ES2333691T3 - Union a gmp ciclica, materiales de fosfodiesterasa especificos a gmp ciclicos y metodos. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23.

Description

Unión a GMP cíclica, materiales de fosfodiesterasa específicos a GMP cíclicos y métodos.

El trabajo experimental descrito en el presente documento ha sido realizado en parte con los subsidios a la investigación GM15731, DK21723, DK40029 y GM41269 y el Medical Scientist Training Program Grant GM07347 concedido por los Institutos Nacionales de la Salud norteamericanos. El gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

La presente invención se refiere de forma general a una fosfodiesterasa específica de guanosín monofosfato cíclico que se une al guanosín monofosfato cíclico, designada como cGB-PDE.

Las fosfodiesterasas (PDEs) de nucleótidos cíclicos que catalizan la hidrólisis de 3'5'-nucleótidos cíclicos tales como el guanosín monofosfato cíclico (GMPc) y el adenosín monofosfato cíclico (AMPc) en los correspondientes nucleótidos 5'-monofosfatos constituyen una familia compleja de enzimas. Al mediar la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos, las isoenzimas de la PDE actúan en rutas de transducción de señales en las que participan segundos mensajeros de nucleótidos cíclicos.

Se han aislado numerosas PDEs de diferentes fuentes tisulares y muchas de las PDEs actualmente caracterizadas presentan diferencias en cuanto a propiedades biológicas, incluidas las propiedades físico-químicas, especificidad de sustrato, sensibilidad a los inhibidores, reactividad inmunológica y modo de regulación [ver Beavo y col., Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, Chichester, R.U. (1990)]. La comparación de secuencias de aminoácidos conocidas de diferentes PDEs muestra que la mayoría de las PDEs son proteínas multidominio quiméricas que tienen diferentes dominios catalíticos y reguladores [ver Charbonneau, pág. 267-296 en Beavo y col., supra]. Todas las PDEs de mamífero actualmente caracterizadas comparten una secuencia de aproximadamente 250 residuos de aminoácido de longitud que parece comprender el sitio catalítico y está situada en la región terminal carboxilo de la enzima. Los dominios PDE que interactúan con moléculas alostéricas o reguladoras se piensa que están situados dentro de las regiones amino-terminales de las isoenzimas. De acuerdo con sus propiedades biológicas, las PDEs pueden clasificarse de forma general en seis familias: las PDEs estimuladas por Ca^{2+}/calmodulina (Tipo I), las PDEs estimuladas por GMPc (Tipo II), las PDEs inhibidas por GMPc (Tipo III), las PDEs específicas de AMPc (Tipo IV), las PDEs específicas de GMPc o cGB-PDE (Tipo V), que constituye el objeto de la presente invención, y las PDE fotorreceptoras específicas de GMPc (Tipo VI).

Las PDEs que se unen a GMPc (PDEs de Tipo II, Tipo V y Tipo VI), además de tener un dominio catalítico homólogo cerca de su extremo terminal carboxilo, tienen una segunda secuencia conservada que está situada más cerca de su extremo terminal amino y que puede comprender un dominio de unión a GMPc alostérico (ver Charbonneau y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 288-292 (1990)).

Las PDEs estimuladas por GMPc (cGs-PDEs) de tipo II están ampliamente distribuidas por diferentes tipos de tejidos y se cree que existen como homodímeros de subunidades de 100-105 kDa. Las cGs-PDEs responden en condiciones fisiológicas a concentraciones elevadas de GMPc aumentando la velocidad de la hidrólisis de AMPc. La secuencia de aminoácidos de una cGs-PDE de corazón bovino y una secuencia parcial de ADNc de una cGS-PDE de corteza suprarrenal bovina se describen en LeTrong y col., Biochemistry, 29: 10280-10288 (1990) y secuencias de ADNc de cGB-PDE de longitud completa de corteza suprarrenal bovina y cerebro fetal humano se describen en PCT WO 92/18541, publicada el 29 de octubre de 1992. La secuencia de longitud completa de ADNc de corteza suprarrenal bovina también se describe en Sonnenburg y col., J. Biol Chem., 266: 17655-17661 (1991).

Las PDEs fotorreceptoras y las cGB-PDE se han descrito como PDEs específicas de GMPc porque presentan una selectividad para hidrolizar el GMPc como mínimo 50 veces mayor que la que presentan para el AMPc.

Las PDEs fotorreceptoras son la PDE del segmento externo del bastón (ROS-PDE) y la PDE del cono (COS-PDE). La estructura de la holoenzima de la ROS-PDE consiste en dos grandes subunidades \alpha (88 kDa) y \beta (84 kDa), ambas catalíticamente activas, y dos subunidades reguladoras y más pequeñas (ambas de 11 kDa). También se ha identificado una forma soluble de la ROS-PDE que incluye las subunidades \alpha, \beta y \gamma y una subunidad \delta (15 kDa) que parece ser idéntica a la subunidad de 15 kDa de COS-PDE. Un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad a de ROS-PDE de membrana bovina se describe en Ovchinnikov y col., FEBS Lett., 223: 169-173 (1987) y un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad \beta de ROS-PDE bovino se describe en Lipkin y col., J. Biol. Chem., 265: 12955-12959 (1990). Ovchinnikov y col., FEBS Lett., 204: 169-173 (1986) describen un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad y de ROS-PDE bovino y la secuencia de aminoácidos de la subunidad \delta. También se ha descrito la expresión de la ROS-PDE en cerebro en Collins y col., Genomics, 13: 698-704 (1992). La COS-PDE está compuesta de dos subunidades \alpha' (94 kDa) idénticas y tres subunidades más pequeñas de 11 kDa, 13 kDa y 15 kDa. Un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad \alpha' de COS-PDE bovino se presenta en Li y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 293-297 (1990).

La cGB-PDE ha sido purificada hasta la homogeneidad en rata [Francis y col., Methods Enzymol. 159: 722-729 (1988)] y tejido de pulmón bovino [Thomas y col., J. Biol. Chem., 265: 14964-14970 (1990), en adelante "Thomas I"]. La presencia de estas enzimas o de otras similares se ha descrito en numerosos tejidos y especies, incluida la rata y plaquetas humanas [Hamet y col. Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res., 16: 119-136 (1984)], bazo de rata [Coquil y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 127: 226-231 (1985)], pulmón de cobaya [Davis y col., J. Biol. Chem., 252: 4078-4084 (1977)], músculo liso vascular [Coquil y col., Biochim. Biophys. Acta, 631: 148-165 (1980)] y esperma de erizo de mar [Francis y col., J. Biol Chem., 255: 620-626 (1979). La cGB-PDE puede ser un homodímero que comprende dos subunidades de 93 kDa [ver Thomas I, supra]. La cGB-PDE ha demostrado contener un único sitio que no se halla en otras PDEs que se unen a GMPc conocidas que es fosforilado por la proteína quinasa dependiente de GMPc (cGK) y, con menor afinidad, por la proteína quinasa dependiente de AMPc(cAK) [ver Thomas y col., J. Biol Chem., 265: 1497114978 (1990), en adelante "Thomas II"]. La principal secuencia de aminoácidos del sitio de fosforilación y del extremo amino-terminal de un fragmento generado por digestión quimiotríptica de la cGB-PDE se describe en Thomas II, supra, y en Thomas 1, supra, respectivamente. Sin embargo, la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de cGB-PDE no ha sido anteriormente descrita.

Se encuentran descritos en la bibliografía diferentes inhibidores de diferentes tipos de PDEs. Dos inhibidores que presentan cierta especificidad por las PDEs de tipo V son el zaprinast y el dipiridamol (ver Francis y col., págs. 117-140 en Beavo y col., supra).

El estudio del ADN y de las secuencias de aminoácidos que codifican la cGB-PDE y la producción de polipéptido cGB-PDE mediante métodos recombinantes proporcionaría información y material que permitirían la identificación de nuevos agentes que modulasen de forma selectiva la actividad de las cGB-PDEs. El reconocimiento de que existen diferentes tipos o familias de isoenzimas de la PDE y que diferentes tejidos expresan diferentes complementos de PDEs ha suscitado interés en el desarrollo de moduladores de PDE que pueden tener indicaciones terapéuticas para patologías en las que intervienen rutas de transducción de señales que utilizan nucleótidos cíclicos como segundos mensajeros. Diferentes inhibidores selectivos y no selectivos de la actividad PDE se discuten en Murray y col., Biochem. Soc. Trans., 20(2): 460-464 (1992). El desarrollo de moduladores de PDE sin poder producir una PDE específica mediante técnicas de ADN recombinante resulta difícil porque todas las PDEs catalizan la misma reacción básica, presentan especificidades de sustrato superpuestas y se producen sólo en cantidades traza. Como resultado, la purificación hasta la homogeneidad de muchas PDEs es un proceso tedioso y difícil.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de disponer de información sobre secuencias de aminoácidos para la cGB-PDE y sobre métodos para identificar moduladores específicos de la actividad de la cGB-PDE.

En un primer aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido purificado y aislado que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de cGB-PDE humana que comprende los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23.

También se proporciona un polinucleótido purificado y aislado que codifica un polipéptido que comprende un fragmento de cGB-PDE humana que comprende los aminoácidos 515-819 de la SEC. ID. Nº: 23.

La presente memoria descriptiva proporciona nuevos polinucleótidos purificados y aislados (p. ej., secuencias de ADN y transcriptos de ARN, hebras sentido y antisentido, incluyendo variantes de escisión de las mismas) que codifican la PDE específica de GMPc que se une a GMPc, designada como cGB-PDE. Las secuencias de ADN de la presente memoria descriptiva incluyen secuencias genómicas y de ADNc así como secuencias de ADN químicamente sintetizadas de forma total o parcial. Las secuencias de ADN que codifican cGB-PDE que se presentan en las SEC. ID. Nº: 9 ó 20 y las secuencias de ADN que se hibridan con ellas en condiciones rigurosas o las secuencias de ADN que hibridarían con las mismas salvo por la redundancia del código genético se encuentran contempladas por la invención. La invención también contempla las réplicas biológicas (es decir, las copias de secuencias de ADN aisladas realizadas in vivo o in vitro) de secuencias de ADN de la invención. También se proporcionan construcciones recombinantes replicantes de forma autónoma tales como vectores plásmidos y de ADN viral que incorporan secuencias de cGB-PDE y especialmente vectores en donde el ADN que codifica la cGB-PDE está unido de forma operativa a una secuencia de ADN de control de expresión endógena o exógena y un terminador de transcripción. Un plásmido de expresión que ilustra de forma específica la invención es el plásmido hcgbmetl56-2 6n en E. coli, cepa JM109, que fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20832, el 4 de mayo de 1993 con el N.º de acceso 69296.

De acuerdo con otro aspecto de la divulgación, las células hospedadoras que incluyen células procariotas y eucariotas son transformadas de forma estable con secuencias de ADN de la invención de manera que permitan la expresión de los polipéptidos deseados en ellas. Las células hospedadoras que expresan productos cGB-PDE pueden servir para numerosos fines de utilidad. Estas células constituyen una fuente valiosa de anticuerpos para el desarrollo de sustancias anticuerpo específicamente inmunorreactivas con cGB-PDE. Las células hospedadoras de la invención son especialmente útiles en métodos para la producción a gran escala de polipéptidos cGB-PDE en donde las células son cultivadas en un medio de cultivo adecuado y los productos polipeptídicos deseados son aislados de las células o del medio en donde las células son cultivadas mediante, p. ej. purificación por inmunoafinidad.

Los productos cGB-PDE pueden ser obtenidos como productos aislados de fuentes celulares naturales o pueden ser sintetizados químicamente, pero preferiblemente se producen mediante procedimientos recombinantes con las células hospedadoras de la invención. El uso de células hospedadoras de mamífero se espera que proporcione estas modificaciones post-traducción (p. ej., glicosilación, truncación, lipidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para proporcionar una óptima actividad biológica en productos de expresión recombinante de la invención. Los productos cGB-PDE de la invención pueden ser polipéptidos de longitud completa, fragmentos o variantes. Las variantes pueden comprender análogos de polipéptidos cGB-PDE en donde uno o más de los aminoácidos especificados (es decir, codificados de forma natural) es eliminado o sustituido o en donde se añaden uno o más aminoácidos no especificados:

(1) sin pérdida de una o más de las actividades biológicas o características inmunológicas específicas para cGB-PDE; o (2) con desactivación específica de una actividad biológica particular de la cGB-PDE.

También están comprendidas en la presente divulgación las sustancias anticuerpo (p. ej., anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de hebra única, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR y similares) y otras proteínas de unión específicas de cGB-PDE. Las proteínas de unión específicas pueden desarrollarse utilizando cGB-PDE aislado o recombinante o variantes de la cGB-PDE o células que expresan estos productos. Las proteínas de unión son útiles, a su vez, para composiciones de inmunización así como para purificar polipéptidos cGB-PDE y para la detección o cuantificación de polipéptidos cGB-PDE en muestras de fluidos y tejidos mediante procedimientos inmunológicos conocidos. También son claramente útiles para modular (es decir, bloquear, inhibir o estimular) actividades bioquímicas de la cGB-PDE, especialmente aquellas actividades implicadas en la transducción de señales. También se contemplan los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para anticuerpos anti-cGB-PDE.

El valor científico de la información incluida en las divulgaciones de las secuencias de ADN y de aminoácidos de la invención es manifiesto. A título ilustrativo, el conocimiento de la secuencia de un ADNc para cGB-PDE permite el aislamiento mediante hibridación ADN/ADN de secuencias de ADN genómico que codifican cGB-PDE y que especifican secuencias reguladoras de control de expresión de la cGB-PDE tales como promotores, operadores y similares. Los procedimientos de hibridación ADN/ADN realizados con secuencias de ADN de la invención en condiciones rigurosas se espera que probablemente permitan aislar ADNs que codifican variantes alélicas de la cGB-PDE, otras proteínas estructuralmente relacionadas que comparten una o varias de las propiedades bioquímicas e/o inmunológicas específicas para cGB-PDE y proteínas de especies no humanas homólogas a las cGB-PDE. Los polinucleótidos de la divulgación cuando están adecuadamente marcados son útiles en ensayos de hibridación para detectar la capacidad de las células para sintetizar cGB-PDE. Los polinucleótidos de la divulgación también pueden servir de base para métodos diagnósticos útiles para identificar alteraciones genéticas en el locus cGB-PDE que subyace en un estado patológico. La divulgación también proporciona polinucleótidos anti-sentido relevantes para regular la expresión de la cGB-PDE por parte de células que normalmente expresan las mismas.

La información sobre las secuencias de ADN y de aminoácidos proporcionada por la presente invención también permite el análisis sistemático de la estructura y la función de las cGB-PDE y la definición de aquellas moléculas con las que interactuarán. Los agentes que modulan la actividad de las cGB-PDE pueden ser identificados incubando un modulador putativo con lisado de células eucariotas que expresan cGB-PDE recombinante y determinando el efecto del modulador putativo sobre la actividad de la fosfodiesterasa cGB-PDE. En una realización preferida la célula eucariota no tiene actividad endógena de fosfodiesterasa de uncleótidos cíclicos. La cepa de levadura YKS45 ilustra especialmente una célula eucariota de este tipo, la cual fue depositada en la ATCC el 19 de mayo de 1993 con el N.º de acceso 74225. La selectividad de un compuesto que modula la actividad de la cGB-PDE puede ser evaluada comparando su actividad sobre la cGB-PDE con su actividad sobre otras isoenzimas PDE. La combinación de los productos cGB-PDE recombinantes de la invención con otros productos PDE recombinantes en una serie de ensayos independientes proporciona un sistema para desarrollar moduladores selectivos de la cGB-PDE.

Los moduladores selectivos pueden incluir, p. ej. Anticuerpos y otras proteínas o péptidos que de forma específica se unen a la cGB-PDE o al ácido nucleico cGB-PDE, oligonucleótidos que de forma específica se unen a la cGB-PDE o al ácido nucleico cGB-PDE y otros compuestos no peptídicos (p. ej., moléculas orgánicas aisladas o sintéticas) que de forma específica reaccionan con cGB-PDE o con el ácido nucleico cGB-PDE. Las formas mutantes de la cGB-PDE que afectan a la actividad enzimática o a la localización celular de la cGB-PDE de tipo silvestre también están contempladas por la invención. Actualmente los objetivos preferidos en el desarrollo de moduladores selectivos incluyen, p. ej.: (1) las regiones de la cGB-PDE que entran en contacto con otras proteínas y/o localizan la cGB-PDE dentro de una célula, (2) las regiones de la cGB-PDE que se unen a un sustrato, (3) los sitios alostéricos de unión a GMPc de la cGB-PDE, (4) los sitios de fosforilación de la cGB-PDE y (5) las regiones de la cGB-PDE que están implicadas en la dimerización de subunidades cGB-PDE. Los moduladores de la actividad de la cGB-PDE pueden ser terapéuticamente útiles para el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades y condiciones fisiológicas.

Otros muchos aspectos y ventajas de la invención resultarán evidentes tras leer la siguiente descripción detallada de la misma haciendo referencia a los dibujos de la memoria descriptiva, en donde:

Las figuras 1A-1C son una alineación de los dominios catalíticos conservados de varias isoenzimas de la PDE en donde los residuos que son idénticos en todas las PDEs enumeradas se indican mediante su abreviatura de aminoácido de una letra en la línea "conservado", los residuos que son idénticos en la cGB-PDE y las PDEs fotorreceptoras sólo se indican con una estrella en la línea "Conservado" y los espacios introducidos para una alineación óptima se indican mediante puntos;

Las Figuras 2A-2C son una alineación de los dominios de unión a GMPc de varias isoenzimas de la PDE en donde los residuos que son idénticos en todas las PDEs enumeradas se indican mediante su abreviatura de aminoácido de una letra en la línea "Conservado" y los espacios introducidos para una óptima alineación se indican con puntos;

La Figura 3 es una alineación de repeticiones internamente homólogas de varias isoenzimas de la PDE en donde los residuos idénticos en cada repetición A y B de todas las PDEs de unión a GMPc enumeradas se indican mediante su abreviatura de aminoácido de una letra en la línea "Conservado" y las estrellas en la línea "Conservado" representan posiciones en las que todos los residuos están químicamente conservados;

La Figura 4 ilustra esquemáticamente la organización de dominios de la cGB-PDE;

La Figura 5 es un gráfico de barras que representa los resultados de experimentos en los que se analizaron extractos de células COS transfectadas con secuencias de cGB-PDE de bovino o extractos de células COS no transfectadas para la actividad fosfodiesterasa utilizando 20 \muM de GMPc o 20 \muM de AMPc como sustrato;

La Figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de ensayos de extractos de células transfectadas con secuencias de cGB-PDE de bovino para analizar la actividad de la fosfodiesterasa de GMPc en presencia de una serie de concentraciones de inhibidores de fosfodiesterasa, incluyendo dipiridamol (cuadrados cerrados), zaprinast (círculos cerrados), metoximetilxantina (triángulos cerrados) y rolipram (círculos abiertos);

La Figura 7 es un gráfico de barras que presenta los resultados de experimentos en los que se analizaron extractos celulares de células COS transfectadas con secuencias de cGB-PDE de bovino o células COS no transfectadas de control para determinar la actividad de unión a [^{3}H]GMPc en ausencia (-) o presencia (+) de IBMX 0,2 mM; y

La Figura 8 es un gráfico de los resultados de ensayos en los que se analizaron extractos de células transfectadas con secuencias de cGB-PDE de bovino para determinar la actividad de unión a [^{3}H]GMPc en presencia de un exceso de AMPc (círculos abiertos) o GMPc (círculos cerrados) no marcado en las concentraciones indicadas.

Los Ejemplos 10-12 ilustran la invención. Los restantes ejemplos se proporcionan a título informativo. El Ejemplo 1 describe el aislamiento de un fragmento de ADNc de cGB-PDE bovina mediante PCR y el posterior aislamiento de un ADNc de cGB-PDE de longitud completa utilizando el fragmento obtenido mediante PCR como sonda. En el ejemplo 2 se presenta un análisis de la relación entre la secuencia de aminoácidos de cGB-PDE bovina y las secuencias notificadas para otras PDEs. En el ejemplo 3 se presenta un análisis Northern blot del ARNm de cGB-PDE en diferentes tejidos bovinos. La expresión del ADNc de cGB-PDE bovina en células COS se describe en el ejemplo 4. En el ejemplo 5 se presentan los resultados de ensayos del producto de expresión de la célula COS de cGB-PDE para determinar la actividad de la fosfodiesterasa, la actividad de unión a GMPc y la actividad de la Zn^{2+} hidrolasa. En el ejemplo 6 se describe el aislamiento de ADNc humano homólogo al ADNc de cGB-PDE bovina. La expresión de un ADNc de cGB-PDE humana en células de levadura se presenta en el Ejemplo 7. Los ensayos de protección de ARNsas para detectar cGB-PDE en tejidos humanos se describen en el Ejemplo 8. En el Ejemplo 9 se describe la expresión bacteriana del ADNc de cGB-PDE humana y el desarrollo de anticuerpos que reaccionan con el producto de expresión de cGB-PDE bacteriana. En el ejemplo 10 se describen análogos y fragmentos de cGB-PDE. La generación de anticuerpos monoclonales que reconocen cGB-PDE se describe en el Ejemplo 11. El Ejemplo 12 se refiere al uso de productos recombinantes de cGB-PDE de la invención para desarrollar agentes que modulen de forma selectiva las actividades biológicas de la cGB-PDE.

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Ejemplo 1

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para aislar un fragmento de ADNc que codifica una porción de cGB-PDE de la primera hebra de ADNc de pulmón bovino. Se diseñaron cebadores PCR sentido y antisentido totalmente redundantes basados en la secuencia de aminoácidos cGB-PDE parcial descrita en Thomas I, supra, y nueva información de secuencia de aminoácidos parcial.

A. Purificación de la proteína cGB-PDE

La cGB-PDE fue purificada según se describe en Thomas I, supra, o mediante una modificación de este método según se describe a continuación.

Se obtuvieron pulmones bovinos frescos (5-10 kg) de un matadero y estos se colocaron inmediatamente sobre hielo. El tejido se trituró y se combinó con tampón PEM frío (fosfato sódico 20 mM, pH 6,8, que contenía EDTA 2 mM y \beta-mercaptoetanol 25 mM). Tras realizar una homogeneización y centrifugación, el sobrenadarte resultante se incubó con 4-7 litros de DEAE-celulosa (Whatman, RU) durante 3-4 horas. La suspensión espesa de DEAE se filtró a continuación al vacío y se lavó con múltiples volúmenes de PEM frío. La resina se vertió en una columna de vidrio y se lavó con de tres a cuatro volúmenes de PEM. La proteína se eluyó con NaCl 100 mM en PEM y se recogieron doce fracciones de 1 litro. En las fracciones se analizó la unión a GMPc estimulada por IBMX y las actividades de la fosfodiesterasa de GMPc mediante procedimientos estándar descritos en Thomas y col., supra. Se mezclaron fracciones apropiadas, se diluyó la mezcla 2 veces con agua desionizada fría y se sometió a cromatografía Blue Sepharose® CL-6B (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). A continuación se realizó una cromatografía de adsorción por afinidad con zinc quelado utilizando una matriz de gel basada en agarosa o Sepharose. La mezcla de proteínas resultante de la etapa de quelación con cinc se trató según se describe en Thomas I, supra, o se sometió a un procedimiento de purificación modificado.

Según se describe en Thomas I, supra, la mezcla de proteínas se aplicó en múltiple cargas a una columna DEAE HPLC Bio-Sil TSK-545 (150 x 21,5 mm) (BioRad Laboratories, Hercules, CA) equilibrada en PEM a 4ºC. Tras un período de equilibrado, a un lavado con 120 ml de NaCl 50 mM en PEM le siguió una elución en gradiente lineal (NaCl 50-200 mM en PEM) de 120 ml a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto. Fracciones apropiadas se mezclaron y se concentraron en tubos de diálisis frente a Sephadex G-200 (Boehringer Mannheim Biochemicals, UK) hasta un volumen final de 1,5 ml. La mezcla concentrada de cGB-PDE se aplicó a una columna de filtración en gel HPLC (Bio-Sil TSK-250, 500 x 21,5 mm) equilibrada en fosfato sódico 100 mM, pH 6,8, EDTA 2 mM, \beta-mercaptoetanol 25 mM y se eluyó con una velocidad de flujo de 2 ml/minuto a 4ºC.

Cuando se realizó el procedimiento modificado, menos tedioso, la mezcla de proteínas se dializó frente a PEM durante 2 horas y se cargó en una columna preparativa DEAE Sephacel (Pharmacia) de 10 ml equilibrada en tampón PEM. La proteína se eluyó de forma discontinua con NaCl 0,5M en PEM, obteniéndose una concentración aproximadamente 10-15 veces superior de proteína. La muestra de proteína concentrada se cargó en una columna de filtración en gel de 800 ml (2,5 cm x 154 cm) Sephacryl S400 (Boehringer) equilibrada en NaCl 0,1 M en PEM y se eluyó a una velocidad de flujo de 1,7 ml/minuto.

La pureza de la proteína se valoró mediante tinción Coomassie tras una SDS-PACE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico). Se obtuvieron aproximadamente 0,5-3,0 mg de cGB-PDE puro por 10 kg de pulmón bovino.

Los anticuerpos policlonales de conejo específicos de la cGB-PDE bovina purificada se generaron mediante procedimientos estándar.

B. Secuenciación de aminoácidos de cGB-PDE

La cGB-PDE se fosforiló con [^{32}P]ATP y después se digerió con proteasa para obtener fosfopéptidos marcados con ^{32}P. Se fosforilaron aproximadamente 100 \mug de cGB-PDE purificada en una mezcla de reacción que contenía MgCl_{2} 9 mM, [^{32}P]ATP 9 \muM, GMPc 101.1M y 4,2 \mug de subunidad catalítica bovina purificada de proteína quinasa dependiente de AMPc (cAK) en un volumen final de 900 \mul. La subunidad catalítica de cAK se preparó de acuerdo con el método de Flockhart y col., págs. 209-215 en Marangos y col., Brain Receptor Methodologies, Part A, Academic Press, Orlando, Florida (1984). La reacción se incubó durante 30 minutos a 30ºC y se interrumpió añadiendo 60 \mul de EDTA 200 mM.

Para obtener una primera secuencia de péptidos de cGB-PDE se añadieron 3,7 \mul de una solución 1 mg/ml de \alpha-quimotripsina en tampón KPE (fosfato potásico 10 mM, pH 6, 8, con EDTA 2 mM) a 100 \mug de cGB-PDE fosforilada purificada y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC. La proteolisis se interrumpió añadiendo 50 \mul de SDS 10% y 25 \mul de \beta-mercaptoetanol. La muestra se mantuvo a ebullición hasta reducir el volumen a menos de 400 \mul y se cargó en un gel de poliacrilamida preparativo al 8% en presencia de SDS y se sometió a electroforesis a 50 mAmps. Los productos de digestión separados se identificaron mediante electroforesis sobre difluoruro de polivinilideno Immobilon (Millipore, Bedford, MA), de acuerdo con el método de Matsudaira, J. Biol. Chem, 262: 10035-10038 (1987). La proteína transferida se identificó mediante tinción con azul de Coomassie y se separó una banda de 50 kDa de la membrana para la secuenciación automática en fase gaseosa de aminoácidos. La secuencia del péptido obtenida mediante el procedimiento de digestión \alpha-quimiotríptica se describe a continuación como SEC. ID. Nº: 1.

SEC. ID. Nº: 1

REXDANRINYMYAQYVKNTM

Una segunda secuencia se obtuvo a partir de un fragmento de péptido cGB-PDE generado mediante proteolisis V8. Se añadieron aproximadamente 200 \mug de cGB-PDE purificada a MgCl_{2} 10 mM, [^{32}P] ATP 10 \muM, GMPc 1004M y 1 \mug/ml de subunidad catalítica purificada de cAK en un volumen final de 1,4 ml. La reacción se incubó durante 30 minutos a 30ºC y se terminó mediante la adición de 160 \mul de EDTA 0,2M. A continuación se añadieron 9 \mul de proteasa V8 Staphylococcal aureus 1 mg/ml (International Chemical Unclear Biomedicals, Costa Mesa, CA) diluidos en KPE y a continuación se incubaron durante 15 minutos a 30ºC. La proteolisis se interrumpió añadiendo 88 \mul de SDS 10% y 45 \mul de \beta-mercaptoetanol. Los productos de digestión se separaron mediante electroforesis en gel preparativo de poliacrilamida-SDS al 10% a 25 mAmps durante 4,5 horas. Las proteínas se identificaron mediante electroforesis y se marcaron como se ha descrito anteriormente. Se separó una banda de proteína de 28 kDa de la membrana y se sometió a una secuenciación automática de aminoácidos en fase gaseosa. La secuencia obtenida se presenta a continuación como SEC. ID. Nº: 2.

SEC. ID. Nº: 2

QSLAAAVVP

C. Amplificación por PCR de ADNc bovino

Las secuencias de aminoácidos parciales utilizadas para diseñar cebadores (SEC. ID. Nº: 3, que se muestra a continuación, y los aminoácidos 9-20 de la SEC. ID. Nº: 1) y las secuencias de los correspondientes cebadores PCR (en la nomenclatura IUPAC) se presentan a continuación, siendo la SEC. ID. Nº: 3 la secuencia incluida en Thomas I, supra.

SEC. ID. Nº: 3

100

SEC. ID. Nº: 1, aminoácidos 9-20

101

Los cebadores sentido y antisentido, sintetizados con un sintetizador de ADN Applied Biosystems Model 380A (Foster City, CA), se utilizaron en todas las combinaciones posibles para amplificar las secuencias específicas de cGB-PDE de la primera hebra de ADNc de pulmón bovino, según se describe a continuación.

Tras la precipitación con etanol, se combinaron pares de oligonucleótidos (SEC. ID. Nº: 4 ó 5 combinada con las SEC. ID. Nº: 6, 7 u 8) a 400 nM cada una en una reacción PCR. La reacción se llevó a cabo utilizando 50 ng de la primera hebra de ADNc de pulmón bovino (generada utilizando transcriptasa inversa AMV y cebadores aleatorios sobre ARNm de pulmón bovino seleccionado con oligo(dT)), dNTPs 200 \muM y 2 unidades de Taq polimerasa. La etapa inicial de desnaturalización se realizó a 94ºC durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94ºC, una etapa de apareamiento de dos minutos a 50ºC y una etapa de extensión de 2 minutos a 72ºC. La PCR se realizó con un reactor térmico Hybaid (ENK Scientific Products, Saratoga, CA) y los productos se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en Tris-acetato 40 mM y EDTA 2 mM. Se observó una banda débil de aprox. 800-840 pb con los cebadores mencionados en las SEC. ID. Nº: 4 y 7 y con los cebadores mencionados en las SEC. ID. Nº: 4 y 8. Ninguno de los otros pares de cebadores produjo bandas visibles. El producto PCR generado por amplificación con los cebadores mencionados en las SEC. ID. Nº: 4 y 7 se aisló utilizando el kit de purificación de ADN Gene Clean® (Bio101, La Jolla, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El producto PCR (20 ng) se ligó en 200 ng de pBluescript KS(+) linearizado (Stratagene, La Jolla, CA) y el constructo de plásmido resultante se utilizó para transformar células azules XL1 de E. coli (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Los positivos putativos de transformación se seleccionaron mediante secuenciación. Las secuencias obtenidas no fueron homólogas a ninguna secuencia PDE conocida o a las secuencias de cGB-PDE parciales conocidas.

La PCR se realizó de nuevo en ADNc de primera hebra de pulmón bovino utilizando los cebadores mencionados en las SEC. ID. Nº: 4 y 7. Se identificó un clon que contenía un inserto de 0,8 Kb con un único marco de lectura grande abierto. El marco de lectura abierto codificaba un polipéptido que incluía los aminoácidos KNTM (aminoácidos 17-20 de la SEC. ID. Nº: 1 que no fueron utilizados para diseñar la secuencia cebadora que se menciona en la SEC. ID. Nº: 7) y que poseía un alto grado de homología con las secuencias de aminoácidos deducidas de las cGs-PDEs, ROS-PDEs y COS-PDEs. El clon identificado corresponde a los uncleótidos 489-1312 de la SEC. ID. Nº: 9.

D. Construcción e hibridación de una biblioteca de ADNc bovino

Para obtener un ADNc que codifique una cGB-PDE de longitud completa se seleccionó una biblioteca de ADNc de pulmón bovino utilizando como sonda el inserto de ADNc marcado con ^{32}P y generado mediante PCR.

El ARN poliadenilado se preparó a partir de pulmón bovino según describen Sonnenburg y col., J. Biol Chem., 266: 17655-17661 (1991). El ADNc de primera hebra se sintetizó utilizando transcriptasa inversa AMV (Life Sciences, St. Petersburg, FL) con cebadores de hexanucleótidos aleatorios según se describe en Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1987). La segunda hebra de ADNc se sintetizó utilizando ADN Pol I en E. coli en presencia de ADN ligasa en E. coli y ARNsa H en E. coli. La selección de ADNc superiores a 500 pb se realizó mediante cromatografía Sepharose® CL-4B (Millipore). Los adaptadores EcoRI (Promega, Madison, WI) se ligaron al ADNc utilizando ADN ligasa de T4. Tras la desactivación por calor de la ligasa, el ADNc se fosforiló con polinucleótido quinasa de T4. Los adaptadores no ligados se eliminaron mediante cromatografía Sepharose® CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). El ADNc se ligó a brazos lambda Zap®II (Stratagene) defosforilados y digeridos con EcoRI y empaquetados con extractos de Gigapack® Gold (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El título de la biblioteca no amplificada fue 9,9 x 10^{5} con 18% de no recombinantes. La biblioteca se amplificó cultivando 50.000 unidades formadoras de placas (ufp) en veinte placas de 150 mm para obtener un título final de 5,95 x 10^{6} ufp/ml con 21% de no recombinantes.

La biblioteca se colocó en veinticuatro placas de 150 mm a 50.000 ufp/placa y se seleccionó con el clon ADNc marcado con ^{32}P. La sonda se preparó por el método de Feinberg y col., Anal Biochem., 137: 266-267 (1984) y el ADN marcado con ^{32}P se purificó con columnas Elutip-D® (Schleicher and Schuell Inc., Keene, NH) según el protocolo del fabricante. Se realizaron transferencias de placas utilizando filtros de nitrocelulosa de 15 cm. Después de la desnaturalización y la neutralización, el ADN se fijó sobre los filtros mediante cocción a 80ºC durante 2 horas. La hibridación se realizó a 42ºC durante la noche en una solución que contenía formamida 50%, 5X SSC (NaCl 0,75M, citrato sódico 0,75M, pH 7), fosfato sódico 25 mM (pH 7,0), solución de Denhardt 2X, sulfato de dextrano 10%, 90 11 g/ml de tARN de levadura y aproximadamente 10^{6} cpm/ml de sonda marcada con ^{32}P (5x10^{8} cpm/\mug). Los filtros se lavaron dos veces en 0,1X SSC, SDS 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos por lavado, seguido de un único lavado de 20 minutos en 0,1X SSC, SDS 1% a 45ºC. Los filtros se expusieron a continuación a una película de rayos X a -70ºC durante varios días.

Las placas que hibridaron con la sonda marcada se purificaron mediante varios ciclos de colocación repetida en placas y cribado. Los insertos de ADNc se subclonaron en el vector pBluescript SK(-) (Stratagene) mediante el método de separación in vivo descrito por el protocolo del fabricante. Se realizaron Southern blots para verificar que el ADNc rescatado hibridaba con la sonda PCR. Los ADNc de cGB-PDE putativos se secuenciaron utilizando Sequenase® versión 2.0 (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio) o kits TagTrack® (Promega).

Se aislaron tres clones de ADNc diferentes designados como cGB-2, cGB-8 y cGB-10. El ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas del clon cGB-8 se presentan en las SEC. ID. Nº: 9 y 10. La secuencia de ADN en dirección 3' del nucleótido 2686 puede representar un artefacto de clonación. La secuencia de ADN de cGB-10 es idéntica a la secuencia de cGB-8 a excepción de un uncleótido. La secuencia de ADN del clon cGB-2 diverge de la del clon cGB-8 5' en el nucleótido 219 del clon cgb-8 (ver SEC. ID. Nº: 9) y podría codificar una proteína con un extremo amino diferente.

El clon de ADNc cGB-8 tiene una longitud de 4474 pb y contiene un marco de lectura abierto grande de 2625 pb. El triplete ATG en la posición 99-101 en la secuencia de nucleótidos se prevé que sea el sitio de inicio de traducción del gen cGB-PDE porque está precedido por un codón de terminación en el marco y las bases circundantes son compatibles con el sitio de inicio del consenso Kozak para ARNms eucariotas. El codón de terminación TAG está situado en las posiciones 2724-2726 y va seguido de 1748 pb de la secuencia 3' no traducida. La secuencia de cGB-8 no contiene una secuencia de consenso de terminación de la transcripción, por tanto el clon puede no representar toda la región 3' no traducida del correspondiente ARNm.

El marco de lectura abierto del ADNc cGB-8 codifica un polipéptido de 875 aminoácidos con una masa molecular calculada de 99,5 kD. Esta masa molecular calculada es sólo ligeramente mayor que la masa molecular notificada para la cGB-PDE purificada, que ha sido estimada mediante análisis SDS-PAGE en aproximadamente 93 kDa. La secuencia de aminoácidos deducida de cGB-8 se correspondía exactamente con todas las secuencias peptídicas obtenidas de cGB-PDE purificada de pulmón bovino, lo que proporciona una fuerte evidencia de que el cGB-8 codifica cGB-PDE.

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Ejemplo 2

Una búsqueda en las bases de datos SWISS-PROT y GEnEmbl (versión de febrero de 1992) realizadas con el programa FAST A suministrado con el paquete de software Genetics Computer Group (GCG) (Madison, Wisconsin) reveló que solamente el ADN y las secuencias de aminoácidos notificadas para otras PDEs presentaban una similitud significativa con el ADN y el aminoácido deducido del clon cGB-8.

Se realizaron comparaciones apareadas entre la secuencia de aminoácidos de cGB-PDE deducida y las secuencias de otras ocho PDEs con los programas ALIGN [Dayhoff y col., Methods Enzymol., 92: 524-545 (1983)] y BESTFIT [Wilbur y col., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 80. 726-730 (1983)]. Al igual que todas las fosfodiesterasas de mamífero secuenciadas hasta el momento, la cGB-PDE contiene una secuencia conservada de dominio catalítico de aprox. 250 aminoácidos en el extremo terminal carboxilo y se cree que la mitad de las proteínas son esenciales para la actividad catalítica. Este segmento comprende los aminoácidos 578-812 de la SEC. ID. Nº: 9 y presenta una conservación de secuencia con las correspondientes regiones de otras PDEs. En la Tabla 1 se presentan los valores de identidad específicos obtenidos en comparaciones apareadas de otras PDEs con los aminoácidos 578812 de la cGB-PDE, en donde "ratdunce" es la PDE específica de AMPc de rata; "61 kCaM" es la PDE dependiente de calcio/calmodulina bovina de 61 kDa; "63 kCaM" es la PDE dependiente de calcio/calmodulina bovina de 63 kDa; "drosdunce" es la PDE de la dunce específica de AMPc de drosophila; "ROS-\alpha" es la subunidad a de ROS-PDE de bovino; "ROS-\beta" es la subunidad \beta de ROS-PDE de bovino; "COS-\alpha'" es la subunidad \alpha' de COS-PDE de bovino; y "cGs" es la cGs-PDE de bovino (612-844).

TABLA 1

1

Se realizaron múltiples alineaciones de secuencia utilizando el algoritmo de alineación progresiva [Feng y col. Methods Enzymol, 183: 375-387 (1990)] implantado en el programa PILEUP (GCG Software). Las Figs. 1A-1C muestran una alineación de secuencia múltiple del dominio catalítico propuesto de la cGB-PDE con todas las correspondientes regiones de las PDEs de la Tabla 1. Veintiocho residuos (ver los residuos indicados con una letra en las abreviaturas de aminoácido de la línea "Conservado" de las FIGURAS 1A-1C) no varían entre las diferentes isoenzimas, incluidos varios residuos de histidina conservados que se prevé jueguen un papel funcional en la catálisis. Ver Charbonneau y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, supra. El dominio catalítico de la cGB-PDE se parece más a los dominios catalíticos de las ROS-PDEs y COS-PDEs que a las correspondientes regiones de otras isoenzimas de la PDE. Existen varias regiones conservadas entre las PDEs fotorreceptoras y la cGB-PDE que no son compartidas por otras PDEs. Las posiciones de aminoácido en estas regiones que no varían en la PDE fotorreceptora y las secuencias de cGB-PDE están indicadas con estrellas en la línea "Conservado" de las Figuras 1A-1C. Las regiones de homología entre cGB-PDE y las ROS-PDEs y COS-PDEs pueden jugar un papel importante a la hora de conferir especificidad para la hidrólisis de GMPc con respecto a la hidrólisis de AMPc o para la sensibilidad a agentes farmacológicos específicos.

La similitud de secuencia entre cGB-PDE, cGs-PDE y las PDEs fotorreceptoras no se limita al dominio catalítico conservado sino que también incluye el dominio de unión a GMPc no catalítico en la mitad amino-terminal de la proteína. La optimización de la alineación entre cGB-PDE, cGs-PDE y las PDEs fotorreceptoras indica que puede existir un segmento conservado amino-terminal que incluya los aminoácidos 142-526 de la SEC. ID. Nº: 9. Un análisis pareado de la secuencia del dominio de unión a GMPc propuesto de la cGB-PDE con las correspondientes regiones de PDEs fotorreceptoras y cGs-PDE revelaron una identidad de secuencia del 26-28%. La alineación de secuencia múltiple de los dominios de unión a GMPc propuestos con las PDEs de unión a GMPc se muestra en las Figuras 2A-2C, en donde las abreviaturas son las mismas que se indican en la Tabla 1. Treinta y ocho posiciones en este dominio no catalítico parecen no variar entre todas las PDEs de unión a GMPc (ver posiciones indicadas por abreviaturas de aminoácido de una letra en la línea "Conservado" de las Figuras 2A-2C).

El dominio de unión a GMPc de las PDEs que se unen a GMPc contiene repeticiones internamente homólogas que pueden formar dos sitios de unión a GMPc similares aunque diferentes entre las diferentes subunidades o dentro de una misma subunidad. La Figura 3 muestra una alineación múltiple de la secuencia de las repeticiones a (que corresponden a los aminoácidos 228-311 de la cGB-PDE) y b (que corresponden a los aminoácidos 410-500 de la cGB-PDE) de las PDEs que se unen a GMPc. Siete residuos se mantienen invariables en cada región A y B (ver residuos indicados mediante abreviaturas de aminoácido de una letra en la línea "Conservado" de la Figura 3). Los residuos que están químicamente conservados en las regiones A y B se indican mediante estrellas en la línea "Conservado" de la Figura 3. Estudios de análogos de GMPc de la cGB-PDE apoyan la existencia de un enlace de hidrógeno entre el sitio de unión de nucleótido cíclico en la cGB-PDE y el 2'OH de GMPc.

Tres regiones de la cGB-PDE no presentan una similitud de secuencia significativa con otras isoenzimas de la PDE. Estas regiones incluyen la secuencia que flanquea al extremo terminal carboxilo del dominio catalítico (aminoácidos 812-875), la secuencia que separa los dominios que se unen a GMPc y catalíticos (aminoácidos 527-577) y la secuencia amino-terminal que se encuentra entre los aminoácidos 1-141. El sitio (la serina en la posición 92 de la SEC. ID. Nº: 10) de fosforilación de la cGB-PDE por cGK está situado en esta región amino-terminal de la secuencia. La unión de GMPc al sitio alostérico en cGB-PDE es necesaria para su fosforilación.

Una estructura de dominio propuesta de la cGB-PDE basada en las comparaciones anteriores con otras isoenzimas de la PDE se presenta en la Figura 4. Esta estructura de dominio está respaldada por los estudios bioquímicos de la cGB-PDE purificada de pulmón bovino.

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Ejemplo 3

Se estudió la presencia del ARNm de cGB-PDE en diferentes tejidos bovinos mediante hibridación de tipo Northern blot.

El ARN poliadenilado se purificó a partir de preparaciones de ARN total utilizando el kit de purificación de ARNm Poly(A) Quick® (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras de ARN (5 \mug) se cargaron sobre un gel de agarosa 1,2% y formaldehído 6,7%. La electroforesis y la transferencia de ARN se realizaron como se ha descrito anteriormente en Sonnenburg y col., supra. La prehibridación del blot de ARN se realizó durante 4 horas a 45ºC en una solución que contenía formamida 50%, 5X SSC, fosfato sódico 25 mM, pH 7, solución de Denhardt 2X, sulfato de dextrano 10% y 0,1 mg/ml de tARN de levadura. Se preparó una sonda con cebador marcado con hexanucleótidos aleatorios (5 X 10^{8} cpm/\mug) según se describe en Feinberg y col., supra, utilizando el clon cGB-8 de ADNc de 4,7 kb del ejemplo 2 separado por digestión con AccI y Sacil. La sonda se desnaturalizó con calor y se inyectó en una bolsa de electrotransferencia (6 X 10^{5} cpm/ml) después de la prehibridación. El Northern blot se hibridó durante la noche a 45ºC y después se lavó durante 15 minutos con 2X SSC, SDS 0,1% a temperatura ambiente y tres lavados de 20 minutos con 0,1X SSC y SDS 0,1% a 45ºC. El blot se expuso a una película de rayos X durante 24 horas a -70ºC. El tamaño del ARN que hibridó con la sonda de cGB-PDE se estimó utilizando una escalera de ARN de 0,24-9,5 kb marcada con bromuro de etidio y visualizada con luz UV.

El ADNc de cGB-PDE marcado con ^{32}P hibridó con una única especie de ARN de pulmón bovino de 6,8 kb. También se detectó una banda de ARNm de idéntico tamaño en ARN poliadenilado aislado de tráquea, aorta, riñón y bazo bovinos.

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Ejemplo 4

El ADNc de cGB-PDE en el clon cGB-8 del ejemplo 2 se expresó en células COS-7 (ATCC CRL1651).

Una porción del ADNc de cGB-8 se aisló después de la digestión con la enzima de restricción Xbal. Xbal corta en una posición en la secuencia policonector pBluescript situada a 30 pb en sentido del extremo 5' del inserto cGB-8 y en la posición 3359 dentro del inserto cGB-8. El fragmento de 3389 pb resultante, que contiene toda la región de codificación de cGB-8, se ligó a continuación en el sitio de clonación XbaI único del vector de expresión pCDM8 (Invitrogen, San Diego, CA). El plásmido pCDM8 es un vector de expresión eucariota de 4,5 kb que contiene un promotor y un potenciador de citomegalovirus, un origen de replicación derivado de SV40, una señal de poliadenilación, un origen de replicación procariota (derivado de pBR322) y un marcador genético procariota (supF). Las células MC1061/P3 de E. coli (Invitrogen) se transformaron con los productos de ligadura resultantes y las colonias positivas de la transformación se cribaron para obtener una adecuada orientación del inserto cGB-8 mediante PCR y análisis con enzimas de restricción. El constructo de expresión resultante que contenía el inserto cGB-8 en la orientación correcta se denomina pCDM8-cGB-PDE.

El ADN de pCDM8-cGB-PDE se purificó a partir de preparaciones de plásmido a gran escala utilizando columnas Qiagen pack-500 (Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células COS-7 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal bovino 10%, 50 \mug/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina a 37ºC en una atmósfera humidificada al 5% con CO_{2}. Aproximadamente 24 horas antes de la transfección se volvieron a colocar placas confluentes de 100 mm de células a una cuarta parte o una quinta parte de la densidad original. En un experimento típico de transfección, las células se lavaron con tampón que contenía NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, fosfato potásico 1, 1 mM y fosfato sódico 8, 1 mM, pH 7,2 (PBS). A continuación se añadieron a cada placa 4-5 ml de DMEM que contenía NuSerum 10% (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). La transfección con 10 \mug de ADN de pCDM8-cGB-PDE o ADN de vector pCDM8 mezclado con 400 \mug de DEAE-dextrano (Pharmacia) en 60 \mul de TBS [solución salina tamponada con Tris: Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,6 mM, CaCl_{2} 0,7 mM y MgCl_{2} 0,5 mM] se realizó añadiendo gota a gota la mezcla en cada placa. Las células se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 4 horas y después se trataron con dimetilsulfóxido 10% en PBS durante 1 minuto. Después de 2 minutos se eliminó el dimetilsulfóxido, las células se lavaron con PBS y se incubaron en medio completo. Después de 48 horas se suspendieron las células en 0,5-1 ml de tampón de homogeneización frío [Tris-HCl 40 mM (pH 7,5), benzamidina 15 mM, \beta-mercaptoetanol 15 mM, 0,7 \mug/ml de pepstatina A, 0,5 \mug/ml de leupeptina y EDTA 5 \muM] por placa de células y se rompieron utilizando un homogeneizador Dounce. Los extractos de célula completa resultante se analizaron en cuanto a actividad de la fosfodiesterasa, actividad de unión a GMPc y concentración total de proteínas, según se describe a continuación en el ejemplo 5.

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Ejemplo 5

Se midió la actividad de la fosfodiesterasa en los extractos de las células COS transfectadas del ejemplo 4 o en los extractos de las células COS transfectadas de control utilizando una modificación del procedimiento de ensayo descrito para las cGs-PDE en Martins y col., J.Biol. Chem., 257: 1973-1979 (1982). Se cosecharon las células y se prepararon extractos a las 48 horas de la transfección. Las mezclas de incubación contenían tampón MOPS 40 mM (pH 7), EDTA 0,8 mM, acetato de magnesio 15 mM, 2 mg/ml de albúmina de suero bovino, [^{3}H]GMPc o [^{3}H]AMPc 20 \muM (100.000-200.000 cpm/ensayo) y extracto de células COS-7 en un volumen total de 250 \mul. La mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a 30ºC y después se interrumpió mediante ebullición. A continuación se añadieron 10 \mul de venoma 10 mg/ml de Crotalus atrox (Sigma) y la mezcla se incubó durante 10 minutos a 30ºC. Los productos de nucleósido se separaron de los nucleótidos sin reaccionar según se describe en Martins y col., supra. En todos los estudios se hidrolizó menos del 15% del nucleótido cíclico marcado con [^{3}H] total durante la reacción.

Los resultados de los ensayos se presentan en la Figura 5, en donde los resultados mostrados son promedios de tres transfecciones separadas. La transfección de células COS-7 con ADN de pCDM8-cGB-PDE produjo la expresión de niveles aprox. 15 veces superiores de actividad de la fosfodiesterasa de GMPc con respecto a las células transfectadas de control o las células transfectadas con el vector pCDM8 solamente. En los extractos de células transfectadas con ADN de pCDM8-cGB-PDE no se detectó un aumento de la actividad de la fosfodiesterasa AMPc con respecto a las células transfectadas de control o transfectadas solamente con el vector. Estos resultados confirman que el ADNc de cGB-PDE bovina codifica una fosfodiesterasa específica de GMPc.

Los extractos de las células COS transfectadas del ejemplo 4 también fueron analizados para determinar la actividad PDE de GMPc en presencia de una serie de concentraciones de los inhibidores de la PDE zaprinast, dipiridamol (Sigma), isobutil-1-metil-8-metoximetilxantina (MeOxMeMIX) y rolipram.

Los resultados de los ensayos se presentan en la Figura 6, en donde la actividad PDE en ausencia de inhibidor se toma como 100% y cada punto representa la media de dos determinaciones separadas. Las potencias relativas de los inhibidores de PDE para inhibir la hidrólisis de GMPc por el producto proteico del ADNc de cGB-BPDE expresado fueron idénticas a las potencias notificadas para cGB-PDE nativa purificada de pulmón bovino (Thomas 1, supra). Los valores CI50 calculados a partir de las curvas de la Figura 6 son los siguientes: zaprinast (círculos cerrados), 2 \muM; dipiridamol (cuadrados cerrados), 3,5 \muM; McOxMeMIX (triángulos cerrados), 30 \muM; y rolipram (círculos abiertos), >300 \muM. El valor CIso de zaprinast, un inhibidor relativamente específico de las PDEs específicas de GMPc, fue al menos dos órdenes de magnitud inferior al notificado para la inhibición de la actividad de la fosfodiesterasa de la cGs-PDE o de la fosfodiesterasa inhibida por GMPc (cGi-PDEs) (Reeves y col., págs. 300-316 en Beavo y col., supra). El dipirimadol, un inhibidor efectivo de PDEs específicas de AMPc y GMPc seleccionadas, también fue un potente inhibidor de la cGB-PDE expresada. El inhibidor relativamente selectivo de fosfodiesterasas estimuladas por calcio/calmodulina (CaM-PDEs), McOxMeMDC, fue aproximadamente 10 veces menos potente que el zaprinast y el dipiridamol, en acuerdo con los resultados obtenidos para la actividad de la cGB-PDE purificada de pulmón bovino. El rolipram, un potente inhibidor de fosfodisterasas de AMPc de baja K_{m}, fue un inhibidor deficiente del producto proteico del ADNc de cGB-PDE expresado. Estos resultados muestran que el ADNc de cGB-PDE codifica una fosfodiesterasa que posee actividad catalítica característica de la cGB-PDE aislada de tejido bovino, verificando así la identidad del clon cGB-8 de ADNc como una cGB-PDE.

Resulta interesante destacar que aunque las potencias relativas de los inhibidores de PDE para inhibir la hidrólisis de GMPc fueron idénticas para la cGB-PDE recombinante y aislada de bovino, los valores CI_{50} absolutos para todos los inhibidores analizados fueron 2-7 veces superiores para la cGB-PDE recombinante. Esta diferencia no pudo ser atribuida a los efectos de cualquier factor presente en extractos celulares de COS-7 sobre la actividad hidrolítica de la GMPc ya que la cGB-PDE aislada de tejido bovino presentó una cinética de inhibición idéntica a la de la enzima pura, o cuando fue añadida de nuevo a extractos de células COS-7 transfectadas de control. Esta diferencia aparente de sensibilidad farmacológica puede deberse a una diferencia sutil en la estructura del producto proteico del ADNc de cGB-PDE recombinante y cGB-PDE de pulmón bovino como, p. ej. una diferencia en la modificación post-traducción en o cerca del sitio catalítico. De forma alternativa, esta diferencia puede deberse a una alteración de la actividad catalítica de la cGB-PDE de pulmón bovino a lo largo de las diferentes etapas de purificación.

Los extractos celulares se analizaron para determinar la actividad de unión a [^{3}H]GMPc en ausencia o en presencia de 3-isobutil-1-metilaxantina (IBMX) 0,2 mM (Sigma), un inhibidor competitivo de la hidrólisis de GMPc. El ensayo de unión a GMPc, modificado con respecto al ensayo descrito en Thomas I, supra, se realizó en un volumen total de 80 \mul. Se combinaron 60 de extracto celular con 20 \mul de un cóctel de unión de manera que la concentración final de componentes de la mezcla fuera [^{3}H]GMPc 1 \muM, AMPc 51.1M y 8-bromo-GMPc 10 \muM. El AMPc y el 8-bromo-GMPc se añadieron a [^{3}H]GMPc de unión en bloque a cAK y a cGK, respectivamente. Los ensayos se realizaron en ausencia y en presencia de IBMX 0,2 mM. La reacción se inició añadiendo el extracto celular y se incubó durante 60 minutos a 0ºC. La filtración de las mezclas de reacción se realizó según se describe en Thomas I, supra. Los blancos se determinaron mediante incubaciones paralelas con tampón de homogeneización que sustituía a los extractos celulares, o con un exceso 100 veces superior de GMPc no marcado. Con ambos métodos se obtuvieron resultados similares. La concentración total de proteínas de los extractos celulares se determinó por el método de Bradford, Anal. Biochem., 72:248-254 (1976) usando albúmina de suero bovino como patrón.

Los resultados del ensayo se presentan en la Figura 7. Cuando se midieron a [^{3}H]GMPc 1 \muM en presencia de IBMX 0,2 mM, los extractos de células COS-7 transfectados con pCDM8-cGB-PDE presentaron una actividad de unión a GMPc ocho veces superior a la de los extractos de células transfectadas de control. No se observó una estimulación con IBMX de la unión a GMPc en segundo plano que sugiera la presencia de una cantidad pequeña o nula de cGB-PDE endógeno en los extractos celulares de COS-7. En los extractos de células transfectadas de pCDM8-cGB-PDE la actividad específica de GMPc se estimuló a un nivel aproximadamente 1,8 veces superior al añadir IBMX 0,2 mM. La capacidad del IBMX para estimular en 2-5 veces la unión a GMPc es una propiedad específica de las fosfodiesterasas que se unen a GMPc.

Los extractos celulares se analizaron como se ha descrito anteriormente para determinar la actividad de unión a [^{3}H]GMPc (en donde la concentración de [^{3}H]GMPc fue 2,5 \muM) en presencia de un exceso de AMPc o GMPc no marcado. Los resultados se presentan en la Figura 8, en donde la unión a GMPc en ausencia de competidor no marcado se consideró como el 100% y cada punto representa la media de tres determinaciones separadas. La actividad de unión del producto proteico codificado por el ADNc de cGB-PDE fue específica de GMPc con respecto a AMPc. Se necesitaron concentraciones menos de 10 veces superiores de GMPc no marcado para inhibir la actividad de unión a [^{3}H]GMPc en un 50% mientras que fueron necesarias concentraciones aprox. 100 veces superiores de AMPc para conseguir el mismo grado de inhibición.

Los resultados presentados en este ejemplo muestran que el ADNc de cGB-PDE codifica una fosfodiesterasa que posee actividades bioquímicas características de la cGB-PDE nativa.

Los dominios catalíticos de PDEs de mamífero y una PDE de Drosophila contienen dos secuencias conservadas en tándem (HX_{3} HX_{24-26}E) que son motivos de unión a Zn^{2+} típicos en hidrolasas Zn^{2+} como la termolisina [Vallee y Auld, Biochem., 29: 56475659 (1990)]. La cGB-PDE se une a Zn^{2+} en presencia de grandes excesos de Mg^{2+}, Mn^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ca^{2+} o Cd^{2+}. En ausencia de metal añadido, la cGB-PDE tiene una actividad PDE que es aproximadamente un 20% de la actividad máxima producida en presencia de Mg^{2+} 40 mM y esta actividad basal es inhibida por la 1,10-fenantrolina o ED-TA. Esto sugiere que uno o varios metales traza son los responsables de la actividad PDE basal a pesar de aplicar tratamientos exhaustivos para eliminar los metales. La actividad PDE es estimulada por la adición de Zn^{2+} (0,02-1 \muM) o Co^{2+} (1-20 \muM) pero no por Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ca^{3+}, Cd^{2+} o Cu^{3+}. El Zn^{2+} aumenta la actividad PDE basal hasta el 70% de la estimulación máxima producida por Mg^{2+} 40 mM. El efecto estimulador del Zn^{2+} en estos ensayos puede verse comprometido por un efecto inhibidor causado por concentraciones de Zn^{2+} > 1 \muM. La actividad PDE soportada por Zn^{2+} y la unión a Zn^{2+} de la cGB-PDE se producen a concentraciones similares de Zn^{2+}. Por tanto, la cGB-PDE parece ser una hidrolasa Zn^{2+} y el Zn^{2+} parece jugar un papel crítico en la actividad de la enzima. Ver, Colbran y col., The FASEB J., 8: Abstract 2148 (15 de marzo de 1994).

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Ejemplo 6

Varios clones de ADNc humano, homólogo al clon de ADNc bovino que codifica la cGB-PDE, fueron aislados por hibridación en condiciones rigurosas utilizando una sonda de ácido nucleico que corresponde a una porción del clon cGB-8 bovino (nucleótidos 489-1312 de la SEC. ID. Nº: 9).

Aislamiento de fragmentos de ADNc que codifican cGB-PDE humana

Tres bibliotecas de ADNc humano (dos procedentes de glioblastomas y una de pulmón) en el vector lambda Zap fueron sondadas con la secuencia cGB-PDE bovina. El clon generado por PCR correspondiente a los nucleótidos 484-1312 de la SEC. ID. Nº: 9 que se describe en el ejemplo 1 fue digerido con EcoRI y SalI y el inserto de ADNc resultante de 0,8 kb se aisló y purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. El fragmento se marcó con nucleótidos radiactivos utilizando un kit de marcaje aleatorio de ADN (Boehringer).

Las bibliotecas de ADNc se colocaron en placas de Petri de 150 mm con una densidad de aprox. 50.000 placas por plato. Se prepararon réplicas duplicadas de filtro de nitrocelulosa. El tampón de prehibridación fue 3X SSC, sarcosilo 0,1%, solución de Denhardt 10X, fosfato sódico 20 mM (pH 6,8) y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. La prehibridación se realizó a 65ºC durante como mínimo 30 minutos. La hibridación se realizó a 65ºC durante la noche en un tampón de la misma composición añadiendo 1-5X10^{5} cpm/ml de sonda. Los filtros se lavaron a 65ºC en 2X SSC y SDS 0,1%. Las placas de hibridación se detectaron mediante autorradiografía. El número de ADNc que hibridaron con la sonda bovina y el número de ADNc cribados se presentan en la Tabla 2 siguiente.

TABLA 2

2

Los plásmidos designados como cgbS2.1, cgbS3.1, cgbL23.1, cgbL27.1 y cgbS27.1 se separaron in vivo de los clones lambda Zap y a continuación se secuenciaron.

El clon cgbS3.1 contiene 2060 pb de un marco de lectura abierto de PDE seguido de un intrón putativo. El análisis del clon cgbS2.1 revela que corresponde a las posiciones 664 - 2060 del clon cgbS3.1 y que extiende el marco de lectura abierto de PDE otros 585 pb antes de la lectura en un intrón putativo. Las secuencias de la región 5' no traducida putativa y las porciones que codifican la proteína de los clones cgbS2.1 y cgbS3.1 se presentan en las SEC. ID. Nº: 11 y 12, respectivamente. Cuando se combinan los dos ADNc se obtiene una secuencia que contiene aproximadamente 2,7 kb de una lectura abierta que codifica una PDE. Los otros tres ADNc no se extendieron más allá de los extremos 5' o 3' que el cgbS3.1 de ADNc o el cgbS2.1 de ADNc.

Para aislar otros ADNc se prepararon sondas específicas para el extremo 5' del clon cgbS3.1 y el extremo 3' del clon cgbS2.1 y se utilizaron para cribar una biblioteca de ADNc de glioblastoma SW1088 y una biblioteca de ADNc de aorta humana. Una sonda 5' se derivó del clon cgbS3.1 por PCR usando los cebadores cgbS3.1S311 y cgbL23.1Al286, cuyas secuencias se presentan en las SEC. ID. Nº: 8 y 9, respectivamente, y a continuación.

Cebador cgbS3.1S311 (SEC. ID. Nº: 13)

5' GCCACCAGAGAAATGGTC 3'

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Cebador cgbL23.1A1286 (SEC. ID. Nº: 14)

5' ACAATGGGTCTAAGAGGC 3'

La reacción PCR se realizó en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 50 pg de ADNc de cgbS3.1, dNTP 0,2 mM, 10 \mug/ml de cada cebador, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8, 2, MgCl_{2} 1, 5 mM y Taq polimerasa. Tras una desnaturalización inicial de cuatro minutos a 94ºC se realizaron 30 ciclos de un minuto a 94ºC, dos minutos a 50ºC y cuatro minutos a 72ºC. Se generó un fragmento de aprox. 0,2 kb mediante la reacción PCR que correspondió a los nucleótidos 300-496 del clon cgbS3.1.

Una sonda 3' se derivó de cgbS2.1 de ADNc mediante PCR utilizando los oligos cgbL23.1S1190 y cgbS2.1A231 cuyas secuencias se presentan a continuación.

Cebador cgbL23. 1S1190 (SEC. ID. Nº: 15)

5' TCAGTGCATGTTTGCTGC 3'

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Cebador cgbS2.1A231 (SEC. ID. Nº: 16)

5' TACAAACATGTTCATCAG 3'

La reacción PCR se realizó de forma análoga a la descrita anteriormente para generar la sonda 5' obteniéndose un fragmento de aprox. 0,8 kb que corresponde a los nucleótidos 1358-2139 de cgbS2.1 de ADNc. Los 157 3'nucleótidos del fragmento obtenido por PCR (no mostrado en la SEC. ID. Nº: 12) se encuentran dentro del presunto intrón.

Los dos fragmentos obtenidos por PCR se purificaron y aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se marcaron con nucleótidos radiactivos mediante marcaje aleatorio. Una biblioteca de ADNc de glioblastoma SW1088 con marcaje aleatorio (1,5x10^{6} placas) se cribó con los fragmentos marcados como se ha descrito anteriormente y se aislaron 19 placas de hibridación. Se aislaron otras 50 placas de hibridación a partir de una biblioteca de ADNc de aorta humana (con cebadores dT y aleatorio, Clontech, Palo Alto, CA).

Los plásmidos se separaron in vivo de algunos de los clones lambda Zap positivos y se secuenciaron. Un clon designado como cgbS53.2, cuya secuencia se menciona en la SEC. ID. Nº: 17, contiene un inserto de aprox. 1,1 kb cuya secuencia se solapa con los últimos 61 pb de cgbS3.1 y amplía el marco de lectura abierto en otros 135 pb más allá de lo encontrado en cgbS2.1. El clon contiene un codón de terminación y aprox. 0,3 kB de secuencia 3' no traducida putativa.

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Generación de una cGB-PDE humana que codifica ADNc compuesto

Los clones cgbS3.1, cgbS2.1 y cgbS53.2 se utilizaron, según se describe en los párrafos siguientes, para construir un ADNc compuesto que contenía un marco de lectura abierto de cGB-PDE humana completa. El ADNc compuesto se designa como cgbmetl56-2 y se insertó en el vector de expresión ADH1 pBNY6N de levadura.

En primer lugar se generó un plásmido designado como cgb stop-2 que contenía el extremo 3' terminal del marco de lectura abierto de cGB-PDE. Se generó mediante PCR una porción del inserto del plásmido utilizando el clon cgbS53.2 como plantilla. Los cebadores PCR utilizados fueron cgbS2.1S1700 y cgbstop-2.

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Cebador cgbS2.1S1700 (SEC. ID. Nº: 18)

5' TTTGGAAGATCCTCATCA 3'

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Cebador cgbstop-2 (SEC. ID. Nº: 19)

5' ATGTCTCGAGTCAGTTCCGCTTGGCCTG 3'

La reacción PCR se realizó en 50 \mul que contenían 50 pg de matriz de ADN, dNTPs 0,2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,2, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, MgCl_{2} 1, 5 mM, Triton-X-100 0, 1%, 500 ng de cada cebador y 0,5 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene). La reacción se calentó a 94ºC durante 4 minutos y después se realizaron 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 50ºC y 4 minutos a 72ºC. La polimerasa se añadió durante el primer ciclo a 50ºC. El producto PCR resultante se extrajo con fenol/cloroformo, se extrajo con cloroformo, se precipitó con etanol y se cortó con las enzimas de restricción BclI y XhoI. El fragmento de restricción se purificó sobre un gel de agarosa y se eluyó.

Este fragmento se ligó al cgbS2.1 de ADNc que había sido cultivado en dam de E. coli, se cortó con las enzimas de restricción BclI y XhoI y se purificó en gel utilizando el kit Promega magic PCR. El plásmido resultante fue secuenciado para verificar que el cgbstop-2 contenía la porción 3' del marco de lectura abierto de cGB-PDE.

En segundo lugar, se generó un plásmido que llevaba el extremo 5' terminal del marco de lectura abierto de la cGB-PDE humana. Su inserto se generó mediante PCR utilizando el clon cgbS3.1 como matriz. La PCR se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando los cebadores cgbmetl56 y cgbS2.1A2150.

Cebador cgbmetl56 (SEC. ID. Nº: 20)

5' TACAGAATTCTGACCATGGAGCGGGCCGGC 3'

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Cebador cgbS2.1A2150 (SEC. ID. Nº: 21)

5' CATTCTAAGCGGATACAG 3'

El fragmento obtenido por PCR resultante se extrajo con fenol/cloroformo, se extrajo con cloroformo, se precipitó con etanol y se purificó sobre una columna Sepharose CL-6B. El fragmento se cortó con las enzimas de restricción EcoRV y EcoRI, se trató sobre gel de agarosa y se purificó haciéndolo pasar a través de lana de vidrio. Tras la extracción con fenol/cloroformo, la extracción con cloroformo y la precipitación con etanol, el fragmento se ligó en Bluescriptll SK(+) digerido con EcoRI/EcoRV para generar el plásmido cgbmetl56. Se determinó la secuencia de ADN del inserto y las uniones. El inserto contiene un nuevo sitio EcoRI y otros 5 nucleótidos más que juntos sustituyen a los 155 5'-nucleótidos originales del codón de iniciación. El inserto se extiende hasta un sitio EcoRV que comienza en 531 uncleótidos desde el codón de iniciación.

Las porciones 5' y 3' del marco de lectura abierto de cGB-PDE se ensamblaron a continuación en el vector pBNY6a. El vector pBNY6a se cortó con EcoRI y XhoI, se aisló de un gel y se combinó con el fragmento EcoRI/EcoRV purificado en gel de agarosa a partir de cgbmetl56 y el fragmento EcoRV/XhoI purificado en gel de agarosa a partir de cgbstop-2. Las uniones del inserto se secuenciaron y el constructo se denominó hcbgmetl56-2 6a.

El inserto cGB-PDE de hcbgmetl56-2 6a se desplazó a continuación al vector de expresión pBNY6n. La expresión del ADN insertado en este vector está dirigida desde el promotor y terminador ADH1 de levadura. El vector contiene el origen de replicación de 2 micras de levadura, el origen de replicación pUC19 y un gen de resistencia a la ampicilina. El vector pBNY6n se cortó con EcoRI y XhoI y se purificó en gel. El inserto EcoRI/XhoI del hcgbmetl56-2 6a se purificó en gel con columnas PCR Promega magic y se ligó en el corte pBNY6n. Se secuenciaron todas las uniones nuevas en el constructo resultante, hcgbmetl56-2 6n. El ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas del inserto de hcgbmetl56-2 6n que codifica una cGB-PDE compuesta humana se presentan en las SEC. ID. Nº: 22 y 23. El inserto se extiende desde la primera metionina en el clon cgbS3.l (nucleótido 156) hasta el codón de terminación (nucleótido 2781) en el ADNc compuesto. Puesto que en el clon cgbS3.1 la metionina más frecuente es la 5'-metionina y dado que no existen codones de terminación en el marco con la metionina y en dirección 5' de ella, el inserto en pBNY6n puede representar una forma truncada del marco de lectura abierto.

Variantes de ADNc

Se han aislado cuatro ADNc de cGB-PDE humana que son diferentes del ADNc compuesto hcgbmetl56-2 6n. A un ADNc, cgbL23.1, le falta una región interna de hcgbmetl56-2 6n (nucleótidos 997-1000 a 1444-1447). Los puntos finales exactos de la deleción no pueden ser determinados a partir de la secuencia de ADNc en estas posiciones. Tres de las cuatro variantes de ADNc tienen secuencias de extremo 5' que divergen de la secuencia hcgbmetl56-2 6n en dirección 5' del nucleótido 151 (ADNc cgbA7f, cgbA5C, cgbl2). Estos ADNc presumiblemente representan ARNms escindidos de forma alternativa o no escindidos.

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Ejemplo 7

El constructo compuesto de ADNc de cGB-PDE humana, hcgbmetl56-2 6n, se transformó en la cepa YKS45 de levadura (ATCC 74225) (MAT\alpha his3 trpl ura3 leu3 pdel::HIS3 pde2::TRP1) en la que se han eliminado dos genes de PDE endógenos. Se seleccionaron los transformantes que complementan la deficiencia leu de la cepa YKS45 y se determinó en ellos la actividad de la cGB-PDE. En los extractos de células que llevan el plásmido hcgbmetl56-2 6n se determinó la actividad de la fosfodiesterasa específica de GMP cíclico mediante el ensayo descrito a
continuación.

Un litro de células YKS45 transformadas con el plásmido cgbmetl56-2 6n y cultivadas en medio SC-leu con una densidad de 1-2x10^{7} células/ml fue cosechado tras proceder a su centrifugación, lavado una vez con agua desionizada, congelación en hielo seco/etanol y almacenamiento a -70ºC. Los pellets de células (1-1,5 ml) se descongelaron sobre hielo en presencia de un volumen igual de Tris-Cl 25 mM (pH 8,0)/EDTA 5 mM/EGTA 5 mM/o-fenantrolina 1 mM/AEBSF 0,5 mM (Calbiochem)/\beta-mercaptoetanol 0,1% y 10 \mug/ml de cada una de aprotinina, leupeptina y pepstatina A. Las células descongeladas se añadieron a 2 ml de perlas de vidrio lavadas con ácido (425-600/\muM, Sigma) en un tubo Corex de 15 ml. Las células se rompieron con 4 ciclos que consistían en aplicar agitación excéntrica durante 30 segundos en el punto 1 seguido de una incubación de 60 segundos sobre hielo. El lisado celular se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,8 \mu. En el sobrenadante se determinó la actividad PDE de GMPc de la forma siguiente: Las muestras se incubaron durante 20 minutos a 30ºC en presencia de Tris-Cl 45 mM (pH 8,0), EGTA 2 mM, EDTA 1 mM, 0,2 mg/ml de BSA, MgCl_{2} 5 mM, o-fenantrolina 0,2 mM, 2 \mug/ml de cada una de pepstatina A, leupeptina y aprotinina, AEBSF 0,1 mM, \beta-mercaptoetanol 0,02% y [^{3}H]GMPc 0,1 mM como sustrato. Se añadió AMP marcado con [^{14}C] (0,5 nCi/ensayo) como patrón de recuperación. La reacción se finalizó con tampón de parada (etanolamina 0,1M, pH 9,0, sulfato de amonio 0,5M, EDTA 10 mM, concentración final de SDS 0,05%). El producto se separó del sustrato de nucleótido cíclico mediante cromatografía sobre BioRad Affi-Gel 601. La muestra se aplicó a una columna que contenía aprox. 0,25 ml de Affi-Gel 601 equilibrado en tampón de columna (etanolamina 0,1M, pH 9,0, que contenía sulfato de amonio 0,5M). La columna se lavó cinco veces con 0,5 ml de tampón de columna. El producto se eluyó con cuatro alícuotas de 0,5 ml de ácido acético 0,25 y se mezcló con 5 ml de Ecolume (ICN Biochemicals). El producto radiactivo se midió mediante recuento por
centelleo.

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Ejemplo 8

El análisis de expresión del ARNm de cGB-PDE en tejidos humanos se realizó mediante ensayo de protección de ARNsas.

Se generó una sonda que correspondía a una porción del dominio de unión a GMPc putativo de la cGB-PDE (402 pb que corresponde a los nucleótidos 1450 a 1851 de la SEC. ID. Nº: 13) mediante PCR. El fragmento obtenido por PCR se insertó en el sitio EcoRI del plásmido pBSII SK(-) para generar el plásmido RP3. El plásmido de ADN RP3 se linearizó con XbaI y se generaron sondas antisentido mediante una modificación del kit de polimerasa ARN Stratagene T7. Veinticinco ng de plásmido linearizado se combinaron con 20 microcurios de alfa ^{32}P rUTP (800 Ci/mmol, 10 mCi/ml), tampón de transcripción 1X (TrisCl 40 mM, pH 8, MgCl_{2} 8 mM, espermidina 2 mM, NaCl 50 mM), 0,25 mM de cada uno de rATP, rGTP y rCTP, 0,1 unidades de ARNsa bloque II, DTT 5 mM, rUTP 8 \muM y 5 unidades de ARN polimerasa T7 en un volumen total de 5 \mul. La reacción se dejó continuar durante 1 hora a temperatura ambiente y después la matriz de ADN se eliminó por digestión con ADNsa libre de ARNsa. La reacción se diluyó en 100 \mul de TrisCl 40 mM, pH 8, MgCl_{2} 6 mM y NaCl 10 mM. Se añadieron cinco unidades de ADNsa libre de ARNsa y la reacción se dejó que continuara durante otros 15 minutos a 37ºC. La reacción se interrumpió mediante extracción con fenol seguida de una extracción con fenol/cloroformo. Se añadió medio volumen de NH_{4}OAc 7,5M y la sonda se precipitó con etanol.

Los ensayos de protección de ARNsas se realizaron con el kit de protección de ARNsas Ambion (Austin, TX) y 10 \mug de ARN aislado de tejidos humanos mediante un método de extracción con guanidinio ácido. La expresión del ARNm de cGB-PDE se detectó fácilmente en ARN extraído de músculo esquelético, útero, bronquio, piel, vena safena derecha, aorta y células de glioblastoma SW1088. Se observó una expresión apenas detectable en ARN extraído de aurícula derecha, ventrículo derecho, corteza renal y médula renal. Sólo se observó una protección completa de la sonda RP3. La falta de protección parcial contradice la afirmación de que el cgbL23.1 de ADNc (una variante de ADNc descrita en el ejemplo 7) representa un transcripto principal, al menos en estas muestras de ARN.

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Ejemplo 9

El antisuero policlonal se cultivó para obtener fragmentos producidos en E. coli de la cGB-PDE humana.

Una porción del ADNc de cGB-PDE humana (nucleótidos 1668-2612 de la SEC. ID. Nº: 22, aminoácidos 515-819 de la SEC. ID. Nº: 23) se amplificó mediante PCR y se insertó en el vector de expresión pGEX2T de E. coli (Pharmacia) como un fragmento BamHI/EcoRI. El plásmido pGEX2T lleva un gen resistente a la ampicilina, un gen laq I^{4} de E. coli y una porción del gen glutatión-S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum. El ADN insertado en el plásmido puede ser expresado como una proteína de fusión con GST y puede después ser escindido de la porción GST de la proteína con trombina. El plásmido resultante, designado como cgbPE3, se transformó en la cepa LE392 de E. coli (Stratagene). Las células transformadas se cultivaron a 37ºC a una DO600 de 0,6. Se añadió IPTG (isopropiltioalactopiranósido) 0,1 mM y las células se cultivaron a 37ºC durante otras 2 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lisaron mediante tratamiento ultrasónico. Los residuos celulares se retiraron mediante centrifugación y el sobrenadante se fraccionó mediante SDS-PAGE. El gel se tiñó con KCl 0,4M frío y la banda de la proteína de fusión GST-cgb se separó y electroeluyó. La porción de PDE de la proteína se separó de la porción GST mediante digestión con trombina. El digerido se fraccionó mediante SDS-PAGE y la proteína PDE se electroeluyó e inyectó por vía subcutánea en un conejo. El antisuero resultante reconoce el fragmento de cGB-PDE bovina utilizado como antígeno y la proteína cGB-PDE humana de longitud completa expresada en levadura (ver ejemplo 8).

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Ejemplo 10

Los polinucleótidos que codifican diferentes análogos de cGB-PDE y fragmentos de cGB-PDE se generaron por métodos convencionales.

A. Análogos de cGB-PDE

Todas las PDEs que se unen a GMPc conocidas contienen dos repeticiones en tándem internamente homólogas dentro de sus dominios de unión a GMPc putativos. En la cGB-PDE bovina de la invención, las repeticiones abarcan al menos los residuos 228-311 (repetición A) y 410-500 (repetición B) de la SEC. ID. Nº: 10. Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio de un ácido aspártico conservado en las repeticiones A y B de todas las PDEs que se unen a GMPc conocidas para crear análogos de la cGB-PDE que tuvieran el Asp-289 sustituido con Ala (D289A) o el Asp-478 sustituido con Ala (D478A). Las cGB-PDE recombinantes de tipo silvestre (WT) bovinas y las mutantes bovinas se expresaron en células COS-7. La cGB-PDE purificada de pulmón bovino (cGB-PDE nativa) y la cGB-PDE WT mostraron una cinética de unión a GMPc idéntica con un K_{d} de aprox. 2 \muM y un perfil de disociación curvilíneo (t_{1/2} = 1,3 horas a 4ºC). Esta curvilinealidad puede haberse debido a la presencia de diferentes sitios de alta afinidad (lento) y de baja afinidad (rápido) de unión a GMPc. El mutante D289A presentaba una afinidad significativamente reducida por GMPc (K_{d} > 20 \muM) y una única velocidad de asociación a GMPc (t_{1/2} = 0,5 horas), similar a la calculada para el sitio rápido de WT y de cGB-PDE nativa. Esto sugería la pérdida de un sitio de unión a GMPc lenta en la repetición A de este mutante. Por el contrario, el mutante D478A mostró una mayor afinidad por GMPc (K_{d} de aprox. 0,5 \muM) y una única velocidad de disociación de GMPc (t_{1/2} =2,8 horas) similar a la velocidad calculada para el sitio lento de WT y cGB-PDE nativa. Esto sugirió la pérdida de un sitio rápido cuando se modificó la repetición B. Estos resultados indican que la cGB-PDE dimérica posee dos sitios de unión a GMPc homólogos pero cinéticamente diferentes, siendo el ácido aspártico conservado crítico para la interacción con GMPc en cada sitio. Ver, Colbran y col., FASEB J., 8: Abstract 2149 (15 de mayo de 1994).

B. Polipéptidos cGB-PDE truncados amino terminales

Un polipéptido cGB-PDE humano truncado que incluía los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23 se expresó en levadura. Un inserto de ADNc que se extiende desde el sitio NcoI en el nucleótido 1555 de la SEC. ID. Nº: 22 hasta el sitio XhoI en el extremo terminal 3' de la SEC. ID. Nº: 22 fue insertado en el vector de expresión ADH2 de levadura YEpC-PADH2d [Price y col., Meth. EnzymoL, 185: 308-318 (1990)] que había sido digerido con NcoI y SaII para generar el plásmido YEpC-PADH2d HcGB. El plásmido se transformó en esferoplastos de la cepa de levadura yBJ2-54 (prcl-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 Ap-del::URA3, HIS3 Apde2::TRP1 cir'). Los genes PDE endógenos son eliminados en esta cepa. Las células se cultivaron en medio SC-leu con glucosa 2% a 10^{7} células/mi, se recogieron por filtración y se cultivaron 24 horas en medio YEP que contenía glicerol 3%. Las células se convirtieron en pellets mediante centrifugación y se almacenaron congeladas. Las células se rompieron con perlas de vidrio y en el homogeneizado celular se determinó la actividad de la fosfodiesterasa básicamente según se describe en Price y col., Anal. Biochem., 208: 155-160 (1993). El polipéptido cGB-PDE humano truncado presentó actividad de fosfodiesterasa.

C. Polipéptidos cGB-PDE truncados carboxi terminales

Se construyeron dos plásmidos diferentes que codifican polipéptidos cGB-PDE humanos truncados carboxi terminales.

El plásmido pBJ6-84Hin contiene un ADNc que codifica los aminoácidos 1-494 de la SEC. ID. Nº: 23 insertado en los sitios NcoI y SalI del vector YEpC-PADH2d. El inserto de ADNc se extiende desde el sitio NcoI en la posición 10 de nucleótido de la SEC. ID. Nº: 22 hasta el sitio HindIII en la posición de nucleótido 1494 de la SEC. ID. Nº: 22 seguido de un conector y el sitio SalI de YEpC-PADH2d.

El plásmido pBJ6-84Ban contiene un ADNc que codifica los aminoácidos 1-549 de la SEC. ID. Nº: 23 insertado en los sitios NcoI y SalI del vector YEpC-PADH2d. El inserto de ADNc se extiende desde el sitio NcoI en la posición 10 de nucleótido de la SEC. ID. Nº: 22 hasta el sitio BanI en la posición de nucleótido 1657 de la SEC. ID. Nº: 22 seguido de un conector y el sitio SalI de YEpC-PADH2d.

Los polipéptidos cGB-PDE truncados son útiles para seleccionar moduladores de la actividad de la cGB-PDE.

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Ejemplo 11

Se generaron anticuerpos monoclonales que reaccionan con cGB-PDE humana. La levadura yBJ2-54 que contenía el plásmido YEpADH2 HcGB (ejemplo 10B) se fermentó en un Microferm de New Brunswick Scientific de 10 litros. El inserto de ADNc de cGB-PDE en el plásmido YEpADH2 HcGB se extiende desde el sitio NcoI en el nucleótido 12 de la SEC. ID. Nº: 22 hasta el sitio XhoI en el extremo 3' terminal de la SEC. ID. Nº: 22. Se añadió un inóculo de 4 x 10^{9} células a 8 litros de medio que contenía SC-leu, glucosa 5%, metales traza y vitaminas traza. La fermentación se mantuvo a 26ºC, agitando a 600 rpm con el impulsor microbiano estándar y se aireó con aire comprimido a 10 volúmenes por minuto. Cuando la glucosa se redujo al 0,3% a las 24 horas de la inoculación, el cultivo se infundió con 2 litros de medio 5X YEP que contenían glicerol 15%. A las 66 horas de la inoculación se cosechó la levadura del fermento mediante centrifugación a 4.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. El rendimiento total de biomasa de esta fermentación fue aproximadamente 350 g de peso húmedo.

La enzima cGB-PDE humana se purificó a partir del pellet de células de levadura. Se utilizaron ensayos para determinar la actividad PDE utilizando GMPc 1 mM como sustrato para seguir la cromatografía de la enzima. Todas las manipulaciones cromatográficas se realizaron a 4ºC.

La levadura (29 g de peso húmedo) se resuspendió en 70 ml de tampón A (Tris 25 mM, pH 8,0, DTT 0,25 mM, MgCl_{2} 5 mM, ZnSO_{4} 10 \muM, benzamidina 1 mM) y se lisó pasándola a través de un microfluidizador a 22-24.000 psi. El lisado se centrifugó a 10.000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante se aplicó a una columna de 2,6 x 28 cm que contenía resina de intercambio aniónico Pharmacia Fast Flow Q equilibrada en tampón B que contenía BisTris-propano 20 mM, pH 6,8, DTT 0,25 mM, MgCl_{2} 1 mM y ZnSO_{4} 10 mM. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón B que contenía NaCl 0,125M y después se desarrolló con un gradiente lineal de NaCl de 0,125 a 1,0M. Las fracciones que contenían la enzima se mezclaron y aplicaron directamente a una columna de 5 x 20 cm de hidroxiapatita cerámica (BioRad) equilibrada en tampón C que contenía BisTris-propano 20 mM, pH 6,8, DTT 0,25 mM, KCl 0,25M, MgCl_{2} 1 mM y ZnSO_{4} 10 \muM. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón C y se eluyó con un gradiente lineal de fosfato potásico de 0 a 250 mM en tampón C. La enzima mezclada se concentró 8 veces mediante ultrafiltración (membrana YM30, Amicon). La enzima concentrada se cromatografió en una columna de 2,6 x 90 cm de Pharmacia Sephacryl S300 (Piscataway, NJ) equilibrada en BisTris-propano 25 mM, pH 6,8, DTT 0,25 mM, NaCl 0,25M, MgCl_{2} 1 mM y ZnSO_{4} 20 \muM. Se obtuvieron aprox. 4 mg de proteína. La enzima cGB-PDE recombinante humana constituyó aproximadamente el 90% de la proteína obtenida de acuerdo con la SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida y la tinción con azul de Coomassie.

La proteína purificada se utilizó como antígeno para obtener anticuerpos monoclonales. Cada uno de los ratones Balb/c de 19 semanas (Charles River Biotechnical Services, Inc., Wilmington, Mass.) se inmunizó por vía subcutánea con 50 \mug de enzima cGB-PDE purificada humana en una emulsión de 200 \mul que consistía en adyuvante completo de Freund al 50% (Sigma Chemical Co.). Las posteriores pulsaciones los días 20 y 43 se administraron en adyuvante incompleto de Freund. Una pulsación pre-fusión se realizó el día 86 utilizando 50 \mug de enzima en PBS. La fusión se realizó el día 90.

El bazo del ratón nº 1817 fue extraído de forma estéril y colocado en 10ml de RPMI 1640 libre de suero. Se formó una suspensión monocelular que se filtró a través de un colador celular estéril Nitex de malla 70 (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) y se lavó dos veces centrifugando a 200 g durante 5 minutos y a continuación se resuspendió el pellet en 20 ml de RPMI libre de suero. Los timocitos de 3 ratones Balb/c sin tratamiento previo se prepararon de forma similar.

Células de mieloma NS-1, mantenidas en fase logarítmica en RPMI con Fetalclon 11% (FBS) (Hyclon Laboratories, Inc., Logan, Utah) los tres días antes de la fusión, se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos y el pellet se lavó dos veces según se ha descrito en el párrafo anterior. Tras el lavado, cada suspensión celular se llevó a un volumen final de 10 ml con RPMI libre de suero y 20 \mul se diluyeron 1:50 en 1 ml de RPMI libre de suero. Se retiraron 20 \mul de cada dilución, se mezclaron con 20 \mul de tinción de azul de Tripán al 0,4% en solución salina al 0,85% (Gibco), se cargaron en un hemocitómetro (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois) y se contaron.

Se combinaron 2 x 10^{8} células de bazo con 4,0 x 10^{7} células NS-1, se centrifugó la mezcla y se aspiró el sobrenadante. El pellet celular se expelió golpeando suavemente el tubo y se añadieron 2 ml de PEG 1500 a 37ºC (50% en Hepes 75 mM, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) agitando durante 1 minuto y después se añadieron 14 ml de RPMI libre de suero durante 7 minutos. Se añadieron otros 16 ml de RPMI y las células se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos. Tras desechar el sobrenadante, el pellet se resuspendió en 200 ml de RPMI que contenía FBS 15%, hipoxantina de sodio 100 \muM, aminopterina 0,4 \muM, timidina 16 \muM (HAT) (Gibco), 25 unidades/ml de IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml. La suspensión se colocó en un matraz T225 (Corning, Reino Unido) a 37ºC durante dos horas antes de dispensarla en diez placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Reino Unido) de 200 \mul/pocillo. Las células de las placas se alimentaron los días 3, 4, 5 siguientes al día de la fusión aspirando aprox. 100 \mul de cada pocillo con una aguja 20 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul/pocillo del medio de cultivo descrito anteriormente salvo que este contenía 10 unidades/ml de IL-6 y no tenía timocitos.

La fusión se analizó inicialmente con ELISA. Las placas Immulon 4 (Dynatech) se recubrieron a 4ºC durante la noche con enzima cGB-PDE humana purificada recombinante (100 ng/pocillo en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6). Las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST). El sobrenadante de los diferentes pocillos de hibridoma se añadió a los pocillos recubiertos con enzima (50 \mul/pocillo). Tras realizar la incubación a 37ºC durante 30 minutos y el lavado como se ha indicado anteriormente, se añadieron 50 \mul de IgG(fc) de anti-ratón preparado en cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) diluido 1:3500 en PBST. Las placas se incubaron como se ha indicado anteriormente, se lavaron 4 veces con PBST y se añadieron 100 \mul de sustrato que consistía en 1 mg/ml de o-fenilendiamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml de H_{2}O_{2} 30% en citrato 100 mM, pH 4,5. La reacción de color se interrumpió a los 5 minutos añadiendo 50 \mul de H_{2}SO_{4} 15%. El valor A_{490} se leyó en un lector de placas (Dynatech).

Los pocillos C5G, E4D, FIG, F9H, FUG, J4A y J5D se retiraron y se renombraron como 102A, 102B, 102C, 102D, 102E, 102F y 102G, respectivamente, se clonaron dos o tres veces sucesivas, doblando la dilución en RPMI, FBS 15%, hipoxantina sódica 100 \muM, timidina 16 \muM y 10 unidades/ml de IL-6. Los pocillos de las placas de clon se puntuaron visualmente a los 4 días y se registró el número de colonias en los pocillos menos densos. Los pocillos seleccionados de cada clonación se analizaron con ELISA.

Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas anteriores fueron isotipados en un ensayo ELISA. Los resultados mostraron que los anticuerpos monoclonales 102A-102E eran IgGl, el 102F era IgG2b y el 102G era IgG2a.

Los siete anticuerpos monoclonales reaccionaron con cGS-PDE humana como se determinó mediante análisis Western.

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Ejemplo 12

El desarrollo de moduladores de las actividades biológicas de PDEs específicas requiere la diferenciación de las isoenzimas PDE presentes en una determinada preparación de ensayo. El enfoque enzimológico clásico de aislar PDEs de fuentes tisulares naturales y estudiar cada nueva isoenzima se ve dificultado por las limitaciones de las técnicas de purificación y la incapacidad de valorar definitivamente si se ha alcanzado una resolución completa de una isoenzima. Otro enfoque ha sido identificar las condiciones de ensayo que pudieran favorecer la contribución de una isoenzima y minimizar la contribución de otras en una preparación. Otro enfoque ha sido la separación de PDEs con medios inmunológicos. Todos estos enfoques para diferenciar isoenzimas PDE son lentos y técnicamente complejos. Como consecuencia, se han realizado numerosos intentos de desarrollar moduladores de PDE selectivos con preparaciones que contienen más de una isoenzima. Además, las preparaciones de PDE a partir de fuentes tisulares naturales permiten una proteolisis limitada y pueden contener mezclas de productos proteolíticos activos con propiedades cinéticas, reguladoras y fisiológicas diferentes a las de las PDEs de longitud completa.

Los productos polipeptídicos cGB-PDE recombinantes de la invención facilitan considerablemente el desarrollo de moduladores de cGB-PDE nuevos y específicos. El uso de enzimas recombinantes humanas para el cribado de moduladores presenta numerosas ventajas inherentes. Puede evitarse tener que purificar una isoenzima expresándola de forma recombinante en una célula huésped que no tenga actividad endógena de fosfodiesterasa (p. ej., cepa de levadura YKS45 depositada como ATCC 74225). Los compuestos de cribado frente a proteína humana evitan las complicaciones que a menudo surgen del cribado frente a proteína no humana cuando un compuesto optimizado en una proteína no humana no es específico frente a la proteína humana o no reacciona con ella. Por ejemplo, una simple diferencia de aminoácido entre los receptores de la serotonina 5HT1B humana y la de roedores da lugar a una diferencia de unión de un compuesto a los receptores [ver Oskenberg y col., Nature, 360: 161-163 (1992)]. Cuando se descubre un compuesto que modula la actividad de la cGB-PDE, su selectividad puede ser evaluada comparando su actividad en la cGB-PDE con su actividad en otras isoenzimas PDE. Por tanto, la combinación de los productos cGB-PDE recombinantes de la invención con otros productos PDE recombinantes en una serie de ensayos independientes proporciona un sistema para desarrollar moduladores selectivos de cGB-PDE. Los moduladores selectivos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos y otras proteínas o péptidos que se unen de forma específica a la cGB-PDE o al ácido nucleico de cGB-PDE, oligonucleótidos que se unen de forma específica a la cGB-PDE (ver PCT WO 93/05182, publicada el 18 de marzo de 1993, que describe métodos para seleccionar oligonucleótidos que se unen de forma selectiva a biomoléculas diana) o ácido nucleico cGB-PDE (p. ej., oligonucleótidos antisentido) y otros compuestos no peptídicos naturales o sintéticos que se unen de forma específica a la cGB-PDE o al ácido nucleico cGB-PDE. También se contemplan las formas mutantes de la cGB-PDE que alteran la actividad enzimática de la cGB-PDE o su localización en una célula. La cristalización de la cGB-PDE recombinante sola y unida a un modulador, el análisis de la estructura atómica por cristalografía de rayos X y el modelado por ordenador de estas estructuras son métodos útiles para diseñar y optimizar moduladores no peptídicos selectivos. Ver, por ejemplo, Erickson y col., Ann. Rep. Med. Chem., 27:271-289 (1992) para una revisión general del diseño de medicamentos basado en la estructura.

Los objetivos para el desarrollo de moduladores selectivos incluyen, por ejemplo: (1) las regiones de la cGB-PDE que están en contacto con otras proteínas y/o localizan la cGB-PDE dentro de una célula, (2) las regiones de la cGB-PDE que se unen a un sustrato, (3) los sitios de unión a GMPc alostéricos de la cGB-PDE, (4) las regiones que se unen a un metal de la cGB-PDE, (5) el sitio(s) de fosforilación de la cGB-PDE y (6) las regiones de la cGB-PDE implicadas en la dimerización de subunidades cGB-PDE. Aunque la presente invención se ha descrito en términos de realizaciones específicas, el experto en la técnica comprenderá que pueden realizarse variaciones y modificaciones de la misma. Igualmente, solamente aquellas limitaciones que se indican en las reivindicaciones adjuntas formarán parte de la invención.

INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: The Board of Regents of the University of Washington & ICOS Corporation

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(ii)

TÍTULO DE INVENCIÓN: Materiales y métodos de fosfodiesterasas específicas de GMP cíclico que se {}\hskip4cm unen a GMP cíclico

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Forrester & Boehmert

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Franz-Joseph Strasse 38

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(C)

CIUDAD: D-80801 Munich

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: Alemania

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con PC de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn serie #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 de mayo de 1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/068,051

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 de mayo de 1993

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: RICHARDSON, Kate

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: FB5306A/F9540EP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE COMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: +49(0)89 384 07 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: +49(0)89 34 70 10

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 524282 FORBO D

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYGAYAAYG AYGARGGNGA RCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

NO CODIFICANTE: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARCTRTTRC TRCTYCCNCT YGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAYTAYATGT AYGCNCARTA YGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

NO CODIFICANTE: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTRATRTACA TRCGNGTYAT RCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

NO CODIFICANTE: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTRATRTACA TRCGNGTYAT RCANTTYTTR TGNTAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4474 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 99..2723

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:9

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 875 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:10:

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2060 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:11:

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1982 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:12:

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACCAGAG AAATGGTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAATGGGTC TAAGAGGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGTGCATG TTTGCTGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAAACATG TTCATCAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1107 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGAAGAT CCTCATCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTCTCGAG TCAGTTCCGC TTGGCCTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACAGAATTC TGACCATGGA GCGGGCCGGC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTCTAAGC GGATACAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2645 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 12..2636

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. Nº:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 875 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº:23:

25

27

28

Claims (2)

1. Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23.

2. Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 515-819 de la SEC. ID. Nº: 23.