JP3354149B2 - 哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

哺乳類ホスホジエステラーゼをコードするｄｎａ

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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1991年４月19日に出願された我々の係属
中の米国特許出願No.07/688,356の一部継続出願であ
る。
発明の背景 本発明は、哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激ホスホジ
エステラーゼ（CaM−PDEs）およびサイクリック−GMP−
刺激ホスホジエステラーゼ（cGS−PDEs）をコードする
新規の精製され、単離されたヌクレオチド配列に関す
る。また、前記ヌクレオチド配列に対応する組み換え発
現物質、該物質に特異的に反応する免疫学的試薬、およ
びかような発現物質の酵素活性を調節する化合物を同定
するための方法も提供される。
サイクリック・ヌクレオチドは、生物化学的刺激物質
を多種多様の細胞性反応に介在するとして知られてい
る。サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラー
ゼ（PDEs）は、サイクリック・アデノシン・モノホスフ
ェート（cAMP）や、サイクリック・グアノシン・モノホ
スフェート（cGMP）などの3'、5'サイクリック・ヌクレ
オチドの、対応する5'−ヌクレオチド・モノホスフェー
トへの加水分解を触媒し、従って、サイクリック・ヌク
レオチドの細胞性濃度の調節において重要である。一
方、PDEsは、トランスメンブラン・シグナルもしくはカ
ルシウム・イオン（Ca2+）あるいはcGMPなどの第二メッ
センジャー物質により調節される。そして、PDEsは、細
胞外ホルモン、神経伝達物質、あるいはメッセンジャー
としてサイクリック・ヌクレオチドを用いる他のシグナ
ルからの情報の流れを調節する際の中心的役割を果た
す。
PDEsは、大きく、複雑な酵素の集団である。それら
は、ほとんどの真核生物の細胞および組織全体に分布し
ているが、普通は、微量でしか存在していない。少なく
とも五つの異なる科が、基質特異性、動力学的特性、細
胞性調節条件、大きさ、ある場合には、選択的阻害剤に
よる調整、などの特徴を基にして記されている。［Beav
o,Adv.in Second Mess.and Prot.Phosph.Res.22:1−38
（1988）］。この五つの科とは、次のものを含む。
Ｉ Ca2+/カルモジュリン−刺激 II cGMP−刺激 III cGMP−阻害 IV cAMP−特異性 Ｖ cGMP−特異性 各科には、密接に関連したPDEsの複数の形態がある。
Cyc−lic Nucleotide Phosphodiesterase:Structure,Re
gulation and Drug Action,Beavo,J.and Houslay,M.D.,
Eds.;John Wiley ＆ Sons,New York（1990）にある、Be
avo,“Multiple Phosphodiesterase Isozymes Backgrou
nd,Numenclature and Implications",pp.3−15;Wang et
al.,“Calmodulin−Stimulated Cyclic Nucleotide Ph
osphodiesterases",pp.19−59;およびManganiello et a
l.,“Cyclic GMP−Stimulated Cyclic Nucleotide Phos
phodiesterases",pp.62−85を参照のこと。
Ca2+/カルモジュリン依存性PDEs（CaM−PDEs）は、cA
MPおよび／またはcGMPの細胞内濃度の減少をもたらす細
胞内カルシウムに対する反応により特徴付けられる。cG
MP−刺激ホスホジエステラーゼ（cGS−PDEs）に特有の
特徴は、cAMP加水分解においてcGMPにより刺激される能
力である。
In vitro研究では、試験した哺乳類組織のほとんどす
べて、ならびにキイロショウジョウバエ、タマホコリカ
ビ、および睡眠病病原虫での、Ca2+/カルモジュリンに
対する増大したPDE活性が見られた。組織、細胞性およ
び亜細胞性区画でのCaM−PDEのレベルは、多様に変化す
る。ほとんどの細胞は、脳、特に、シナプス領域におい
て、最も高い組織レベルで、少量のCaM−PDE活性を含
む、Greenberg et al.,Neuropharmacol.,17:737−745
（1978）およびKincaid et al.,PNAS（USA），84:1118
−1122（1987）。ムスカリン刺激に応答するアストロチ
トーム細胞でのcAMPの減少は、CaM−PDE活性でのカルシ
ウム依存性の増大によるものと思われる。Tanner et a
l.,Mol.Pharmacol.,29:455−460（1986）。また、CaM−
PDEは、甲状腺組織におけるcAMPの重要な調節器であろ
う。Erneux et al.,Mol.Cell.Endocrinol.,43:123−134
（1985）。
初期の研究では、独特のCaM−PDEsの組織特異性イソ
酵素があることを示唆していた。CaM−PDE科のいくつか
が、ウシ心臓から単離した59kDaのイソ酵素、およびウ
シ脳から単離した61および63kDaのイソ酵素を含むこと
が記されている。LaPorte et al.,Biochemistry,18;282
0−2825（1979）;Hansen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,79:2788−2792（1982）；およびSharma et al.,J.Bi
ol.Chem.,261:14160−14166（1986）。ウシの59および6
1kDaイソ酵素の相似物が、ラットの組織からも単離され
ており、Hansen et al.,J.Biol.Chem.,261:14636−1464
5（1986）、これら二つのイソ酵素が他の哺乳動物種に
おいても発現されうることを示唆している。
分子量指標に加えて、他の証拠が、イソ酵素のCaM−P
DE科での類似性および相違性双方を支持している。例え
ば、59kDa心臓イソ酵素および61kDa脳イソ酵素CaM−PDE
sは、SDS−PAGEでの移動度およびDEAEクロマトグラフィ
ーでの溶出位置において相違し、59kDaイソ酵素は、カ
ルモジュリンよりも少なくとも10−20倍高い親和性を有
している。胎盤および形質転換した細胞において非常に
高い濃度で存在する胎児／オンコカルシウム結合タンパ
ク質であるオンコモジュリンも、61kDa酵素よりも高い
親和性で59kDa酵素と結合する。しかしながら、61kDa脳
イソ酵素および59kDa心臓イソ酵素共に、単一モノクロ
ーナル抗体によって認識される。この抗体は、PDE単独
の場合よりも100倍高い親和性で、Ca2+/CaM−PDE複合体
に結合する。Hansen et al.,1986,supra。59および61kD
aイソ酵素は、ほとんど同一の基質特性ならびに動力学
定数を有している。Krinks et al.,Adv.Cyc.Nucleotide
Prot.Phosphorylation Res.,16:31−47（1984）は、ペ
プチド解析実験を基にして、心臓59kDaタンパク質が脳6
1kDaイソ酵素のタンパク質分解形態であると示唆してい
る。
63kDaウシ脳イソ酵素は、59および61kDaイソ酵素とは
実質的に相違する。63kDa酵素は、59および61kDa酵素に
結合するモノクローナル抗体によって認識されない。Ha
nsen et al.,1986,supra。61kDaタンパク質が燐酸化さ
れるのに対し、63kDaタンパク質は、cAMP依存性タンパ
ク質キナーゼによってin vitroでは燐酸化されない。そ
して、63kDaタンパク質は、CaM−キナーゼIIによっての
みin vitroで燐酸化される。Sharma et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.（USA），82:2603−2607（1985）；およびHas
himoto et al.,J.Biol.Chem.,264:10884−10887（198
9）。しかしながら、ウシ脳からの61および63kDa CaM−
PDEイソ酵素は、同様のCaM−結合親和性を有するように
思われる。Staphylococcal V8プロテアーゼで限界タン
パク分解して調製したペプチド地図、Sharma et al.,J.
Biol.Chem.,259:9248（1984）は、61および63kDaタンパ
ク質は異なるアミノ酸配列を有することを示唆してい
る。
cGMP−刺激PDEs（cGS−PDEs）は、cGMPによるcAMP加
水分解を刺激する、非触媒作用、cGMP−特異性部位を有
するものと提案された。Stoop et al.,J.Biol.Chem.,26
4:13718（1989）。この酵素は、生理学的サイクリック
・ヌクレオチド濃度にて、cAMPの向上した加水分解によ
って、高められたcGMP濃度に応答する。そして、cGS−P
DEは、cAMP−介在反応を調節もしくは阻害するために、
cGMP濃度の上昇を許容する。本出願の発明者との共同執
筆に係る最近の、LeTrong et al.,Biochemistry,29:102
80（1990）に載せられた主要配列は、調節特性ならびに
この酵素の領域基礎構造を理解し、および異なるシグナ
ルに応答する他のPDEイソ酵素と比較するための分子骨
格が提供されている。この文献は、cGS−PDEをコードす
る2.2kbウシ副腎皮質cDNA断片のクローニングも述べて
いる。ラット褐色細胞腫細胞からの「Type II PDE」の
クローニングを報告しているThompson et al.,FASEB
J.,５（６）:A1592（Abstract No.7092）も参照のこ
と。
多数の異なるPDEsおよび細胞内シグナルにおけるその
重要な役割の発見に伴い、特異性PDEイソ酵素を選択的
に活性化あるいは阻害する薬剤の発見に努力が払われて
きた。細胞性PDE活性に影響を及ぼし、そして細胞性cAM
Pを改変する薬剤は、広範な疾患および生理学的条件を
制御するために積極的に使用できる。PDEsを阻害するこ
とによりcAMPレベルを向上するいくつかの薬品が使用さ
れているが、一般的には広範な非特異的阻害剤として機
能し、目的としない型の組織および細胞におけるcAMP活
性に関して心身に有害な副作用を呈する。従って、選択
されたPDEイソ酵素に特異的な薬剤が必要とされていた
のである。特異的PDEイソ酵素の選択的阻害剤は、強心
薬剤、抗抑制薬、抗高血圧、抗血栓症、および他の薬剤
として有用であろう。しかしながら、特定の分析用調製
物中に存在する特定のPDEイソ酵素を同定することの困
難さがために、作用薬／拮抗薬のスクリーニング研究は
複雑なものであった。さらに、すべてのPDEsが同じ基礎
反応を触媒し、すべてのPDEsの基質特異性が重複してお
り、および、すべてのPDEsが微量でしか存在しない。
PDEs間の区別化が、いくつかの異なる方法によって試
みられてきた。各新規イソ酵素を単離および研究する古
典的な酵素学的方法は、精製技術の限界ならびにイソ酵
素の完全な分離がなされたか否かを正確に評価できない
ことによって、妨げられている。第二の方法は、ひとつ
のイソ酵素に寄与し、他の酵素への寄与を最小限にす
る、イソ酵素特異的分析条件を同定するものであった。
他の方法は、免疫学的同定および科集団および／または
各イソ酵素への分離であった。疑いのない同定および特
定のイソ酵素の研究のためのこれら各方法には、時間を
費やし、ある場合には、技術的に非常に困難な確立する
必要のある多数の識別基準という問題がある。その結
果、ほとんどの研究では、一個より以上のイソ酵素を含
むであろう部分的にのみ純粋なPDE調製物を用いて行わ
れていた。さらに、ほとんどの組織における多くのPDEs
は、限定タンパク質分解に非常に感受的であり、その親
物質とは異なる動力学的、調節的、および生理学的特性
を有するであろう活性タンパク質分解生成物を容易に形
成する。
新規で、特異的PDE−調節剤の開発は、組み換え手段
による大量の組織特異性PDEsを単離する能力によって、
大きく促進される。比較的わずかなPDE遺伝子が今日ま
でクローニングされており、クローニングされたこれら
のほとんどが、ホスホジエステラーゼのcAMP特異性（cA
MP−PDEs）の科に属している。Cyclic Nucleotide Phos
phodiesterases:Structure,Regulation and Drug Actio
n,Beavo,J and Houslay,M.D.,Eds.John Wiley ＆ Sons,
New York;1990のDavis,“Molecular Genetics of the C
yclic Nucleotide Pho−sphodiesterases",pp.227−241
を参照のこと。Faure,et al.,PNAS（USA），85:8076（1
988）−D.discoideum;Sass et al.,PNAS（USA），83:93
03（1986）−S.cerevisiae;PDE2と称するPDE class IV;
Nikawa et al.,Mol.Cell.Biol.,７:3629（1987）−S.ce
revisiae;PDE1と称する;Wilson et al.,Mol.Cell.Bio
l.,８:505（1988）−S.cerevisiae;SRA5と称する;Chen
et al.,PNAS（USA），83:9313（1986）−D.melanogaste
r,dnc+と称する;Ovchinnikow et al.,FEBS,223:169（19
87）−ウシ網膜、GMP PDEと称する;Davis et al.,PNAS
（USA），86:3604（1989）−ウサギ肝臓、rat dnc−１
と称する;Colicelli et al.,PNAS（USA），86:3599（19
89）−ウサギ脳、rat DPDと称する;Swinnen et al.,PNA
S（USA）,86:5325（1989）−ラット精巣、rat PDE1、PD
E2、PDE3およびPDE4;およびLivi et al.,Mol.Cell.Bio
l.,10:2678（1990）−ヒト単球、hPDE1と称するも参照
のこと。LeTrong et al.,supraおよびThompson et al.,
supraも参照のこと。
相補性スクリーニングが、PDEsあるタイプをコードす
る哺乳類cDNAクローンを検出し、単離するために用いら
れてきた。Calicelli et al.,PNAS（USA），86:3599（1
989）には、S.cerevisiae発現ベクターでのラット脳cDN
Aライブラリーの構築、該ライブラリーからの酵母にお
いてRAS2va119の表現型効果を抑制するよう機能する能
力がある遺伝子の単離、ヒトHRAS遺伝子の発癌変異体に
対するRAS2遺伝子類似体の変異体を報告している。クロ
ーニングされ、DPD（ラットdunce様ホスホジエステラー
ゼ）と称されたcDNAは、酵母株TK161−R2V（A.T.C.C.74
050）にある活性化RAS2Va119と関連する生長調節の欠
損、ならびに酵母PDE遺伝子座（pde-1、pde-2）双方に
て欠陥のある酵母変異株10DAB（A.T.C.C.74049）の生長
調節表現型の類似体欠陥を相補あるいは「救済」する能
力を有している。高親和性cAMP特異性ホスホジエステラ
ーゼをコードする遺伝子のアミノ酸配列は、Drosophila
melanogasterのdunce座によってコードされるcAMP特異
性ホスホジエステラーゼと高い相同性を示す。
本出願の親出願である米国特許出願No.07/688,356の
出願日まで、哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激またはcGM
P刺激PDEs（PDE科ＩおよびII）のいずれもコードするDN
A配列のクローニングおよび発現は報告されておらず、
従って、当該分野においては、引き続き、これらPDEsの
完全なヌクレオチド配列情報が要望されているのであ
る。
本発明の簡単な概要 本発明は、哺乳類種（例えば、ヒトおよびウシ）Ca2+
/カルモジュリン刺激サイクリック・ヌクレオチド・ホ
スホジエステラーゼおよびcGMP刺激サイクリック・ヌク
レオチド・ホスホジエステラーゼ・ポリペプチドの発現
をコードする新規に精製され、単離したポリヌクレオチ
ド配列（例えば、センスおよびアンチセンス鎖を含むDN
AおよびRNA）を提供する。本発明によって提供されたゲ
ノミックおよびcDNA配列は、メッセンジャーRNAへのin
vivoおよびin vitroでの転写を許容する、プロモータ
ー、オペレーター、レギュレーター、ターミネーターな
どの同種あるいは異種発現調節DNA配列、そして、機能
性ホスホジエステラーゼおよび関連ポリペプチドを大量
に調製するためのmRNAsの転写に関連があるものと思わ
れる。
本発明によって特に得られるものは、米国特許商標庁
およびブダペスト条約の規定に従って、1991年４月11お
よび15日ならびに1992年４月14日の、American Type Cu
lture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Ma
ryland 20852への寄託の対象となった細菌プラスミドお
よびウィルス・ベクターでの哺乳類DNA挿入体として存
在する、ホスホジエステラーゼおよびその断片をコード
する哺乳類DNA配列である。本発明に関連して寄託したD
NAsには、下記のものを含む。
1. 61kDa CaM−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68576）中のプラス
ミドpCAM−40; 2. 63kDa CaM−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68577）中のプラス
ミドp12.3A; 3. 61kDa CaM−PDEイソ酵素を断片的にコードするヒト
海馬cDNA挿入体を含むバクテリオファージλCaM H6a
（A.T.C.C.寄託No.75000）； 4. 61kDa CaM−PDEイソ酵素をコードする混成ヒトcDNA
挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68963）中のプラ
スミドpHcam61−6N−7; 5. 61kDa CaM−PDEに相同な新規のPDEをコードするヒト
海馬cDNA挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68964）
中のプラスミドpcamH3EF; 6. 61kDa CaM−PDEに相同な新規のPDEをコードするヒト
心臓cDNA挿入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68965）
中のプラスミドpcamHella; 7. cGS−PDEイソ酵素をコードするウシ副腎cDNA挿入体
を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68579）中のプラスミド
p3CGS−5; 8. cGS−PDEイソ酵素断片をコードするウシ脳cDNA挿入
体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68578）中のプラスミ
ドpBBCGSPDE−5; 9. cGS−PDEイソ酵素をコードするウシ脳cDNAを含む大
腸菌（A.T.C.C.受託No.68580）中のプラスミドpBBCGSPD
E−7; 10. cGS−PDEイソ酵素断片をコードするヒト心臓cDNAを
含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68583）中のプラスミドpG
SPDE6.1; 11. cGS−PDEイソ酵素断片をコードするヒト海馬cDNA挿
入体を含む大腸菌（A.T.C.C.受託No.68585）中のプラス
ミドpGSPDE7.1;および 12. cGS−PDEイソ酵素断片をコードするヒト海馬cDNA挿
入体を含むプラスミドpGSPDE9.2（A.T.C.C.受託No.6858
4）。
13. cGS−PDEをコードするヒトcDNA挿入体を含む大腸菌
（A.T.C.C.受託No.68962）中のプラスミドpHcgs6n。
本発明によって特に提供されるものは、ウシ59kDa Ca
M−PDEをコードするヌクレオチドを含み、配列番号:16
および17のDNA配列およびアミノ酸配列で特徴付けられ
るウシcDNA配列である。
関連する態様において、本発明は、それぞれ酵素もし
くは酵素断片の発現のために操作的に連繋した、転写プ
ロモーターを含むDNA構築物、PDEあるいはその断片をコ
ードするDNA配列、および転写ターミネーターに関す
る。構築物は、宿主細胞、好ましくは真核細胞、より好
ましくは哺乳類もしくは酵母細胞を形質転換あるいは形
質変換するために用いるのが好ましい。大量生産の目的
で、発現したPDEは、例えば、免疫親和的精製により細
胞から単離できる。
標準的形質転換手法および形質変換手法によって、原
核および真核宿主細胞への、適切なDNAおよびRNAウィル
スベクターおよび環状DNAプラスミドベクターを含む、D
NA配列の組み込みも本発明の範疇にあり、今まで自然界
から多量の入手ができなかった有用なタンパク質の提供
も期待される。本発明によって提供されたシステムは、
上述したものを含んだ形質転換した大腸菌細胞、ならび
に、酵母および哺乳類細胞を含んだ他の形質転換した真
核細胞を含む。哺乳類宿主細胞は、本発明の組み換え発
現物質に関する至適生物学的活性を参照する必要に迫ら
れることから、翻訳後の修飾（例えば、先端削除、脂質
化、およびチロシン、セリン、もしくはスレオニン燐酸
化）への使用が予想される。
本発明の新規タンパク生成物は、上記核酸配列の発現
生成物、およびCaM−PDEの一次構造配座（すなわち、ア
ミノ酸配列）を有するポリペプチド、およびcGS−PDEタ
ンパク質ならびにそのペプチド断片、および、複製する
よう組み立てられた、そのアミノ酸配列の合成ペプチド
を含む。本発明のタンパク質、タンパク質断片、および
合成ペプチドは、治療、診断、および予後での用途を含
む多くの用途を意図しており、本発明のタンパク質と特
異的に免疫反応するモノクローナルおよびポリクローナ
ル抗体の基礎を提供するであろう。
本発明のタンパク質、その断片およびペプチドに高い
免疫特異性で結合し、他のタンパク質と共通しない独特
のエピトープを認識する能力によって特徴付けられる
（ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗
体、一本鎖抗体などを含む）抗体基質が、本発明によっ
てさらに提供される。本発明のモノクローナル抗体は、
CaM−PDEsおよびcGS−PDEsの親和的精製、例えば、Hans
en et al.,Meth.Enzymol.,159:543（1988）、に使用で
きる。
CaM−PDEsならびにcGS−PDEsの正常、不正常、もしく
は変異形態、およびそれに関連した核酸（例えば、DNA
およびmRNA）の検出および／または定量のための新規の
手法が、本発明によってさらに提供される。例示的に、
本発明の抗体は、流体および組織標本中のこれらタンパ
ク質、および適切に標識付けされ、これらタンパク質を
コードするmRNAの定量検出のために用いられるであろう
本発明のDNA配列の定量検出のための公知の免疫学的手
法において用いられるであろう。
それ故、本発明の数々の態様の中には、（ａ）ポリヌ
クレオチド配列をコードする新規のCaM−PDEおよびcGS
−PDE、（ｂ）本明細書に記載した条件とほぼ同等、あ
るいはそれより寛容なハイブリダイゼーション条件下
で、新規のCaM−PDEおよびcGS−PDEをコードする配列と
ハイブリダイズする哺乳類CaM−PDEあるいは哺乳類cGS
−PDEの活性を有するポリペプチドをコードし、本発明
のcDNAsの初期単離に用いられたポリヌクレオチド配
列、および（ｃ）少なくとも部分的に、変性コドンを使
用する時に、同じもの（もしくは、対立性変異体もしく
は類似体ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド
配列がある。ポリヌクレオチド配列および該ポリヌクレ
オチド配列ならびにベクターで形質転換あるいは形質変
換された原核および真核宿主細胞に組み込まれたウィル
スDNAおよびRNAベクターあるいは環状プラスミドDNAベ
クター、ならびに、これら宿主の培養成長によるこれら
タンパク質の組み換え生成のための新規の方法、および
宿主あるいはその培地からの発現タンパク質の単離が、
対応して提供される。
さらに他の実施態様において、本発明は、PDE活性を
調節できる化合物を同定するための組成物と方法を提供
する。そのような方法は、組み換えPDEポリペプチドを
発現する真核細胞でPDE調節活性が評価される化合物を
インキュベートし、遺伝子発現によってもたらされるホ
スホジエステラーゼ活性に関する該化合物の効果を決定
することを含む。この方法は、全細胞あるいは細胞溶解
調製物のいずれでも効果的である。好ましい態様におい
て、真核細胞は、酵母細胞もしくは内因性ホスホジエス
テラーゼ活性が欠けている哺乳類細胞である。ホスホジ
エステラーゼ活性に関する化合物の効果は、cAMPおよび
／またはcGMPの加水分解を観察する生物化学的分析法、
あるいは組み換えPDEポリペプチドの有無に関連する真
核細胞の表現型特性の改変に関する化合物の効果を追跡
することにより、決定することができる。
本発明の他の態様および利点は、本発明の実用での数
々の例示的実施例を含む下記の本発明の詳細な説明、図
面に関する記載を考慮すれば明確になるであろう。
図１には、61kDa（ウシ脳）イソ酵素の完全配列と共
に並べた、単離した59kDa（ウシ心臓）および63kDa（ウ
シ脳）CaM−PDEタンパク質のアミノ酸配列決定の結果を
示している。61kDaイソ酵素に対する59および63kDaタン
パク質の同一部分を下線で示した。仮想同一部を半行下
がりで示し、およびハイフンは、未同定残基を示してい
る。リシルペプチドでブロックしたアミノ末端の組成物
からメチオニルペプチド（mDDHVTIRRK）を除去すること
で決定される、59kDaイソ酵素のＮ−末端を括弧で示し
た。黒塗枠を、61および59kDaイソ酵素で同定したCaM−
結合部位中の残基上に置いた。
本発明の詳細な説明 下記実施例に、本発明の実例を示した。実施例Ｉは、
ウシ脳からの61kDa CaM−PDEの単離、精製、および配列
決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその発現に関する。
実施例IIは、ウシ肺からの59kDa CaM−PDEの単離、精
製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその
発現に関する。実施例IIIは、ウシ脳からの63kDa CaM−
PDEの単離、精製、および配列決定、ならびに哺乳類宿
主細胞でのその発現に関する。実施例IVは、ウシ副腎皮
質からのcGS−PDE cDNAの単離、精製、および配列決
定、ならびに哺乳類宿主細胞でのDNAの発現に関する。
実施例Ｖは、ウシ脳からのcGS−PDE cDNAの単離、精
製、および配列決定、ならびに哺乳類宿主細胞でのその
発現に関する。実施例VIは、ヒトcGS−PDE cDNAの取
得、およびcGS−PDEをコードするヒトcDNAの開発のため
の、cGS−PDEウシ副腎cDNAの使用に関する。実施例VII
は、ヒトCaM−PDE 61kDa cDNAおよび新規構造の関連cDN
Aの取得のための、CaM−PDE 61kDaウシ脳cDNAの使用に
関する。実施例VIIIは、酵母表現型欠陥の相補性および
発現生成物のホスホジエステラーゼ活性の確認のため
の、ウシおよびヒトPDE cDNAの発現に関する。実施例IX
は、ノザン分析および本発明のポリヌクレオチド（特
に、cDNAsおよびアンチセンスRNAs）を用いたRNアーゼ
保護研究を含む組織発現研究に関する。
冗長なオリゴヌクレオチドの構成を本明細書で称する
場合、J.Biol.Chem.,261:13−17（1986）にて報告され
た、下記表Ｉの一文字表記を、不明瞭なヌクレオチド配
列のために用いることを勧める。
実施例Ｉ ウシ脳からの61kDa CaM−PDE cDNAの単離、精製、およ
び配列決定 この実施例では、タンパク質のアミノ末端をコードす
る61kDaウシ脳CaM−PDEの遺伝子部分に相当するcDNA配
列が、ウシ脳mRNAから調製した第一鎖状cDNAsのコレク
ションからPCRによって単離された。PCR−調製した断片
は、全長ウシ脳CaM−PDE配列を単離するために用いられ
た。
全RNAが、Chomczynski et al.,Anal.Biochem.,162:15
6−159（1987）の方法を用いて、ウシ心臓から調製さ
れ、そしてmRNAが、Poly（Ａ）Quick（登録商標）mRNA
精製キットを用いて、その使用説明書に従って選択され
た。第一鎖状cDNAは、50mM Tris HCl（pH8.3、42℃）、
10mM MgCl2、10mMジチオトレイトール、0.5mM（それぞ
れ）デオキシヌクレオチド三燐酸、50mM塩化カリウム、
2.5mMナトリウムピロ燐酸、５μｇデオキシチミジル酸
オリゴマー（12−18塩基）および65℃で15分間かけて変
性した５μｇウシ心臓mRNAを含む反応混合物（最終体積
40μｌ）に、AMV逆転写酵素の80単位を加えることによ
って合成された。
第一鎖状cDNA合成物を定量するために、［32P］−ラ
ベルした１μｌのdCTP（3000Ci/mmol）が混合された。
反応物は、42℃で60分間インキュベートした。反応物
は、フェノール／塩化メチル抽出され、エタノール沈澱
された。核酸ペレットが、10mM Tris−HCl（pH7.5）/0.
1mM EDTAの50μｌに、最終濃度が、15ng/μｌになるよ
う再懸濁した。
図１にある61kDaペプチド配列に対応する冗長なセン
スおよびアンチセンス・オリゴマーは、目的鋳型に特異
的にハイブリダイズするに充分な長さにまで、最小限の
冗長になるようにデザインされている。
CaM PCR−2Sと称する、最初の23塩基オリゴマーを、A
pplied Biosystems社製のDNA合成機で合成した。そのオ
リゴマーは、下記アミノ酸配列； に特異的な下記配列を有していた。
CaM PCR−3ASと称する、下記アミノ酸配列； に対応する下記配列の二番目の23塩基オリゴマーが合成
された。
612bp CaM PDE cDNA断片が、PCR増幅手法を用いて、5
0mM塩化カリウム、10mM Tris−HCl（pH9.0）、1.5mM Mg
Cl2、0.01％ゼラチン、0.1％Triton X−100、0.2mM（そ
れぞれ）デオキシヌクレオチド三燐酸、１μＭ（それぞ
れ）CaM PCR 2SおよびCaM PCR−3ASオリゴマー、および
Thermus aquaticus DNAポリメラーゼの2.5単位を含む反
応混合物に、15ngの第一鎖状cDNAを加えることによって
合成された。反応物は、90℃で１分間、50℃で２分間、
および72℃で２分間の、30サイクルでインキュベートし
た。反応生成物は、0.5μg/mlエチジウムブロミドを含
んだ0.04M Tris−酢酸/0.001M EDTA緩衝液を用いた１％
アガロースゲルにて精製した。DNA生成物は、紫外線で
視覚化され、カミソリ刃でゲルからていねいに切り出さ
れ、Geneclean II試薬キットを用いて精製され、そし
て、EcoR Vで切り出されたpBluescriptベクターDNAに繋
がれた。
PCR増幅生成物が、CaM PDE cDNAであるかを決定する
ために、サブクローニングしたPCR DNA生成物を、T3お
よびT7プロモータープライマー、およびSequenaseある
いはTaqポリメラーゼ配列決定キットのいずれかを用い
て、末端から配列決定を行った。DNAのこの断片の各末
端から約250塩基が配列決定され、図１の59および61kDa
CaM−PDEsのアミノ酸配列と対応するcDNAからの推定ア
ミノ酸配列が、PCR DNA生成物はCaM PDE cDNAの一部で
あることを確認した。
（Ronald E.Diehl、Merck、Sharp ＆ Dohmeから提供
された）ラムダZAPベクターで構築されたウシ脳cDNAラ
イブラリーは、PCR増幅により得られた放射ラベルした6
15bp CaM−PDE cDNAでスクリーニングした。プローブ
は、Feinberg et al.,Anal.Biochem.,137:266−267（19
84）の方法を用いて調製し、［32P］−ラベルしたDNA
は、Elutip−Ｄ（登録商標）カラムを用いて精製した。
円形フィルターに結合したプラーク（12−150mmプレー
ト上での700,000プラーク）を、50％ホルムアミド、20m
M Tris−HCl（pH7.5）、1X Denhardt溶液、10％デキス
トラン硫酸、0.1％SDSおよび106cpm/mlの［32P］−ラベ
ルしたプローブ（109cpm/μｇ）を含む溶液中で、42℃
で、終夜ハイブリダイズした。フィルターは、室温で、
15分間、2X SSC/0.1％SDSで三度洗浄し、次いで、45℃
で、15分間、0.1X SSC/0.1％SDSで二度洗浄した、フィ
ルターは、終夜Ｘ線フィルムに曝された。
［32P］−ラベルしたプローブとハイブリダイズした4
6個のプラークの内、任意に選択した８個のクローン
を、再培養およびスクリーニングを数回行うことにより
精製し［Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Labora
tory Manual 545pp.Cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbour,N.Y.,（1982）］、挿入cDNAは、製
造者が勧めているように、in vvivo削除［Short et a
l.,Nuc.Acids Res.,16:7583−7599（1988）］により、p
Bluescript SK（−）にサブクローニングされた。
各クローンの培地から調製されたプラスミドDNAは、E
coR Iを用いた制限分析に供した。適切な長さの二つの
クローンが、Taq Tak（登録商標）およびSequenase（登
録商標）配列決定キットを用いた配列解析のために選択
された。その二つのクローンとは、pCAM−40（2.3kb）
とpCAM−34（2.7kb）である。この方法からの配列情報
は、pCAM−40の挿入が、ウシ脳61kDa CaM−PDEの全長の
コードすることを確認した。このクローンの配列、およ
びそこから推定されたアミノ酸配列を、配列番号:5およ
び６に示した。
COS−７細胞（A.T.C.C.CRL 1651）での61kDa CaM−PD
E cDNAの過渡発現を下記のようにして、行った。大腸菌
宿主細胞MC1061−p3中のベクターpCDM8［Seed,Nature,3
29:840−843（1987）］は、マサチューセッツ州、ボス
トンのマサチューセッツ総合病院のBrian Seed博士より
提供を受けた。このベクターは、Invitrogen社（カリフ
ォルニア州、サンジエゴ）からも入手できる。プラスミ
ドpCAM−40は、Hind IIIおよびNot Iで消化され、Hind
IIIおよびNot Iで消化されたCDM8ベクターDNAに繋がれ
る2.3kb断片を産生した。得られたプラスミドは、MC106
1−p3細胞にて増殖された。プラスミドDNAは、Ausubel
et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biolog
y,1:1.7.1（John Wiley ＆ Sons,New York,1989）のア
ルカリ溶解法を用いて調製され、Qiagen−Tip 500カラ
ム（Qiagen社、カリフォルニア州、チャッツワース）を
用いて、使用説明書に従って精製した。
COS−７細胞は、Ausubel et al.,supra at 1:9.2 et
seqのDEAEデキストラン法を用いて、ｐ−CAM−40/CDM8
構築物（あるいは、CDM8ベクターのみで形質変換したモ
デル）で形質変換された。具体的には、エタノール沈澱
したDNAの10μｇを80μl TBS緩衝液に再懸濁し、10％Nu
Serumを補ったDMEMの4ml中の50％融合性COS−７細胞の1
00mmプレートに、10mg/ml DEAEデキストランの160μｌ
を滴下して加え、渦巻攪拌して混合した。細胞は、水飽
和、７％二酸化炭素雰囲気下で、37℃で、３−４時間イ
ンキュベートした。培地を取り除き、細胞を直ちに、PB
S中の10％DMSOで１分間処理した。この処理の後、細胞
はPBS、次いでDMEMで洗浄され、そして最終的に、10％
胎児ウシ血清ならびに抗生物質（50μg/mlストレプトマ
イシン硫酸）を補ったDMEMにて、７％二酸化炭素インキ
ュベーターで、36時間培養した。
COS細胞は、プレートから掻き取られ、40mM Tris−HC
l（pH＝7.5）、5mM EDTA、15mMベンズアミジン、15mM
β−メルカプト・エタノール、1ml当たり１μｇのペプ
スタチンＡ、および1ml当たり１μｇのロイペプチンを
含む緩衝液（100mmプレート当たり1ml）にて、Dounceホ
モジェナイザーで均質化した。均質化物は、基質として
［3H］cGMPを用いて、Hanson et al.,Proc.Nat'l.Acad.
Sci.,U.S.A.,79:2788−2792（1982）の方法に従って、P
DE活性について分析された。20mM Tris−HCl（pH＝7.
5）、20mMイミダゾール（pH＝7.5）、3mM MgCl2、15mM
酢酸マグネシウム、1ml当たり0.2mgのBSA、および2mM E
GTAもしくは0.2mM塩化カルシウムを伴う１μM 3H−cAM
P、および1ml当たり４μｇのCaMを含む緩衝液にて、30
℃で、10分間反応を行った。分析は、90℃の水浴で試験
管を１分間インキュベートすることで終了した。冷却
後、1ml当たり2.5mgのヘビ毒10μｌを各分析物に添加
し、37℃で、５分間インキュベートした。試料は、20mM
Tris−HCl（pH＝7.5）の250μｌで希釈され、直ちに0.
7ml A−25イオン交換カラムに適用された。カラムは20m
M Tris−HCl（pH＝7.5）の0.5mlで三度洗浄され、シン
チレーション瓶に回収された。試料は、シンチレーショ
ン計測器Packard Model 1600TRを用いて、１分間計測し
た。特異的サイクリック・ヌクレオチド加水分解活性
が、1mgタンパク質当たりの１分当たりに加水分解され
たcAMPあるいはcGMPのピコモルとして表現される。タン
パク質濃度は、標準としてBSAを用いた、Bradford,Ana
l.Biochem.,72:248−254（1976）の方法に従って見積も
った。模擬的に形質変換した細胞と比較して、pCAM−40
cDNAで形質変換した細胞の抽出物は、EGTAの存在下
で、非常に大きなcAMPおよびcGMP加水分解活性を有して
いた。カルシウムおよびCaMの存在下での、pCAM−40cDN
A形質変換細胞の分析は、cAMPおよびcGMP加水分解の刺
激を示す結果となった。
実施例II ウシ肺からの59kDa CaM−PDEの単離、精製、および配列
決定 ウシ心臓59kDa CaM−PDEからアミノ酸配列 に対応する完全に変性したセンス・オリゴヌクレオチ
ドが合成された。このオリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ド配列は、 の配列を有するアミノ酸配列 に対応する、ウシ脳61kDa CaM−PDEの図１の配列か
ら、アンチセンス・オリゴヌクレオチドがデザインされ
た。
プライマー対が、鋳型として（実施例Ｉで調製したよ
うな）ウシ心臓第一鎖状cDNAを用いたPCR反応を起こす
ために使われた。この反応では、59kDa配列独特の75b
p、54pb、ならびに59kDaと61kDaイソ酵素との間で共有
される21bpのPCR生成物が予想される。PCR生成物は、ア
ガロースゲル電気泳動を篩うことによって分析され、76
bpに泳動しているバンドをゲルから削り取った。DNA
は、pBluescript KS+にサブクローニングされ、青／白
選択法による陽性コロニーが、ベクター配列に対抗する
プライマーを使用したPCRによってスクリーニングされ
た。適当な大きさの挿入体を有するコロニーが選択さ
れ、これらの一つ（pCaM59/75.14）が配列決定のために
選抜された。Quiagen P20プッシュ・カラムを用いて、
プラスミドDNAが調製され、ジデオキシ法を用いた配列
決定での鋳型として用いられた。PCR生成物の配列は 配列の分析では、得られた配列と予想していた配列と
の間に二つのコドンの相違が認められた。センス・オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列の再検討は、二つのコド
ンのふとした転位が、オリゴヌクレオチドのデザインに
おける誤りを導くことを示していた。59および61kDaイ
ソ酵素との重複が最小限である54bp生成物と思われる二
番目のオリゴヌクレオチドPCRプライマー対に加えて、
最初のセンス・プライマーのデザインでの誤りが訂正さ
れた第二センス・プライマーが調製された。センス・オ
リゴヌクレオチドは、配列 を有しており、アンチセンス・オリゴヌクレオチド
は、配列 このプライマー対は、鋳型としてウシ心臓第一鎖状cD
NAを用いたPCR反応を起こすために用いられ、PCR生成物
は上記したように、サブクローニングされ、正確にスク
リーニングされた。二つのクローン（pCaM59/54.9およ
びpCaM59/54.10）が挿入体の大きさを基にして、配列決
定のために選択され、上記したように配列決定され、双
方のクローンが、アミノ酸配列 が予想される、予想された配列 の54bp挿入体を含んでいた。
cDNAライブラリーがウシ肺mRNAから構築され、ウシ副
腎皮質ライブラリーのスクリーニングに関する、下記、
実施例IVに記載された手法を用いてスクリーニングし
た。約1.2×106プラーク形成単位が、32P−ラベルしたp
CAM−40 cDNAの1.6kb EcoR I制限エンドヌクレアーゼ開
裂生成物でプローブ検定された。この最初のスクリーニ
ングで、四つの推定59kDa CaM−PDE cDNAクローンが生
成した。予備的な配列解析にて、p59KCAMPDE−２と称す
る、一つのクローンが、推定59kDa CaM−PDEの完全なコ
ード配列を含んでいることを示した。一連の入れ子状欠
失が、p59KCAMPDE−２プラスミド［Sonnenburg et al.,
J.Biol.Chem.,266（26）:17655−17661（1991）参照］
から構築され、得られた鋳型の配列決定をTaq DyeDeoxy
（登録商標）ターミネーター・サイクル・配列決定キッ
トおよびApplied Biosystems Model 373A DNA配列決定
システムを用いて行った。DNAと推定アミノ酸配列を、
配列番号:16および17にそれぞれ示した。cDNAにある大
きな読取枠が、アミノ末端18残基を除く、61kDa CaM−P
DEアミノ酸配列とほぼ同一の約59キロダルトンの推定分
子量を伴う515残基ポリペプチドをコードする。さら
に、p59KCAMPDE−２読取枠の予想されたアミノ酸配列
は、ウシ心臓から精製された59kDa CaM−PDEの利用可能
な配列、Novack,et al.,Biochemistry,30:7940−7947
（1991）と同一である。これら結果は、p59KCAMPDE−2
cDNAが、59kDa CaM−PDEをコードするmRNA種であること
を意味している。
59kDaウシ肺PDEの一過性の発現は、実施例Ｉでのよう
に達成された。具体的には、2.66kbの、p59KCAMPDE−2
cDNAのEcoR I/ブラント・エンドした断片が、Xho Iで消
化され、およびブラント・エンドされたpCDM8にサブク
ローニングされた。p59KCAMPDE−２称する組換えプラス
ミドが、COS−７細胞を一過的に形質変換するために用
いられ、形質変換したCOS−７細胞から調製された抽出
物は、２μM cAMPを用いてCaM−PDE活性に関して分析さ
れた。p59KCAMPDE−2 cDNAで形質変換したCOS−７細胞
は、カルシウムおよびカルモジュリンの存在下で、４〜
５倍の刺激を受けたcAMP加水分解活性を産生した。模擬
的に形質変換したCOS−７細胞では、カルモジュリン刺
激cAMP加水分解活性は検出されなかった。
実施例III ウシ脳からの63kDa CaM−PDEの単離、精製および配列決
定 図１にて報告されたアミノ酸配列に対応する多数の全
体的および部分的冗長なオリゴヌクレオチドが、63kDa
CaM−PDEのためのcDNAクローンを取得する試験に使用す
るために合成された。ポリメラーゼ連鎖反応に用いられ
たアニーリング温度は、各センス−アンチセンス対の最
も低い融解オリゴヌクレオチドのための理論的融点より
低い２〜20℃の間で変化した。後述するプローブ63−12
sおよび63−13aを除いて、多様な条件下でのオリゴヌク
レオチド対の各々のPCR生成物は、アガロース・ゲル電
気泳動した時に、複数のエチジウムブロミドの帯を形成
した。63−12sおよび63−13aの使用は、配列決定した時
に、63kDa CaM−PDEをコードするためのPCR生成物に帰
する結果となった。
63−12sと称する全体的冗長なセンス23−merオリゴヌ
クレオチドは、61kDaウシCaM−PDEs（図１参照）に保存
されているアミノ酸配列 を基にして、下記配列 を含むように組み立てられた。63−13aと称する部分
的冗長なセンス32−merオリゴヌクレオチドは、 の配列を有しており、さらに63kDa CaM−PDEに保存さ
れている下記配列 ウシ大脳皮質および選択されたポリA+からメッセンジ
ャーRNAが調製された。第一鎖状相補性DNAが、AMVまた
はMMLV逆転写酵素を用いて生成された。脱トリチル化し
たオリゴヌクレオチドは、１×106cpm/nmolの1mM［γ−
32P］ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて燐
酸化した。NENsorb 20カラムを用いた遊離ATPからの5'
32P−ラベルしたオリゴヌクレオチドの分離の後、それ
ぞれが20μＭ（5'燐酸）ストックとして懸濁され、最終
的にPCRにおいてそれぞれ400nMにて合わされる。反応
は、約１μｇのPCR生成物を得るために、50ng全cDNAお
よび200μM dNTPを用いて実施された。反応には、５分
間・94℃の最初の変性工程に続いて、１分間・94℃の変
性、１分間・50℃のアニーリング工程、および２分間・
72℃の伸長工程の30サイクルが含まれていた。反応条件
下にて、450塩基対の単一のエチジウムブロミド染色バ
ンドが、100ngのPCR生成物のアガロースゲル電気泳動に
て得られた。5'燐酸化PCR生成物の５μｇが、５％PEG−
6000中のT4 DNAリガーゼを用いて、21℃で、12時間かけ
て、15ng EcoR V−切断Bluescript KS（＋）プラスミド
に繋いだ。XL 1−blue形質転換の推定陽性体は、発色選
択のためのイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）およ
びブロモ−クロロ−インドリル−ガラクトシド（Xgal）
を用いれば白いコロニーを形成した。この精選物は、T3
もしくはT7プライマー、ジデオキシヌクレオチド・ター
ミネーター、およびシークエナーゼを用いて配列決定を
行った。
得られた一つのクローン（p11.5B）は、配列番号:22
および配列番号:23にそれぞれ示した、ヌクレオチド配
列および翻訳したアミノ酸配列を有していた。オリゴヌ
クレオチド63−12sに見られたアミノ酸YEHへのコドン
は、p11.5Bにあるアミノ酸配列NTRへのコドンに取って
代わられた。これはおそらく、63−12sでの汚染物質に
よるものであろう。翻訳した読取枠（ORF）が、図１に
て報告された63kDa CaM PDEと類似しているので、p11.5
Bは、cDNAクローン全長について、ウシ脳cDNAライブラ
リーをスクリーニングするために用いられた。
ウシ脳cDNAライブラリーは、λ ZAP IIに構築され
た。第一鎖状cDNAは、第二鎖状cDNAを合成するために、
RNase H、E.coli DNAポリメラーゼ、およびE.coli DNA
リガーゼで処理された。cDNAは、T4−DNAポリメラーゼ
でブラントエンドされ、cDNAのEcoR I部位は、EcoR Iメ
チラーゼおよびＳ−アデノシルメチオニンで保護され、
T4 DNAリガーゼを用いてEcoR Iリンカーがそこに繋がれ
た。EcoR I制限酵素処理した後、遊離リンカーが、Seph
arose CL−4Bを用いたゲル濾過によってcDNAから分離さ
れた。λ ZAP IIの腕はcDNAに繋がれ、Stratagene社か
ら入手したin vitro Gigapack Coldパッケージング・キ
ットによってまとめた。9.5×105の組換体が、IPTGおよ
びＸ−galを置くことによって検定した5.8％非組換体プ
ラークによって得られた。ライブラリーは、プレート溶
解法によって、1.4×107pfu/mlにまで一度増幅された。
λ ZAP IIにある全ウシ脳cDNAライブラリーの最初の
スクリーニングが実施された。ハイブリダイゼーション
時に32P−ラベルしたオリゴヌクレオチド63−1sを用
い、そして40℃の温度で洗浄して、700,000pfuがスクリ
ーニングされた。オリゴヌクレオチド63−1sは、アミノ
酸配列 を有する完全に冗長な23−merである。
21個の推定陽性体のすべてが選び取られた。後続の再
スクリーニングが、このスクリーニング法を用いて認め
られた非常に高いバックグラウンドによって妨げられ
た。それ故、最初に選び取った各々がプールされ、プー
ルした内の50,000pfuが任意のプライマーおよび［α−
32P］dCTPによって放射標識付けされたp11.5Bと取り代
えられ、再スクリーニングされた。プラーク精製した一
つの陽性体が得られ、そしてプラスミドp12.3aとして取
得した。そのDNA配列を配列番号:26に示した。そして、
ウシ大脳皮質ライブラリーが、p11.5Bでさらにスクリー
ニングされた。さらに二つの独立したクローン、p12.2
7.9およびp12.27.11が、最初のスクリーニングでの1.4
×106pfuから得られた。これらは、プラーク精製され
て、配列決定のために取得された。
クローンp12.3aは、図１に示したようなウシ63kDa Ca
M−PDEから単離された整列したペプチドのほとんどのタ
ンパク質配列をコードする。配列番号:26および配列番
号:27に、p12.3aのコード領域（すなわち、約2.5キロベ
ース挿入体の1844ヌクレオチド）を示した。塩基番号24
8−290は、アミノ酸配列 をコードする一方で、対応するペプチド（図１）は、 を有していた。
塩基番号942−990は、アミノ酸配列 をコードする一方で、対応する単離したペプチド（図
１）配列は、 p12.3aのいかなる読取枠にも、非整列の63kDaペプチ
ド配列は認められず、また翻訳した、p12.3aの読取枠分
子量は60,951であり、63,000ではなかった。それ故、こ
のcDNAは、63kDaタンパク質のイソ酵素変異体を意味し
ている。他の二つの独立したクローン（p12.27.9および
p12.27.11）は、p12.3aと同一の読取枠配列を有してい
るように思われる。一方のクローンの読取枠は、p12.3a
のヌクレオチド番号823から始まり、その終止コドン通
じてp12.3aと同一である。他方のクローンは、p12.3aの
ヌクレオチド番号198から開始し、その長さからしてp1
2.3aと同一である。三つのクローンのいずれも、p11.5B
に変則NTRペプチド配列を持っておらず、三つすべて
が、61kDa CaM PDEとしてYEHを有している。
COS−７細胞での63kDa GaM−PDEの一過性の発現が、
下記のようにして行われた。配列番号:26の領域をコー
ドし、BamH I制限部位に位置させたタンパク質を含むプ
ラスミドp12.3のcDNA挿入体の断片が、PCRによって調製
された。具体的には、（推定開始コドンを含んだ）塩基
番号94−117および（終止コドンの3'に近接した配列を
含んだ）配列番号:26の塩基番号1719−1735のアンチセ
ンスに対応するオリゴヌクレオチドが、その5'末端にあ
る二つの一列に並んだBamH I部位によって合成された。
二つのプライマーは、下記の配列を有していた。
二つのオリゴヌクレオチドは、72℃・10分間の最終伸
長反応を含む、94℃・１分間のインキュベーションか
ら、72℃・２分間のインキュベーションに至る30回のPC
Rサイクルに用いられた。５μｇの1665塩基対生成物を
生成するために、100μｌ反応物には、20μＭの各オリ
ゴヌクレオチドならびに鋳型としての100pgのp12.3aを
用いた。
生成物は1:1フェノール：クロロフォルムの等量で一
旦抽出され、酢酸ナトリウムに関して0.3Mとされ、およ
びエタノールの二倍量で終夜沈澱された。沈澱物は乾燥
され、50μｌ中に再水和され、そしてcDNAは、37℃で、
１時間、５単位のBamH I制限エンドヌクレアーゼで消化
された。その後、溶液は1:1フェノール：クロロフォル
ムの等量で一旦抽出された。BamH I5'ならびに3'端を持
つ1641塩基対cDNAは、Qiagen Q−20カラム（Qiagen社、
チャッツワース、カリフォルニア州）およびメーカーが
作成した使用説明書を用いて、水層から精製された。
切断し、精製したPCR生成物は、BamH I消化したアル
カリフォスファターゼ処理したBluescript KS（＋）プ
ラスミドに繋げられた。連繋生成物は、XL1細胞にサブ
クローニングされ、得られた形質転換体は、配列決定に
よりスクリーニングされた。（p11.6.c6と称する）ある
形質転換体は、Bluescript KS（＋）Hind III制限部位
が、開始コドンをコードする挿入体の配列の5'側の30塩
基であるように調整したBamH I挿入体を用いて単離され
た。このプラスミドは、1689塩基対断片を遊離するため
に、Hind IIIおよびXba I制限エンドヌクレアーゼで消
化された。この断片は、実施例Ｉのように、Hind III−
およびXba I−消化したCDM8ベクターDNAに繋いだ。
COS−７細胞は、p12.3.a/CDM8構築物で形質変換、あ
るいは実施例１に記載したようなDEAE−デキストラン法
を用いてCDM8のみで模擬的に形質変換した。培地中の10
0μg/mlの最終DEAE−デキストラン濃度にて、10μg DNA
/400μg DEAE−デキストランの比率が用いられた。48時
間後、細胞は1mlの均質化緩衝液（40mM Tris−HCl,pH＝
7.5、15mMベンズアミジン塩酸、15mM 6−メルカプトエ
タノール、0.7μg/mlペプスタチンＡ、0.5μg/mlロイペ
プチン、および5mM Na4EDTA）に懸濁され、Dounceホモ
ジェナイザーを用いて氷上に粉砕した。−20℃での貯蔵
用に最終50％（v/v）グリセロールを作成するために、
均質化物は1/2に希釈され、そしてホスホジエステラー
ゼ活性の検定あるいはタンパク質濃度を決定のいずれか
のために使用された。CaM−依存性および非依存性活性
が、実施例１のように決定された。p12.3.a DNAで形質
変換された細胞は、基準レベルからして、15倍に増大し
たCaM−刺激性cAMPホスホジエステラーゼ活性および12
倍に増大したCaM−刺激性cGMPホスホジエステラーゼ活
性を有していた。模擬的に形質変換したCOS−７細胞
は、CaM刺激であっても、基準レベルからして、PDE活性
が認められなかった。
実施例IV ウシ副腎皮質からのcGS−PDE cDNAの単離、精製、およ
び配列決定、および発現 全RNAが、Chomczynski et al.,supraの方法を用いて
ウシ副腎外皮質から調製した。ポリアデニリル化RNA
を、Poly（Ａ）Quick（登録商標）mRNA精製キットを用
いて、使用説明書に従って、全RNA調製物から精製され
た。第一鎖状cDNAは、80単位のAMV逆転写酵素を、50mM
Tris−HCl（pH8.3、42℃）、10mM塩化マグネシウム、10
mMジチオトレイトール、0.5mM（それぞれ）デオキシヌ
クレオチド三燐酸、50mM塩化カリウム、2.5mMナトリウ
ムピロ燐酸、５μｇデオキシチミジル酸オリゴマー（12
−18塩基対）および65℃で、15分間かけて変性した５μ
ｇウシ副腎皮質mRNAを含む反応混合物（40μl:最終体
積）に添加することにより合成された。反応物は、42℃
で、60分間インキュベートされた。第二鎖状cDNAは、Wa
tson et al.,DNA Cloning:Practical Approach,1:79−8
7（1985）の方法を用いて合成され、cDNAの端は、T4 DN
Aポリメラーゼで鈍化させた。EcoR I制限エンドヌクレ
アーゼ部位は、EcoR Iメチラーゼ（Promega）を用いて
メチル化され［Maniatis et al.,supra］、EcoR Iリン
カー（50倍モル過剰）は、T4 DNAリガーゼを用いてcDNA
に連結された。過剰のリンカーは、cDNAをEcoR I制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、Sepharose CL−4Bクロマト
グラフィーによって除去した。Ausubel et al.,supra。
（１μｇベクター当たり25−50ngの）cDNAは、EcoR I消
化した脱燐酸化ZAP（登録商標）II（Stratagene社）ア
ームに連繋し［Short et al.,Nuc.Acids Res.,16:7583
−7599（1988）］、Gigapack（登録商標）Gold抽出物
に、使用説明書に従って包み込んだ［Maniatis et al.,
supra］。
最初に、未増幅のウシ副腎皮質cDNAライブラリーを作
成し、末端をγ−［32P］ATPおよびT4ポリヌクレオチド
キナーゼでラベルした冗長な23−merアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド・プローブでスクリーニングした。ア
ミノ酸配列 に対応するオリゴマーが、Applied Biosystems model
380A DNA合成装置を用いて作成された。これらの配列
は、以下の通りである。
12個体集合150mmプレート（１プレート当たり約50,00
0pfu）からのプラークを有する円形の複製ニトロセルロ
ース・フィルターを、6x SSC、1x Denhardt溶液、100μ
g/ml酵母tRNA、0.05％ナトリウムピロ燐酸、および（1p
mol当たり106cpmを超える）10cpm/ml放射ラベルしたプ
ローブを含む溶液中にて、45℃で一晩ハイブリダイズし
た。フィルターを、室温にて、6x SSCで三度洗浄し、続
いて、オリゴマー・プローブの最低融点より10℃低い温
度にて、綿密に調製された6x SSCで洗浄し、そして、Ｘ
線フィルムに一晩曝した。
（pcGS−3:2.1と称する）単一の2.1kb cDNAクローン
が単離され、そして配列決定された。このクローンの大
きな読取枠によって囲まれたアミノ酸配列は、ウシ心臓
破砕懸濁液の上清画分から精製されたcGS−PDEのペプチ
ド配列と同一であった。LeTrong et al.,supra。
増幅された第二ウシ副腎皮質cDNAライブラリーが、
（3CGS−５と称する）4.2kb cDNAを産生する、［32P］
ラベルしたCGS−3:2.1部分cDNAを用いてスクリーニング
された。
ライブラリーは構築され、Maniatis et al.,supraに
あるようにして増幅され、移植され、そして、クローン
CGS−3:2.1からのウシcDNA挿入体でスクリーニングされ
た。プローブは、Feinberg et al.,supraの方法を用い
て調製され、そして、放射ラベルしたDNAが、Elutip−
Ｄ（登録商標）カラムを用いて精製された。円形フィル
ターに結合した（12個の150mmプレートにある600,000pf
uの）プラークは、50％ホルムアミド、20mM Tris−HCl
（pH7.5）、1x Denhardt溶液、10％デキストラン硫酸、
0.11％SDS、および106cpm/mlの［32P］ラベルしたプロ
ーブ（109cpm/μｇ）を含んだ溶液中で、42℃で、一晩
ハイブリダイズした。フィルターは、室温にて、15分
間、6x SSC/0.1％SDSで三度洗浄し、そして、45℃で、1
5分間、0.1x SSC/0.1％SDSで二度洗浄した。フィルター
は、Ｘ線フィルムに一晩曝した。Ausubel et al.,supr
a。
この最初のスクリーニングから、52個の推定クローン
が同定された。これらクローンの20個が任意に選択さ
れ、再移植とスクリーニング［Maniatis et al.,supr
a］を数回反復することにより精製され、そして挿入cDN
Asは、製造者が推奨するように、in vivo削除［Short e
t al.,supra］によって、pBluescript SK（−）へサブ
クローニングされた。これらクローンから調製されたプ
ラスミドDNAは、制限分析および／または配列決定によ
り解析された。この研究から、最も大きな読取枠を表現
する4.2kb cDNAが同定された。他の推定クローンからの
cDNA挿入体は短く、挿入端のヌクレオチド配列の基づい
た同一のものであるように思われた。
推定cGS−PDE cDNAsは、製造者が指示しているよう
に、Sequenase（登録商標）あるいはTaq Trak（登録商
標）キットを用いてSangerの方法［Sanger et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463−5467］の修正法によっ
て配列決定された。鋳型は、製造者の使用説明書に従っ
たエキソヌクレアーゼIIおよびヤエナリ・ヌクレアーゼ
を用いたベクター、pBluescript SK（−）（Stratagene
社）での一連の巣状削除［Heinkoff,Gene,28:351−359
（1984）］を構築することにより、cDNAsから調製され
た。この方法によって、重複した鋳型が得られなかった
場合には、cDNAsは好適な制限エンドヌクレアーゼ部位
で開裂されてpBluescriptにサブクローニングされる
か、あるいは配列決定のための鋳型を用意するために特
定のオリゴマーが製造される。一本鎖DNA鋳型は、製造
者（Stratagene社）が推奨するように、pBluescriptプ
ラスミド［Levinson,et al.,supra］に宿るヘルパー・
ファージ感染XL1細胞によって分泌されたファージから
のDNAを単離することにより選抜した。GENEBANK（Relea
se 66.0）、EMBL（Release 25.0）、およびNBRF核酸（R
elease 36.0）、およびタンパク質（Release 26.0）デ
ータベースの相同関係調査が、Devereux et al.,Nuc.Ac
ids Res.,12:387−395（1984）のGenetics Computer Gr
oupソフトウェアー・パッケージによって提供されたWor
ldsearch、FASTAおよびTFASTAプログラムを用いて実施
された。
p3CGS−5 cDNAクローン挿入体の大きな読取枠によっ
てコードされるヌクレオチド配列および推定アミノ酸配
列を、配列番号:38および配列番号:39に示した。最初の
メチオニン・コドンから始まって、cDNAは算定分子量約
103,000の921残基ポリペプチドをコードする。この配列
に先んじる終止コドンは無いものの、反対開始メチオニ
ン一致配列［Kozak、J.Cell Biol.,108:229−241（198
9）］は同定されていた。転写終止一致配列［Birnstiel
et al.,Cell,41:349−359（1985）］に先んじられたcD
NAの3'端の36アデノシン残基は、cGS−PDE mRNAの3'未
翻訳配列のすべてが、このクローンによって表現されて
いることを示唆している。
S49細胞［Bourne et al.,J.Cell.Physiol.,85:611−6
20（1975）］の推定ホスホジエステラーゼ欠陥（PPD）
株は、DEAEデキストラン法を用いて、cGS−PDE cDNAで
一過的に形質変換した。cGS−PDE cDNAは、pZEM 228と
称する、亜鉛誘導できるメタロチオネイン・プロモータ
ーに続き、SV40転写終止配列に先がけた、哺乳類発現ベ
クターにある独特のBamH Iクローニング部位に繋がれ
た。DNAは、製造者が指示したように、Qiagen pack−50
0カラムを用いて大規模プラスミド調製物から精製され
た。PPD−S49細胞は、10％心臓不活化ウマ血清、50μg/
mlペニシリンＧ、および50μg/mlストレプトマイシン硫
酸を含むDMEMにて、37℃、水飽和７％二酸化炭素雰囲気
下で培養した。形質変換に先立って、細胞の集合100mm
プレートは、当初の1/5の密度で、再移植され、24−36
時間インキュベートした。典型的な形質変換実験におい
て、PPD−S49（50−80％集合）は、Tris緩衝化食塩水で
洗浄し、約２×107個の細胞が、1ml TBS中の400μg DEA
Eデキストランと混合した10μｇのDNAで形質変換した。
細胞は、20分ごとにゆっくり攪拌して、37℃で、１時間
インキュベートした。次に、最終濃度が10％になるよう
DMSOが添加され、ピペットで吸引・排出して直ちに混合
した。２分後、細胞は15容量部のTBSで希釈され、遠心
分離で回収され、そしてTBSとDMEMで連続的に洗浄し
た。細胞は、完全培地に再懸濁され、新鮮な100mmプレ
ート（１−2x107細胞/10mm/プレート）に播種された。2
4時間後、細胞はTBSのみ、あるいは（最終濃度が125μ
Ｍの）硫酸亜鉛を含むTBSで処理され、さらに24時間イ
ンキュベートした。最終細胞ペレットは、2mlの均質化
緩衝液（40mM Tris−HCl;pH＝7.5、15mMベンズアミジ
ン、15mM β−メルカプトエタノール、0.7μg/mlペプス
タインＡ、0.5μg/mlロイペプチン、および5mM EDTA）
に再懸濁され、dunceホモジェナイザーを用いて氷上で
粉砕した。均質化物は、４℃で、５分間、10,000xgで遠
心分離され、上清はホスホジエステラーゼ活性およびタ
ンパク質濃度について分析された。
cGS PDE活性は、Martins et al.,J.Biol.Chem.,257:1
973−1979（1982）にあるように基質として［3H］cAMP
を用いた先に示した方法によって決定した。ホスホジエ
ステラーゼ分析は、三つ並行して行った。標準としてBS
Aを用いたBradford分析法［Bradford,Anal.Biochem.,7
2:248−254（1976）］が、タンパク質を定量するために
用いられた。
亜鉛処理を行わない場合、cGS PDE−ZEM 228構築物あ
るいはベクターのみで形質変換されたPPD S49細胞で
は、基本活性あるいはcGMP刺激ホスホジエステラーゼ活
性の増加は検出されなかった。しかしながら、ベクター
のみでなく、cGS−PDE cDNAで形質変換した亜鉛処理し
た細胞は、cDNAがcGS−PDEをコードすることを示す、cG
MP強化cAMPホスホジエステラーゼ活性を発現した。均質
化物と50,000xg上清の総活性には、顕著な相違は認めら
れなかった。
COS−７細胞でのcGS−PDE cDNAの一過的発現が、実施
例Ｉのようにして行われた。p3CGS−５の4.2kb断片が、
Hind IIIとNot Iを用いて単離され、同じ酵素で消化さ
れているプラスミドpCDM8に挿入された。p3CGS−5/pCDM
8構築物で形質転換されたCOS−７細胞に生成した生成物
の特性は、下記実施例Ｖにて議論する。
実施例Ｖ ウシ脳からのcGS−PDE cDNAの単離、精製、および部分
的配列決定 A.ウシ脳cGS−PDE cDNAクローン、pBBCGSPDE−５の単離 （Merck、Sharp ＆ DohmeのRonald E.Diehl氏から提
供された）λ ZAPベクターで構築されたウシ脳cDNAライ
ブラリーが、（p3CGS−５）ヌクレオチド位置番号１−4
52に対応するp3CGS−5 cDNAの450bp EcoR I/Apa I制限
エンドヌクレアーゼ開裂断片でスクリーニングされた。
Feinberg et al.,supraの方法を用いてプローブが調製
され、［32P］ラベルしたDNAが、Elutip D（登録商標）
カラムを用いて精製された。円形フィルターに結合した
（12−150mmプレート上の全600,000の）プラークを、50
％ホルムアミド、20mM Tris−HCl（pH7.5）、1x Denhar
dt溶液、10％デキストラン硫酸、0.1％SDS、および106c
pm/mlの［32P］ラベルしたプローブ（109cpm/μｇ）を
含んだ溶液中で、42℃で、一晩ハイブリダイズした。フ
ィルターは、室温にて、15分間、2x SSC/0.1％SDSで三
度洗浄し、そして、45℃で、15分間、0.1x SSC/0.1％SD
Sで二度洗浄した。フィルターは、Ｘ線フィルムに一晩
曝した。
この最初のスクリーニングから40個の推定クローンを
選び取り、その内の６個を任意に選抜して、再移植とス
クリーニングを数回反復して精製した［Maniatis et a
l.,supra］。挿入cDNAは、製造者の推奨にあるように、
in vivo削除によってpBluescript SK（−）にサブクロ
ーニングした。各クローンの培地から調製したプラスミ
ドcDNAは、SequenaseおよびTaq Trak配列決定キットを
用いて両端から配列決定を行った。この実験から得られ
た配列は、ウシ脳cDNAクローンpBBCGSPDE−５がcGS−PD
E cDNAであり、５−端側の副腎cGS−PDE cDNAとは相違
することを確認した。
（タンパク質のアミノ末端領域をコードする）pBBCGS
PDE−５挿入体の5'末端の部分的配列解析は、配列番号:
40に示したセンス鎖を示し、一方で、該挿入体の3'末端
の配列決定は、配列番号:41に示したアンチセンス配列
を示した。
B.ウシ脳cGS−PDE cDNAクローン、pBBCGSPDE−７の単離 上記した最初の一連の精製から選択された40個の推定
クローンを、それぞれ宿主XL1細胞にスポットし、37℃
で、一晩インキュベートした。プラークを、（p3CGS−
５ヌクレオチド位置番号2661−3034に対応する）p3CGS
−5 cDNAの370bp Pst I/Sma I制限エンドヌクレアーゼ
開裂断片によってスクリーニングされた。プローブは、
Feinberg et al.,supra,の方法を用いて調製され、［32
P］ラベルしたDNAをElutip−Ｄ（登録商標）カラムで精
製した。円形フィルターに結合しているプラークを、50
％ホルムアミド、20mM Tris−HCl（pH7.5）、1x Denhar
dt溶液、10％デキストラン硫酸、0.1％SDS、および106c
pm/mlの［32P］ラベルしたプローブ（109cpm/μｇ）を
含んで溶液中で、42℃で、一晩ハイブリダイズした。フ
ィルターは、室温にて、15分間、2x SSC/0.1％SDSで三
度洗浄し、そして、45℃で、15分間、0.1x SSC/0.1％SD
Sで二度洗浄した。フィルターは、Ｘ線フィルムに一晩
曝した。
移植と再スクリーニングを数回反復した後、６つの推
定クローンが精製され、両端から配列決定を行った。cD
NAクローンpBBCGSPDE−７の５−端側の配列は、クロー
ンpBBCGSPDE−５と同一であったが、副腎由来クローンp
3CGS−５とは異なっていた。pBBCGSPDE−7 cDNAクロー
ンの３−端側の配列は、p3CGS−５挿入配列と同一であ
った。
pBBCGSPDE−７挿入体の配列解析は、配列番号:42にあ
るDNA配列と配列番号:43のアミノ酸配列を示した。
大きな読取枠は、副腎cGS−PDEイソ酵素（921残基）
とほぼ同一の942残基ポリペプチドをコードする。これ
ら二つのイソ酵素の第一次構造における相違点は、脳cG
S−PDEのアミノ末端残基１−46、および副腎cGS−PDEの
残基１−25にある。脳および副腎cGS−PDEの残りのカル
ボキシ末端残基は同一である。
COS−７細胞での一過的発現のために、Hind IIIおよ
びNot Iを用いてpBBCGSPDE−７の3.8kb断片が単離さ
れ、Hind IIIおよびNot I制限エンドヌクレアーゼで切
断されたプラスミドpCDM8に挿入された。組み換えpBBCG
SPDE−7/pCDM8構築物は、COS−７細胞を一過的に形質変
換するために用いられた。次いで、pBBCGSPDE−7/pCDM8
構築物および実施例IVにて調製したp3CGS−5/pCDM8構築
物の特性を、比較した。膜と上清画分は、形質変換した
COS−７細胞の抽出物から調製され、cGS−PDE活性に関
して分析された。pBBCGSPDE−7/pCDM8およびp3CGS−5/p
CDM8プラスミド構築物双方が、COS−７細胞抽出物に
て、cGS−PDE活性を呈し、その活性の大半は上清画分で
検出された。しかしながら、pBBCGSPDE−7/pCDM8構築物
で形質変換したCOS−７細胞抽出物からの膜において、p
3CGS−5/pCDM8構築物で形質変換したCOS−７細胞から調
製した膜よりも10倍高いパーセント数の全cGS−PDE活性
が検出された。これら結果は、副腎cGS−PDEに関して、
pBBCGSPDE−7 cDNAによってコードされたイソ酵素が、
細胞膜と優先的に関連することを示すものである。
実施例VI ヒトcGS−PDE cDNAsの取得のためのcGS−PDEウシ副腎cD
NAの使用 ウシ・サイクリックGMP−刺激ホスホジエステラーゼ
をコードするcDNAクローンに相同な、いくつかのヒトcD
NAクローンが、ウシcDNAから誘導した核酸プローブを用
いたハイブリダイゼーションによって単離された。配列
解析とハイブリダイゼーション研究の組み合わせは、こ
れらヒトcDNAクローンが、ヒト・ホスホジエステラーゼ
に対応する読取枠を含んでいることを示している。
cDNAライブラリーは、ウシcGS−PDEをコードする4.2k
b cDNA挿入体を含むプラスミドp3CGS−５からのDNAで調
査した。このプラスミドは、制限酵素Sma IおよびEcoR
Iで消化した。cDNA挿入体から誘導した約3.0kb断片は単
離され、アガロースゲル電気泳動で精製された。この断
片は、PDEの全読取枠を含んでいる。この断片は、任意
プライミングにより、放射性ヌクレオチドでラベルし
た。
cDNAライブラリーは、プレート当たり約50,000プラー
クの密度で、150mmペトリ皿に置かれた。二つのニトロ
セルロースフィルターのレプリカを調製した。放射性核
酸プローブを、50％ホルムアミド、5x SSPE（0.9M塩化
ナトリウム、0.05M NaH2PO4・H2O、0.04M水酸化ナトリ
ウム、および0.005M Na2EDTA・H2O）、0.5％SDS、100μ
g/mlサケ精巣DNA、および5x Denhardt溶液にて、42℃
で、一晩、フィルターにハイブリダイゼーションするた
めに用いた。フィルターを室温にて洗浄し、そして、65
℃にて、0.1％SDSを含む2x SSC中で洗浄した。陽性プラ
ークは精製され、その挿入体は標準的手法によって、DN
A配列解析用の適切な配列決定用ベクターにサブクロー
ニングされた。
まず、（Clontech、任意の、dTプライム化した）ヒト
海馬mRNAから調製されたλgt10 cDNAライブラリーがス
クリーニングされた。検査した約500,000プラークの
内、33個がプローブとハイブリダイズした。これらファ
ージの一つを、cDNA挿入体を除去するためにEcoR Iで消
化した。このEcoR I断片を含む挿入体を、EcoR Iで消化
されたBluescript KSにクローニングし、そして子牛腸
アルカリホスファターゼで処理した。この反応の一つの
生成物が、ウシcGS−PDE cDNAと比較した際に大きな相
違点が認められる、プラスミドpGSPDE9.2であった。pGS
PDE9.2挿入体の5'側の0.4kbが、ウシcDNAから分岐して
いた。ヒトcDNAの5'端から約0.7kbに、ウシcDNAから分
岐した0.7kb領域がある。この領域は、イントロンであ
ろう。ウシ・プローブとハイブリダイズした残りの海馬
プラークの内の25個が、PCR、ハイブリダイゼーション
および／または配列決定により検定された。この領域を
通じて、ウシとヒトcDNAsとの間における相違点は皆無
であった。
海馬ライブラリーからの他の二つのファージ、ファー
ジλGSPDE7.1およびλGSPDE7.4が、EcoR IとHind IIIで
消化された。それぞれが、cDNA挿入体の大半を含む1.8k
b断片と、約0.2kbファージλDNAを産生した。それぞれ
の場合において、cDNA挿入体を典型的に一括するEcoR I
部位の一つが、恐らくライブラリーを構築する際に壊さ
れるため、λDNAは該断片中に存在する。EcoR I/Hind I
IIは、EcoR IとHind IIIで消化されたBluescript KSに
クローニングされた。この方法により、プラスミドpGSP
DE7.1とpGSPDE7.4が得られた。cDNA挿入体は、ウシ・ホ
スホジエステラーゼcDNAの3'部分に相同のDNAをコード
する。これらクローンにある双方のcDNA挿入体は、EcoR
I部位に始まり、その配列はこの部位の直後と相同であ
る。
pGSPDE7.1およびpGSPDE7.4cDNA挿入体部分が配列決定
され、その3'端の短領域以外は同一であった。pGSPDE7.
1のcDNA挿入体は、約70個のアデニン塩基の配列で終わ
っており、一方でpGSPDE7.4のcDNA挿入体は、約20個の
アデニン塩基の配列が続く、pGSPDE7.1に存在しない三
つのヌクレオチドで終わっている。
次に、λZap II（Stratagene）にて、ヒト心臓mRNAか
ら調製されたcDNAライブラリーは、スクリーニングした
約500,000のプラークから、一つのハイブリダイズする
プラークを産生した。ハイブリダイズする挿入体を含む
Bluescript SK（−）プラスミドpGSPDE6.1が、λZap II
クローンからin vivoにて削除された。配列解析は、挿
入体がウシ・ホスホジエステラーゼcDNAと相同であるこ
とを示した。相同領域は、pGSPDE9.2からの挿入体の配
列とpGSPDE7.1もしくはpGSPDE7.4にある挿入体の配列を
接合することにより形成された配列中にあるEcoR Iの位
置にまで及ぶ。つまり、海馬からのクローンは、完全な
読取枠を形成しているものと考えられる。
ヒト胎盤mRNAから誘導したλgt10ライブラリーは、ス
クリーニングした約800,000のプラークから五つのハイ
ブリダイズするプラークを産生した。これら胎盤cDNAク
ローンは短く、その配列は、海馬cDNA pGSPDE9.2の部分
と同一であった。U118多形性神経膠cDNAライブラリーか
らの５×105プラーク、脾臓cDNAライブラリーからの５
×105プラーク、および副腎ライブラリー（クッシング
症候群）からの５×105プラークのスクリーニングで
は、ハイブリダイズするプラークは得られなかった。
ヒトとウシcGS−PDE配列との間に大きな相同性を付与
すれば、0.4kb 5'配列が人造物であるか否かを決定する
ための、ヒトcGS−PDEの5'端を含む多数の独立したcDNA
クローンを取得することが決断される。ウシcGS cDNAプ
ラスミドp3cgs5の5'端からの約0.95kb EcoR I−Hind II
I断片は、任意にプライム化され、多数のヒトcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするプローブとして用いた。
海馬ライブラリーのスクリーニングは、上記したスクリ
ーニング条件と同一条件下で実施した。残りのスクリー
ニングのすべては、下記実施例VIIのヒト心臓cDNAライ
ブラリーのスクリーニングに関して記述したようにして
実施した。（Hut78、dt−プライム化した）ヒトT4細胞
ライブラリーからの５×105プラーク、（任意に、dt−
プライム化した）海馬cDNAライブラリーからの106プラ
ーク、（dt−プライム化し、5'伸長した、Clontech）ヒ
ト肝臓cDNAライブラリーからの５×105プラーク、（dt
−プライム化した）ヒトSW1088多形性神経膠cDNAライブ
ラリーからの５×105プラーク、（任意に、dt−プライ
ム化した）同様のヒトcDNAライブラリーからの５×105
プラーク、および（任意にプライム化した）ヒト肺cDNA
ライブラリーからの1.5×106プラークのスクリーニング
では、陽性体は得られなかった。（任意にdt−プライム
化した、Stratagene）ヒト胎児脳cDNAライブラリーから
の５×105プラークのスクリーニングでは、二つの陽性
体が得られた。これらを、HFB9.1およびHFB9.2と称し
た。
Bluescript SK（−）プラスミドpHFB9.2およびpHFB9.
1は、λZap IIクローンからin vivoにて削除された。DN
A配列解析では、HFB9.1は、HFB9.2よりもさらに3'側の
約80個目のヌクレオチドから始まり、HFB9.2への配列の
約1.9kbのイントロンへ読み込む。HFB9.2は、cGS−PDE
の全読取枠を覆うが、停止コドンから後の、イントロン
と思われる59個のヌクレオチドを読み込む。双方共に、
5'側の0.4kbとpGSPDE9.2に見られる推定したイントロン
が欠けている。HFB9.2の全読取枠が、単離され、酵母発
現ベクターpBNY6Nにて組み立てられた。pHcgs6nと称す
る得られたプラスミドは、EcoR I/Xho I挿入体として、
cDNAのコード領域を含む。挿入体のDNAおよび推定アミ
ノ酸配列を、配列番号:44および45にそれぞれ示した。
実施例VII ヒトCaM−PDE 61kDa cDNAの取得のためのCaM−PDE 61kD
aウシ脳cDNAの使用 ウシ61kDa CaM−PDEをコードするcDNAと相同な、ヒト
cDNAクローン、λCaM H6aとλCaM H3aが、ウシ特異性酵
素をコードするcDNAから誘導された核酸プローブを用い
たハイブリダイゼーションによって得られた。配列解析
とハイブリダイゼーション研究の組み合わせは、λCaM
H6aが、ヒトCaM−PDEをコードする読取枠の大半を含む
ことを示している。
ヒトDNAを単離するために用いたハイブリダイゼーシ
ョン・プローブは、PCR処理によるウシ肺組織の第一鎖
状cDNAから誘導された。具体的には、実施例ＩにてPCR
−2Sと称した23−merのオリゴヌクレオチド（配列番号:
1参照）は、pCAM−40挿入体のコード領域の大部分に相
当する1098塩基対のcDNA断片を作成するために、実施例
ＩおよびIIIの一般的手法に従って、アミノ酸配列、 のpCAM挿入配列を基にした、冗長なアンチセンス23−
merのオリゴヌクレオチド（PCR−5AS）およびウシ肺cDN
Aと、PCR反応において結合した。PCR生成物は、0.5μg/
mlのエチジウムブロミドを含む0.4M Tris−酢酸/0.001M
EDTA緩衝液を用いた１％アガロース・ゲルにて精製し
た。DNA生成物は、紫外線で視覚化され、カミソリ刃で
ゲルよりきれいに摘出され、Geneclean II試薬キットを
用いて精製され、そして、EcoR V切断したpBluescript
ベクターDNAに繋がれた。
PCR増幅生成物がCAM−PDE cDNAsであるか否かを決定
するために、サブクローニングしたPCR DNA生成物は、T
3およびT7プロモーター・プライマーと、Sequenaseある
いはTaq Polymerase配列決定キットのいずれかを用い
て、両端から配列決定を行った。このDNAの各端から約2
50塩基は、ウシCAM−PDEのアミノ酸配列と比較され、PC
R DNA生成物が、部分的CAM PDE cDNAであることが確認
された。このクローンは、pCAM−1000と称され、pCAM−
40の挿入体の409から1505のヌクレオチドに対応する1.1
kb核酸の挿入体を含んでいた。この1.1kb断片は、アガ
ロース・ゲル電気泳動で精製され、そして、制限酵素Ac
c Iで消化された。この二つの断片は分離され、そし
て、アガロース・ゲル電気泳動で精製された。これら分
離された断片は、任意プライミングにより、放射性ヌク
レオチドがラベルされた。
ヒトcDNAライブラリーを、150mmペトリ皿に、皿当た
り約50,000プラークの密度で移植され、そして、複製ニ
トロセルロース・フィルター・レプリカが調製された。
各プローブは、各組の複製フィルターにハイブリダイズ
された。フィルターは、3x SSC、0.1％sarkosyl、50μg
/mlサケ精巣DNA、10x Denhardt溶液、20mM燐酸ナトリウ
ム（pH6.8）にて、65℃で、一晩ハイブリダイズした。
フィルターは、65℃で、0.1％SDSを含んだ2x SSCで洗浄
した。
ヒト海馬mRNAから調製したλgt10ライブラリーは、ス
クリーニングした約500,000プラークから、三つのハイ
ブリダイズするプラークを産生した。これら三つのハイ
ブリダイズしたプラークの内、二つは双方のプローブと
ハイブリダイズし、三番目のものは、二つのプローブよ
りも長いプローブとハイブリダイズした。λCam H6aク
ローンは、pCAM−40のウシ・クローンをコードするcDNA
に相同な、約2kb挿入体を含む。
λCam H6a cDNAは、配列解析のために、プラスミドBl
uescript KSにサブクローニングされた。cDNAライブラ
リーはEcoR Iリンカーで構築されてきたが、cDNA挿入体
の側面に位置すべきEcoR I部位の一つが、EcoR Iで切断
されていなかった。そして、cDNAは、約0.7kb EcoR I/H
ind III断片（pcamH6C）、および約1.3kbのcDNAと側面
に位置する0.25kbのλgt10ベクターDNA（pcamH6B）を含
む約1.6kb Hind III断片の二つの断片としてサブクロー
ニングした。DNA配列解析は、それが、コード領域の中
程にある二つの塩基対が欠けていると思われるヒトcDNA
を除いて、ウシ61k CaM−PDEと相同なヒトCaM−PDEの大
半をコードしていることを示している。これら欠けてい
るヌクレオチドは、最大の相同性を示すpCAM−40ウシ61
kDa CaM−PDE（配列番号:5）と対照すれば、ヒトcDNA配
列の626および627の位置に対応する。
ウシ61kDa CaM−PDEプローブでスクリーニングされた
海馬cDNAライブラリーからの他のcDNAクローンは、λca
mH2aであった。λcamH6a cDNAの場合のように、挿入体
の両端に存在すべき二つのEcoR I部位の一つのみを切断
する。このcDNAのための最初のサブクローニングとDNA
配列解析は、側面に位置するλgt10ベクター・アーム中
のオリゴで作成されたPCR断片を利用した。このcDNA
は、λcamH6aでの挿入体の5'端の多くと重複しており、
ウシ配列から推定された二つのヌクレオチドをさらに含
み、そして、PDE読取枠を維持することを必要とする。
λcamH2a挿入体も、イニシエーター・メチオニンと、Hi
nd III部位の下流の、二つのイントロンを含んでいるよ
うに思われる。（pcamH6Cによって覆われる領域に相当
する）λcamH2aからのEcoR I/Hind III断片は、プラス
ミドBluescript SK-にサブクローニングされ、pcamH2A
−16と称された。これは、下記する酵母発現プラスミド
の構築における、さらに二つの塩基対の源として用いら
れた。
二つの異なるプラスミドが、酵母にて、ヒトCaM−PDE
発現のために構築された。一方のプラスミド、pHcam61
−6N−７は、全読取枠を含んでいる。二つ目のプラスミ
ド、pHcam61met140は、（ヌクレオチド位置505にて始ま
る）内部メチオニンから始まり、読取枠の終端まで伸び
る。これら発現プラスミドは、読取枠の3'部分を修飾
し、そして、3'に二つの異なる修飾した5'端を付加する
ことによって構築される。pHcam61−6N−７のcDNA挿入
体の配列を配列番号:48に示し、それによってコードさ
れるCaM−PDEの推定アミノ酸配列を配列番号:49に示し
た。cDNA挿入体の構築中に、826の位置のヌクレオチド
は、ＴからＣに改変されたが、コードされたアミノ酸は
保存されていた。上記したように、プラスミドpHcam61m
et140は、pHcam61−6N−７のコード領域の最初の140個
のコドンが欠けているcDNA挿入体を有しているが、その
他は同一である。
三番目のcDNA、λcamH3aは、約2.7kb挿入体を含んで
いた。このcDNA挿入体は、配列解析のためにサブクロー
ニングされた。cDNAライブラリーは、EcoR Iで構築され
てきたが、λcamH3a中に挿入されたcDNAは、EcoR Iで摘
出することはできなかった。恐らく、EcoR I部位の一つ
は、ライブラリーの構築中に壊されたものと思われる。
cDNA挿入体は、λクローンからHind IIIおよびEcoR Iで
の消化によって摘出された。この消化によって、cDNA挿
入体に付いたλgt10の左アームからのDNAの一部分を含
む0.6kb Hind III断片と、cDNA挿入体の残りの部分を含
む約2.4kbのHind III/EcoR I断片、の二つの関連する断
片を産生する。これら二つの断片は、約3kbの断片を産
生するために、プラスミドBluescript KSにて組み立て
られる。小さなHind III断片の配向は、最初のλクロー
ンと同じであった。このサブクローンは、pcamH3EFとし
て知られている。このcDNAはウシCaM−PDE 61kDa cDNA
からのウシ・プローブとハイブリダイズするが、配列解
析は、異なるCaM−PDE遺伝子の生成物であると思われる
こと示した。プラスミドpcamH3EFは、全読取枠であろう
ものを含んでおり、その大半の長さにわたって、pHcam6
1−6N−７の挿入体によってコードされたタンパク質
と、約75％相同であるタンパク質をコードする。DNAと
推定アミノ酸配列を、配列番号:50と51にそれぞれ示し
た。pcamH3EFのヌクレオチド80と100の間の領域のDNA配
列は判然としていない。この領域は、イニシエーター・
メチオニン・コドンの5'側であるので、読取枠には効果
が及ばない。
pcamH3EFの約2.4kbの断片は、制限酵素Hind IIIとEco
R Iでの消化に続いて、ゲル精製された。この断片は、
上記したスクリーニング方法と同様に、さらにヒトcDNA
ライブラリーをスクリーニングするために用いられた。
ヒト心臓cDNAライブラリー（Stratagene）からの約５×
105個のプラークのスクリーニングは、pcamH3EFプロー
ブにハイブリダイズする二つのプラークを産生した。Bl
uescript SK-プラスミドpcamHellaは、これら陽性λZap
IIクローンの一つからin vivoにて摘出された。cDNA挿
入体のDNAと推定アミノ酸配列を、配列番号:52と53にそ
れぞれ示した。pcamHellaの配列解析は、pcamH3EFのヌ
クレオチド位置610にて挿入が始まり、DNA配列がpcamH3
EFのそれから分岐する位置であるヌクレオチド位置2066
までほとんど同一であった。pcamHellaのcDNA挿入体
は、約0.6kbにまで続いていた。この分岐の結果、cDNA
にある読取枠によってコードされるタンパク質のカルボ
キシ末端が改変される。pcamH3EF cDNAは、634アミノ酸
（分子量72,207）のタンパク質をコードすることができ
た。pcamHellaのcDNAの5'が、pcamH3EFの5'（ヌクレオ
チド位置610の5'）と同じであると仮定すれば、pcamHel
laは、709アミノ酸（分子量80,759）をコードできる。
これら3'分岐端は、代替接合、接合の欠如、もしくはク
ローニング過程で近接して並べた関連のないDNA配列の
結果によるものであろう。
実施例VIII 酵母表現型欠陥の相補性のためのウシおよびヒトPDE cD
NAの発現 この実施例は、酵母ホスホジエステラーゼ遺伝子の突
然変異に関連する熱ショック表現型を抑制する機能性PD
E発現物質の能力を実証する酵母中でのウシおよびPDEク
ローンの発現に関し、さらに発現生成物の生化学的分析
にも関する。これら実験に用いた宿主細胞は、共に熱シ
ョック感受性、すなわち、55−56℃程度の昇温下に曝し
た細胞の生存不能によって特徴づけられる表現型に起因
するpde1-、pde2-であるS.cerevisiae酵母株10DAB（ATC
C受託No.74049）およびYKS45である。これら相補性実験
において、挿入された遺伝子生成物が熱ショック表現型
を顕著に修飾することが認められた。さらに、この能力
は、化学化合物の哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激性お
よびcGMP刺激性サイクリックヌクレオチド・ホスホジエ
ステラーゼのin vivoでの酵素活性を修飾する能力（お
よび、特に阻害する能力）の検定するよう設計したシス
テムの可能性を実証している。
A.CaM−PDEをコードするcDNAの発現による酵母表現型相
補性酵母発現プラズミドpADNS（ATCC受託No.68588）お
よびpADNS（ATCC受託No.68587）へ挿入する2.2kb cDNA
断片は、ポリメラーゼ連鎖反応によるプラズミドpCAM−
408（実施例Ｉ）から誘導された。要約すれば、下記のP
CR増幅が、pCAM−40 DNA挿入体をベクター内においてAD
H1プロモーターと共に適切に整列するよう改変するため
に用いられた。
PCR反応に用いたオリゴヌクレオチド・プライマー
（オリゴＡ）の一つ は、塩基対位置100−116にてpCaM−40 cDNAクローン
にアニールされ、開始メチオニンコドンの前にHind III
部位を含んでいる。第二オリゴヌクレオチド・プライマ
ー（オリゴＢ） は、位置520−538にてアニールされるよう設計されて
おり、メチオニンコドンの前にHind III部位に二つの塩
基も含んでいた。三番目のオリゴヌクレオチド は、挿入体の3'であるプラスミド中の位置にアニール
された。
ある反応のために、オリゴＡとオリゴＣが、鋳型とし
てのpCAM−40共に、プライマーとして用いられた。この
反応の核酸生成物は、全読取枠を含んでいた。第二反応
では、オリゴＡとオリゴＢを、鋳型pCAM−40に、プライ
マーとして用い、カルモジュリン結合領域をコードする
cDNA配列部分が欠けた核酸生成物を産生した。これら増
幅産生物は、Hind IIIおよびNot Iで消化され、Hind II
I/Not I消化酵母発現ベクターpADNSおよびpADANSに繋が
れた。挿入体を含むプラズミド・クローンが選択され、
リチウム酢酸形質転換によりS.crevisiae株10DABに形質
転換された。
形質転換した酵母は、アミノ酸ロイシン（SC−ロイシ
ン寒天）が欠如している合成培地を含む寒天平板上に画
線培養し、30℃で、３日間生長させた。この寒天平板の
レプリカを、三つのタイプの寒天平板:SC−ロイシン寒
天のレプリカ、室温でのYPD寒天のレプリカ、および56
℃に温めたYPD寒天平板のレプリカ、を作成した。これ
ら三つの温めたレプリカを、56℃で、10、20、もしくは
30分間維持した。これらレプリカは室温にまで冷やさ
れ、すべての平板を30℃にて置いた。CaM−PDEを発現す
るよう構築したプラスミドで形質転換した酵母は、熱衝
撃耐性であった。より具体的には、全読取枠を発現する
ように設計され、さらに、pADNSもしくはpADANSのいず
れかにて、（触媒領域を含むが、カルモジュリン結合領
域を含まない）末端削除したタンパク質を発現するよう
に設計された構築物は、10DAB宿主細胞の熱ショック感
受性表現型、すなわち、56℃温度衝撃耐性、に相補的で
あった。
同様の方法で、プラズミドpHcam61−6N−７とpHcam61
met140（実施例VII）が、酵母宿主10DAB中に形質転換さ
れた。熱ショック表現型は、双方の形質転換にて抑制さ
れた。
B.発現生成物の生化学的分析 ウシCaM−PDE発現生成物も、10DAB酵母細胞からの細
胞を含まない抽出物を調製し、抽出物の生化学的ホスホ
ジエステラーゼ活性を測定することによって評価した。
この目的のために、形質転換した酵母の200ml培養液
を、液体SC−ロイシン中にて約600万細胞/mlの密度にな
るまで生育させた。細胞は遠心分離した回収され、細胞
ペレットは冷凍された。抽出物は、氷上に冷凍細胞を解
凍し、PBS 1mlと同量のガラス・ビーズと混合し、酵母
細胞を粉砕するためこれらを撹拌し、そして、不溶性の
残骸を除去するために、粉砕した細胞を約12,000xgで、
５分間、遠心分離することにより調製した。上清が、ホ
スホジエステラーゼ活性について分析された。
50μｌまでの酵母細胞の抽出物が、10×75mmガラス製
試験管中の、50mM Tris（pH8.0）、1.0mM EGTA、0.01mg
/mL BSA（ウシ血清アルブミン）、［3H］−サイクリッ
クヌオクレチド（410,000cpm/pmol）、および5mM MgCl2
の最終体積250μｌにて、30℃で、ホスホジエステラー
ゼ活性が分析された。インキュベーションを、0.5M炭酸
ナトリウムpH9.3、1M塩化ナトリウム、および0.1％SDS
からなる250μｌ加えることで終了した。ホスホジエス
テラーゼ反応の生成物は、BioRad Affi−Gel 601ホウ酸
ゲルの８×33mmカラムでのクロマトグラフィーにより、
サイクリック・ヌクレオチドから分離された。カラムは
0.25M重炭酸塩ナトリウム（pH9.3）と0.5M塩化ナトリウ
ムで平衡化された。反応はカラムにも適用された。検査
用試験管は、0.25M重炭酸塩ナトリウム（pH9.3）と0.5M
塩化ナトリウムですすぎ、このすすぎはカラムについて
も行った。ホウ酸カラムは、3.75mlの0.25M重炭酸塩ナ
トリウム（pH9.3）と0.5M塩化ナトリウムで二度洗浄さ
れ、さらに、0.5mlの50mM酢酸ナトリウム（pH4.5）によ
って洗浄された。生成物は、0.1Mソルビトールを含む2.
5mlの50mM酢酸ナトリウムによって溶出され、シンチレ
ーション瓶に回収された。溶出物は4.5mlのEcoliteシン
チレーション・カクテルと共に混合され、液体シンチレ
ーション分光測定法によって放射能が測定された。
pADNSあるいはpADANSのいずれにおいても、ウシ全読
取枠を発現するよう、また、先端削除したタンパク質を
発現するよう設計された双方の構築物は、細胞抽出物の
生化学的ホスホジエステラーゼ分析により決定した活性
タンパク質を発現した。pcam61met140を宿す10DABの抽
出物は、計測可能なホスホジエステラーゼ活性（下記、
part Dの第二方法を参照）を呈する一方で、pcamH61−6
N−７を宿す10DAB細胞の抽出物は検出可能な活性が欠如
していた。
C.cGS−PDEをコードするcDNAの発現による酵母表現型相
補性 ウシcGS−PDEをコードする4.2kb DNA断片を含むプラ
スミドp3CGS−５を、プラスミドの挿入に適した制限部
位で、cDNAの最初の147塩基を置き換えることにより、p
ADNSおよびpADANSへのクローニングに適用した。オリゴ
ヌクレオチドBS1は、Hind III部位をコードする配列 を有し、cDNA挿入体の148−165の位置にアニールし
た。BS3と称するオリゴヌクレオチド を、唯一のNsi I部位の3'の835−855の位置にアニー
ルした。Hind IIIとNsi Iでの消化を終えて得られたPCR
−生成断片は、Hind IIIとNsi Iで消化されたp3CGS−５
に繋がれ、これにより、ウシcDNAの最初の5'端を取り代
えた。この結合から得られたプラスミドは、修飾cDNA挿
入体を遊離するためにHind IIIとNot Iで消化された。
挿入体は、そのHind IIIとNot I部位にて、pADNSおよび
pADANSへクローニングされた。そして、これらプラスミ
ドは、酢酸リチウム法によって、酵母株10DABに形質転
換され、形質転換された細胞を生長させ、上記Ａにある
ように昇温下に曝した。ウシcGS−PDEを発現するよう構
築したプラスミドで形質転換した酵母は、熱衝撃耐性で
あった。
同様の方法にて、プラスミドpHcgs6n（実施例VI）
を、酢酸リチウム法によって、酵母宿主株YKS45に形質
転換した。プレートを最初、二日間、30℃にて培養し、
温めたプレートを56℃にて、10、20、30および45分間維
持した以外は、上記したようにして、熱ショック分析を
行った。ヒトcGS−PDEの全長を発現するように設計した
プラスミドで形質転換した酵母は、熱衝撃耐性であっ
た。
D.発現生成物の生化学的分析 ウシcGS−PDEの発現も、酵母からの細胞を含まない抽
出物を調製し、抽出物の生化学的ホスホジエステラーゼ
活性を測定することによって評価した。この目的のため
に、形質転換した10DAB酵母細胞の50ml培養液を、液体S
C−ロイシン中にて約1000万細胞/mlの密度になるまで生
育させた。Sherman et al.,Methods in Yeast Genetic
s,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo
r,New York（1986）。細胞は遠心分離して回収され、細
胞ペレットは一度洗浄され、そして最終細胞ペレットは
冷凍された。抽出物を調製すつために、冷凍細胞は氷上
で解凍され、PBS 1mlと同量のガラス・ビーズと共に混
合し、酵母細胞を粉砕するためこれらを撹拌し、そし
て、不溶性の残骸を除去するために遠心分離した。そし
て、上清が、上記Ｂにあるように、ホスホジエステラー
ゼ活性について分析された。pADNSあるいはpADANSのい
ずれかにある構築物は、細胞抽出物の生化学的ホスホジ
エステラーゼ活性によって決定された活性タンパク質を
発現した。
プラスミドpHcgs6nで形質転換したYKS45を、１−２×
107細胞/mlになるまでSC−ロイシン培地にて生育した。
細胞を遠心分離により採取し、細胞ペレットを凍結し
た。典型的には1010細胞を含んだ凍結細胞ペレットは、
全体積が2.5mlになるように、溶解緩衝液（25mM Tris−
HCl pH8、5mM EDTA、5mM EGTA、1mM o−フェナントロリ
ン、0.5mM AEBSF、0.01mg/mLペプスタチン、0.01mg/mL
ロイペプチン、0.01mg/mLアプロチニン、0.1％２−メル
カプトエタノール）と共に混合した。混合物を氷上で解
凍し、そして、等量のガラス・ビーズを添加した。細胞
を、氷上での、攪拌および冷却のサイクルによって粉砕
し、そして、5mlの全溶解緩衝液が加えられるように、
粉砕した細胞と追加の溶解緩衝液が混合された。懸濁液
は、12,000×ｇで、５分間、遠心分離された。上清は除
去された後、直ちに分析に供されるか、あるいはドライ
アイス・エタノール・バスにて急速冷凍されてから、−
70℃にて保存された。
ホスホジエステラーゼ活性は、5mM塩化マグネシウム
および放射性物質を含んだ（40mM Tris−HCl pH8.0、1m
M EGTA、0.1mg/mL BSA）にて、細胞抽出物の部分試料を
混合し、30分間まで30℃でインキュベートし、そして、
反応を停止緩衝液（0.1MエタノールアミンpH9.0、0.5M
硫酸アンモニウム、10mM EDTA、最終濃度0.05％のSDS）
で終了することにより分析した。生成物は、BioRad Aff
i−Gel 601でのクロマトグラフィーにより、サイクリッ
ク・ヌクレオチド物質から分離された。試料を、カラム
緩衝液（0.5M硫酸アンモニウムを含んだ0.1Mエタノール
アミン）にて平衡化したAffi−Gel 601の約0.25mlを含
んだカラムに適用した。カラムを、カラム緩衝液の0.5m
lで５回洗浄した。生成物は、0.25M酢酸の４つの0.5ml
部分試料で溶出され、5mlのEcolume（ICN Biochemical
s）と共に混合した。放射性生成物は、シンチレーショ
ン計測法により測定された。ヒトcGS−PDEを発現する酵
母からの抽出物は、サイクリックAMPおよびサイクリッ
クGMP双方を、このイソ酵素においても予期されたよう
に加水分解した。
実施例IX CaM−PDEおよびcGS−PDEポリヌクレオチドを含む組織発
現研究 A.ノザン・ブロット分析 上記実施例Ｉ、IIIおよびIVにて単離したDNAsを、様
々な組織から単離した全選択RNAsあるいはポリＡ−選択
PNAsをスクリーニングするためのプローブを作成するた
めに使用し、その結果を下記にまとめた。
1.EcoR IおよびSma Iで消化したプラスミドp3CGS−５か
ら単離した約3kbの放射ラベルしたcDNA断片を用いて、
ウシ副腎皮質、副腎髄質、心臓、大動脈、大脳皮質、脳
幹神経節、海馬、大脳、骨髄／脊髄、肝臓、腎臓皮質、
腎臓髄質、腎臓乳頭、気管、肺、脾臓およびＴ−リンパ
球組織の種類から調製したmRNAにてノザン分析を行っ
た。単一の4.5kb mRNAは、ほとんどの組織にて検出され
た。cGS−PDE mRNAの大きさは、大脳皮質、脳幹神経節
および海馬から単離したmRNAより若干大きい（約4.6k
b）ように思われた。副腎皮質においては、cGS−PDE mR
NAが豊富であった。副腎髄質および心臓においても、cG
S−PDE mRNAは豊富であった。脳と腎臓の解剖学的に異
なる領域において、特異的に発現しているようであっ
た。五つの異なる脳の領域から単離したRNAsの内、cGS
−PDE mRNAは、海馬、大脳皮質および脳幹神経節におい
て最も豊富であった。cGS−PDE転写は、大脳あるいは骨
髄および脊髄RNAsにおいては、ほとんど検出されなかっ
た。cGS−PDE mRNAは、腎臓のすべての領域にて検出さ
れたが、外皮赤色骨髄および乳頭において豊富に認めら
れた。cGS−PDE mRNAは、肝臓、気管、肺、脾臓および
Ｔ−リンパ球RNAにおいても検出された。大動脈から単
離したRNAでは、cGS−PDE mRNAは、ほとんど検出されな
かった。
2.放射ラベルしたDNAプローブが、プラスミドpCAM−40
のcDNA挿入体の熱変性した1.6kb EcoR I制限エンドヌク
レアーゼ断片にまで及ぶ任意に六つのプライム化をした
断片から調製した。ノザン分析にて、DNAプローブは、
脳の3.8および4.4kb mRNAsとハイブリダイズし、分析し
た他の組織のほとんどには、大脳皮質、脳幹神経節、海
馬、大脳、骨髄および脊髄、心臓、大動脈、腎臓髄質、
腎臓乳頭および肺が含まれる。肝臓、腎臓皮質および気
管からの3.8kb mRNAとプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンでは、比較的長い放射能写真的露光の後にのみ検出
された。
3.中枢神経系のいくつかの組織からのmRNAのノザン・ブ
ロット分析を、プローブとして（保存されたPDE触媒領
域のほとんどを含んだ）サブクローニングされ、ラベル
されたp12.3a DNA断片を用いて行った。最も強いハイブ
リダイゼーションシグナルが、脳幹神経節からのmRNAに
おいて認められ、また、強力なシグナルが、腎臓乳頭お
よび副腎髄質を含む他の組織からのmRNAにおいても認め
られた。
B.RNAse保護 1.三つのアンチセンス・リボプローブが構築された。す
なわち、p3cGS−５の触媒領域コード部分（配列番号:38
の塩基2393から2666に対応する273塩基対）に対応する
プローブIII;cGMP結合領域をコードする（塩基959から1
426に対応する468塩基対）に対応するプローブII;およ
び、アミノ末端コード領域（塩基１から457に対応する4
57塩基対）の部分およびその5'端に対応するプローブＩ
である。
試験した組織のすべてから抽出した全RNAsは、プロー
ブIIおよびIIIを完全に保護した。副腎皮質、副腎髄質
および肝臓から単離したRNAsで、リボプローブＩのほと
んど完全な保護（457塩基）も観察された。しかしなが
ら、大脳皮質、脳幹神経節および海馬から単離したRNA
は、リボプローブＩの約268−塩基断片しか保護されて
いなかった。脳RNA試料にて観察された大きな断片と同
一の大きさの部分的に保護されたプローブＩの比較的少
量が、肝臓を除く試験した組織のすべてから単離したRN
Asにおいても検出された。興味深いことに、心臓RNA
は、相補的に保護された（457塩基の）リボプローブ
と、脳RNAのような、268−塩基断片を産生した。しかし
ながら、他のいかなる組織から単離したRNAsを用いて観
察された保護パターンと異なり、部分的に保護されたリ
ボプローブＩ断片は、より豊富であるように思われた。
試験結果は、二つの異なるcGS−PDE RNA種が発現されて
いることを示唆している。
2.CaM−PDEの触媒領域もしくはCaM−結合領域のいずれ
かの部分に対応する放射性ラベルしたアンチセンス・リ
ボプローブが、pCAM−40cDNAの制限エンドヌクレアーゼ
開裂断片（Acc I/Sst IおよびTth111 I/Hinc II）から
構築された。五つの異なる脳領域（大脳皮質、脳幹神経
節、海馬、大脳、骨髄／脊髄）から単離した全RNAsは、
CaM−結合および触媒領域の双方をコードするアンチセ
ンス・リボプローブを完全に保護した。心臓、大動脈、
肺、気管および腎臓からの全RNAsは、触媒領域に対応す
るリボプローブを完全に保護するが、CaM−結合領域リ
ボプローブの約150塩基しか保護せず、61kD CaM−PDEに
構造的に関連するイソ形態が、これら組織にて発現され
ていることを示唆している。
3.アンチセンス・リボプローブは、プラスミドp12.3aを
基にして作成され、配列番号:26の塩基−１から363およ
び883から1278に対応する。前者のプローブは、推定CaM
−結合領域を通じて、5'非コード配列の113塩基と開始
メチオニン・コドン含んでいるものの、後者は触媒領域
をコードした。分析したすべての組織の中で、脳幹神経
節からのRNAが最も強力に各プローブを保護した。アミ
ノ末端を意味するプローブに相当する大きさの強力なシ
グナルが、大脳皮質、小脳、脳幹神経節、海馬および副
腎髄質RNAによる保護において観察された。たとえ、組
織が保存領域プローブのノザン分析およびRNAse保護の
シグナルを示していても、腎臓乳頭あるいは精巣RNAに
よるプローブでは何の保護も付与されず、構造的に関連
のあるイソ酵素がこの組織にて発現されていることを示
唆している。
本願発明に関して、特定の方法と組成物に関して記述
してきたが、当業者が本発明を考慮すれば、様々な改良
と変更を想到されるものと思われる。すなわち、添付し
た請求の範囲の記載にあるような限定のみが、付加され
るべきである。従って、請求した本願発明の範疇にある
同等の変更をすべて包含した、添付した請求の範囲を希
求する次第である。
配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ビーボ、ジョセフ エー ベントレー、ケリー シャルボンヌ、ハリー ソネン、ウィリアム ケイ （ii）発明の名称：哺乳類ホスホジエステラーゼをコ
ードするDNA （iii）配列の数:58 （iv）連絡先住所： （Ａ）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェース
ティン、マレー アンド ビックネル （Ｂ）番地：トゥー ファースト ナショナル プ
ラザ、20サウス クラーク ストリート （Ｃ）都市名：シカゴ （Ｄ）州名：イリノイ （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号:60603 （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体：フロッピー ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース＃
1.0、バージョン＃1.25 （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： （Ａ）出願番号:US 07/688,356 （Ｂ）出願日;04−４月−1991 （viii）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ノーランド、グレタ イー （Ｂ）登録番号:35,302 （Ｃ）参照／事件番号:27866/30822 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（312）346−5750 （Ｂ）ファックス：（312）984−9740 （Ｃ）テレックス:25−3856 （２）配列番号:1の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:20塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:1 （２）配列番号:2の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:4 （２）配列番号:5の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2291塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:100..1689 （xi）配列：配列番号:5 （２）配列番号:6の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:530アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:6 （２）配列番号:7の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:7アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:7 （２）配列番号:8の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:20塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:8 （２）配列番号:9の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:7アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:9 （２）配列番号:10の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号:10 （２）配列番号:11の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:75塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （xi）配列：配列番号:11 （２）配列番号:12の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:12 （２）配列番号:13の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号:13 （２）配列番号:14の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:54塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （xi）配列：配列番号:14 （２）配列番号:15の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:18アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:15 （２）配列番号:16の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2656塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:136..1677 （xi）配列：配列番号:16 （２）配列番号:17の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:514アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:17 （２）配列番号:18の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:18 （２）配列番号:19の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:19 （２）配列番号:20の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:20 （２）配列番号:21の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:11アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:21 （２）配列番号:22の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:412塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..412 （xi）配列：配列番号:22 （２）配列番号:23の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:137アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:23 （２）配列番号:24の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:24 （２）配列番号:25の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:25 （２）配列番号:26の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:1844塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:114..1715 （xi）配列：配列番号:26 （２）配列番号:27の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:534アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:27 （２）配列番号:28の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:14アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:28 （２）配列番号:29の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:14アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:29 （２）配列番号:30の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:30 （２）配列番号:31の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:16アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:31 （２）配列番号:32の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:34塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:32 （２）配列番号:33の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:33 （２）配列番号:34の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:34 （２）配列番号:35の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:35 （２）配列番号:36の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:36 （２）配列番号:37の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:37 （２）配列番号:38の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:4131塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:148..2910 （xi）配列：配列番号:38 （２）配列番号:39の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:921アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:39 （２）配列番号:40の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:249塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （xi）配列：配列番号:40 （２）配列番号:41の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:250塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号:41 （２）配列番号:42の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3789塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:181..3006 （xi）配列：配列番号:42 （２）配列番号:43の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:942アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:43 （２）配列番号:44の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:3044塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:12..2843 （xi）配列：配列番号:44 （２）配列番号:45の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:941アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:45 （２）配列番号:46の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:23塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （iv）アンチセンス:Yes （xi）配列：配列番号:46 （２）配列番号:47の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:47 （２）配列番号:48の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:1625塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:12..1616 （xi）配列：配列番号:48 （２）配列番号:49の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:535アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:49 （２）配列番号:50の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2693塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:176..2077 （xi）配列：配列番号:50 （２）配列番号:51の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:634アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:51 （２）配列番号:52の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:2077塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:2..1693 （xi）配列：配列番号:52 （２）配列番号:53の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:564アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号:53 （２）配列番号:54の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:54 （２）配列番号:55の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:31塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:55 （２）配列番号:56の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:16塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:56 （２）配列番号:57の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:57 （２）配列番号:58の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （xi）配列：配列番号:58
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） 前置審査 (72)発明者 ベントレー，ジェイ．，ケリー アメリカ合衆国 98155 ワシントン シアトル ＃402 エヌ．イー．サンド ポイント ウェイ 6200 (72)発明者 シャルボンヌ，ハリー アメリカ合衆国 47906 インディアナ ダブリュ．ラファイッテ アブト．デ ィー ケストラル ブルーブァード 2447 (72)発明者 ソネン，ウィリアム，ケイ. アメリカ合衆国 98155 ワシントン シアトル モントレイク テラス 236 ス エス．ダブリュ．5704 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，83（1986）ｐ．9308−9312 Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，30（1991) ｐ．7931−7947 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号:49、51または53に記載の哺乳類C
    a2+/カルモジュリン刺激サイクリックヌクレオチドホス
    ホジエステラーゼ酵素をコードするDNA配列を含む、こ
    とを特徴とする精製および単離したポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】前記DNA配列が、cDNA配列である請求項１
    に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】前記DNA配列が、ゲノミックDNA配列である
    請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヌ
    クレオチドで安定して形質転換した、ことを特徴とする
    原核宿主細胞。
  5. 【請求項５】請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヌ
    クレオチドで安定して形質転換した、ことを特徴とする
    真核宿主細胞。
  6. 【請求項６】前記宿主細胞が、酵母細胞である請求項５
    に記載の真核宿主細胞。
  7. 【請求項７】請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヌ
    クレオチドで挿入されてなる、ことを特徴とするDNAベ
    クター。
  8. 【請求項８】pcamHella（A.T.C.C.68965）の名称が付与
    された請求項７に記載のDNAベクター。
  9. 【請求項９】pcamH3EF（A.T.C.C.68964）の名称が付与
    された請求項７に記載のDNAベクター。
  10. 【請求項１０】λCAM H6a（A.T.C.C.75000）の名称が付
    与された請求項７に記載のDNAベクター。
  11. 【請求項１１】pHcam61−6N−７（A.T.C.C.68963）の名
    称が付与された請求項７に記載のDNAベクター。
  12. 【請求項１２】哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激サイク
    リックヌクレオチドホスホジエステラーゼ酵素の酵素活
    性を有する精製および単離されたポリペプチドの製造方
    法であって、以下の工程、すなわち、 （ａ）請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヌクレオ
    チドで、原核宿主細胞または真核宿主細胞を安定して形
    質転換または形質変換し：および （ｂ）当該宿主細胞にて当該ポリヌクレオチドの発現を
    許容する条件下の栄養培地で、工程（ａ）で形成した宿
    主細胞を生育する、 工程を含む、ことを特徴とするポリペプチドの製造方
    法。
  13. 【請求項１３】前記宿主細胞において前記ポリヌクレオ
    チドが発現したポリペプチド生成物を単離する工程をさ
    らに含む、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請
    求項12または13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】哺乳類Ca2+/カルモジュリン刺激サイク
    リックヌクレオチドホスホジエステラーゼ酵素の酵素活
    性を有する精製および単離されたポリヌクレオチドであ
    って、当該ポリヌクレオチドが、配列番号:48、50また
    は52に記載の配列のアンチセンス鎖とストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズする、ことを特徴とする精製
    および単離したポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】精製および単離されたCa2+/カルモジュ
    リン刺激サイクリックヌクレオチドホスホジエステラー
    ゼポリペプチドであって、当該ポリペプチドが、配列番
    号:49、51または53に記載のアミノ酸配列を含む、こと
    を特徴とする精製および単離されたポリペプチド。
  17. 【請求項１７】形質転換した原核宿主細胞または真核宿
    主細胞での、配列番号:49、51または53に記載の哺乳類C
    a2+/カルモジュリン刺激サイクリックヌクレオチドホス
    ホジエステラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の
    発現によって得られるポリペプチド生成物。
  18. 【請求項１８】哺乳類Ca2+/カルモジュリン感受性サイ
    クリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性
    を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であっ
    て、以下の工程、すなわち、 （ａ）当該ポリヌクレオチドの発現があり次第に改変感
    受性になる表現型特性を有する原核宿主細胞または真核
    宿主細胞を、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリヌ
    クレオチドで安定して形質転換し； （ｂ）宿主細胞表現型での改変に対応して当該宿主細胞
    での当該ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下の栄
    養培地で、工程（ａ）で形成した宿主細胞を生育し； （ｃ）工程（ｂ）で生育せしめた宿主細胞と分析する化
    学薬品とを接触させ；および （ｄ）工程（ｃ）で化学薬品と接触した当該宿主細胞の
    表現型の改変を決定する、 工程を含む、ことを特徴とする哺乳類Ca2+/カルモジュ
    リン感受性サイクリックヌクレオチドホスホジエステラ
    ーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分
    析方法。
  19. 【請求項１９】前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請
    求項18に記載の分析方法。
  20. 【請求項２０】哺乳類Ca2+/カルモジュリン感受性サイ
    クリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの酵素活性
    を修飾する化学薬品を同定するための分析方法であっ
    て、以下の工程、すなわち、 （ａ）当該ポリヌクレオチド配列の発現があり次第に改
    変感受性になる表現型特性を有する原核宿主細胞または
    真核宿主細胞を、請求項１乃至３のいずれかに記載のポ
    リヌクレオチドで安定して形質転換し； （ｂ）宿主細胞表現型での改変に対応して当該宿主細胞
    での当該ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下の栄
    養培地で、工程（ａ）で形成した宿主細胞を生育し； （ｃ）改変した表現型を有する宿主細胞を同定し； （ｄ）当該宿主細胞を粉砕し； （ｅ）粉砕した当該宿主細胞から細胞質ゾルを単離し；
    および （ｆ）当該細胞質ゾルでの酵素活性の改変を決定する、 工程を含む、ことを特徴とする哺乳類Ca2+/カルモジュ
    リン感受性サイクリックヌクレオチドホスホジエステラ
    ーゼの酵素活性を修飾する化学薬品を同定するための分
    析方法。
  21. 【請求項２１】前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請
    求項20に記載の分析方法。
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