAMPDB−2と称する 組換えプラスミドが、CO3−7細胞を一過的に形質変換するために用いられ、 形質変換したCO5−7細胞から調製された抽出物は、2μM cAMPを用い てCaM−PDE活性に関して分析された。 p59KCAMPDE−2cDN Aで形質変換したCO3−7細胞は、カルシウムおよびカルモジュリンの存在下 で、4〜5倍の刺激を受けたcAMP加水分解活性を産生じた。 模擾的に形質 変換したCO5−7細胞では、カルモジュリン刺激cAMP加水分解活性は検出 されなかった。 寒鼻斑l ウシ脳からの63kDa CaM−PDE!の単離 および 判決図1にて報告 されたアミノ酸配列に対応する多数の全体的および部分的冗長なオリゴヌクレオ チドが、63kDa CaM−PDEのた′七のcDNAクローンを取得する試 験に使用するために合成された。 ポリメラーゼMR反応に用いられたアニーリング温度は、各センス−アンチセン ス対の最も低い融解オリゴヌクレオチドのための理論的融点より低い2〜20℃ の間で変化した。 後述するプローブ63−12sおよび83−13aを除いて 、多様な条件下でのオリゴヌクレオチド対の各々のPCR生成物は、アガロース ・ゲル電気泳動した時に、複数のエチジウムプロミドの帯を形成した。 63− 12sおよび63−13aの使用は、配列決定した時に、63kDaCaM−P DEをコードするためのPCR生成物に帰する結果となった。 63−12sと称する全体的冗長なセンス23−marオリゴヌクレオチドは、 61kDaウシCaM−PDEs (図1参照)に保存されているアミノ酸配列 を基にして、下記配列 を含むように組み立てられた。 63−13aと称する部分的冗長なセンス32 −marオリゴヌクレオチドは、の配列を有しており、さらに63kDa Ca M−PDEに保存されている下記配列 ウシ大脳皮質および選択されたポリA+からメツセンジャーRNAが調製された 。 第一鎖状相補性DNAが、AMVまたはMMLV逆転写酵素を用いて生成さ れた。 脱トリチル化したオリゴヌクレオチドは、I XIO’ epm/nm olの1 mM [r −’ ”P]ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナー ゼを用いて燐酸化した。 NBNsorb 20カラムを用いた遊離ATPから の5°5tp−ラベルしたオリゴヌクレオチドの分離の後、それぞれが20℃M (5゛ 燐酸)ストックとして懸濁され、最終的にPCHにおいてそれぞれ40 0nMにて合わされる。 反応は、約1μgのPCR生成物を得るために、50 ng全cDNAおよび200μM dNTPを用いて実施された。 反応には、 5分間・94℃の最初の変性工程に続いて、1分間・94℃の変性、1分間・5 0℃のアニーリング工程、および2分間・72℃の伸長工程の30サイクルが含 まれていた。 反応条件下にて、450塩基対の単一のエチジウムプロミド染色 バンドが、1100nのPCR生成物のアガロースゲル電気泳動にて得られた。  5°燐酸化PCR生成物の5μgが、5χPEG−8000中の74 DNA リガーゼを用いて、21℃で、12時間かけて、15ng EcoRV−切断B luescript KS(+)プラスミドに繋いだ。 XL 1−blue形 質転換の推定陽性体は、発色選択のためのイソプロピルチオガラクトシド(IP TG)およびプロモークロロ−インドリル−ガラクトシド(Xgal)を用いれ ば白いコロニーを形成した。 この精選物は、T3もしくはT7プライマー、ジ デオキシヌクレオチド・ターミネータ−1およびシークエテーゼを用いて配列決 定を行った。 得られた一つのクローン(pH,5B)は、配列番号=22および配列番号;2 3にそれぞれ示した、ヌクレオチド配列および翻訳したアミノ酸配列を有してい た。 オリゴヌクレオチド63−12sに見られたアミノ酸YEHへのコドンは 、pH,5Bにあるアミノ酸配′−12sでの汚染物質によるものであろう。  翻訳した読取枠(ORF)が、図1にて報告された63kDa CaM PDP と類似しているので、pH5Bは、cDNAクローン全長について、ウシ脳cD NAライブラリーをスクリーニングするために用いられた。 ウシ脳cDNAライブラリーは、λZAPIIに構築された。 第一鎖状cDN Aは、第二鎖状cDNAを合成するために、RNase H,E。 coli DNAポリメラーゼ、およびE、 coli DNAリガーゼで処理 された。 cDNAは、T4−DNAポリメラーゼでプラントエンドされ、cD NAのEcoR1部位は、BcoRI メチラーゼおよびS−アデノシルメチオ ニンで保護され、T4 DNAリガーゼを用いてEcoRI リンカ−がそこに 繋がれた。 EcoRI制限酵素処理した後、遊離リンカ−が、5epharo se CL−4Bを用いたゲル濾過によつてcDNAから分離された。 λZA PIIの腕はcDNAに繋がれ、Stratagene社から入手したin v itro Gigapack Goldパッケージング・キットによってまとめ た。9.5X10’の組換体が、IPTGおよびX−galを置くことによって 検定した5゜8^非組換体プラークによって得られた。 ライブラリーは、プレ ート溶解法によって、1.4×10’ pfu/mlにまで一度増幅された。 λZAPIIにある全ウシ脳cDNAライブラリーの最初のスクリーニングが実 施された。 ハイブリダイゴーシコン時に■P−ラベルしたオリゴヌクレオチド 63−Isを用い、モして40’Cの温度で洗浄して、700.0OOpfuが スクリーニングされた。 オリゴヌクレオチド63−Isは、アミノ酸配列を有 する完全に冗長な23−marである。 21個の推定陽性体のすべてが選び取られた。 後続の再スクリーニングが、こ のスクリーニング法を用いて認められた非常に高いバックグラウンドによって妨 げられた。 それ故、最初に選び取った各々がプールされ、プールした内の50 .0OOpfuが任意のプライマーおよび[α−”p)dc’rpによって放射 標識付けされたpH,5Bと取り代えられ、再スクリーニングされた。 プラー ク精製した一つの陽性体が得られ、そしてプラスミドp12゜3aとして取得し た。 そのDNA配列を配列番号:26に示した。 そして、ウシ大脳皮質ライブラリーが、p]15Bでさらにスクリーニングされ た。 さらに二つの独立したクローン、p12.27.9およびp12.27. 11が、最初のスクリーニングでの1.4X10@pfuから得られた。 これ らは、プラーク精製されて、配列決定のために取得された。 クローンp12.3aは、図1に示したようなウシ63kDa CaM−PDE から単離された整列したペプチドのほとんどのタンパク質配列をコードする。  配列番号;26および配列番号;27に、p12.3aのコード領域(すなわち 、約2.5キロベ一ス挿入体の1844ヌクレオチド)を示した。 塩基番号2 48−290は、アミノ酸配列をコードする一方で、対応するペプチド(図1) は、を有していた。 塩基番号942−990は、アミノ酸配列をコードする一方で、対応する単離し たペプチド(図1)配列は、 p12.3aのいかなる読取枠にも、非整列の63kDaペプチド配列は認めら れず、また翻訳した、p12.3aの読取枠分子量は60.951であり、63 .000ではなかった。 それ故、このeDNAは、63kDaタンパク質のイ ソ酵素変異体を意味している。 他の二つの独立したクローン(p12.27. 9およびp12.27.11)は、p12.3aと同一の読取枠配列を有してい るように思われる。 一方のクローンの読取枠は、p12.3aのヌクレオチド 番号823から始まり、その終止コドン通じてp12.3aと同一である。 他 方のクローンは、p12.3&のヌクレオチド番号198から開始し、その長さ からしてp12.3aと同一である。 三つのクローンのいずれも、++11. 513に変則NTRペプチド配列を持っておらず、三つすべてが、61kDaC aM PDEとしてYENを有している。 CO5−7細胞での63kDa CaM−PDEの一過性の発現が、下記のよう にして行われた。 配列番号:26の領域をコードし、BamHI制限部位に位 置させたタンパク質を含むプラスミドp12.3のeDNA挿入体の断片が、P CHによって調製された。 具体的には、(推定開始コドンを含んだ)塩基番号 94−117および(終止コドンの3°に近接した配列を含んだ)配列番号=2 6の塩基番号1719−1735のアンチセンスに対応するオリゴヌクレオチド が、その5゛末端にある二つの一列に並んだBamH1部位によりて合成された 。 二つのプライマーは、下記の配列を有していた。 二つのオリゴヌクレオチドは、72°C・10分間の最終伸長反応を含む、94 ℃・1分間のインキュベージコンから、72℃・2分間のインキュベーションに 至る30回のPCRサイクルに用いられた。 5μgの1665塩基対生成物を 生成するために、100μ1反応物には、20μ輩の各オリゴヌクレオチドなら びに鋳型としての1100pのp12.3aを用いた。 生成物は1:1フエノールニクロロフオルムの等量で一旦抽出され、酢酸ナトリ ウムに関して0.3Mとされ、およびエタノールの二倍量で終夜沈澱された。  沈澱物は乾燥され、50μm中に再水和され、モしてcDNAは、37℃で、1 時間、5単位のBamHI制限エンドヌクレアーゼで消化された。 その後、溶 液は1.1フェノール:クロロフォルムの等量で一旦抽出された。 BamHi 5°ならびに3゛端を持ツ1641塩基対cDNAは、Qiagen Q−20 カラム(Qiagen社、チャッツワース、カリフォルニア州)およびメーカー が作成した使用説明書を用いて、水層から精製された。 切断し、精製したPCR生成物は、BamHI消化したアルカリフォスフ了ター ゼ処理したBluescript KS(÷)プラスミドに繋げられた。 連繋 生成物は、XLI細胞にサブクローニングされ、得られた形質転換体は、配列決 定によりスクリーニングされた。 (pH,6,e6と称する)ある形質転換体は、Bluescript KS( +)W、i伺111制限部位が、開始コドンをフードする挿入体の配列の5゛側 の30塩基であるように調整したBamHI挿入体を用いて単離された。 この プラスミドは、]689塩基対断片を遊離するために、lii nd I I  ]および−隼1制限エンドヌクレアーゼで消化された。 この断片は、実施例■ のように、HindIII−およびXbal−■化したCDM8ベクターDNA に繋いだ。 ; CO3−7細胞は、p12.3. a/CDM8構築物で形質変換、あ6u ’l[流側]に記載したようなりEAE−デキストラン法を用いてCDM8のみ で模擾的に形質変換した。 培地中の100μg/mlの最終DEAE−デキス トラン漉度にて、10℃g DNA/ 400μg DEAE−デキストランの 比率が用いられた。 48時間後、細胞は1mlの均質化緩衝液(40mM T ris−HCI、 pH=7.5.15mMベンズアミジン塩酸、15mM6− メルカプトエタノール、0.7μg/mlペプスタチンA、0.5μg/ml  ロイペプチン、および5 mM Na4EDTA)に懸濁され、Dounceホ モジェナイザーを用いて氷上に粉砕した。 −20℃での貯蔵用に最終50X( v/v)グリセロールを作成するために、均質化物は1/2に希釈され、そして ホスホジェステラーゼ活性の検定あるいはタンパク質濃度を決定のいずれかのた めに使用された。 CaM−依存性および非依存性活性が、実施例1のように決定された。 p12 .3.a DNAで形質変換された細胞は、基準レベルからして、15倍に増大 したCaM−刺激性cAMPホスホジェステラーゼ活性および12倍に増大した CaM−IJ激性eGMPホスホジェステラーゼ活性を有していた。 模攪的に 形質変換したCO5−7細胞は、CaM刺激であっても、基準レベルからして、 PDE活性が認められなかった。 寒鼻纒■ ウシ副腎皮質からのcGS−PDE cDNAの単離、精製、および配列法 お よび 全RNAが、Chomczynskj et al、、 親肛虹の方法を用いて ウシ副腎外皮質から調製した。 ボリアデニリル化RNAを、Po1y(A)Q uick(登録商標) mRNA精製キットを用いて、使用説明書に従って、全 RNA II製物から精製された。 第一鎖状cDNAは、80単位p AMV 逆転写酵素を、50mM Tris−HCI (pH8,3,42℃) 、 1 0mM塩化マグネシウム、10mMジチオトレイトール、0.5mM(それぞれ )デオキシヌクレオチド三溝酸、50IIIM塩化カリウム、2、5mMナトリ ウムピロ燐酸、5μgデオキシチミジル酸オリゴマー(12−18塩基対)およ び65℃で、15分間かけて変性した5μgウシ副腎皮質mRNAを含む反応混 合物(40μm、最終体II)に添加することにより合成された。 反応物は、 42℃で、60分間インキュベートされた。 第二鎖状eDNAは、Watso n et al工。 賜」如旦珈: Practical 1嬰1Kl」+79−87 (1985) の方法を用いて合成され、eDNAの端は、T4 DNAポリメラーゼで鈍化さ せた。 EeoRI制限エンドヌクレアーゼ部位は、EcoRI メチラーゼ( ProIIDega)を用いてメチル化され[Maniatis et al、 、 5uHi、扛バ1 リンカ−(50倍モル過剰)は、T4 DNAリガーゼ を用いてcDNAに連結された。 過剰のリンカ−は、cDNAをBcoRI制 限エンドヌクレアーゼで消化し、5epharose CL−4Bクロマトグラ フイーによって除去した。 Au5ubel射−1ユ、観■皿−0(1μgベク ター当たり225−50nの) eDNAは、EcoRI消化した脱燐酸化ZA P(登録商標) II (Stratagene社)アームに連繋し[5hor t etal、、 Nue、 Ac1ds Res、、 16:7583−75 99 (1988)]、Gigapack(登録商標) Gold抽出物に、使 用説明書に従って包み込んだ[Man−iaHs et al、、 践肛虹]  。 最初に、未増幅のウシ副腎皮質cDNAライブラリーを作成し、末端をγ−[= 鵞PTA丁PおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼでラベルした冗長な23−m arアンチセンス・オリゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングした。 ア ミノ酸配列に対応するオリゴマーが、Applied Biosystems  model 380ADNA合成装置を用いて作成された。 これらの配列は、 以下の通りである。 12個体集合150mmプレート(1プレート当たり約50.0OOpfu)か らのプラークを有する円形の複製ニトロセルロース・フィルターを、ex SS C,lx Denhardt溶液、100 u g/ml酵母tRNA、o、  ossナトリウムピロ燐酸、および(1pmo1当たり10” Cp(Oを超え る) 10epm/ml放射ラベルしたプローブを含む溶液中にて、45℃で一 晩ハイブリダイズした。 フィルターを、室温にて、6x SSCで三鷹洗浄し 、続いて、オリゴマー・プローブの最低融点より10℃低い温度にて、綿密に調 製された6X SSCで洗浄し、そして、X線フィルムに一晩曝した。 (pcGS−3:2.1と称する)単一の2.1kb cDNAクローンが単離 され、そして配列決定された。 このクローンの大きな読取枠によって囲まれた アミノ酸配列は、ウシ心臓破砕懸濁液の上滑両分から精製されたcGS−PDP のペプチド配列と同一でありた。 LeTrong e(al、 、 親肛虹。 増幅された第二ウシ副腎皮質cDNAライブラリーが、(3CGS−5と称する ) 4.2kb cDNAを産生する、[”PI ラベルしたCG5−3:2. 1部分cDNAを用いてスクリーニングされた。 ライブラリーは構築され、Maniatis et al、、 sgB工にある Peinberg et al、、 践肛虹の方法を用いて調製され、そして、 放射ラベルしたDNAが、Elutip−D (登録商標)カラムを用いて精製 された。 円形フィルターに結合した(12個の150mmプレートにある60 0.0OOpfuの)プラークは、50%ホルムアミド、20mM Tris− MCI (pH7,5)、lx Denhardt溶液、10%デキストランー ブ(10”cpm/μg)を含んだ溶液中で、42℃で、−晩ハイブリダイズし た。 フィルターは、室温にて、15分間、6x 5SC10,1%SDS テ 三度洗浄し、そして、45℃で、15分間、O,IX 5SC10,1%SDS で二度洗浄した。 フィルターは、X線フィルムに一晩曝した。 Au5ube l et al、、 ユ戊口Laこの最初のスクリーニングから、52個の推定 クローンが同定された。 これらクローンの20mが任意に選択され、再移植と スクリーニング[MaoiaHs et al、、 銭肛L]を数回反復するこ とにより精製され、そして挿入cDNAsは、製造者が推奨するように、jn  vivo M除[5hort et al、、 gトL]によって、pBlue −scrjpt 5KC−”)へサブクローニングされた。 これらクローンか ら調製されたプラスミドDNAは、制限分析および/または配列決定により解析 された。 この研究から、最も大きな読取枠を表現する4、2kb cDNAが 同定された。 他の推定クローンからのcDNA挿入体は短く、挿入端のヌクレ オチド配列の基づいた同一のものであるように思われた。 推定cGS−PDP cDNAsは、製造者が指示しているように、5equ− enase(登録商標)あるいはTaq Trak(登録商標)キットを用いて Sangerの方法:Sanger et al、、 Proc、 Natl、  Acad、 Sci、 USA。 74 :5463−5461の修正法によって配列決定された。 鋳型は、製造 者の使用説明書に従ったエキソヌクレアーゼ!■およびヤニf9.ヌクレアーゼ を用いたベクター、pBluescript SK(−)(Jtratagen e社)での一連の巣状削除[He1nkoff、 Gene、 28:た。 こ の方法によって、重複した鋳型が得られなかった場合には、eDNAsは好適な 制限エンドヌクレアーゼ部位で開裂されてpBluescriptにサブクロー ニングされるか、あるいは配列決定のための鋳型を用意するために特定のオリゴ マーが製造される。 −木組DNA鋳型は、製造者(Stratagene社) が推奨するように、pB1ueseriptプラスミド[Levinson、  et al、、 □]に宿るヘルパー・ファージ感染XLI細胞によって分泌さ れたファージからのDNAを単離することにより選抜した。 GENEBANK (Release 66.0)、EMBL (Release 25.0) 、 およびNBRF核酸(Re−1ease 36.0) 、およびタンパク質(R elease 26.0)データベースの相同5i係贋査が、Devereuz  et al、、 Nuc、 Ac1ds Res、。 12+387−395 (1984)のGenetjcs Computer  Groupソフトウェア−・パッケージによつて提供されたWorldsear ch、 FASTAおよびTFASTAプログラムを用いて実施された。 p3CGS−5cDNAクローン挿入体の大きな読取枠によってコードされるヌ クレオチド配列および推定アミノ酸配列を、配列番号;38および配列番号=3 9に示した。 最初のメチオニン・コドンから始まって、cDNAは算定分子量 約103.000の921残基ポリペプチドをコードする。 この配列に先んじ る終止コドンは無いものの、反応開始メチオニン一致配列[Kozak、 J、  Ce1l Biol、、 108:229−241 (1989)]は同定さ れていた。 転写終止一致配列[Birnstiel et al、、釦旦、  41:349−359 (1985)]に先んじられたcDNAの3゛端の36 アデノシン残基は、cGs−PD[E mRNAの3゛未翻訳配列のすべてが、 このクローンによりて表現されていることを示唆している。 S49細胞[Bourne et al、、 J、 Ce11. Ph 5io 1.、85:611−620cGS−PDE cDNAは、pZEM 228と 称する、亜鉛誘導できるメタロチオネイン・プロモーターに続き、SV40転写 終止配列に先がけた、哺乳類発現ベクターにある独特の匣1クローニング部位に 繋がれた。 DNAは、製造者が指示したように、Qiagen pack−5 00カラムを用いて大規模プラスミド高製物からtriされた。PPD−849 細胞は、10%心臓不活化ウマ血清、50Hs/mlペニシリンG、および50 Hg/mlストレプトマイシン硫酸を含むDMEMにて、37℃、水飽和7%二 酸化炭素雰囲気下で培養した。 形質変換に先立って、細胞の集合100mmプ レートは、当初の115の密度で、再移植され、24−36時間インキュベート した。 典型的な形質変換実験において、PPD−S49(50−80%集合) は、Tris緩衝化食塩水で洗浄し、約2X10’個の細胞が、1m1TBS中 の400μg DEAIl!デキストランと混合した10HgのDNAで形質変 換した。 細胞は、20分ごとにゆっくり攪拌して、37℃で、1時間インキュ ベートした。 次に、最終濃度が10%になるようDMSOが添加され、ピペッ トで吸引・排出して直ちに混合した。 2分後、m胞は15容量部のTBSで希 釈され、遠心分離で回収され、そしてTBSとDMEMで1!!続的に洗浄した 。 細胞は、完全培地に再懸濁され、新鮮な100111111プレート(1− 2x 307細胞/10mm/プレート)に播種された。 24時間後、細胞は TBSのみ、あるいは(iIk終濃度が125μMの)硫酸亜鉛を含むTBSで 処理され、さらに24時間インキュベートした。 最終細胞ベレットは、2ml の均質化緩衝液(40mM Tris−)(C1; pH=7.5.15mMベ ンズアミジン、15mMβ−メルカプトエタノール、0.7μg/mlペブスタ インA、0.51/m1ロイペプチン、および5 mM EDTA)に再懸濁さ れ、dunceホモジエナイザーを用いて氷上で粉砕した。 均質化物は、4c Gs PDE活性は、Martins et al、、 J、 Biol、 C hem、、 257:1973−1979 (1982)にあるように基質とし て11H)cAMPを用いた先に示した方法によって決定した。 ホスホジェス テラーゼ分析は、三つ並行して行った。 標準としてBSAを用いたBradf ord分析法(Bradford、 Anal、 Bicehem、、 72: 248−254 (1976)]が、タンパク質を定量するために用いられた。 亜鉛処理を行わない場合、cGs PDE−ZEM 22B構築物あるいはベク ターのみで形質変換されたPPD S49細胞では、基本活性あるいはcGMP il激ホスホジェステラーゼ活性の増加は検出されなかった。 しかしながら、 ベクターのみでなく、cGs−PDEcDNAで形質変換した亜鉛処理した細胞 は、cDNAがCGS−PDEをコードすることを示す、cGMP強化cAMP ホスホジェステラーゼ活性を発現した。 均質化物と50,000 x g上滑 の総活性には、顕著な相違は認められなかった。 CO3−7細胞でのcGs−PDE cDNAの一過的発現が、実施例■のよう にして行われた。 p3CGS−5の4.2kb断片が、肚庭111 とNot  Iを用いて単離され、同じ酵素で消化されているプラスミドpCDM8に挿入 された。 p3cGs−5/pCDM8構築物で形質転換されたCO5−7細胞 に生成した生成物の特性は、下記実施例Vにて議論する。 寒凰鑓M ウシ脳からのcGs−PDE cDNAの単離、製、および部 的 刑法 A、ウシ脳cGs−PDE cDNAクローン BBCGSPDE−5の車(M erck、 5harp & Doha+eのRonald E、 Dieh1 氏から提供された)λZAPベクターで構築されたウシ脳cDNAライブラリー が、(p3CGS−5) :(りt、オチド位置番号1−452i:対応するI )3CGS−5cDNAの450bp EcoRI/Apal制限エンドヌクレ アーゼ開裂断片でスクリーニングされた。Feinberg et al、、  銭肛虹の方法を用いてプローブが調製され、[■門うベルしたDNAが、Blu tip D(登録商標)カラムを用いて精製された。 円形フィルターに結合し た(12−150mmプレート上の全eoo、 oooの)プラークを、50% ホルムアミド、20[11M Tris−HCI (pH7,5)、IX De nhardt溶液、10%デキストラン硫酸、0.1% SDS、および10’ cpm/mlの[0P1ラベルしたプローブ(10°cpm/ u g)を含ん だ溶!中で、42℃で、−晩ハイブリダイズした。 フィルターは、室温にて、 15分間、2x 5SC10,1X SDSで三度洗浄し、そして、45℃で、 15分間、Q、 IX 5SC10,1% SDSで三度洗浄した。 フィルタ ーは、X線フィルムに一晩曝した。 この最初のスクリーニングから40個の推定クローンを選び取り、その内の6個 を任意に選抜して、再移植とスクリーニングを数回反復して精製したpslan iatis虹a1.、封肛〔。 挿入cDNAは、製造者の推奨にあるように、 in vivo削除によってpBluescript 5K(−)にサブクロー ニングした。 各クローンの培地から調製したプラスミドcDNAは、5equ enaseおよびTaqTrak配列決定キットを用いて両端から配列決定を行 った。 この実験から得られた配列は、ウシ脳cDNAクローンpBBcGsP DE−5がeGS−PDE cDNAてあり、5一端側の副腎eGs−PDE  cDNAとは相違することを確認した。 (タンパク質のアミノ末端領域をコードする)pBBCGSPDB−5挿入体の 5゛末端の部分的配列解析は、配列番号;40に示したセ→ス鎖を示し、一方で 、該挿入体の3°末端の配列決定は、配列番号:41に示したアンチセンス配列 を示した。 B、ウシ脳cGs−PDBcDNAクローン BBCGSPDE−7の単上記し た最初の一連の精製から選択された40個の推定クローンを、それぞれ宿主XL I細胞にスポットし、37℃で、−晩インキユベートした。 プラークを、(p 3cGs−5ヌクレオチド位置番号2661−3034に対応する) p3CG S−5cDNAの370bp Pstl/Smal制限エンドヌクレアーゼ開裂 断片によってスクリーニングされた。 プローブは、Feinberg et  al、、 鉗肛虹の方法を用いて調製され、[”P] ラベルしたDNAをEl utip−D(登録商標)カラムで精製した。 円形フィルターに結合している プラークを、50%ホルムアミド、20mM Trjs−HCI (pH7,5 )、IX Denhardt溶液、10%デキストラン硫酸、0.1% SDS 、および10@epm/mlの[0P1ラベルしたプローブ(IQ”cpm/μ g)を含んだ溶液中で、42℃で、−aハイブリダイズした。 フィルターは、 室温にて、15分間、2x 5SC10,11SDSで三度洗浄し、そして、4 5℃で、15分間、0. lx 5SC10,1χSDSで三度洗浄した。 フ ィルターは、X線フィルムに一晩曝した。 移植と再スクリーニングを数回反復した後、6つの推定クローンが精製され、両 端から配列決定を行った。 cDNAクローンpBBcGsPDE−7の5一端 側の配列は、クローンpBBCGSPDB−5と同一であったが、副腎由来クロ ーンp3CGS−5とは異なりでいた。 pBBcGsPDE−7eDNAクローンの3一端側の配列は、p3CGS−5 挿入配列と同一であった。 pBBcGsPDE!−7挿入体の配列解析は、配列番号:42にあるDNA配 列と配列番号:43のアミノ酸配列を示した。 ゛酵素の第一次構造における相違点は、脳cGs−PDEのアミノ末端残基1− 46、および副腎eGs−PDEの残基1−25にある。 脳および副腎cGs −PDHの残りのカルボキシ末端残基は同一である。 CO5−7細胞での一過的発現のために、肛ndlllおよびΔotlを用いて pBBcGsPDE−7の3゜8kb断片が単離され、HindlllおよびN ot I制限エンドヌクレアーゼで切断されたプラスミドpCDM8に挿入され た。 組み換えpBBcGsPDB−7/pcDM8構築物は、CO5−7細胞 を一過的に形質変換するために用いられた。 次いで、pBBcGsPDE−7 /pCDM8411築物および実施例■にて調製したp3cGs−5/pCDM 8構築物の特性を、比較した。 膜と上滑画分は、形質変換したCO5−7細胞 の抽出物から調製され、CGS−PDE活性に関して分析された。 pBBcG sPDE−7/l)C0M8およびp3CGS−5/pcDM8プラスミド構築 物双方が、CO5−7細胞抽出物にて、eGs−PDE活性を呈し、その活性の 大半は上滑両分で検出された。 しかしながら、pBBCGSPDB−7/pC DM8構築物で形質変換したCO3−7細胞抽出物からの膜において、p3CG S−5/pCDM8構築物で形質変換したCO3−7細胞から調製した膜よりも 10倍高いパーセント数の全eGs−PDE活性が検出された。 これら結果は 、副腎cGs−PDHに関して、pBBcGsPDE−7cDNAによってコー ドされたイソ酵素が、細胞膜と優先的に関連することを示すものである。 寒凰纒■ ヒトcGs−FDI!cDNAsの取得のためのcGs−PDEウシ副 eDN Aの 用ウシ・サイクリックGMP−IJ激ホスホジェステラーゼをコードする cDNAクローンに相同な、い(つかのヒトeDNAクローンが、ウシcDNA から誘導した核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによって単離された 。 配列解析とハイブリダイゼーション研究の組み合わせは、これらヒトcDN Aクローンが、ヒト・ホスホジェステラーゼに対応する読取枠を含んでいること を示している。 cDNAライブラリーは、ウシcGs−PDIEをコードする4、2kb cD NA挿入体を含むプラスミドp3CGS−5からのDNAで調査した。 このプ ラスミドは、制限酵素Smalおよび肝姐1で消化した。 cDNA挿入体から誘導した約3. Okb断片は単離され、アガロースゲル電 気泳動で精製された。 この断片は、FDHの全読取枠を含んでいる。 この断 片は、任意プライミングにより、放射性ヌクレオチドでラベルした。 cDNAライブラリーは、プレート当たり約50.000プラークの密度で、1 50mmペトリ皿に置かれた。 二つのニトロセルロースフィルターのレプリカ を調製した。 放射性核酸プローブを、50%ホルムアミド、5x 5SPE  (0,9M塩化ナトリウム、0.05MNaHtPOa + H*O、0004 M水酸化ナトリウム、および0.005MNa*EDTA−HtO)、0.5X  SDS、100μg/mlサケ精巣DNA 、および5X Denhardt 溶液にて、42℃で、−晩、フィルターにハイブリダイゼーションするために用 いた。 フィルターを室温にて洗浄し、そして、65℃にて、0.1χSDSを 含む2x SSC中で洗浄した。 陽性プラークは精製され、その挿入体は標準的手法によって、DNA配列解析用 の適切な配列決定用ベクターにサブクローニングされた。 まず、(C1ontech、任意の、dTプライム化した)ヒト海馬mRNAか ら調製されたλgtlo eDNAライブラリーがスクリーニングされた。 検 査した約500.000プラークの内、33個がプローブとハイブリダイズした 。 これらファージの−っを、cDNA挿この反応の一つの生成物が、ウシeG s−PDE cDNAと比較した際に大きな相違点が認められる、プラスミドp GsPD[39,2であった。 pGsPD89.2挿入体の5゛側の0.4kbが、ウシeDNAから分岐して いた。 ヒトcDNAの5′端から約0.7kbに、ウシcDNAから分岐した 0、 7kb領域がある。 この領域は、イントロンであろう。 ウシ・プロー ブとハイブリダイズした残りの海馬プラークの内の25個が、PCR、ハイブリ ダイゼーションおよび/または配列決定により検定された。 この領域を通じて 、ウシとヒトcDNAsとの間における相違点は皆無であった。 海鳥ライブラリーからの池の二つのファージ、ファージλGSPDE7.1およ びλGSPDB7.4が、EC0RI とHindlllで消化された。 それぞれが、cDNA挿入体の大半を含む1.8kb断片と、約0.2kbフア ージλDNAを産生じた。 それぞれの場合において、cDNA挿入体を典型的 に一括するEcoR1部位の一つが、恐らくライブラリーを構築する際に壊され るため、λDNAは該断片中に存在する。 肛堕1)数回Illは、江叱1とL 皿IIIで消化されたBluescript KSにクローニングされた。 こ の方法により、プラスミドpGsPD87.1 とpGsPDE7.4が得られ た。 cDNA挿入体は、ウシ・ホスホジェステラーゼcDNAの3°部分に相 同のDNAをコードする。 これらクローンにある双方のcDNA挿入体は、E coR1部位に始まり、その配列はこの部位の直後と相同である。 pGSPDε7.1およびpGsPDE7.4 cDNA挿入体部分が配列決定 され、その3′端の短領域以外は同一であった。 pGsPDE7.1のcDN A挿入体は、約70個のアデニン塩基の配列で終わっており、一方でpGsPD E7.4のcDNA挿入体は、約20個のアデニン塩基の配列が続れたcDNA ライブラリーは、スクリーニングした約500.000のプラークから、一つの ハイブリダイズするプラークを産生じた。 ハイブリダイズする挿入体を含むBluescript 5K(−)プラスミド pGSPDE!6.1が、λZap I I クローンからin vivoにて 割線された。 配列解析は、挿入体がウシ・ホスホジェステラーゼeDNAと相同であることを 示した。 相同領域は、pGsPD89.2からの挿入体の配列とpGsPD8 7.1 もしくはpGSPD87.4にある挿入体の配列を・接合することによ り形成された配列中にあるEcoRlの位置にまで及ぶ。 つまり、海馬からの クローンは、完全な読取枠を形成しているものと考えられる。 ヒト胎盤mRNAから誘導したλgtloライブラリーは、スクリーニングした 約800.000のプラークから五つのハイブリダイズするプラークを産生じた 。 これら胎盤cDNAクローンは短く、その配列は、海馬cDNA pGsP DE9.2の部分と同一であった。 U118多形性神経膠cDNAライブラリ ーからの5XIQ’プラーク、牌臓cDNAライブラリーからの5×10″プラ ーク、および副腎ライブラリー(クッシング症候群)からの5X10’プラーク のスクリーニングでは、ハイブリダイズするプラークは得られなかった。 ヒトとウシcGS−PDE配列との間に大きな相同性を付与すれば、0.4kb  5’配列が人造物であるか否かを決定するための、ヒトcGs−PDEの5゛ 端を含む多数の独立したcDNAクローンを取得することが決断される。 ウシ cGS cDNAプラスミドp3cgs5の5′端からの約0.95kb Ec oRI−H3ndlll断片は、任意にプライム化され、多数のヒトcDNAラ イブラリーをスクリーニングするプローブとして用いた。 海鳥ライブラリーの スクリーニングは、上記したスクリーニング条件と同一条件下で実施した。 残 りのスフ(Hut78、di−プライム化した)ヒトT4細胞ライブラリーから の5X10’プラーク、 (任意に、di−プライム化した)海馬cDNAライ ブラリーからの106プラーク、(dt−プライム化し、5°伸長した、C1o ntech) ヒト肝臓cDNAライブラリーからノ5X10’プラーク、(d t−プライム化した)ヒト5W1088多形性神経膠cDNAライブラリーから の5X10’プラーク、(任意に、dt−プライム化した)同様のヒトcDNA ライブラリーからの5X10’プラーク、および(任意にプライム化した)ヒト 肺cDNAライブラリーからの1.5 X 10@プラークのスクリーニングで は、陽性体は得られなかった。(任意に、dt−プライム化した、Strata −gene)ヒト胎児脳cDNAライブラリーからの5X10″プラークのスク リーニングでは、二つの陽性体が得られた。 これらを、](FB9.1および HFB9.2と称した。 Bluescript 5K(−)プラスミドpHFB9.2およびpHFB9 .1は、λZapHクローンからin vjvoにて割線された。 DNA配列 解析では、HFB9.1は、HFB9.2よりもさらに3゛側の約80個目のヌ クレオチドから始まり、HP89.2への配列の約1.9kbのイントロンへ読 み込む。 HFB9.2は、cGs−PDHの全読取枠を覆うが、停止コドンか ら後の、イントロンと思われる59個のヌクレオチドを読み込む。 双方共に、 5゛側の0.4kbとpGsPDIE9.2に見られる推定したイントロンが欠 けている。HFB9.2の全読取枠が、単離され、酵母発現ベクターpBNY6 Nにて組み立てられた。pHegs6nと称する得られたプラスミドは、Eco RI/Xho I挿入体として、cDNAのコード領域を含む。 挿入体のDN Aおよび推定アミノ酸配列を、配列番号:44および45にそれぞれ示した。 X亀五亘 ヒトCaM−PDP 61kDa eDNAの取得のためのCaM−PDE 6 1kDaウシ脳cDNAの 用ウシ61kDa CaM−PDEをコードするc DNAと相同な、ヒトcDNAクローン、λCaM H8aとλCaM H3a が、ウシ特異性酵素をコードするcDNAから誘導された核酸プローブを用いた ハイブリダイゼーションによって得られた。 配列解析とハイブリダイゼーショ ン研究の組み合わせは、λCaM H6aが、ヒトCaM−PDEをコードする 読取枠の大半を含むことを示している。 ヒトDNAを単離するために用いたハイブリダイゼーション・プローブは、PC R処理によるウシ肺組織の第一鎖状([)NAから誘導された。 具体的には、 実施例IにてPC)!−2Sと称した23−merのオリゴヌクレオチド(配列 番号=1参照)は、pCAM−40挿入体のコード領域の大部分に相当する10 98塩基対のcDNA断片を作成するために、実施例Iおよび■の一般的手法に 従って、アミノ酸配列、 のpCAM挿入配列を基にした、冗長なアンチセンス23−marのオリゴヌク レオチド(PCR−5AS)およびウシ肺eDNAと、PCR反応において結合 した。 PCR生成物は、0.5μg/mlのエチジウムプロミドを含む0.4 M Tris−酢酸10.0O1lJ EDTAIlli液を用いた1%pB1 ueseriptベクターDNAに繋がれた。 PCR増幅生成物がCAM−PDE cDNAsであるか否かを決定するために 、サブクローニングしたPCRDNA生成物は、T3および1710%−ター拳 プライマーと、5equenaseあるいはTaq Polymerase配列 決定キットのいずれかを用いて、両端から配列決定を行った。 このDNAの各 端から約250塩基は、ウシCAM−FDPのアミノ酸配列と比較され、PCR DNA生成物が、部分的CAM PDEcDNAであることが確認された。 こ のクローンは、pCAM−1000と称され、pCAM−40の挿入体の409 から1505のヌクレオチドに対応する1、1kb、i酸の挿入体を含んでいた 。 この1. lkb断片は、アガロース・ゲル電気泳動で精製され、そして、 制限酵素A c cj−で消化された。 この二つの断片は分離され、そして、 アガロース・ゲル電気泳動で精製された。 これら分離された断片は、任意プラ イミングにより、放射性ヌクレオチドがラベルされた。 ヒトcDNAライブラリーを、150mmベトリ皿に、皿当たり約50、000 プラークの密度で移植され、そして、複製ニトロセルロース・フィルター・レプ リカが調製された。 各プローブは、各組の複製フィルターにハイブリダイズさ れた。 フィルターは、3x 5SC10,1! 5arkosyl 、50F g/ml′+l−ケ精巣DNA 、10xDenhardt溶液、20mM燐酸 ナトリウム(pH6,8)にて、65℃で、−晩ハイブリダイズした。 フィル ターは、65℃で、0.1%SDSを含んだ2x SSCで洗浄した。 ヒト海馬mRNAから調製したλgtloライブラリーは、スクリーニングした 約500.000プラークから、三つのハイブリダイズするプラークを産生じた 。 これら三つのハイブリダイズしたブイズした。 λCam H6aクローン は、pCAM−40のウシ・クローンをコードするcDNAに相同な、約2kb 挿入体を含む。 λCam H6a cDNAは、配列解析のために、プラスミドBlue−sc rjpt KSにサブクローニングされた。 cDNAライブラリーはEcoR I リンカ−で構築されてきたが、eDNA挿入体の側面に位置すべきR皿1部 位の一つが、EcoRIで切断されていなかった。 そして、cDNAは、約0.7kb EcoRI/1(indI11断片(pc amH6c) 、および約1.3kbのcDNAと側面に位置する0、 25k bのλgtloベクターDNA(pcamH6B)を含む約1.6kb Hjn dlll断片の二つの断片としてサブクローニングした。 DNA配列解析は、 それが、コード領域の中程にある二つの塩基対が欠けていると思われるヒトcD NAを除いて、ウシelk CaM−PDEと相同なヒトCaM−PDEの大半 をコードしていることを示している。 これら欠けているヌクレオチドは、最大 の相同性を示すpCAM−40ウシ61kDa CaM−PDE(配列番号=5 )と対照すれば、ヒトeDNA配列の626および627の位置に対応する。 ウシ61kDa CaM−PDEプローブでスクリーニングされた海馬cDNA ライブラリーからの他のcDNAクローンは、λeamH2aであった。 λc amH6a eDNAの場合のように、挿入体の両端に存在すべき二つのEco R1部位の−・つのみを切断する。 このcDNAのための最初のサブクローニ ングとDNA配列解析は、側面に位置するλgtloベクター・アーム中のオリ ゴで作成されたP(R断片を利用した。 このeDNAは、λcaml(6aで の挿入体の5°端の多(と重複しており、ウシ配列から推定された二つのヌクレ オチドをさらに含み、そして、PDE読取枠を維持することを必要とする。 EeoRI/Hindl II断片は、プラスミドBluescript SK −にサブクローニングされ、pcamH2A−16と称された。 これは、下記 する酵母発現プラスミドの構築における、さらに二つの塩基対の源として用いら れた。 二つの異なるプラスミドが、#母にて、ヒトCaM−PDE発現のために構築さ れた。 一方のプラスミド、pHcam61−6N−7は、全読取枠を含んでい る。 二つ目のプラスミド、pHcam61met140は、(ヌクレオチド位 置505にて始まる)内部メチオニンから始まり、読取枠の終端まで伸びる。  これら発現プラスミドは、読取枠の3′部分を修飾し、そして、3′に二つの異 なる修飾した5゛端を付加することによって構築される。 pHcam61−6 N−7のcDNA挿入体の配列を配列番号:48に示し、それによってコードさ れるCaM−PDEの推定アミノ酸配列を配列番号;49に示した。 cDNA挿入体の構築中に、826の位置のヌクレオチドは、TからCに改変さ れたが、コードされたアミノ酸は保存されていた。 上記したように、プラスミドpHcam61met140は、pHcam61− 6N−7のコード領域の最初の140個のコドンが欠けているcDNA挿入体を 有しているが、その他は同一である。 三番目のcDNA、λcamH3aは、約2.7kb挿入体を含んでいた。 このeDNA挿入体は、配列解析のためにサブクローニングされた。 eDNAライブラリーは、EcoRIで構築されてきたが、λcamH3a中に 挿入されたcDNAは、EeoRlで摘出することはできなかった。 恐ら< 、EcoR1部位の一つは、ライブラリーの構築中に壊されたものと思 われる。 cDNA挿入体は、λクローンからHindlllおよび囮1での消 化によって摘出された。 この消化にょっする。 これら二つの断片は、約3k bの断片を産生ずるために、プラスミドBluescript KSにて組み立 てられる。 小さなHindI11断片の配向は、最初のλクローンと同じであ った。 このサブクローンは、pcam!(32Fとして知られている。 この cDNAはウシCaM−FD881kDa eDNAからのウシ・プローブとハ イブリダイズするが、配列解析は、異なるCaM−PDE遺伝子の生成物である と思われること示した。 プラスミドpcamH32Fは、全読取枠であろうも のを含んでおり、その大半の長さにわたって、pHeam61−6N〜7の挿入 体によってコードされたタンパク質と、約75%相同であるタンパク質をコード する。 DNAと推定アミノ酸配列を、配列番号;50と51にそれぞれ示した 。 pcam)t3EFのヌクレオチド80と100の間の領域のDNA配列は 判然としていない。 この領域は、イニシエーター・メチオニン・コドンの5゛側であるので、読取枠 には効果が及ばない。 pcamH38Fの約2.4kbの断片は、制限酵素Hindlll とEco RIでの消化に続いて、ゲル精製された。 この断片は、上記したスクリーニン グ方法と同様に、さらにヒトcDNAライブラリーをスクリーニングするために 用いられた。 ヒト心臓cDNAライブラリー(Stratagene)からの 約5×10″個のプラークのスクリーニングは、pcamH38Fプローブにハ イブリダイズする二つのプラークを産生じた。Bluescrjpt SK−プ ラスミドpcamHellaは、これら陽性λZap I I クローンの一つ からin vivoにて摘出された。 cDNA挿入体のDNAと推定アミノ酸配列を、配列番号=52と53にそれぞ れ示した。 pcamHellaの配列解析は、pcamH3EFのヌクレオチ ド位置610にて挿入が始まり、DNA配列がpcamH32Fのそ−ドされる タンパク質のカルボキシ末端が改変される。pcamH3EP cDNAは、6 34アミノ酸(分子量72.207)のタンパク質をコードすることができた。  pcamHellaのcDNAの5′が、pcamH3EPの5゛(ヌクレオ チド位置610の5°)と同じであると仮定すれば、pcamHellaは、7 09アミノ酸(分子量80.759)をコードできる。 これら3゛分岐端は、代替接合、接合の欠如、もしくはクローニング過程で近接 して並べた関連のないDNA配列の結果によるものであろう。 寒鼻医! 酵母表現型欠陥の相補性のための ウシおよびヒトPDP cDNAの この実施例は、酵母ホスホジェステラーゼ遺伝子の突然変異に関連する熱シヨツ ク表現型を抑制する機能性PDE発現物質の能力を実証する酵母中でのウシおよ びPDEクローンの発現に関し、さらに発現生成物の生化学的分析にも関する。  これら実験に用いた宿主細胞は、共に熱シヨツク感受性、すなわち、55−5 6℃程度の昇温下に曝した細胞の生存不能によって特徴づけられる表現型に起因 する関虻−、配−であるS、 cerevisiae酵母株10DAB (AT CC受託No、 74049)およびYKS45である。 これら相補性実験において、挿入された遺伝子生成物が熱シヨツク表現型を顕著 に修飾することが認められた。 さらに、この能力は、化学化合物の哺乳類Ca ”/カルモジュリン刺激性およびcGMP刺激性サイクリックヌクレオチド・ホ スホジエステラA、 Cab−PDEをコードするcDNAの発 による酵母表  型相補性酵母発現ブラズミドpADNS (ATCC受託No、 68588 )およびpADNS(ATCC受託No、 68587)へ挿入する2、2kb  cDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応によるプラスミドpCAM−408( 実施例I)から誘導された。 要約すれば、下記のPCR増幅が、pCAM−4 0DNA挿入体をベクター内においてADHIプロモーターと共に適切に整列す るよう改変するために用いられた。 PCR反応に用いたオリゴヌクレオチド・プライマー(オリゴA)の一つ は、塩基対位置100−116にてpCaM−40cDNAクローンにアニール され、關始メチオニンコドンの前にHjndl11部位を含んでいる。 第二オ リゴヌクレオチド・プライマー(オリゴB)配列番号二55 5−TACGAAGCTTTGATGGTTGGCTTGGCATATC−3’ は、位置520−538にてアニールされるよう設計されており、メチオニンコ ドンの前にHindl11部位の二つの塩基も含んでいた。 三番目のオリゴヌ クレオチド は、挿入体の3゛であるプラスミド中の位置にアニールされた。 ある反応のために、オリゴAとオリゴCが、鋳型としてのモジュリン結合領域を コードするcDNA配列部分が欠けた咳酸生成物を産生した。 これら増幅産生 物は、HindlllおよびNot 1で消化され、肛ndlll/Notl消 化酵母発現ベクターpADNSおよびpADANSに繋がれた。 挿入体を含む プラスミド・クローンが選択され、リチウム酢酸形質転換によりS、 crev isiae株10DABに形質転換された。 形質転換した酵母は、アミノ酸ロイシン(SC−ロイシン寒天)が欠如している 合成培地を含む寒天平板上に画線培養し、30’Cで、3日間生長させた。 こ の寒天平板のレプリカを、三つのタイプの寒天平板:SC−ロイシン寒天のレプ リカ、室温でのYPD寒天のレプリカ、および56℃に温めたYPD寒天平板の レプリカ、を作成した。 これら三つの温めたレプリカを、56℃で、10.2 0、もしくは30分間維持した。 これらレプリカは室温にまで冷やされ、すべ ての平板を30℃にて置いた。 CaM−PDEを発現するよう構築したプラス ミドで形質転換した酵母は、熱衝撃耐性であった。 より具体的には、全読取枠 を発現するように設計され、さらに、pADNSもしくはpADANSのいずれ かにて、(触媒領域を含むが、カルモジュリン結合領域を含まない)末端削除し たタンパク質を発現するように設計された構築物は、l0DAB宿主細胞の熱シ ヨツク感受性表現型、すなわち、56℃温度衝撃耐性、に相補的であった。 同様の方法で、プラスミドpHcam61−8N−7とpHcam61met1 40(実施例VI +)が、酵母宿主10DAB中に形質転換された。 熱シヨ ツク表現型は、双方の形質転換にて抑制された。 ゼ活性を測定することによって評価した。 この目的のために、形質転換した酵 母の200m1培養液を、液体SC−ロイシン中にて約600万細胞/mlの密 度になるまで生育させた。 細胞は遠心分離して回収され、細胞ペレットは冷凍 された。 抽出物は、氷上に冷凍細胞を解凍し、PBS 1mlと同量のガラス ・ビーズと混合し、酵母細胞を粉砕するためこれらを撹拌し、そして、不溶性の 残骸を除去するために、粉砕した細胞を約12,000 x gで、5分間、遠 心分離することにより調製した。 上清が、ホスホジェステラーゼ活性について 分析された。 50μmまでの酵母細胞の抽出物が、10 X 75mmガラス製試験管中の、 50mM Tris (pH8,0)、1.0mM EGTA、0.01mg/ mL BSA (ウシ血清アルブミン) 、[”H]−サイクリックヌオクレチ ド(4−10,000cpm/pmo1)、および5mMMgC1*の最終体積 250μmにて、30℃で、ホスホジェステラーゼ活性が分析された。 インキ ュベーションを、0.5M炭酸ナトリウムpH9,3,1M塩化ナトリウム、お よび0.1%SDSからなる250μl加えることで終了した。 ホスホジェス テラーゼ反応の生成物は、BjoRad Affi−Gel 601ホウ酸ゲル の8X33mmカラムでのクロマトグラフィーにより、サイクリック・ヌクレオ チドから分離された。 カラムは0.25M重炭酸塩ナトリウム(pH9,3) と0.5!ii塩化ナトリウムで平衡化された。 反応はカラムにも適用された 。 検査用試験管は、0、25M重炭酸塩ナトリウム(pH9,3)と0.5M 塩化ナトリウムですすぎ、このすすぎはカラムについても行った。 ホウ酸カラ ムは、3.75m1の0.25M重炭酸塩ナトリウム(pH9,3)と0.5M 塩化ナトリウムで三直洗浄され、さらに、0.5mlの50 mM酢酸ナトリウ ム(pH4,5)によって洗浄された。 生成物は、0.1Mソルビトールを含 む2.5mlの50mM酢酸ナトリウムによって溶出され、シンチレーション瓶 に回収された。 溶出物は、4.5mlのBe01iteシンチレーシ3ン・カ クテルと共に混合され、液体シンチレーション分光測定法によって放射能が測定 された。 pADNSあるいはMDANSのいずれにおいても、ウシ全読取枠を発現するよ う、また、先端削除したタンパク質を発現するよう設計された双方の構築物は、 細胞抽出物の生化学的ホスホジェステラーゼ分析により決定した活性タンパク質 を発現した。 pcam81met140を宿すl0DABの抽出物は、計測可能なホスホジェ ステラーゼ活性(」、part Dの第二方法を参照)を呈する一方で、pca mH$1−6N−7を宿すl0DAB細胞の抽出物は検出可能な活性が欠如して いた。 C,、pGS九PDE e’ffl −−ドt (lqp進−9≧’;@1曝」 ;隈を6 #m*BM1mM’fkウシcGs−PDEを1−ドする4、2kb  DNA断片を含むプラスミド+13CGS−5を、プラスミドの挿入に適した 制限部位で、cDNAの最初の147塩基を置き換えることにより、pADNS およびpADANSへのクローニングに適用した。 オリゴヌクレオチドBSI は、Hjn−dl11部位をコードする配列を有し、cDNA挿入体の148− 165の位置にアニールした。BS3と称するオリゴヌクレオチド を、唯一・のN5i1部位の3゛の835−855の位置にアニールした。 11−m伏Ill とS↓1での消化を終えて得られたI’CR−生成断片は、 ]−jir可]11 と5旦で消化されたp3CGS−5に繋がれ、これにより 、’7 :)cDNAの最初の5°端を取り代えた。 この結合から得られたプ ラスミドは、修飾cDNA挿入体を遊離するためにHindlll とNotl で消化された。 挿入体は、そのHindlll とNot1部位にて、pAD NSおよびpADANSへクローニングされた。 そして、これらプラスミドは 、酢酸リチウム法によって、酵母株10DABに形質転換され、形質転換された 細胞を生長させ、上記Aにあるように昇温下に曝した。 ウシeGs−PDEを 発現するよう構築したプラスミドで形質転換した酵母は、熱衝撃耐性であった。 同様の方法にて、プラスミドpHcgs6n(実施例■)を、酢酸リチウム法に よって、酵母宿主株YKS45に形質転換した。 プレートを最初、二B間、3 0℃にて培養し、温めたプレートを56℃にて、10.20.30および45分 間維持した以外は、上記したようにして、熱シヨツク分析を行つた。 ヒトeG s−PDEの全長を発現するように設計したプラスミドで形質転換した酵母は、 熱衝撃耐性であった。 D、Q男盈ヌ(FソJVシ司黛梶 ウシeGs−PDEの発現も、酵母からの細胞を含まない抽出物を調製し、抽出 物の生化学的ホスホジェステラーゼ活性を測定することによって評価した。 こ の目的のために、形質転換した10DAB酵母細胞の50m1培養液を、液体S C−ロイシン中にて約1000万細胞/mlの密度になるまで生育させた。 s herman etal、、Methods ’n Yeast Geneti cs、 Co1d Spring Harbor Lab。 ratory、 Co1d Spring Harbor、 New York  (1986)。 細胞は遠心分離して回収され、細胞ペレットは一度洗浄され 、そして最終細胞ペレットは冷凍された。 抽出物を調製すっために、冷凍細胞 は氷上で解凍され、PBS 1mlと同量のガラス・ビーズと共に混合し、酵母 細胞を粉砕するためこれらを撹拌し、そして、不溶性の残骸を除去するために遠 心分離した。 そして、上滑が、−に記Bにあるように、ホスポジエステラーゼ 活性について分析された。 pADNSあるいはpADANSのいずれかにある 構築物は、細胞抽出物の生化学的ホスホジェステラーゼ活性によって決定された 活性タンパク質を発現した。 プラスミドpHegs6nで形質転換したYKS45を、1−2X10’ !胞 /[111になるまでSC−ロイシン培地にて生育した。 細胞を遠心分離によ り採取し、細胞ペレットを凍結した。 典型的には101G細胞を含んだ凍結細 胞ペレッt−i才、全体積が2.5mlになるように、溶解緩衝液(25mM  TriS−MCI pH8,,5mM EDTA、5mMEGTA、1mM o −フェナントロリン、0.5m!J AEBSF 、 0.01mg/mLペプ スタチン、0.01mg/m1. I:lイペブヂン、0.01mg/mLアプ ロチニン、、0.1%2−メルカプトエタノール)と共に混合した。 混合物を 氷上で解凍し、そして、等量のガラス・ビーズを添加した。 細胞を、氷上での、攪拌および冷却のサイクルによって粉砕し、そして、5ml の全溶解緩衝液が加えられるように、粉砕した細胞ど追加の溶解緩衝液が混合さ れた。 懸濁液は、12.000 X gで、5分間、遠心分離された。 」− 清は除去された後、直ちに分析に供されるか、あるいはドライアイス・エタノー ル・バスにて急速冷凍されてから、−70℃にて保存された。 ホスホジェステラーゼ活性は、5mM塩化マグネシウムおよび放射性物質を含ん だ(40mM Tris−HCI pH8,0,1mM EGTA、0゜1mg /m1. BSA)にて、細胞抽出物の部分試料を混合し、30分間まで30″ Cでインキュベートし、そして、反応を停止緩衝液(0,1Mエタノールアミン I)H9,Olo、5M硫酸アンモニウム、10mM EDTA、最終濃度0. 05χの5DS)で終了することにより分析した。 生成物は、BioRad  Affi−Gel 601でのクロマトグラフィーニより、サイクリ、り・ヌク レオチド物質から分離された。 試料を、カラム緩衝液(0,5輩硫酸アンモニ ウムを含んだO,1Mエタノールアミン)にて平衡化したAffi−Gel 6 01の約0.251111を含んだカラムに適用した。 カラムを、カラム緩衝 液の0.5mlで5回洗浄した。 生成物は、0.25M酢酸の4つの0.5m 1部分試料で溶出され、5mlのEcolume (ICN Bioehemi cals)と共に混合した。 放射性生成物は、シンチレーション計測法により測定された。 ヒトcGs−PDEを発現する酵母からの抽出物は、サイクリックAMPおよび サイクリックGMI’双方を、このイソ酵素においても予期されたように加水分 解した。 寒鑑叢■ CaM−PDEおよびcGS−PDEポリヌクレオチド 含a−鬼A、ノザン・ プロット分析 上記実施例工、■、および■にて単離したDNA5を、様々な組織から単離した 全選択RNA5あるいはポリA−選択RNA5をスクリーニングするためのプロ ーブを作成するために使用し、その結果を下記にまとめた。 1、EeoRIおよび冗で消化したプラスミドp3CGS−5から単離した約3 kbの放射ラベルしたcDNA断片を用いて、ウシ副腎皮質、副腎髄質、心臓、 大動脈、大脳皮質、脳幹神経節、海鳥、大脳、骨髄、/を髄、肝臓、腎臓皮質、 腎臓髄質、腎臓乳頭、気管、肺、牌臓およびT−リンパ球組織の種類から調製し たmRNAにてノザン分析を行った。 単一の4.5kb mRNAは、はとん どの組織にて検出された。 cGs−PDE mRNAの大きさは、大脳皮質、 脳幹神経節および海馬から単離したmRNAより若干大きい(約4、6kb)よ うに思われた。 副腎皮質においては、cGs−PDE m)iNAが豊富であ った。 副腎髄質および心臓においても、cGs−PDEmRNAは豊富であっ た。 脳と腎臓の解剖学的に異なる領域において、特異的に発現しているようで あった。 五つの異なる脳の領域から単離したRNA5の内、eGs−PDEm RNAは、海馬、大脳皮質および脳幹神経節において最も豊富であった。 cG s−PDE転写は、大脳あるいは骨髄およびを髄RNA5においては、はとんど 検出されなかった。 eGs−PDE [DRNAは、腎臓のすべての領域にて 検出されたが、外皮赤色骨髄および乳頭において豊富に認められた。 cGs− FDI!mRNAは、肝臓、気管、肺、牌臓およびT−リンパ球RNAにおいて も検出された。 大動脈から単離したRNAでは、cGs−PDE mRNAは 、はとんど検出されなかった。 2、放射ラベルしたDNAプローブが、プラスミドpCAM−40のcDNAD NAG11性した1、6kb EcoR1制限エンドヌクレアーゼ断片にまで及 ぶ任意に六つのプライム化をした断片から調製した。 ノザン分析にて、DNA プローブは、脳の3,8および4.4kb mRNA5とハイブリダイズし、分 析した他の組織のほとんどには、大脳皮質、脳幹神経節、海鳥、大脳、骨髄およ びを髄、心臓、大動脈、腎臓髄質、腎臓乳頭および肺が含まれる。 肝臓、腎臓 皮質および気管からの3.8kb [llRNAとプローブとのハイブリダイゼ ーションでは、比較的長い放射能写真的露光の後にのみ検出された。 3、中枢神経系のいくつかの組織からのmRNAのノザン・プロット分析を、プ ローブとして(保存されたPDE触媒領域のほとんどを含んだ)サブクローニン グされ、ラベルされたp12.3aDNA断片を用いて行った。 最も強いハイ ブリダイゼーションシグナルが、脳幹神経節からのmRNAにおいて認められ、 また、強力なシグナルが、腎臓乳頭および副腎髄質を含む他の組織からのmRN Aにおいても認められた。 B、 RNA5e保覆 1、三つのアンチセンス・リボプローブが構築された。 すなわち、p3cGs −5の触媒領域コード部分(配列番号:38の塩基2393から2666に対応 する273塩基対)に対応するプローブI[:cGMP結合領域をコードする( 塩基959から1426に対応する468塩基対)に対応するプローブ■:およ び、アミノ末端コード領域(塩基1から457に対応する457塩基対)の部分 およびその5゛端に対応するプローブIである。 試験した組織のすべてから抽出した全RNA5は、プローブ■および■を完全に 保護した。 副腎皮質、副腎髄質および肝臓から単離したRNA5で、リボプロ ーブIのほとんど完全な保護(457塩基)も観察された。 しかしながら、大 脳皮質、脳幹神経節および海鳥から単離したRNAは、リボプローブIの約26 8=塩基断片しか保護されていなかった。 脳RNA試料にて観察された大きな 断片と同一の大きさの部分的に保護されたブローブエの比較的少量が、肝臓を除 く試験した組織のすべてから単離したRNA5においても検出された。 興味深 いことに、心臓RNAは、相補的に保護された(457塩基の)リボプローブと 、脳RNAのような、268−塩基断片を産生じた。 しかしながら、他のいか なる組織から単離したRNA5を用いて観察された保護パターンと異なり、部分 的に保護されたりボブローブI断片は、より豊富であるように思われた。 試験 結果は、二つの異なるcGs−PDERNA種が発現されていることを示唆して いる。 2、 CaM−PDHの触媒領域もしくはCaM−結合領域のいずれかの部分に 対応する放射性ラベルしたアンチセンス・リボプローブが、pCAM−40cD NAの制限エンドヌクレアーゼ開裂断片(顕/5stlおよびTthllll/ HincII)から構築された。 五つの異なる脳領域(大脳皮質、脳幹神経節 、海馬、大脳、骨髄7.′をN)から1ift、た全RNA5は、CaM−結合 および触媒領域の双方をコードするアンチセンス・リボプローブを完全に保護し た。 心臓、大動脈、肺、気管および腎臓からの全RNA5は、触媒領域に対応 するりボブローブを完全に保護するが、CaM−結合領域リボプローブの約15 0塩基しか保護せず、61kD CaM−PDEに構造的に関連するイソ形態が 、これら組織にて発現されていることを示唆している。 3、アンチセンス・リボプローブは、プラスミドp12.3aを基にして作成さ れ、配列番号:26の塩基−1から363および883から1278に対応する 。 前者のプローブは、推定CaM−結合領域を通じて、5゛非コ一ド配列の1 13塩基と開始メチオニン・コドン含んでいるものの、後者は触媒領域をコード した。 分析したすべての組織の中で、脳幹神経節からのRNAが最も強力に各 プローブを保護した。 アミノ末端を意味するプローブに相当する大きさの強力 なシグナルが、大脳皮質、小脳、脳幹神経節、海馬および測腎髄質RNAによる 保護において観察された。 たとえ、組織が保存領域プローブのノザン分析およ びRNA5e保護のシグナルを示していても、腎臓乳頭あるいは精巣RNAによ るプローブでは何の保護も付与されず、構造的に関連のあるイソ酵素がこの組織 にて発現されていることを示唆している。 本願発明に関して、特定の方法と組成物に関して記述してきたが、当業者が本発 明を考慮すれば、様々な改良と変更を想到されるものと思われる。 すなわち、 添付した請求の範囲の記載にあるような限定のみが、付加されるべきである。  従って、請求した本願発明の範嗜にある同等の変更をすべて包含した、添付した 請求の範囲を希求する次第である。 配 列 表 (1)□ (i)出願人:ビーボ、ジコセフ エーソネン、ウィリアム ケイ (iD発明の名称;哺乳類ホスホジェステラーゼをコードするDNAG11)配 列の数:58 (iv)連絡先住所: ■名宛人:マーシャル、オドウール、ジェースティン、マレ−アンドビックネル (B)番地;トウー ファースト ナショナル プラザ、加すウス クラークス トリート (C)都市名ニジカゴ (D)州名:イリノイ (E) 13i!=S 二m (P)郵便番号:60803 (v)コンピューター読取形式: (A)媒体:フロッピー ディスク (B)コンピューター:Itl!PC互換機(C)操作シスチムニに一美シ冨− DOS(D)ソフトウェア:パテント イン リリースj1.0.バージョン# 1.25(vi)現出願データ: (A)出願番号: (B)出願B; (C)穆二 (vii)先行出願データ: (幻出願番号: t’s 07/688.356(B)出願E:04−4月−1 991 (viii)プ円IヒL/弁阻」まけ宵啼饅二(A)氏名;ノーランド、グレタ  イー(B)登録番号:35,302 (C)参照/事件番号:2786a/30822(ix)通信情報; (刀電話: (312) 34B−ゴ団(B)7yツク7、 : (312)  984−9740(C)テレックス;ゐ−3856 (2)配列番号;1の情報 (i)配列特徴: (4)配列の長さ:20塩基対 (B)配列の型、核酸 (C)鎖の数ニー重鎖 (D)トポロジー、直鎖状 (iD配列の種類二呪 (xD配列・配列番号=1 AARATGGGNA TGA/冑M提函(2)配列番号72の情報 (i)配列特徴: (A)配列の長さ二8アミノ酸 (B)配列の型二アミノ酸 (D)トポロジー二直鎖状 (i i)配列の種類;ペプチド (xD配列:配列番号;2 Lys I!et Gly l!et I!et Lys Lys Lys(2 )配列番号=3の情報 (i)配列特徴: (A)配列の長さ二久411吋 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数ニー重鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA (xi)配列:配列番号:3 ACRrTcAnT CYrff CAT 23(2)配列番号;4の情報 (i)配列特徴: (A)配列の長さ:8アミノ酸 (B)配列の型二アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (i i)配列の種類:ペプチド 20 (xi)配列;11号:4 Met Gin Glu Glu Glu Met Asn Va1(2) 1 1ii!1;Fljl;1:;シ@−二5cν!(D厩りグ月啼唱款二 (A)配列の長さ: 2291塩基対 (B)配列の型;核酸 (C)j!!の数、−重鎖 (D)トポロジー;直鎖状 (iD配列の種類:eD!1iA (ix)配列の特徴; (A)特徴を表す記号: CD5 (B)存在位It: 1(X)、、1689(xi)配列:配列番号:5 GGCTr、AGMA CTTAGGMT TCTGATGTGCTTCGGT GCAT GGAACAGTM CAGATCAGCT 6O αブロゴtccu cAGCTwc cσ丁CAGTCGG AGTATCAT CATCGCC丁(’r ACT GCT 114Met Guy Ser T hr AlaACA GAA ACT CAA CAA CTG CAA MC XゴMゴη了MG TAT (7CATr GGA 162Thr Glu T hr Glu Glu Leu Glu Asn Thr Thr Phe L ys Tyr Liu Ile Glylo 15 20 GAA CAG ACT CAA AAA ATG TGGυA印CσG抛印A  ATAσA駆AπC210Glu Gin Thr Glu Lys Met  Trp Gln 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As■ 610 6]5 に0625 1T:A MG MA ACA CAT GAT TCA CAA GAG T 航続W胃ITCATAGACA 2097Ser Lys Lys Thr A sp Asp Ser Gin Glu彊損 (2)酉己ダ’III号二51σバ囁陣従(i)配列特徴: (A)配列の長さ:634アミノ酸 (B)配列の型7アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ji)九1ゼ11類;タンパク賀 (xj)配列:配列番号=51 !Tht Giu Ser Pro Thr Lys Glu ile Glu  Glu Phe Glu Ser Asn Ser Le■ ] 5 10 15 Lys Tyr Lll!11 Gln Pro Glu Gin Ile G lu Lys lie Trp 1.eu Arg I、e普@Arg Guy 1.eu Arg Lys Tyr Lys Lys Thr Ser  Gln 、Arg Leu Arg Ser Leu V≠P Lys Gln Leu Glu Arg Gly Glu 、AIa Ser  VaI Val Asp Leu Lys Lys As■ Leu Giu Tyr Ala Aha Thr Val Leu Glu  Ser Vaどyr lie Asp Gln ThrArg Arg Leu  Leu Asp Thr GIu ASTI G11l Leu Ser A sp Ile Gin Ser A唐■ Ala Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp  Leu Ala Ser Thr Plte Thr kgloo 105 1 10 Gin Met Gly Met Met Leu Arg Arg Ser  Asp Glu Lys Pro Arg Phe LysSer Ile V al Hjs Ala Val Gin Ala Gly Ile Phe V al Glu Arg Met TyrArg Arg Thr Ser As n Met Val Gly Leu Ser Tyr Pro Pro Al a Val 1ieGlu Ala Leu Lys Asp Val Asp  Lys Trp Ser Phe Asp Val Phe Ser Leu Asn Glu Ala Ser Gly Asp 1(js Ala Leu  Lys Phe lle Phe Tyr Glu Le■ Leu Thr Arg Tyr Asp Leu lie Ser Arg  Phe Lys lie Pro Ile Ser AlaLeu Val S er Phe Val Glu Ala Leu Glu Val Gly T yr Ser Lys Hjs LysAsn Pro Tyr His 、A sn Leu Met Is Ala Ala Asp Val Thr Gl n Thr ValZ25 230 235 240 His Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr Guy Val  Aha Asn Trp Lau Thr Glu LeuGlu lie P he Ala lie Ile Phe Ser Ala Ala lie H is Asp Tyr G11l Hi■ 260 265 Z70 Thr Gly Thr Thr Asn Asn Pt1e Hjs lie  Gin Thr Arg Ser Asp Pro Al■ 1ie Leu Tyr Asn Asp Arg Ser Val Leu  Glu Asn His His l1=u Ser Al■ Ala Tyr Arg Leu IAu Gin Asp Asp Glu  Glu ’jet Asn lie Leu Ile As■ Leu Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe  Arg Thr Leu Val IIe Glu MetVal Met A la Thr Asp Met Ser Cys Is Phe Gln Gl n Ile Lys 、Ala &tLys Thr Ala Leu Gin  G]、n Pro Glu Ala Ile Glu Lys Pro Ly s Ala Le■ Ser Leu Met Leu )fjs Thr Ala Asp Ile  Ser His Pro Ala Lys Ala Tr■ Asp Leu His His 、Arg Trp Thr Met Ser  Leu Leu Glu Glu Phe Phe Ar■ 3B5 390 395 400 Gln Gly Asp Arg Glu Ala Glu Leu Gly  Leu Pro Phe Ser Pro Leu Cys405 4]0 4 15 Asp Arg Lys Ser Thr Met Val Ala Gin  Ser Gln Val Gly Phe lie AspPhe lie V al Glu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr A sp Met Thr Glu Lysl1e Val Ser Pro Le u Ile Asp Glu Thr Ser Gin Thr Gly Gl y Thr GlyGln Arg Arg Ser Ser Leu Asn  Ser lie Ser Ser Ser Asp Ala Lys Arg 4お 470 475 480 Ser Gly Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu  Gly Ser Ala Pro lie Asn AsnSer val l ie Ser Val Asp Tyr Lys Ser Phe Lys A la Thr Trp Thr GluVal Val His lie As n Arg Glu Arg Trp Arg Ala Lys Val Pr o Lys Glu(ilu Lys Ala Lys Lys Glu Al a Glu Glu Lys Ala Arg Leu Ala Ala Gl ■ Glu Gln Gln Lys Glu Met Glu Ala Lys  Ser Gln Ala Glu Glu Gly AlaSer Gly L ys Ala Glu Lys Lys Thr Ser Gly Glu T hr Lys Asn Gin Va1Asn Gay Thr Arg Al a Asn Lys Ser Asp Asn Pro Arg Gly Ly s Asn 5erLys Ala Glu Lys Ser Ser Gly  Glu Gin Gln Gln Asn Gly Asp Phe Lys Asp Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys  Asp His Ser fisn lie Gly As■ Asp Ser Lys Lys Thr Asp Asp Ser Gin  Glu軸5 昭0 (2)配列番号:52の情報 (i)配列特徴: (M配列の長さ:20″r1塩基対 (B)配列の型;核酸 (C)鎖の数ニー水銀 (D)トポロジー:直鎖状 (i i’)配列の種類: eDNA (ix)配列の特徴: ■特徴を表す記号: CD5 (B)存在位置; 2..1693 (xi)配列;配列番号:52 A CGG ACA TCA MCATG GTT GGA CTG AGCT AT CCA CCA CCT σTTATr 46Arg Thr Ser  Asn 勤t Val Gly Leu Ser Tyr Pro Pro A la Val 1ieGAG GCA TrA MG GAT (ITG GA CMG ′rrJGπ℃ηゴCACGTCm TCCCTC94Glu Ala  Leu Lys Asp Val Asp Lys Trp Ser Phe  Asp Val Phe Ser LeuMT GAG GCCACT GG G GAT CAT GCA 口G AAA Tl了薊ゴTTCTAT CAA  口A 142Asn Glu Ala Ser Gly Asp Is Al a Leu Lys Phe Ile Phe Tyr Glu LeuCTC ACA CGT TAT CAT [’rG ATCAGCCGT TrCMG  ATCCCCATr TIT GCA 190Leu Thr Arg Ty r Asp Leu lie Ser Arg Phe Lys lle Pr o lie Ser AlaCTT GTCTCA m GTG CAG GC CCTG CAA GTG GGA TACAGCMG CACAAA 238 Leu Val Ser Phe Val Glu Aha Leu Glu  Val Gly Tyr Ser Lys 1(is Ly■ 65 To 75 MTCC丁丁ACCA丁MCT]’A 、ATG CACGCT GCCGAT  GTT 、ACA CAG 、ACA GTG 286Asn Pro Ty r His Asn Leu 動t ](lieAla Ala Asp Va l Thr Gin Thr Va1CAT TACCTCCTCTAT MG  ACA GGA GTG GCG MCTGG CTG ACG CAG C TG 334)(is Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr G ly Val Aha Asn Trp Leu Thr Glu Le■ loo 105 110 CAG ATCTTr GCT ATA ATC’ITC’ICA GCT G CCATCCAT GACTACCAG CAT 382Glu lie Ph e Ala IIe lie Phe Ser Aha Aja lie Hi s Asp Tyr Glu HisACCGGA、 ACCACCMCMT  TTCCACATr CAG ACT CGG TCT GAT CCA GC T 430Thr Gly Thr Thr Asn ASn Phe His  lle Gin Thr Arg Ser Asp Pro AlaATr  CTG TAT AAT CAC、AGA T(ゴ(7ACTG GAG MT  CACCAT TTA AGT GCA 4781ie Leu Tyr A sn Asp Arg Ser Val Leu Glu Asn Hjs ) Us Leu Ser AlaGCT TAT CGCCTT C7rG CA A CAT [、NCGAG GAA ATCAAT ATT TrG ATT  AAC5Q6 Ala Tyr Arg Leu Leu Gln Asp Asp Glu  Glu Met Asn lie Leu lie fis■ CTCT:A MG CAT GACTGG AGG GAG m CGA A CCTTG GTA ATT GM ATG 574Leu Ser Lys  Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg Thr Leu  Val Ile Glu MetGT[: ATG GCC、ACA GAT  ATG TCT TIT CACTTCCAA CAA ATCMA GCA  、ATG 6Q2 Val !1let Ala Thr Asp 5let Ser Cys H is Phe Gin Gln Ile Lys Ala let MG ACT GCT (7G CAG CAG CCA CAA GCCAT T GAA Me CCA MA GCCTTA 670Lys k Ala  IAu Gln Gin Pro Glu Ala lie Glu Lys  Pro Lys Ala Leuム0 215 220 TCCCTT ATG CTG CA丁ACA GCA GAT ATr AG CCAT CCA GCA MA GCA TGG 718Ser Leu l !et Leu His Thr Ala Asp lie Ser His  Pro Ala 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Ser Ala Le■ Val Ser Pt1e Val Glu 、Ala Izu Glu Va l Gly Tyr Ser Lys His Lys A唐■ Pro Tyr His Asn Leu 1Aet His Ala 、Al a Asp Val Thr Gin Thr Val H■ Tyr Leu Leu Tyr Lys Thr Gly Val Ala  Asn Trp Leu Thr Glu Leu Gluloo 105 1 10 1ie Phe Ala Ile lie Phe Ser Ala Ala  Ile Is Asp Tyr Glu Hjs ThrGly Thr Th r Asn Asn Phe Has Ile Gln Thr Arg Se r Asp Pro Ala 1ieLeu Tyr Asn Asp Arg  Ser Val Leu Glu fisn Hjs His Leu Se r Ala Al■ Tyr Arg Leu Leu Gin Asp Asp Glu GIu  Met +Asn Ile Leu Ile Asn Le■ Ser Lys Asp Asp Trp Arg Glu Phe Arg  Thr Leu Val Ile Glu Met Va1Met Ala T hr Asp Met Ser Cys His Phe Gin Gln l le Lys Ala Met LysThr Ala Leu Gln Gi n Pro Glu Ala lie Glu Lys Pro Lys Al a Leu 5erLeu l!et Leu )Is Thr Ala As p lie Ser )Is Pro Ala Lys Ala Trp As ■ Leu His His 、Arg Trp Thr &t Ser Leu  Leu Glu Glu Phe Phe Arg G1nGly Asp A rg Glu 、Ala Glu Leu Gly Leu Pro Phe  Ser Pro Leu Cys As■ Arg Lys Ser Thr Met Val AIa Gln Ser  Gin Val Guy Phe IIe Asp Phe11e Val G lu Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Asp M et Thr Glu Lys 1ieVal Ser Pro Leu Il e Asp Glu Thr Ser Gin Thr Gly Gly Th r Gly G1nArg Arg Ser Ser Leu Asn Ser  Ile Ser Ser Ser Asp Ala Lys Arg 5er 325 羽0335 Gly Val Lys Thr Ser GIy Ser Glu Gly  Ser Ala Pro lie Asn Asn 5erVal lie S er Val Asp 、Tyr Lys Ser Phe Lys Ala  Thr Trp Thr Glu VaP Val His Ile Asn Arg Glu Arg Trp Arg  Ala Lys Val Pro Lys Glu GluLys Ala L ys Lys Glu Ala Glu Glu Lys Ala Arg L eu Ala Ala Glu GluGin Gin Lys Glu Me t Glu Ala Lys Ser Gln Ala Glu Glu Gl y Ala 5erGly Lys Ala Glu Lys Lys Thr  Ser Gly Glu Thr Lys Asn Gln Val Asn Gly Thr Arg Ala Asn Lys Ser Asp Asn  Pro Arg Gly Lys Asn Ser LysAha Glu L ys Ser Ser Gly Glu Gin Gln Gln Asn G ly Asp Phe Lys Aspa 455 460 Gly Lys Asn Lys Thr Asp Lys Lys Asp  Hjs Ser Asn Ile Gly Asn 、As■ Ser Lys Lys Thr Asp Gly Thr Lys Gln  Arg Ser Hjs Gly Ser Pro AlaPro Ser T hr Ser Ser Thr Cys Arg Leu Thr Leu P ro Val lie Lys Pr。 Pro Leu Arg His Phe Lys Arg Pro Ala  Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr AlaPro Ser V al Ser Lys Lys Thr Asp Glu Is Pro Al a Arg Tyr Lys 勤tLeu Asp Gin Arg lie  Lys Met Lys Lys lie Gin Asn Ile Ser  市s AsnTrp Asn Arg Lys (2)配列番号、54の情報 (i)配列特徴; (M配列の長さ=3川1に吋 (B)ffic瓢W 二m (C)鎖の数ニー水銀 (D)トポロジー:直鎖状 (j i)配列の種類: DNA (xD配列;配列番号:54 TACGMGCTr TCATGGGGTCTA(lTGcT、Ac 29(2 ) W;!iIJ#@・二sm (i)配列特徴: (M配列の長さ;31埴l(吋 CB)配列の型:核酸 (C)鎖の数ニー水銀 (D)トポロジー:直鎖状 (i i)配列の種類: DIIIA (xi)配列:配列番号:55 TACGMGCTr TGATGGTrGG CTrGGCATAT C31( 2)配列番号:56の情報 (i)配列特徴: θ0配列の長さ:1鋲IL吋 (B)fflcシW 二! (C)鎖の数;−重鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (xj)配列:配列番号=56 AITACCCCTCATAMG 16(2)配列番号=57の情報 (i)配列特徴: (A)配列の長さ:3川また吋 (B)配列の型:核酸 (C’l鎖の数ニー水銀 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA (xD配列;配列番号:57 TAC口鴇GCTT TGA冗部α:G ACAG工πC四(2)配列番号:5 8の情報 (i)配列特徴: (A)配列の長さ:21増1(吋 (B)配列の型、核酸 (C)鎖の数ニー水銀 (D)トポロジー;直鎖状 (ji)配列の種類: DNA (xD配列:配列番号:58 GGTiCTGT TGCAGATATT G 2]要 約 書 本願発明は、哺乳類Ca”″7/カルモジュリン刺激性ホスホジェステラーゼ( CaM−PDEs)およびサイクリックGMP刺激性ホスホジェステラーゼ(c Gs−PDEs)をコードする新規の精製、単離したヌクレオチド配列に関する 。 さらに、前記ヌクレオチド配列の対応組換発現物質、それに特異的反応性を 示す免疫学的試薬、および、そのような発現物質の酵素活性を修飾する化合物を 同定するだめの方法も提供される。 国際調査報告

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激性サイクリックヌクレオチドホスホジ ェステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から必須的に構成 される、精製および単離したポリヌクレオチド配列。
  2. 2.哺乳類サイクリックGMP刺激性サイクリックヌクレオチドホスホジエステ ラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から必須的に構成される 、精製および単離したポリヌクレオチド配列。
  3. 3.ヒトホスホジエステラーゼポリペプチドをコードする請求の範囲第1項ある いは第2項に記載のポリヌクレオチド配列。
  4. 4.ベクターpGSPDE6.1(A.T.C.C.68583)、pGSPD E7.1(A.T.C.C.68585)、pGSPDE9.2(A.t.C. C.68584)、λCaM H6a(A.T.C.C.75000)、pca mH3EF(A.T.C.C.68964)、pcam61−6N−7(A.T .C.C.68963)、pcamHella(A.t.C.C.68965) 、およびpHcgs6n(A.T.C.C.68962)に存在するヒトDNA 挿入体からなるグループから選択される請求の範囲第3項に記載のポリヌクレオ チド配列。
  5. 5.ウシホスホジエステラーゼポリペプチドをコードする請求の範囲第1項ある いは第2項に記載のポリヌクレオチド配列。
  6. 6.ウシ脳61kDaCa2+/カルモジュリンホスホジエステラーゼポリペプ チドをコードする請求の範囲第5項に記載のポリヌクレオチド配列。
  7. 7.ウシ脳63kaCa2+/カルモジュリンホスホジエステラーゼポリペプチ ドをコードする請求の範囲第5項に記載のポリヌクレオチド配列。
  8. 8.ウシ心臓59kDaCa2+/カルモジュリンホスホジエステラーゼポリペ プチドをコードする請求の範囲第5項に記載のポリヌクレオチド配列。
  9. 9.配列番号:16の配列である請求の範囲第8項に記載のDNA配列。
  10. 10.ベクターp12.3A(A.T.C.C.68577)、pCaM−40 (A.T.C.C.68576)、pBBCGS PDE−5(A.T.C.C .685T8)、pBBCGS PDE−7(A.T.C.C.68580)、 およびP3CGS−5(A.T.C.C.68579)に存在するウシDNA挿 入体からなるグループから選択される請求の範囲第5項に記載のDNA配列。
  11. 11.請求の範囲第1項もしくは第2項に記載のcNA配列。
  12. 12.請求の範囲第1項もしくは第2項に記載のゲノミックDNA配列。
  13. 13.請求の範囲第1項もしくは第2項に記載のDNA配列が挿入されたDNA ベクター。
  14. 14.請求の範囲第1項もしくは第2項に記載のポリヌクレオチド配列で安定し て形質転換した原核あるいは真核宿主細胞。
  15. 15.請求の範囲第14項に記載の酵母宿主細胞。
  16. 16.請求の範囲第1項もしくは第2項に記載のポリヌクレオチド配列で形質転 換した原核あるいは真核宿主細胞での発現によるポリペプチド生成物。
  17. 17.酵母宿主細胞にて発現した請求の範囲第16項に記載のポリペプチド生成 物。
  18. 18.哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激性サイクリックヌクレオチドホスホ ジエステラーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド 配列から必須的に構成される、精製および単離したポリヌクレオチド配列であっ て、(a)ベクターpCAM−40(A.T.C.C.68576)、p12. 3(A.T.C.C.68577)、およびpHcam61−6N−7(A.T .C.C.68963)にある哺乳類DNA挿入体; (b)ベクターpCAM−40(A.T.C.C.68576)、p12.3A (A.T.C.C.68577)、λCAM H6a(A.T.C.C.750 00)、pHcam61−6N−7(A.T.C.C.68963)、pcam H3EF(A.T.C.C.68964)、およびpcamHella(A.T .C.C.68965)にある哺乳類DNA挿入体から選択されたDNA配列と 、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチ ド配列:(c)配列番号:16に記載した配列と、厳密なハイブリダイゼーショ ン条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列;(d)変性コドンによ って上記(a)、(b)および(c)のポリヌクレオチド配列と同じポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチド配列; からなるグループから選択される。
  19. 19.請求の範囲第18項に記載のポリヌクレオチド配列で、形質転換あるいは 形質変換した原核あるいは真核宿主細胞での発現によるポリペプチド生成物。
  20. 20.酵母宿主細胞にて発現した、請求の範囲第19項に記載のポリペプチド生 成物。
  21. 21.哺乳類サイクリックGMP刺激性ヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵 素活性を有したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から必須的に構 成される、精製および単離したポリヌクレオチド配列であって、 (a)ベクターp3CGS−5(A.T.C.C.68579)、およびpHc gs6n(A.T.C.C.68962)にある哺乳類DNA挿入体;(b)ベ クターp3CGS−5(A.T.C.C.68579)、pHcgs6n(A. T.C.C.68962)、pGSPDE6.1(A.T.C.C.68583 )、pGSPDE7.1(A.T.C.C.68585)、pGSPDE9.2 (A.T.C.C.68584)、pBBCGSPDE−5(A.T.C.C. 68578)、およびpBBCGSPDE−7(A.T.C.C.68580) にある哺乳類DM挿入体と、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリ ダイズするポリヌクレオチド配列;および(c)変性コドンによって上記(a) および(b)のNA配列と同じポリペプチドをコードするDNA配列;からなる グループから選択される。
  22. 22.請求の範囲第21項に記載のポリヌクレオチド配列で、形質転換あるいは 形質変換した原核あるいは真核宿主細胞での発現によるポリペプチド生成物。
  23. 23.酵母宿主細胞にて発現した、請求の範囲第22項に記載のポリペプチド生 成物。
  24. 24.請求の範囲第16項、第19項あるいは第22項に記載のポリペプチド生 成物と特異的な免疫反応性を示す抗体物質。
  25. 25.哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激性サイクリックヌクレオチドホスホ ジエステラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記 方法は、(a)請求の範囲第1項あるいは第18項に記載のポリヌクレオチド配 列で、原核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換あるいは形質変換し;お よび (b)前記宿主細胞にて前記DNA配列の発現を許容する条件下の栄養培地で、 工程(a)で形成した宿主細胞を生育すること、を含む。
  26. 26.前記宿主細胞での前記ポリヌクレオチド配列の発現によるポリペプチド生 成物を単離する工程をさらに含む、請求の範囲第25項に記載の方法。
  27. 27.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第25項に記載の方法。
  28. 28.サイクリックGMP刺激性サイクリックヌクレオチドホスホジエステラー ゼの酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記方法は、 (a)請求の範囲第2項あるいは第21項に記載のポリヌクレオチド配列で、原 核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換あるいは形質変換し:および (b)前記宿主細胞にて前記DNA配列の発現を許容する条件下の栄養培地で、 工程(a)で形成した宿主細胞を生育すること、を含む。
  29. 29.前記宿主細胞での前記ポリヌクレオチド配列の発現によるポリペプチド生 成物を単離する工程をさらに含む、請求の範囲第28項に記載の方法。
  30. 30.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第28項に記載の方法。
  31. 31.哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激柱サイクリックヌクレオチドホスホ ジエステラーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であっ て、前記方法は、(a)請求の範囲第1項あるいは第18項に記載のポリヌクレ オチド配列で、前記ポリヌクレオチド配列の発現があり次第、改変感受性になる 表現型特性を有する、原核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換し; (b)宿主細胞表現型における対応する改変を伴った、前記宿主細胞にて前記ポ リヌクレオチド配列の発現を許容する条件下の栄養培地で、工程(a)で形成し た宿主細胞を生育し;(c)工程(b)で生育した宿主細胞と、分析する化学薬 品を接触させ;および (d)工程(c)にて前記化学薬品と接触した前記宿主細胞の表現型の改変にお けるいかなる修飾をも決定すること、を含む。
  32. 32.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第31項に記載の分析方 法。
  33. 33.哺乳類サイクリックGMP刺激性サイクリックヌクレオチドホスホジエス テラーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であって、前 記方法は、(a)請求の範囲第2項あるいは第21項に記載のポリヌクレオチド 配列で、前記ポリヌクレオチド配列の発現が宿主細胞にてあり次第、改変感受性 になる表現型特性を有する、原核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換し ;(b)宿主細胞表現型における対応する改変を伴った、前記宿主細胞にて前記 ポリヌクレオチド配列の発現を許容する条件下の栄養培地で、工程(a)で形成 した宿主細胞を生育し;(c)工程(b)で生育した宿主細胞と、分析する化学 薬品を接触させ;および (d)工程(c)にて前記化学薬品と接触した前記宿主細胞の表現型の改変にお けるいかなる修飾をも決定すること、を含む。
  34. 34.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第33項に記載の分析方 法。
  35. 35.哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激性サイクリックヌクレオチドホスホ ジエステラーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であっ て、前記方法は、(a)請求の範囲第1項あるいは第18項に記載のポリヌクレ オチド配列で、前記ポリヌクレオチF配列の発現があり次第、改変感受性になる 表現型特性を有する、原核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換し; (b)宿主細胞表現型における対応する改変を伴った、前記宿主細胞にて前記ポ リヌクレオチド配列の発現を許容する条件下の栄養培地で、工程(a)で形成し た宿主細胞を生育し;(c)改変した表現型を有する宿主細胞を同定し;(d) 前記宿主細胞を粉砕し; (e)前記粉砕した宿主細胞から細胞質ゾルを単離し;(f)前記細胞質ゾルと 、前記化学薬品を接触させ;および(g)前記酵素活性が改変されたかどうかを 決定すること、を含む。
  36. 36.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第35項に記載の分析方 法。
  37. 37.哺乳類サイクリックGMP刺激性サイクリックヌクレオチドホスホジエス テラーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であって、前 記方法は、(a)請求の範囲第2項あるいは第21項に記載のポリヌクレオチド 配列で、前記ポリヌクレオチド配列の発現が宿主細胞にてあり次第、改変感受性 になる表現型特性を有する、原核あるいは真核宿主細胞を、安定して形質転換し ;(b)前記宿主細胞にて前記ポリヌクレオチド配列の発現を許容する条件下の 栄養培地で、工程(a)で形成した宿主細胞を生育し; (c)改変した表現型を有する宿主細胞を同定し;(d)前記宿主細胞を粉砕し ; (e)前記粉砕した宿主細胞から細胞質ゾルを単離し;(f)前記細胞質ゾルと 、前記化学薬品を接触させ;および(g)前記酵素活性が改変されたかどうかを 決定すること、を含む。
  38. 38.前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である請求の範囲第37項に記載の分析方 法。
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