ES2348458T3 - Adn que codifica fosfodiesterasas de mamíferos. - Google Patents

Adn que codifica fosfodiesterasas de mamíferos. Download PDF

Info

Publication number
ES2348458T3
ES2348458T3 ES03018317T ES03018317T ES2348458T3 ES 2348458 T3 ES2348458 T3 ES 2348458T3 ES 03018317 T ES03018317 T ES 03018317T ES 03018317 T ES03018317 T ES 03018317T ES 2348458 T3 ES2348458 T3 ES 2348458T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
cdna
host cell
sec
pde
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03018317T
Other languages
English (en)
Inventor
Harry Charbonneau
William K. Sonnenburg
Joseph A. Beavo
J. Kelley Bentley
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Original Assignee
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington filed Critical University of Washington
Application granted granted Critical
Publication of ES2348458T3 publication Critical patent/ES2348458T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Una secuencia polinucleotídica purificada y aislada que codifica un polipéptido de fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano, donde la secuencia polinucleotídica se selecciona del grupo que consiste en los insertos de ADN presentes en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584).

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a secuencias nucleotídicas novedosas, purificadas y aisladas, que codifican fosfodiesterasas estimuladas por GMP cíclico (cGS-PDEs) de humano. También se proveen los correspondientes productos de expresión recombinantes de dichas secuencias nucleotídicas, reactivos inmunológicos específicamente reactivos con las mismas y procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad enzimática de tales productos de expresión.
Se conocen nucleótidos cíclicos que median una amplia variedad de respuestas celulares frente a estímulos biológicos. Las nucleótido cíclico-fosfodiesterasas (PDEs) catalizan la hidrólisis de nucleótidos 3´, 5´ cíclicos, tales como el adenosín monofosfato cíclico (cAMP) y el guanosín monofosfato cíclico (cGMP), a sus correspondientes 5´nucleótido monofosfatos y son, en consecuencia, importantes en el control de la concentración celular de los nucleótidos cíclicos. Las PDEs, a su vez, son reguladas por señales transmembrana o ligandos segundos mensajeros tales como el ion calcio (Ca2+)
o el cGMP. Las PDEs tienen, de este modo, un papel central en la regulación del flujo de información desde las hormonas extracelulares, los neurotransmisores u otras señales que utilizan a los nucleótidos cíclicos como mensajeros.
Las PDEs son un grupo grande y complejo de enzimas. Están distribuidas ampliamente en las células y tejidos de la mayoría de los organismos eucariotas pero se encuentran habitualmente presentes a nivel de trazas. Se han descripto por lo menos cinco familias diferentes de PDEs en base a características tales como la especificidad de sustrato, propiedades cinéticas, control regulatorio celular, tamaño y, en algunos casos, modulación por inhibidores selectivos. [Beavo, Adv. in Second Mess. And Prot. Phosph. Res. 22:1-38 (1988)]. Las cinco familias incluyen a:
I estimuladas por Ca2+/calmodulina II estimuladas por cGMP III inhibidas por cGMP IV específicas para cAMP V
específicas para cGMP
Dentro de cada familia existen múltiples formas de PDEs íntimamente relacionadas. Véase, Beavo, “Multiple Phosphodiesterase Isozymes Background, Nomenclature and Implications”, páginas 3-15; Wang et al., “Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases”, páginas 19-59; y Manganiello et al., “Cyclic GMP-Stimulates Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases”, páginas 62-85; todos en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo, J. and Houslay, M.D., Eds.; John Wiley & Sons, New York (1990).
Las PDEs dependientes de Ca2+/calmodulina (Cam-PDEs) se caracterizan por su respuesta al calcio intracelular, lo cual conduce a una concentración intracelular disminuida del cAMP y/o del cGMP. Una característica distintiva de las fosfodiesterasas estimuladas por cGMP (cGS-PDEs) es su capacidad de ser estimuladas por el cGMP para concretar la hidrólisis del cAMP.
Estudios in vitro han demostrado la actividad de PDE aumentada en respuesta al Ca2+/calmodulina en casi todos los tejidos de mamífero estudiados, como así también en Drosophila, Dictyostelium y tripanosomas. El nivel de CaM-PDE en tejidos y compartimientos celulares y subcelulares varía ampliamente. La mayoría de las células contienen al menos una pequeña proporción de actividad de Cam-PDE, encontrándose los niveles tisulares más altos en el cerebro, particularmente en las áreas sinápticas, Greenberg et al., Neuropharmacol., 17:737-745 (1978) y Kincaid et al., PNAS (USA), 84:1118-1122 (1987). Una disminución del cAMP en células de astrocitoma en respuesta a la estimulación muscarínica puede deberse a aumentos calcio-dependientes en la actividad de Cam-PDE. Tanner et al., Mol. Pharmacol., 29:455-460 (1986). También, la Cam-PDE puede ser una importante reguladora del cAMP en el tejido de la tiroides. Erneux et al., Mol. Cell Endocrinol., 43:123-134 (1985).
Los primeros estudios sugirieron que existen diferentes isoenzimas tejido-específicas de las CaM-PDEs. Varios miembros de la familia Cam-PDE se han descripto ahora, incluyendo una isoenzima de 59 kDa aislada de corazón bovino, e isoenzimas de 61 y 63 kDa aisladas de cerebro bovino. La Porte et al., Biochemistry, 18:2820-2825 (1979); Hansen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2788-2792 (1982); véase también Sharma et al., J. Biol. Chem., 261:14160-14166 (1986). Las posibles contrapartidas de las isoenzimas bovinas de 59 y 61 kDa se han aislado también de tejidos de rata, Hansen et al., J. Biol. Chem., 261:14636-14645 (1986), sugiriendo que dos isoenzimas pueden expresarse en otras especies de mamíferos.
Además de criterios de peso molecular, otra evidencia apoya tanto similitudes como diferencias entre la familia CaM-PDE de isoenzimas. Por ejemplo, la isoenzima cardíaca de 59 kDa y la isoenzima cerebral de 61 kDa de Cam-PDEs difieren en movilidad en SDS-PAGE y en posición de elución en cromatografía DEAE y la isoenzima de 59 kDa tiene una afinidad por la calmodulina por lo menos 10-20 veces mayor. La oncomodulina, una oncoproteína fetal de unión al calcio presente en muy altas concentraciones en la placenta y en las células transformadas, también se une a la enzima de 59 kDa con una afinidad mayor que a la enzima de 61 kDa. Sin embargo, tanto la isoenzima cerebral de 61 kDa como la cardíaca de 59 kDa son reconocidas por un único anticuerpo monoclonal. Este anticuerpo se une al complejo Ca2+/CaM-PDE con una afinidad 100 veces mayor que a la PDE sola. Hansen et al., 1986, supra. Las isoenzimas de 59 y de 61 kDa tienen especificidades de sustrato y constantes cinéticas casi idénticas. Krinks et al., Adv. Cyc. Nucleotide Proteína. Phosphorylation Res., 16:31-47 (1984) han sugerido, en base a experimentos de mapeo de péptidos, que la proteína cardíaca de 59 kDa podría ser una forma proteolítica de la isoenzima cerebral de 61 kDa.
La isoenzima bovina cerebral de 63 kDa difiere sustancialmente de las isoenzimas de 59 y 61 kDa. La enzima de 63 kDa no es reconocida por el anticuerpo monoclonal que se une a las enzimas de 59 y 61 kDa. Hansen et al., 1986, supra. La proteína de 63 kDa no es fosforilada in vitro por la proteína quinasa cAMP-dependiente, mientras que la proteína de 61 kDa es fosforilada. Además, sólo la proteína de 61 kDa es fosforilada in vitro por la CaM-quinasa II. Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:2603-2607 (1985); y Hashimoto et al., J.Biol. Chem., 264:10884-10887 (1989). Las isoenzimas de CaM-PDE de 61 y 63 kDa de cerebro bovino sí parecen, sin embargo tener afinidades de unión a CaM similares. Los mapas de péptidos generados por la proteólisis limitada con proteasa de Staphylococcus V8, Sharma et al., J.Biol. Chem., 259:9248 (1984), han sugerido que las proteínas de 61 y 63 kDa poseen diferentes secuencias de aminoácidos.
Se propone que las PDEs estimuladas por cGMP (cGMP-PDEs) tienen un sitio no catalítico específico para el cGMP que puede explicar la estimulación de la hidrólisis del cAMP por parte del cGMP. Stoop et al., J. Biol. Chem., 264:13718-(1989). A concentraciones de nucleótidos cíclicos fisiológicas, esta enzima responde a elevadas concentraciones de cGMP con una hidrólisis incrementada de cAMP. Así, la cGS-PDE permite que los aumentos en la concentración de cGMP moderen o inhiban las respuestas mediadas por cAMP. La secuencia primaria presentada recientemente en LeTrog et al., Biochemistry, 29:10280 (1990), con la co-autoría de los inventores de la presente, provee el armazón molecular para comprender las propiedades regulatorias y la subestructura de los dominios de esta enzima y para compararla con otras isoenzimas de PDE que responden a diferentes señales. Esta publicación también destaca la clonación de un fragmento de cADN de la corteza adrenal bovina de 2,2 kb, que codifica a cGS-PDE. Véase también Thompson et al., FASEB J., 5(6):A1592 (Resumen No. 7092), que informa acerca de la clonación de una “PDE Tipo II” de células de feocromocitoma de rata.
Con el descubrimiento del gran número de PDEs diferentes y su crítico papel en la señalización intracelular, los esfuerzos se han concentrado en hallar agentes que activen
o inhiban selectivamente isoenzimas PDE específicas. Los agentes que afectan la actividad celular de PDE, y de este modo alteran el cAMP celular, pueden utilizarse potencialmente para controlar una amplia gama de enfermedades y condiciones fisiológicas. Algunos fármacos que elevan los niveles de cAMP inhibiendo las PDEs están en uso, pero en general actúan como inhibidores no específicos amplios y tienen efectos colaterales deletéreos sobre la actividad del cAMP en tejidos y en tipos de células no buscados. Por consiguiente, se necesitan agentes que sean específicos para isoenzimas PDE seleccionadas. Los inhibidores selectivos de isoenzimas PDE específicas pueden ser útiles como agentes cardiotónicos, anti-depresivos, anti-hipertensivos, antitrombóticos y como agentes de otro tipo. Los estudios de selección de agonistas/antagonistas han sido complicados, sin embargo, debido a dificultades en la identificación de la isoenzima PDE particular presente en una preparación de ensayo particular. Es más: todas las PDEs catalizan la misma reacción básica; todas tienen especificidades de sustrato superpuestas; y todas existen sólo a nivel de trazas.
La diferenciación entre PDEs se ha intentado por varios medios diferentes. El enfoque enzimológico clásico de aislar y estudiar cada nueva isoenzima se ve dificultado por los límites actuales de las técnicas de purificación y por la incapacidad de evaluar con precisión si se ha alcanzado la resolución completa de una isoenzima. Un segundo enfoque ha sido identificar las condiciones del ensayo específicas de una isoenzima que podrían favorecer la contribución de una isoenzima y minimizar la de otras. Otro enfoque ha sido la identificación inmunológica y separación en grupos de familias y/o de isoenzimas individuales. Existen problemas obvios con cada uno de estos enfoques; para la identificación no ambigua y el estudio de una isoenzima particular, deben establecerse un gran número de criterios distintivos, lo cual a menudo lleva tiempo y en algunos casos técnicamente muy difícil. En consecuencia, la mayor parte de los estudios se han hecho con preparaciones de PDE sólo parcialmente puras que probablemente contenían más de una isoenzima. Más aún: muchas de las PDEs de la mayoría de los tejidos son muy susceptibles a la proteólisis limitada y forman con facilidad productos proteolíticos activos que pueden tener propiedades cinéticas, regulatorias y fisiológicas diferentes de su forma precursora.
El desarrollo de nuevos y específicos agentes moduladores de PDE se vería enormemente facilitado por la capacidad de aislar grandes cantidades de PDEs tejido-específicas por medios recombinantes. Relativamente pocos genes de PDE se han clonado a la fecha y de los clonados, la mayoría pertenece a la familia cGMP-específica de las fosfodiesterasas (cAMP-PDEs). Véase Davis, “Molecular Genetics of the Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases”, páginas 227-241 en Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulations and Drug Action., Beavo, J. y Houslay, M.D. Eds.; John Wiley & Sons, New York; 1990. Véase también, por ejemplo, Faure et al., PNAS (USA), 85:8076 (1988) – D. discoideum; Sass et al., PNAS (USA), 83: 9303 (1986)
– S. cerevisiae, clase PDE IV, denominada PDE2; Nikawa et al., Mol. Cell. Biol., 7:3629 (1987) -S. cerevisiae, denominada PDE1; Wilson et al., Mol. Cell. Biol., 8:505 (1988) -S. cerevisiae, denominada SRA5; Chen et al., PNAS (USA), 83:9313 (1986) – D. melanogaster, denominada dnc*; Ovchinnikow et al., FEBS, 223:169 (1987) – retina de bovino, denominada GMP PDE; Davis et al., PNAS (USA), 86:3604 (1989) – hígado de rata, denominada dnc-1 de rata; Colicelli et al., PNAS (USA), 86:3599 (1989) – cerebro de rata, denominada DPD; Swinnen et al., PNAS (USA), 86:5325 (1989) – testículo de rata, PDE1, PDE2, PDE3 y PDE4 de rata; y Livi et al., Mol. Cell. Biol., 10:2678 (1990) – monocitos humanos, denominada hPDE1. Véase también, LeTrong et al., supra y Thompson et al., supra.
La selección por complementación se ha utilizado para detectar y aislar clones de cADN de mamíferos que codifican ciertos tipos de PDEs. Colicelli et al., PNAS (USA), 86:3599 (1989), informaron la construcción de una biblioteca de cADN de cerebro de rata en un vector de expresión de S. cerevisiae y el aislamiento a partir de la misma de genes que tienen la capacidad de funcionar en levadura para suprimir los efectos fenotípicos de RAS2va119, una forma mutante del gen RAS2 análogo a un mutante oncogénico del gen HRAS humano. Un cADN clonado de este modo y denominado DPD (fosfodiesterasa similar a dunce de rata) tiene la capacidad de complementar o “rescatar” la pérdida del control de crecimiento asociada con un gen RAS2va119 protegido en la cepa de levadura TK161-R2V (A.T.C.C. 74050), como así también el fenotipo de control de crecimiento defectuoso análogo del mutante de levadura 10DAB (A.T.C.C. 74049), el cual es defectuoso en ambos loci del gen de PDE de levadura (pde-1, pde-2). El gen codifica una fosfodiesterasa de cAMP de alta afinidad, cuya secuencia de aminoácidos es altamente homóloga de la fosfodiesterasa específica de cAMP por el locus dunce de Drosophila melanogaster.
Hasta la fecha de presentación de la solicitud madre, no ha habido ningún informe sobre la clonación y expresión de secuencias de ADN que codifiquen cualquiera de las PDEs de mamíferos estimuladas por Ca2+/calmodulina o estimuladas por cGMP (familias de PDE I y II) y, por consiguiente, continúa existiendo en el arte la necesidad de información sobre al secuencia nucleotídica completa para estas PDEs.
Tanaka, T. et al en un artículo titulado “Comparison of Putative Cyclic GMPbinding regions in bovine grain and cardiac cGMP-stimulated phoshodiesterases” (second messages y phoshoproteins, vol. 13, nº 2-3, 1991, páginas 87-98) describe una secuencia de nucleótidos parcial de una cGS-PDE de cerebro bovino y la secuencia de aminoácios parcial deducidas a partir de ella.
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica purificada y aislada que codifica un polipéptido de fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico, donde la secuencia polinucleotídica se selecciona del grupo que consiste en los insertos de ADN presentes en los vectores pGSPDE 6.1 (A.T.C.C. 68583), pGSPDE 7.1 (A.T.C.C. 68585) y pGSPDE 9.2 (A.T.C.C. 68584).
La presente invención provee nuevas secuencias polinucleotídicas purificadas y aisladas, que codifican la expresión de polipéptidos de fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos estimuladas por cGMP. Las secuencias genómicas y de cADN provistas por la invención pueden estar asociadas con secuencias de ADN de control de expresión de especies homólogas o heterólogas tales como promotores, operadores, reguladores, terminadores y similares, para permitir la transcripción in vivo e in vitro al ARN mensajero y, a su vez, la traducción de los mARNs para suministrar fosfodiesterasas funcionales y polipéptidos relacionados en grandes cantidades.
Son específicamente provistas por la invención secuencias de ADN humano que codifican fosfodiesterasas que están presentes como insertos de ADN humano en plásmidos bacterianos y en vectores virales que son el tema de depósitos (A.T.C.C. 68583, 68584 y 68585) realizados con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 el 11 y 15 de Abril de 1991 y el 14 de Abril de1992, de conformidad con los requisitos de la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos y el Tratado de Budapest. Los ADNs depositados en conexión con la presente invención y descripción incluyen:
1.
Plásmido pCAM-40 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68576) que contiene un inserto de cADN de cerebro bovino que codifica una isoenzima CaM-PDE de 61 kDa;
2.
Plásmido p12.3A de E. coli (A.T.C.C. 68577) que contiene un inserto de cADN de cerebro bovino que codifica una isoenzima CaM-PDE de 63 kDa;
3.
Bacteriófago � CaM H6a (acceso a A.T.C.C. No. 75000) que contiene un inserto de cADN de hipocampo humano que codifica una isoenzima CaM-PDE de 61 kDa;
4.
Plásmido pHcam61-6N-7 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68963) que contiene un inserto compuesto de cADN humano que codifica una isoenzima CaM-PDE de 61 kDa;
5.
Plásmido pHcamH3EF de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68964) que contiene un inserto de cADN de hipocampo humano que codifica una PDE novedosa homóloga de una CaM-PDE de 61 kDa;
6.
Plásmido pHcamHella de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68965) que contiene un inserto de cADN de corazón humano que codifica una PDE novedosa homóloga de una CaM-PDE de 61 kDa;
7.
Plásmido p3CGS-5 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68579) que contiene un inserto de cADN adrenal bovino que codifica una isoenzima cGS-PDE;
8.
Plásmido pBBCGSPDE-5 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68578) que contiene un inserto de cADN de cerebro bovino que codifica un fragmento de isoenzima cGS-PDE;
9.
Plásmido pBBCGSPDE-7 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68580) que contiene un cADN de cerebro bovino que codifica una isoenzima cGS-PDE;
10.
Plásmido pGSPDE6.1 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68583) que contiene un cADN de corazón humano que codifica un fragmento de isoenzima cGS-PDE;
11.
Plásmido pGSPDE7.1 de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68585) que contiene un inserto de cADN de hipocampo humano que codifica un fragmento de isoenzima cGS-PDE; y
12.
Plásmido pGSPDE9.2 (acceso a A.T.C.C. No. 68584) que contiene un inserto de cADN de hipocampo humano que codifica un fragmento de isoenzima cGS-PDE.
13.
Plásmido pHcgs6n de E. coli (acceso a A.T.C.C. No. 68962) que contiene un inserto de cADN humano que codifica una cGS-PDE.
También se proporciona específicamente en la presente descripción, una secuencia de cADN bovino que contiene nucleótidos que codifican CaM-PDE de 59kDa bovina y caracterizada por las secuencias de aminoácidos y ADN de la SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17.
En realizaciones relacionadas, la invención se ocupa de constructos de ADN que comprenden un promotor transcripcional, una secuencia de ADN que codifica la PDE y un terminador transcripcional, cada uno unido operativamente para la expresión de la enzima o fragmento de enzima. Los constructos se utilizan con preferencia para transformar o transfectar células huésped, con preferencia células eucariotas, y con mayor preferencia células de mamífero o levadura. Para producción en gran escala, la PDE expresada puede aislarse de las células, por ejemplo, mediante purificación por inmunoafinidad.
La incorporación de secuencias de ADN en células procariotas y eucariotas aisladas mediante procesos de transformación y transfección, que involucran potencialmente a vectores virales de ADN y ARN y a vectores de plásmidos de ADN circulares, también se encuentra dentro de las consideraciones de la invención y se espera que proporcione proteínas útiles en cantidades hasta ahora no disponibles a partir de fuentes naturales. Los sistemas provistos por la invención incluyen células de E. coli transformadas, incluyendo las mencionadas anteriormente, como así también otras células eucariotas transformadas, incluyendo células de levadura y de mamífero. Se espera que las células huésped de mamífero proporcionen tales modificaciones posttraduccionales (por ejemplo, truncamiento, lipidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) como puede requerirse para conferir actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante de la invención.
Los productos proteicos novedosos de la invención incluyen productos de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos arriba mencionadas y polipéptidos que tienen la conformación estructural primaria (es decir la secuencia de aminoácidos) de las proteínas cGS-PDE. Las proteínas de la invención están proyectados para tener numerosos usos, incluyendo usos terapéuticos, diagnósticos y pronósticos, y suministrarán la base para la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales específicamente inmunorreactivos con las proteínas de la invención.
También son provistas por la presente invención sustancias que actúan como anticuerpos (incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única y similares), caracterizadas por su capacidad para unirse con alta inmunoespecificidad a las proteínas de la invención reconociendo epítopos únicos que no son comunes a otras proteínas. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden utilizarse para la purificación por afinidad de las cGS-PDEs, por ejemplo, Hansen et al., Meth. Enzymol., 159:543 (1988).
También son provistos por la presente descripción procedimientos novedosos para la detección y/o cuantificación de formas normales, anormales o mutadas de cGS-PDEs, como así también de ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN) asociados con las mismas. A modo ilustrativo, los anticuerpos de la invención pueden emplearse en procedimientos inmunológicos conocidos para la detección cuantitativa de estas proteínas en muestras de fluidos y tejidos y de secuencias de ADN de la invención que pueden marcarse adecuadamente y emplearse para la detección cuantitativa del mARN que codifica estas proteínas.
Entre los múltiples aspectos de la presente invención, por lo tanto, se encuentra la provisión de: (a) secuencias de polinucleótidos que codifican cGS-PDEs, y (b) secuencias de polinucleótidos que codifican los mismos (o polipéptidos variantes alélicas o análogos) a través del uso de, al menos en parte, codones degenerados. Se proveen en forma correspondiente vectores de ADN y ARN virales o vectores de ADN de plásmidos circulares que incorporan secuencias de polinucleótidos y células huésped procariotas y eucariotas transformadas o transfectadas con dichas secuencias de polinucleótidos y vectores, como así también métodos novedosos para la producción recombinante de estas proteínas a través del crecimiento en cultivo de tales huéspedes y el aislamiento de las proteínas expresadas a partir de los huéspedes o sus medios de cultivo.
En aun otras realizaciones, la invención provee métodos para identificar compuestos que pueden modular la actividad de PDE. Tales métodos comprenden incubar un compuesto a evaluar por su actividad moduladora de PDE con células eucariotas que expresen un polipéptido PDE recombinante y determinar a partir de ello el efecto del compuesto sobre la actividad de fosfodiesterasa provisto por la expresión de genes. El método es efectivo tanto con células completas como con preparados de lisados celulares. En una realización preferida, la célula eucariota es una célula de levadura. El efecto del compuesto sobre la actividad de fosfodiesterasa puede determinarse por medio de ensayos bioquímicos que monitorean la hidrólisis del cAMP y/o del cGMP, o siguiendo el efecto del compuesto sobre la alteración de un rasgo fenotípico de la célula eucariota asociado con la presencia o ausencia del polipéptido PDE recombinante.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes con la consideración de la siguiente descripción detallada de la misma, que incluye numerosos ejemplos ilustrativos de la práctica de la invención, haciéndose referencia al dibujo en el cual:
La Figura 1 provee los resultados de las determinaciones de la secuencia de aminoácidos para las proteínas CaM-PDE aisladas de 59 kDa (corazón bovino) y de 63 kDa (cerebro bovino) en alineación con la secuencia completa de la isoenzima de 61 kDa (cerebro bovino). Las identidades entre las proteínas de 59 y 63 kDa y la isoenzima de 61 kDa están subrayadas. Las identificaciones tentativas están en casilleros inferiores y los guiones indican residuos no identificados. El extremo N-terminal de la isoenzima de 59 kDa, determinado por la sustracción de un metionil-péptido (mDDHVTIRRK) de la composición de un lisil-péptido bloqueado amino-terminal, está entre paréntesis. Se colocan cajas sólidas encima de los residuos dentro de los sitios de unión de CaM identificados en las isoenzimas de 61 y 59 kDa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El Ejemplo I se refiere al aislamiento, purificación y determinación de la secuencia del cADN de CaM-PDE de 61 kDa de cerebro bovino y a la expresión del mismo en una célula huésped de mamífero. El Ejemplo II se refiere al aislamiento, purificación y determinación de la secuencia de una CaM-PDE de 59 kDa de pulmón bovino y a la expresión de la misma en una célula huésped de mamífero. El Ejemplo III se refiere al aislamiento, purificación y determinación de la secuencia del cADN de CaM-PDE de 63 kDa de cerebro bovino y a la expresión del mismo en una célula huésped de mamífero. El Ejemplo IV se refiere al aislamiento, purificación y determinación de la secuencia del cADN de cGS-PDE de corteza adrenal bovina, como así también la expresión del ADN en células huésped de mamífero. El Ejemplo V se refiere al aislamiento, purificación y determinación de la secuencia del cADN de cGS-PDE de cerebro bovino y a la expresión del mismo en una célula huésped de mamífero. El Ejemplo VI se refiere al uso del cADN de cGS-PDE de corteza adrenal bovina para obtener cADNs de cGS-PDE humanos y al desarrollo de un cADN humano que codifica una cGS-PDE. El Ejemplo VII se refiere al uso del cADN de CaM-PDE de 61 kDa de cerebro bovino para obtener un cADN de CaM-PDE de 61 kDa y un cADN novedoso estructuralmente relacionado. El Ejemplo VIII se refiere a la expresión de cADNs de PDE bovinos y humanos para la complementación de defectos fenotípicos en levadura y la verificación de la actividad de fosfodiesterasa para el producto de expresión. El Ejemplo IX se refiere a estudios de expresión en tejidos que involucran análisis Northern y estudios de protección con Rnasa que emplean polinucleótidos (específicamente cADNs y ARNs anti-sentido) de la invención.
En aquellas porciones del texto que apuntan a la formación de oligonucleótidos redundantes, se emplean las siguientes recomendaciones de código único de letras de la Tabla I para la secuencia nucleotídica ambigua, según se informa en J.Biol.Chem., 261:13-17 (1986):
TABLA I
Símbolo
Significado Origen de la denominación
G
G
Guanina
A
A
Adenina
T
T
Timina
C
C
Citosina
R
G o A puRina
Y
T o C Pirimidina (en inglés, pYrimidina)
M
A o C Amino
K
G o T Ceto (en inglés, Keto)
S
G o C Interacción fuerte (Strong, en inglés) (3 puentes de H)
W
A o T Interacción débil (Weak, en inglés) (2 puentes de H)
H
A, C o T no G, pues H sigue a la G en el alfabeto
B
G, C o T no A
V
A, C o G no T, (no U) pues V sigue a U
D
A, G o T no C
N
A, C. G o T cualquier base de nucleótido
EJEMPLO I Aislamiento, Purificación y Determinación de la Secuencia del cADN de CaM-PDE de 61 kDa de Cerebro Bovino
En este Ejemplo, una secuencia de cADN que representa aquella porción de un gen para CaM-PDE de cerebro bovino de 61 kDa que codifica el extremo amino terminal de la proteína, fue aislada mediante PCR a partir de una colección de cADNs de primera hebra desarrollados a partir de mARN de cerebro bovino. El fragmento generado por PCR se empleó luego para aislar una secuencia de CaM-PDE de cerebro bovino de extensión total.
Se preparó ARN total a partir de corazón bovino utilizando el método de Chomczynski et al., Anal.Biochem., 162:156-159 (1987) y el ARN se seleccionó utilizando un kit de purificación de mARN Poly(A) QuikTm de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cADN de primera hebra se sintetizó agregando 80 unidades de transcriptasa de AMV reversa a una mezcla de reacción (volumen final de 40 µl) que contenía Tris HCl 50 mM (pH 8,3 a 42ºC), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, desoxinucleótido trifosfatos 0,5 mM (cada uno), KCl 50 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 5 µg de oligómeros de ácido desoxitimidílico (12-18 bases) y 5 µg de mARN de corazón bovino desnaturalizado durante 15 minutos a 65ºC. La incorporación de 1 µl de dCTP marcado con 32P (3000 Ci/mmol) se utilizó para cuantificar la síntesis del cADN de primera hebra. La reacción se incubó a 42ºC durante 60 minutos. La reacción se extrajo con fenol/CHCl3 y se precipitó con EtOH. El pélet del ácido nucleico se resuspendió en 50 µl de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)/EDTA 0,1 mM a una concentración final de 15 ng por µl.
Los oligómeros redundantes con sentido y anti-sentido correspondientes a las secuencias peptídicas de 61 kDa como las de la Fig. 1 se diseñaron como para ser mínimamente redundantes, aunque lo suficientemente largas como para hibridizarse específicamente al molde objetivo.
Un primer oligómero de 23 bases, denominado CaM-PCR-2S, se sintetizó en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems, Inc. el oligómero tenía la siguiente secuencia: SEC. ID NO: 1
5´-AARATGGGNATGAARAARAA-3´ que especifica la siguiente secuencia de aminoácidos: SEC. ID NO: 2
KMGMMKKK.
Un segundo oligómero de 23 bases, denominado CaM-PCR-3AS, se sintetizó con la siguiente secuencia: SEC. ID NO: 3
5´-ACRTTCATYTCYTCYTCYTGCAT-3´
representando la siguiente secuencia de aminoácidos:
SEC. ID NO: 4
MQEEEMNV.
Se sintetizó un fragmento de cADN de CaM PDE de 612 pb utilizando la técnica de amplificación por PCR agregando 15 ng de cADN de primera hebra a una mezcla de reacción que contenía KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM (pH 9,0), MgCl2 1,5 mM, gelatina 0,01%, Triton X-100 0,1%, desoxinucleótido trifosfatos 0,2 mM (cada uno), oligómeros CaM PCR 2S y CaM PCR-3AS 1 µM (cada uno) y 2,5 unidades de ADN polimerasa de Thermus aquaticus. La reacción se incubó durante 30 ciclos de la siguiente manera: 94ºC durante 1 minuto; 50ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. Los productos de reacción se purificaron en gel de agarosa 1% usando un buffer Tris-acetato 0,04M/EDTA 0,001 M que contenía 0,5 µg/ml de bromuro de etidio. Los ADN producidos se visualizaron con luz UV, se recortaron en forma cuantitativa del gel con una hoja de afeitar, se purificaron utilizando el kit de reactivos Geneclean II y se ligaron al ADN vector Eco RV-cut pBluescript.
Para determinar si los productos de amplificación por PCR eran cADNs CaM PDE, los ADNs subclonados producidos por PCR se secuenciaron desde los extremos utilizando cebadores promotores T3 y T7 y kits de secuenciación Sequenase o Taq Polymerase. Se secuenciaron aproximadamente 250 bases de cada extremo de este trozo de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida del cADN se correspondió con las secuencias de aminoácidos de la Fig. 1 de las CaM-PDEs de 59 y 61 kDa, confirmando que el ADN producido por PCR era un cADN parcial de CaM PDE.
Una biblioteca de cADN de cerebro bovino construída con el vector lambda ZAP (gentilmente provisto por Ronald E. Diehl, de Merck, Sharp & Dohme) se sometió a screening con el cADN de CaM-PDE de 615 pb obtenido por amplificación por PCR. La sonda se preparó utilizando el método de Feinberg et al., Anal.Biochem., 137:266-267 (1984), y el ADN marcado con [32P] se purificó usando columnas Elutip-D®. Se hibridizaron láminas (700.000 láminas sobre placas de 12-150 mm) unidas a círculos filtrantes a 42ºC toda la noche en una solución que contenía formamida 50%, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), solución 1X de Denhardt, dextran sulfato 10%, SDS 0,1% y 106 cpm/ml de sonda marcada con [32P] (109 cpm/µg). los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos con 2X SSC/SDS 0,1% a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de 15 minutos con 0,1X SSC/SDS 0,1% a 45ºC. los filtros se expusieron a una película de rayos X toda la noche.
De las cincuenta y seis láminas que se hibridizaron con las sondas marcadas con [32P], se purificaron ocho clones seleccionados al azar mediante varias vueltas de que se incorporan aquí totalmente como re-plaqueo y screening [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 545 páginas, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)] y los insertos de cADNs se subclonaron en pBluescript SK(-) por recorte in vivo [Short et al., Nuc.Acids Res., 16:7583-7599 (1988)], según recomendación del fabricante.
Los ADN plásmidos preparados a partir de cultivos de cada clon se sometieron a análisis de restricción usando EcoRI. Se seleccionaron dos clones de longitud adecuada para análisis de secuencias usando kits de secuenciación Taq Tak® y Sequenase®. Los dos clones fueron pCAM-40 (2,3 kb) y pCAM-34 (2,7 kb). La información de secuenciación de este procedimiento confirmó que el inserto de pCAM-40 codificaba la CaM-PDE de 61 kDa de cerebro bovino de longitud total. La secuencia de este clon y la secuencia de aminoácidos a partir de la misma se presentan en SEC. ID NO: 5 y en SEC. ID NO: 6.
La expresión transitoria del cADN de CaM-PDE de 61 kDa en células COS-7
(A.T.C.C. CRL 1651) se logró de la siguiente manera. El vector pCDM8 [Seed, Nature, 329:840-843 (1987)] de células huésped MC1061-p3 de E. coli fue generosamente provisto por el Dr. Brian Seed, del Massachusetts General Hospital de Boston, MA. Este vector también se adquiere de Invitrogen, Inc. (San Diego, CA). El plásmido pCAM-40 se digirió con HindIII y NotI, dando un fragmento de 2,3 kb que se ligó en el ADN vector CDM8 que se había digerido con HindIII y NotI. El plásmido resultante se propagó en células MC1061-p3. El ADN plásmido se preparó usando el método de lisis alcalina de Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1:1.7.1 (John Wiley & Sons, New York, 1989) y se purificó usando columnas Qiagen-Tip 500 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células COS-7 se transfectaron con el constructo p-CAM-40/CDM8 (o se transfectaron en forma simulada con el vector CDM8 solo) utilizando el método de DEAE/dextrano de Ausubel et al., supra, en 1:9.2 y siguientes. Específicamente, 10 µg de ADN precipitado con etanol se resuspendieron en 80 µl de buffer TBS y se agregaron 160 µl de DEAE-dextrano de 10 mg por ml gota a gota a una placa de 10 mm de células COS7 de 50% de confluencia en 4 ml de DMEM suplementado con NuSerum 10%, y se mezcló en forma rotativa. Las células se incubaron durante 3-4 horas a 37ºC en una atmósfera de 7% de CO2 saturada de agua. El medio se eliminó y las células se trataron inmediatamente con DMSO 10% en PBS durante 1 minuto. A continuación de este tratamiento, las células se lavaron con PBS, luego DMEM y finalmente se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (50 µg/ml de sulfato de estreptomicina) en una incubadora con 7% de CO2 durante 36 horas.
Las células COS se rasparon de las placas y se homogeneizaron en un buffer que contenía Tris-HCl 40 mM (pH=7,5), EDTA 5 mM, benzamidina 15 mM, betamercaptoetanol 15 mM, 1 µg por ml de pepstatina A y µg por ml de peupeptina, utilizando un homogeneizador Dounce (1 ml por placa de 100 mm). Los homogenatos se ensayaron para determinar la actividad de PDE de acuerdo con los procedimientos de Hanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 79:2788-2792 (1982), utilizando [3H]cGMP como sustrato. Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC durante 10 minutos en un buffer que contenía Tris-HCl 20 mM (pH=7,5), imidazol 20 mM (pH=7,5), MgCl2 3 mM, acetato de Mg 15 mM, 0,2 mg por ml de BSA y 3H-cAMP 1 µM con EGTA 2 mM o CaCl2 0,2 mM, y 4 µg por ml de CaM. Los ensayos se interrumpieron incubando los tubos en un baño de agua a 90º durante 1 minuto. Después de enfriar, se agregaron 10 µl de veneno de serpiente de 2,5 mg por ml a cada ensayo y se incubó a 37ºC durante 5 minutos. Las muestras se diluyeron con 250 µl de Tris-HCl 20 mM (pH=7,5) y se aplicaron de inmediato a columnas de intercambio iónico A-25 de 0,7 ml. Las columnas se lavaron tres veces con 0,5 ml de Tris-HCl 20 mM (pH=7,5) y el eluato se recogió en viales de centelleo. Las muestras se sometieron a recuento por 1 minuto usando un contador de centelleo Packard Modelo 1600TR. La actividad hidrolítica específica de nucleótidos cíclicos se expresó como picomoles de cAMP o cGMP hidrolizado por minuto por mg de proteína. La concentración de proteína se estimó de acuerdo con el método de Bradford, Anal.Biochem., 72:248-254 (1976), usando BSA como estándar. Cuando se los comparó con células transfectadas en forma simulada, los extractos de células transfectadas con cADN de pCAM-40 contenían actividades hidrolíticas de cAMP y cGMP significativamente mayores en presencia de EGTA. Los ensayos de las células transfectadas con cADN de pCAM-40 en presencia de calcio y CaM dieron por resultado la estimulación de la hidrólisis de cAMP y cGMP.
EJEMPLO II Aislamiento, Purificación y Determinación de la Secuencia de una CaM-PDE de 59 kDa de Pulmón Bovino
Se sintetizó un oligonucleótido con sentido totalmente degenerado correspondiente a la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO: 7
MDDHVTI de la CaM-PDE de 59 kDa de corazón bovino. La secuencia nucleotídica de este oligonucleótido es: SEC. ID NO: 8
5´-ATGAGRAGRCAYGTHACNAT-3´. Se diseñó un oligonucleótido antisentido a partir de la secuencia de la Fig. 1 de la CaM-PDE de 61 kDa de cerebro bovino, correspondiente a la secuencia de aminoácidos: SEC. ID NO: 9
LRCLVKQ y que tiene la secuencia: SEC. ID NO: 10
5´-CTGCTTCACTAAGCATCTTAG-3´. Este par de cebadores se utilizó para cebar una reacción de PCR que utilizó cADN de primera hebra de corazón bovino (según se preparó en el Ejemplo I) como molde. Esto pronosticó un producto de PCR de 75 pb, 54 pb de los cuales fueron la secuencia única de 59 kDa y 21 pb de los cuales se compartieron entre las isoenzimas de 59 kDa y 61 kDa. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de tamices de agarosa, y se recortó del gel una banda que migró a 75 pb. El ADN se subclonó en pBluescript KS+ y las colonias positivas en el esquema de selección azul/blanco se rastrearon mediante PCR usando cebadores dirigidos contra secuencias del vector. Se seleccionaron colonias con insertos del tamaño apropiado y una de éstas (pCaM59/75.14) se eligió para la secuenciación. Se preparó el ADN plásmido usando una columna de empuje Qiagen P20 y se utilizó como molde para la secuenciación utilizando el método del didesoxi. La secuencia del producto de PCR es: SEC. ID NO: 11 5´-ATGAGAAGGCACGTAACGATCAGGAGGAAACATCTCCAAAGACCCATCT TT-AGACTAAGATGCTTAGTGAAGCAG-3´. El análisis de la secuencia reveló diferencias en dos codones entre la secuencia obtenida y la secuencia prevista. Un nuevo examen de la secuencia del cebador del oligonucleótido con sentido reveló que una trasposición inadvertida de dos codones había llevado a un error en el diseño del oligonucleótido. Se preparó un segundo conjunto de cebadores de PCR para oligonucleótidos que pronosticó un producto de 54 pb con mínima superposición entre las isoenzimas de 59 y de 61 kDa; además, el segundo cebador con sentido incorporó una corrección del error en el diseño del cebador con sentido original. El oligonucleótido con sentido tenía la secuencia: SEC. ID NO: 12 5´-ATGGAYGAYCACGTAACGATC-3´ y el oligonucleótido antisentido tenía la secuencia: SEC. ID NO: 13 5´-AAGTATCTCATTGGAGAACAG-3´. Este par de cebadores se utilizó para cebar una reacción de PCR que utilizó cADN de primera hebra de corazón bovino como molde y los productos de PCR se subclonaron y sometieron a screening exactamente como se describió más arriba. Se seleccionaron dos clones (pCaM59/54.9 y pCaM59/54.10) para secuenciación basándose en el tamaño de los insertos y se secuenciaron como se describió anteriormente; ambos clones contenían insertos de 54 pb de la secuencia pronosticada: SEC. ID NO: 14 5´-ATGGATGATCACGTAACGATCAGGAGGAAACATCTCCAAAGACCCATCT-TTAGA3´, pronosticando la secuencia de aminoácidos: SEC. ID NO: 15
MDDHVTIRRKHLQRPIFR Se construyó una biblioteca de cADN a partir de mARN de pulmón bovino y se sometió a screening utilizando procedimientos descriptos en el Ejemplo IV, infra, con
respecto al screening de una biblioteca de corteza adrenal bovina. Aproximadamente 1,2 x 106 unidades formadoras de láminas se sondaron con un producto de ruptura del cADN pCAM-40 con endonucleasa de restricción EcoRI de 1,6 kb, marcado con 32P. Este screening inicial produjo 4 clones de cADN de CaM-PDE putativos de 59 kDa. El análisis de secuencias preliminar indicó que un clon, denominado p59KCAMPDE-2, contenía la secuencia codificadora completa de la CaM-PDE putativa de 59 kDa. Se construyó una serie de deleciones anidadas a partir del plásmido p59KCAMPDE-2 [Véase Sonnenburg et al., J.Biol. Chem., 266 (26): 17655-17661 (1991)], y los moldes resultantes se secuenciaron mediante una adaptación del método de Sanger usando el Kit de Secuenciación por Ciclos de Terminación Taq DyeDeoxyTM y un Sistema de Secuenciación de ADN Modelo 373A de Applied Biosystems. Las secuencias del ADN y de aminoácidos deducidas se presentan en las SEC. ID NO: 16 y 17, respectivamente. Un gran marco de lectura abierto dentro del cADN codifica un polipéptido de 515 residuos con un peso molecular estimado de γ 59 kilodaltons que es casi idéntico a la secuencia de aminoácidos de la CaM-PDE de 61 kDa excepto por los 18 residuos de aminoácido amino-terminales. Más aún: la secuencia de aminoácidos prevista del marco de lectura abierto de p59KCAMPDE-2 es idéntica a la secuencia disponible de la CaM-PDE de 59 kDa purificada a partir de corazón bovino, Novack et al., Biochemistry, 30: 7940-7947 (1991). Estos resultados indican que el cADN de p59KCAMPDE-2 representa una especie de mARN que codifica la CaM-PDE de 59 kDa.
La expresión transitoria de la PDE de pulmón bovino de 59 kDa se logró como en el Ejemplo I. Específicamente, un fragmento tratado con EcoRI/con extremos romos de 2,66 kb del cADN de p59KCAMPDE-2 se subclonó en pCDM8, que se había digerido con XhoI y dejado con extremos romos. El plásmido recombinante, denominado p59KCAMPDE-2/CDM8, se utilizó para transfectar en forma transitoria células COS-7 y extractos preparados a partir de células COS-7 transfectadas se sometieron a ensayos de medición de la actividad de CaM-PDE usando cAMP 2 µM. Las células COS-7 transfectadas con el cADN de p59KCAMPDE-2 dieron una actividad hidrolítica del cAMP que se estimuló 4-5 veces más en presencia de calcio y calmodulina. Las células COS-7 transfectadas en forma simulada no tuvieron actividad hidrolítica del cAMP detectable estimulada por calmodulina.
EJEMPLO III Aislamiento, Purificación y Determinación de la Secuencia del cADN de CaM-PDE de 63 kDa de Cerebro Bovino
Múltiples oligonucleótidos total y parcialmente redundantes correspondientes a la secuencia de aminoácidos informada en la Fig. 1 se sintetizaron para utilizar en un intento por obtener un clon de cADN para la CaM-PDE de 63 kDa. Las temperaturas de templado utilizadas para las reacciones en cadena de la polimerasa se variaron entre 2 y 20ºC por debajo del oligonucleótido de temperatura de fusión mínima de cada par sentido-antisentido. Excepto las sondas 63-12s y 63-13a, que se discuten más abajo, los productos de PCR de cada uno de los pares de oligonucleótidos, en una amplia gama de condiciones, dieron bandas múltiples con bromuro de etidio cuando se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. El uso de 63-12s y 63-13a dio lugar a un producto de PCR que codificó para la CaM-PDE de 63 kDa cuando se secuenció.
Se ensambló un oligonucleótido con sentido de 23 residuos totalmente redundante, denominado 63-12s, que tenía la siguiente secuencia: SEC. ID NO: 18
5´-ATHCAYGAYTAYGARCAYACNGG-3´, basada en una secuencia de aminoácidos: SEC. ID NO: 19
IHDYEHTG que se conserva en las CaM-PDEs de bovino de 61 kDa (ver Fig. 1). Un oligonucleótido antisentido de 32 residuos parcialmente redundante, denominado 63-13a, tenía la secuencia: SEC. ID NO: 20
5´-TCYTTRTCNCCYTGNCGRAARAAYTCYTCCAT-3´, y se basó en la secuencia conservada siguiente de la CaM-PDE de 63 kDa: SEC. ID NO: 21:
MEEFFRQGDKE
Se preparó ARN mensajero a partir de corteza cerebral de cerebro bovino y se seleccionó con poli A+. El ADN complementario de primera hebra se produjo usando transcriptasa reversa de AMV o MMLV. Se fosforilaron los oligonucleótidos destritilados usando [�-32P]ATP 1mM a 1 X 106 cpm/nmol y T4 polinucleótido quinasa. Después de la
32P
separación de los oligonucleótidos marcados con en 5´ del ATP libre usando columnas NENsorb 20, cada uno se resuspendió como solución de reserva 20 µM (5´ fosfato) y se combinó finalmente a razón de 400 nM cada uno en la PCR. La reacción se efectuó usando un total de 50 ng de cADN y dNTP 200 µM para obtener alrededor de 1 µg de producto de PCR. La reacción tuvo un paso inicial de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC de 1 minuto, un
paso de templado a 50ºC durante 1 minuto y un paso de extensión de 2 minutos a 72ºC. En las condiciones de reacción, se obtuvo una sola banda teñida de bromuro de etidio de 450 pares de bases por electroforesis en gel de agarosa de 100 ng del producto de PCR. Se ligaron 5 µg de producto de PCR 5´ fosforilado a 15 ng de plásmido Bluescript KS(+) cortado con EcoRV, utilizando T4 ADN ligasa en PEG-6000 al 5% durante 12 horas a 21ºC. Los positivos putativos de las transformaciones XL 1-azules fueron colonias blancas que usaron isopropil tiogalactósido (IPTG) y bromo-cloro-indolil galactósido (Xgal) para la selección cromogénica. Dichas selecciones se secuenciaron usando cebadores T3 ó T7, terminadores de didesoxinucleótidos y Sequenase.
Un clon resultante (p11.5B) tenía la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos traducida provistas en las SEC. ID NO: 22 y SEC. ID NO: 23, respectivamente. Los codones para los aminoácidos YEH hallados en el oligonucleótido 63-12s fueron reemplazados por codones para la secuencia de aminoácidos NTR de p11.5B. esto se debió probablemente a un contaminante en 63-12s. Dado que el marco de lectura abierto (ORF) traducido fue similar al informado en la Fig. 1 para la CaM PDE de 63 kDa, p11.5B se utilizó para seleccionar una biblioteca de cADN de cerebro bovino para un clon de cADN de longitud total.
Se construyó una biblioteca de cADN de cerebro bovino en � ZAP II. El cADN de primera hebra se trató con Rnasa H, ADN polimerasa de E. coli y ADN ligasa de E. coli para sintetizar el cADN de segunda hebra. El cADN se dejó con sus extremos romos mediante T4-ADN polimerasa; se protegieron los sitios de EcoRI del cADN con EcoRI metilasa y S-adenosil metionina y los acopladores (linkers) de EcoRI se ligaron con T4 ADN ligasa. Después del tratamiento con endonucleasa de restricción EcoRI, se separaron los vinculantes libres del cADN por filtración en gel sobre Sefarosa CL-4B. Los brazos � ZAP II se ligaron al cADN y se empacaron in vitro mediante un kit de empaque Gigapack Gold obtenido de Stratagene. Se obtuvieron 9,5 x 105 recombinantes con un 5,8% de láminas no recombinantes según se determinó por plaqueo con IPTG y X-gal. La biblioteca se amplificó una vez por el método del lisado en placa para obtener 1,4 x 107 pfu/ml.
Se realizó una selección inicial de una biblioteca de cADN de cerebro bovino total en � ZAP II. Se seleccionaron 700.000 pfu utilizando el oligonucleótido 63-1s marcado con 32P a una temperatura de hibridización y de lavado de 40ºC. El oligonucleótido 63-1s resultó ser un oligómero de 23 residuos que tenía la secuencia: SEC. ID NO: 24
5´-AARAARAAYYTNGARTAYACNGC-3´, correspondiente a la secuencia de aminoácidos: SEC. ID NO: 25
KKNLEYTA Se seleccionaron un total de 21 positivos putativos. Las posteriores que se incorporan aquí totalmente como referencia.-selecciones fueron impedidas por el muy elevado fondo hallado utilizando este método de screening. Por lo tanto, se combinaron alícuotas de cada selección primaria y 50.000 pfu del pool se re-plaquearon y se re-seleccionaron con p11.5B radiomarcado por medio de cebadores aleatorios y [�-32P]dCTP. Se obtuvo un positivo, se purificó por plaqueado y se rescató como plásmido p12.3a. Su secuencia de ADN se provee en SEC. ID NO: 26. Posteriormente, la biblioteca de corteza cerebral de cerebro bovino se sometió a screening adicional con p11.5B. Se obtuvieron otros dos clones independientes, p12.27.9 y p12.27.11, de una selección primaria de 1,4 X 106 pfu. Se purificaron por plaqueado y se rescataron para la secuenciación.
El clon p12.3a codifica una secuencia de proteína con la mayoría de los péptidos alineados aislados de la CaM-PDE de 63 kDa bovina, según se muestra en la Fig. 1. La SEC. ID NO: 26 y la SEC. ID NO: 27 describieron la región codificadora (es decir, los 1844 nucleótidos de un inserto de aproximadamente 2,5 kilobases) de p12.3a. Los números de bases 248-290 codifican la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO: 28
QLENGEVNIEELKK, mientras que el péptido comparable (Figura 1) tiene la secuencia SEC. ID NO: 29
QLIPGRVNIISLKK Los números de bases 942-990 codifican una secuencia de aminoácidos SEC. ID NO: 30
KSECAILYNDRSVLEN mientras que la secuencia del péptido aislado (Figura 1) es SEC. ID NO: 31
KDETAILYNDRTVLEN.
No se encuentra nada de la secuencia del péptido de 63 kDa en ningún marco de lectura de p12.3a; asimismo, el peso molecular del marco de lectura abierto de p12.3a, traducido, es 60.951 y no 63.000. por lo tanto, este cADN puede representar una variante de isoenzima de la proteína de 63 kDa. Los otros dos clones independientes (p12.27.9 y p12.27.11) parecen tener una secuencia de ORF idéntica a la de p12.3a. El marco de lectura abierto de un clon comienza en el número de nucleótido 823 de p12.3a y es idéntico a p12.3a hasta su codón de terminación. El otro clon comienza en el nucleótido 198 y es idéntico a p12.3a en toda su longitud. Ninguno de los tres clones tiene la secuencia de péptidos anómala NTR hallada en p11.5B; los tres tienen YEH como la CaM PDE de 61 kDa.
La expresión transitoria del cADN de CaM-PDE de 63 kDa en células COS-7 se logró de la siguiente manera. Se preparó mediante PCR un fragmento del inserto de cADN del plásmido p 12.3, incluyendo la región codificadora de proteína de la SEC. ID NO: 26 y flanqueada por sitios de restricción BamHI. Más específicamente, se sintetizaron oligonucleótidos correspondientes a los Nos. de base 94-117 (con el codón de iniciación putativo) y los Nos. de base 1719-1735 antisentido (con la secuencia inmediatamente en 3´ del codón de terminación) de la SEC. ID NO: 26, con dos sitios BamHI en tándem en sus extremos 5´. Los dos cebadores tenían las siguientes secuencias: SEC. ID NO: 32
5´-GGATCCGGATCCCGCAGACGGAGGCTGAGCATGG-3´ SEC. ID NO: 33
5´-GGATCCGGATCCAGGACCTGGCCAGGCCCGGC-3´
Los dos oligonucleótidos se utilizaron en un ciclo de PCR 30 veces desde una incubación de 1 minuto a 94ºC hasta una incubación de 2 minutos a 72ºC con una reacción de extensión final de 10 minutos a 72ºC. La reacción de 100 µl utilizó 20 µM de cada oligonucleótido y 100 pg de p12.3a como molde con el fin de producir 5 µg de producto con 1665 pares de bases.
El producto se extrajo una vez con un volumen igual de fenol:cloroformo 1:1, se hizo 0,3 M con respecto al acetato de sodio y se precipitó con dos volúmenes de etanol durante la noche. El precipitado se secó, se rehidrató llevándolo a 50 µl y el cADN se digirió con 5 unidades de endonucleasa de restricción BamHI durante una hora a 37ºC. Luego, la solución se extrajo una vez con igual volumen de fenol:cloroformo 1:1. El cADN con BamHI en los extremos 5´ y 3´ se purificó a partir de la fase acuosa utilizando columnas Qiagen Q-20 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) y el protocolo suministrado por el fabricante.
El producto de PCR cortado y purificado se ligó al plásmido Bluescript(+) tratado con fosfatasa alcalina y digerido con BamHI. El producto de ligación se subclonó en células XL1; los transformantes resultantes se seleccionaron por secuenciación. Un transformante (denominado p11.6.c6) se aisló con el inserto BamHI orientado de tal manera que el sitio de restricción HindIII del Bluescript KS(+) estuviera a 30 bases en dirección 5´ de la secuencia del inserto codificadora del codón de iniciación. Este plásmido se digirió con endonucleasas de restricción HindIII y XbaI para liberar el fragmento de 1689 pares de bases. El fragmento se ligó al ADN vector CDM8 digerido con HindIII y XbaI como en el Ejemplo I.
Las células COS-7 se transfectaron con el constructo p12.3.a/CDM8 o se transfectaron en forma simulada con el vector CDM8 solo usando el método de DEAE/dextrano según se describió en el Ejemplo I. Se utilizó una relación de 10 µg de ADN/400 µg de DEAE-dextrano, con una concentración final de DEAE-dextrano en el medio de 100 µg/ml. Después de 48 horas, las células se suspendieron en 1 ml de buffer de homogeneización (Tris HCl 40 mM, pH=7,5, 15 mM en benzamidina HCl, 15 mM en λmercaptoetanol, 0,7 µg/ml de pepstatina A, 0,5 µg/ml de leupeptina y Na4EDTA 5 mM) y se fraccionaron en hielo usando un homogeneizador Dounce. Los homogenatos se diluyerona la mitad para alcanzar una concentración final de 50% (v/v) de glicerol para conservar a –20ºC y se utilizaron tanto para probar la actividad de fosfodiesterasa como para determinar la concentración de proteína. Se determinaron las actividades dependiente de CaM e independiente como en el Ejemplo I. Las células transfectadas con un ADN p12.3.a tuvieron un incremento de 15 veces en la actividad de fosfodiesterasa de cAMP estimulada por CaM y un incremento de 12 veces en la actividad de fosfodiesterasa de cGMP estimulada por CaM por sobre los niveles basales. Las células COS-7 transfectadas en forma simulada no mostraron ninguna actividad de PDE por encima de los niveles basales, aun con estimulación de CaM.
EJEMPLO IV Aislamiento, Purificación, Determinación de la Secuencia y Expresión del cADN de cGS-PDE de Corteza Adrenal Bovina
Se preparó ARN total a partir de corteza externa adrenal bovina utilizando el método de Chomczynski et al., supra. El ARN poliadenilado se purificó a partir de las preparaciones de ARN total utilizando el kit de purificación de mARN Poly(A) QuikTm de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cADN de primera hebra se sintetizó agregando 80 unidades de transcriptasa de AMV reversa a una mezcla de reacción (volumen final de 40 µl) que contenía Tris HCl 50 mM (pH 8,3 a 42ºC), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, desoxinucleótido trifosfatos 0,5 mM (cada uno), KCl 50 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 5 µg de oligómeros de ácido desoxitimidílico (12-18 bases) y 5 µg de mARN de corteza adrenal bovina desnaturalizado durante 15 minutos a 65ºC. La reacción se incubó a 42ºC durante 60 minutos. La segunda hebra se sintetizó utilizando el método de Watson et al., DNA Cloning: A Practical Approach, 1:79-87 (1985) y los extremos del cADN se hicieron romos con T4 ADN polimerasa. Se metilaron los sitios de la endonucleasa de restricción EcoRI [Maniatis et al., supra] utilizando una EcoRI metilasa (Promega) y se ligaron vinculantes de EcoRI (exceso molar de 50 veces) al cADN utilizando T4 ADN ligasa. los vinculantes en exceso se eliminaron digiriendo el cADN con endonucleasa de restricción EcoRI, seguido de cromatografía con Sefarosa CL-4B. Ausubel et al., supra. El cADN (25-50 ng por µg de vector) se ligó a los brazos de ZAP® II (Stratagene) defosforilado y digerido con EcoRI [Short et al., Nuc.Acids.Res., 16:7583-7599 (1988)] y se empacó [Maniatis et al., supra] con extractos de Gigapack® Gold de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Inicialmente, se preparó una biblioteca de cADN de corteza adrenal bovina no amplificada y se seleccionó con sondas de un oligonucleótido antisentido redundante de 23 residuos marcado en un extremo con �-[32P]ATP y T4 polinucleótido quinasa. Se prepararon los oligómeros correspondientes a las secuencias de aminoácidos: SEC. ID NO: 34
EMMMYHMK y SEC. ID NO: 35
YHNWMHAF Utilizando un sintetizador de ADN modelo 380ª de Applied Biosystems. Sus secuencias son las siguientes: SEC. ID NO: 36
5´-TT CAT RTG RTA CAT CAT CAT YTC-3´ SEC. ID NO: 37
5´-AA NGC RTG CAT CCA RTT RTG RTA-3´
Se hibridizaron a 45ºC toda la noche círculos de filtro de nitrocelulosa por duplicado que contenían láminas de 12 placas confluyentes de 150 mm (aproximadamente 50.000 pfu/placa), en una solución que contenía 6X SSC, 1X solución de Denhardt, 100 µg/ml de tARN de levadura, 0,05% de pirofosfato de sodio y 106 cpm/ml de sonda radiomarcada (>106 cpm por pmol). Los filtros se lavaron tres veces en 6X SSC a temperatura ambiente, seguido de un lavado con 6X SSC de mayor rigurosidad a 10ºC por debajo de la temperatura de fusión mínima de las sondas oligómeras, y se expusieron a una película de rayos X toda la noche.
Se aisló y secuenció un único clon de cADN de 2,1 kb (denominado pcGS-3:2.1). La secuencia de aminoácidos encerrada por el gran ORF de este clon era idéntica a las secuencias peptídicas de la cGS-PDE purificadas a partir de la fracción sobrenadante de un homogenato de corazón bovino. LeTrog et al., supra.
Una segunda biblioteca de cADN amplificada de corteza adrenal bovina se seleccionó utilizando el cADN parcial CGS-3:2.1 marcado con 32P, dando un cADN de 4,2 kb (denominado 3CGS-5).
La biblioteca se construyó, se amplificó como en Maniatis et al., supra, se plaqueó y se sometió a screening con el inserto de cADN bovino del clon CGS-3:2.1. La sonda se preparó utilizando el método de Feinberg et al., supra, y el ADN radiomarcado se purificó usando columnas Elutip-D®. Las láminas (600.000 pfu en doce placas de 150 mm) unidas a los círculos filtrantes se hibridizaron a 42ºC toda la noche en una solución que contenía formamida al 50%, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), solución 1X de Denhardt, 10% de dextrano sulfato, 0,11% de SDS y 106 cpm/ml de sonda marcada con 32P (109 cpm/µg). Los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos con 2X SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de 15 minutos con 0,1X SSC/0,1% de SDS a 45ºC. Los filtros se expusieron a película de rayos X toda la noche. Ausubel et al., supra.
A partir de este screening inicial, se identificaron 52 clones putativos. Se eligieron al azar veinte de estos clones, se purificaron mediante varias vueltas de re-plaqueado y screening [Maniatis et al., supra] y los cADNs insertos se subclonaron en el pBluescript SK(-) por excisión in vivo [Short et al., supra] según recomienda el fabricante. Al ADN plásmido preparado a partir de estos clones se analizó por análisis de restricción y/o secuenciación. A partir de esta observación, se identificó un cADN de 4,2 kb que representaba el mayor marco de lectura abierto. Los insertos de cADN de los otros clones putativos eran más cortos y parecían ser idénticos en base a la secuencia nucleotídica de los extremos de los insertos.
Se secuenciaron cADNs de cGS-PDE putativos mediante una modificación del método de Sanger [Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74:5463-5467] utilizando kits de Sequenase® o Taq Trak® según las indicaciones del fabricante. Los moldes se prepararon a partir de los cADNs construyendo una serie de deleciones anidadas [Henikoff, Gene, 28:351-359 (1984)] en el vector, pBluescript SK(-) (Stratagene) utilizando exonucleasa III y nucleasa de poroto mung de acuerdo con el protocolo del fabricante. En los casos en los cuales no se conseguían moldes superpuestos por este método, los cADNs se escindían en sitios de endonucleasa de restricción convenientes y se subclonaba en pBluescript, o se fabricaban oligómeros específicos para cebar el molde para secuenciación. Los moldes de ADN monocatenarios se rescataron aislando el ADN del fagomidio secretado por células XL1 ayudantes infectadas por fagos ancladas en el plásmido pBluescript [Levinson et al., supra] según lo recomendado por el fabricante (Stratagene). Se efectuaron búsquedas de homología de ácidos nucleicos en GENBANK (Release 66.0), EMBL (Release 25.0) y NBRF (Release 36.0) y en bases de datos de proteínas (Release 26.0), utilizando programas Wordsearch, FASTA y TFASTA provistos con el paquete de software del Genetics Computer Group, Devereaux et al., Nuc.Acids Res., 12:387-395 (1984).
La secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos deducida codificada por el gran marco de lectura abierto del inserto del clon de cADN p3CGS-5 son provistas en SEC. ID NO: 38 y SEC. ID NO: 39. comenzando con el primer codón de metionina, el cADN codifica un polipéptido de 921 residuos con un peso molecular calculado de alrededor de 103.000. Aunque ningún codón de stop precede a esta secuencia, se ha identificado una secuencia de consenso de metionina iniciadora [Kozak, J.Cell Biol., 108:229-241 (1989)]. La presencia de 36 residuos de adenosina en el extremo 3´ del cADN precedidos por una secuencia de consenso de terminación de la transcripción [Birnstiel et al., Cell, 41:349-359 (1985)] sugiere que toda la secuencia no traducida de 3´ del mARN de cGS-PDE está representada por este clon.
Una cepa de células S49 deficiente en fosfodiesterasas putativa (PPD) [Bourne et al., J.Cell.Physiol., 85:611-620 (1975)] fue transfectada transitoriamente con el cADN de cGS-PDE utilizando el método de DEAE-dextrano. El cADN de cGS-PDE se ligó al sitio de clonación BamHI único en un vector de expresión de mamífero, denominado pZEM228, a continuación de un promotor de metalotionina inducible por zinc y antes de una secuencia de terminación de transcripción SV40. El ADN se purificó a partir de preparaciones de plásmidos en gran escala usando columnas Qiagen pack-500 según las indicaciones del fabricante. Se cultivaron células PPD-S49 en DMEM que contenía 10% de suero de caballo inactivado por calor, 50 µg/ml de penicilina G y 50 µg/ml de sulfato de estreptomicina a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 7% saturada con agua. Antes de las transfecciones, bandejas de células confluentes de 100 mm se replaquearon a un quinto de la densidad original y se incubaron durante 24-36 horas. En un experimento de transfección típico, se lavaron células PPD-S49 (50-80% confluentes) con solución salina bufferizada con Tris y se transfectaron aproximadamente 2 x 107 células con 10 µg de ADN mezclado con 400 µg de DEAE-dextrano en un ml de TBS. Las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora con agitación suave cada 20 minutos. A continuación, se agregó DMSO hasta una concentración final de 10% y se mezcló rápidamente pipeteando en forma ascendente y descendente. Después de 2 minutos, las células se diluyeron con 15 volúmenes de TBS, se recogieron por centrifugación y se lavaron consecutivamente con TBS y DMEM. Las células se resuspendieron en medio completo y se sembraron en placas frescas de 100 mm (1-2 x 107 células/10ml/placa). Después de 24 horas, las células se trataron con TBS solo o conteniendo sulfato de zinc (concentración final = 125 µM) y se incubaron por 24 horas adicionales. Las célula se cosecharon y se lavaron una vez con TBS. Los pélets de células finales se resuspendieron en dos ml de buffer de homogeneización (Tris-HCl 40 mM; pH 7,5, benzamidina 15 mM, λ-mercaptoetanol 15 mM, 0,7 µg/ml de pepstatina A, 0,5 µg/ml de leupeptina y EDTA 5 mM) y se fraccionaron sobre hielo utilizando un homogeneizador dounce. Los homogenatos se centrifugaron a
10.000 x g a 4ºC y los sobrenadantes se ensayaron para determinar la actividad de fosfodiesterasa y la concentración de proteína.
La actividad de cGS PDE se determinó por un método previamente descripto utilizando [3H]cAMP como sustrato como en Martins et al., J.Biol.Chem., 257:1973-1979 (1982). Los ensayos de fosfodiesterasa se realizaron por triplicado. Se usó el ensayo de Bradford [Bradford, Anal.Biochem., 72:248-254 (1976)] para cuantificar la proteína utilizando BSA como estándar.
En ausencia de tratamiento con zinc, no se detectó ningún aumento en la actividad basal o en la actividad de fosfodiesterasa estimulada por cGMP en células PPD S49 transfectadas con el constructo cGS PDE-ZEM o el vector solo. Sin embargo, las células tratadas con zinc transfectadas con cADN de cGS-PDE, pero no el vector solo, expresaron actividad de cAMP fosfodiesterasa reforzada por cGMP, indicando que el cADN codifica una cGS-PDE. La actividad total de los homogenatos y de los sobrenadantes de 50.000 x g no fue significativamente diferente.
La expresión transitoria del cADN de cGS-PDE en células COS-7 se consiguió como en el Ejemplo I. Se aisló un fragmento de p`3CGS-5 de 4,2 kb usando HindIII y NotI y se insertó en el plásmido pCDM8, que se había digerido con las mismas enzimas. El carácter de los productos producidos en células COS-7 transformadas con el constructo p3CGS-5/pCDM8 se discute en el Ejemplo V, infra.
Ejemplo V Aislamiento, Purificación y Determinación Parcial de la Secuencia del cADN de cGS-PDE de Cerebro Bovino
A. Aislamiento del Clon pBBCGSPDE-5 de cADN de cGSPDE de Cerebro Bovino
Una biblioteca de cADN de cerebro bovino construida con el vector � ZAP (provisto gentilmente por Ronald E. Diehl, de Merck Sharp y Dohme) se sometió a screening con un fragmento de escisión de endonucleasa de restricción EcoRI/ApaI de 450 pb, del cADN de p3CGS-5 correspondiente a los números de posición del nucleótido (p3CGS-5) 1-452. La sonda se preparó usando el método de Feinberg et al., supra, y el ADN marcado con 32P se purificó usando columnas Elutip D®. Las láminas (un total de
600.000 láminas sobre placas de 12-150 mm) unidas a círculos filtrantes se hibridizaron a 42ºC toda la noche en una solución que contenía formamida 50%, Tris HCl 20 mM (pH 7,5), solución 1X de Denhardt, dextrano sulfato 10%, SDS 0,1% y 106 cpm/ml de sonda marcada con 32P (109 cpm/µg). Los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos con 2X SSC/SDS 0,1% a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de 15 minutos con 0,1X SSC/SDS 0,1% a 45%. Los filtros se expusieron a una película de rayos X toda la noche.
Se eligieron cuarenta clones putativos de esta primera selección, de los cuales se seleccionaron seis al azar y se purificaron mediante varias vueltas de re-plaqueado y screening [Maniatis et al., supra]. Los cADNs del inserto se subclonaron en pBluescript SK(-) por recorte in vivo, según recomendación del fabricante. El ADN plásmido preparado a partir de cultivos de cada clon se secuenciaron a partir de los extremos usando kits de secuenciación Sequenase t Taq Trak. Las secuencias obtenidas de este experimento confirmaron que el clon de cADN de cerebro bovino, pBBCGSPDE-5 era un cADN de cGS-PDE y que era diferente del cADN de cGS-PDE adrenal en el extremo cinco prima.
El análisis parcial de secuencias del inserto pBBCGSPDE-5 en su extremo 5´ (que codifica la región amino terminal de la proteína) reveló la hebra con sentido descripta en SEC. ID NO: 40, mientras que la secuenciación del extremo 3´ del inserto reveló la secuencia antisentido de SEC. ID NO: 41.
B. Aislamiento del Clon pBBCGSPDE-7 de cADN de cGS-PDE de Cerebro Bovino
Cada uno de los cuarenta clones putativos seleccionados de la primera vuelta de purificación descripta más arriba se sembró individualmente en una monocapa (lawn) de células XLl huésped y se incubó toda la noche a 37ºC. Las láminas se sometieron a screening con un fragmento de escisión de endonucleasa de restricción PstI/SmaI de 370 pb del cADN de p3CGS-5 (correspondiente a los números de posición del nucleótido (p3CGS-5) 2661-3034). La sonda se preparó usando el método de Feinberg et al., supra, y el ADN marcado con 32P se purificó usando columnas Elutip D®. Las láminas unidas a círculos filtrantes se hibridizaron a 42ºC toda la noche en una solución que contenía formamida 50%, Tris HCl 20 mM (pH 7,5), solución 1X de Denhardt, dextrano sulfato 10%, SDS 0,1% y 106 cpm/ml de sonda marcada con 32P (109 cpm/µg). Los filtros se lavaron tres veces durante 15 minutos con 2X SSC/SDS 0,1% a temperatura ambiente, seguido de dos lavados de 15 minutos con 0,1X SSC/SDS 0,1% a 45%. Los filtros se expusieron a una película de rayos X toda la noche.
Después de varias vueltas de plaqueo y re-screening, se purificaron seis clones putativos y se secuenciaron desde los extremos. La secuencia del extremo cinco prima del clon pBBCGDPDE-7 del cADN resultó idéntica al clon pBBCGDPDE-5, pero no al clon p3CGS-5 derivado de la glándula adrenal. La secuencia del extremo tres prima del clon pBBCGDPDE-7 resultó idéntica a la secuencia del inserto p3CGS-5.
El análisis de secuencia del inserto pBBCGDPDE-7 reveló la secuencia de ADN descripta en la SEC. ID NO: 42 y la secuencia de aminoácidos de SEC. ID NO: 43.
El gran marco de lectura abierto codifica un polipéptido de 942 residuos que es casi idéntico a la isoenzima cGS-PDE de la glándula adrenal (921 residuos). La diferencia en la estructura primaria de estas dos isoenzimas radica en los residuos 1-46 amino terminales de la CGS-PDE de cerebro y los residuos 1-25 de la cGS-PDE adrenal. Los restantes residuos carboxilo terminales de las cGS-PDE de cerebro y adrenal son idénticos.
Para la expresión transitoria en células COS-7, se aisló un fragmento de pBBCGDPDE-7 de 3,8 kb utilizando HindIII y NotI y se insertó en el plásmido pCDM8 que se había cortado con las endonucleasas de restricción HindIII y NotI. El constructo recombinante pBBCGDPDE-7/CDM8 se usó para transfectar transitoriamente células COS-7. Las propiedades del constructo pBBCGDPDE-7/CDM8 y del constructo p3CGS5/CDM8 preparados en los productos del Ejemplo IV se compararon posteriormente. Se prepararon fracciones de membrana y sobrenadante a partir de extractos de células COS-7 transfectadas y se probó su actividad de cGS-PDE. Ambos constructos de plásmido, el pBBCGDPDE-7/CDM8 y el p3CGS-5/CDM8, produjeron actividades de cGS-PDE en los extractos de células COS-7 y la mayor parte de la actividad se detectó en las fracciones de sobrenadante. Sin embargo, un porcentaje 10 veces mayor de la actividad total de cGS-PDE se detectó en extractos de membranas de células COS-7 transfectadas con el constructo pBBCGDPDE-7/CDM8 respecto de la membrana preparada a partir de células COS-7 transfectadas con p3CGS-5/CDM8. estos resultados indican que, con respecto a la cGS-PDE adrenal, la isoenzima codificada por el cADN de pBBCGDPDE-7 se asocia de manera preferencial con membranas celulares. .
EJEMPLO VI Uso de cADN Adrenal Bovino de cGS-PDE para Obtener cADNs de cGS-PDE Humanas
Varios clones de cADN humanos, homólogos de un clon de cADN que codifica la fosfodiesterasa bovina estimulada por GMP cíclico fueron aislados por hibridación utilizando una sonda de ácido nucleico derivada del cADN bovino. Una combinación de análisis de secuencias y estudios de hibridación indica que estos clones de cADN humanos abarcan un marco de lectura abierto correspondiente a una fosfodiesterasa humana.
Bibliotecas de cADN se sondaron con ADN proveniente del plásmido p3CGS-5 que contiene un inserto de cADN de 4,2 kb que codifica la cGS-PDE bovina. Este plásmido se digirió con las enzimas de restricción SmaI y EcoRI. El fragmento de aproximadamente 3,0 kb derivado del inserto de cADN se aisló y purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento contiene el marco de lectura abierto completo de la PDE. El fragmento se marcó con nucleótidos radioactivos mediante cebadura al azar.
Las bibliotecas de cADN se plaquearon sobre cápsulas de Petri de 150 mm a una densidad de aproximadamente 50.000 láminas por placa. Se prepararon réplicas con filtros de nitrocelulosa por duplicado. Se utilizó la sonda de ácido nucleico radioactivo para la hibridación a los filtros toda la noche a 42ºC en formamida 50%, 5x SSPE (NaCl 0,9 M, NaH2PO4.H2O 0,05 M, NaOH 0,04 M y Na2EDTA.2H2O 0,005 M), SDS 0,5%, 100 µg/ml de ADN de testículo de salmón y 5x solución de Denhardt. Los filtros se lavaron inicialmente a temperatura ambiente y posteriormente a 65ºC en 2x SSC que contenía SDS 0,1%. Se purificaron las láminas positivas y sus insertos se subclonaron en un vector de secuenciación apropiado para el análisis de secuencia de ADN mediante técnicas estándar.
Primeramente, se sometió a screening una biblioteca de cADN de �gt10 preparada a partir de mARN (Clontech, al azar y dT-cebado) de hipocampo humano. De las aproximadamente 500.000 láminas examinadas, 33 se hibridizaron a la sonda. Uno de estos fagos se digirió con EcoRI para eliminar el inserto de cADN. Este fragmento de EcoRI que contenía el inserto se clonó en Bluescript KS que se había digerido con EcoRI y luego se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Un producto de esta reacción fue el plásmido pGSPDE9.2, que mostró dos diferencias principales cuando se lo comparó con el cADN de cGS-PDE. Las 0,4 kb del extremo 5´ del inserto de pGSPDE9.2 divergían del cADN bovino. A aproximadamente 0,7 kb del extremo 5´ del cADN humano hay una región que diverge del cADN bovino. Esta región puede ser un intrón. Veinticinco de las láminas de hipocampo remanentes que se habían hibridizado a la sonda bovina se examinaron mediante PCR, hibridización y/o secuenciación. No se encontró que ninguna de ellas se extendiera a través de las regiones que diferían entre los cADNs bovino y humano.
Los fagos � GSPDE7.1 y � GSPDE7.4, otros dos fagos de la biblioteca de hipocampo, se digirieron con EcoRI y HindIII. Cada uno dio un fragmento de 1,8 kb que contiene la mayor parte del inserto de cADN y aproximadamente 0,2 kb del fago � ADN. El � ADN está presente en el fragmento porque en cada caso uno de los sitios EcoRI que típicamente enmarcan un inserto de cADN había sido destruido, posiblemente cuando se construyó la biblioteca. Los fragmentos EcoRI/HindIII se clonaron en el Bluescript KS digerido con EcoRI y HindIII. Este procedimiento dio lugar a los plásmidos pGSPDE7.1 y pGSPDE7.4. Los insertos de cADN codifican ADN homólogo a la porción 3´ del cADN de fosfodiesterasa bovina. Ambos insertos de cADN de estos clones comienzan en el sitio EcoRI y las secuencias son homólogas y adyacentes a este sitio.
Se secuenciaron porciones de insertos de cADN pGSPDE7.1 y pGSPDE7.4 y son idénticas excepto por una corta región de sus extremos 3´. El inserto de cADN de pGSPDE7.1 finaliza con una secuencia de aproximadamente 70 bases adenina, mientras que el inserto de cADN de y pGSPDE7.4 finaliza con tres nucleótidos adicionales no presentes en pGSPDE7.1, seguidos de una secuencia de aproximadamente 20 bases adenina.
Luego, una biblioteca de cADN preparada en � ZAPII (Stratagene) as partir de mARN de corazón humano dio una lámina de hibridación de las aproximadamente
500.000 sometidas a screening. El plásmido pGSPDE6.1 de Bluescript SK(-) que contenía el inserto de hibridación se recortó in vivo del clon � ZAPII. El análisis de secuencias demostró que el inserto es homólogo del cADN de fosfodiesterasa bovina. La región homóloga extiende la posición de la EcoRI encontrada en la secuencia formada uniendo la secuencia del inserto de pGSPDE9.2 a la secuencia del inserto de pGSPDE7.1 o pGSPDE7.4. Así, se cree que los dos clones del hipocampo forman un marco de lectura abierto completo.
Una tercera biblioteca �gt10 derivada de mARN de placenta humana dio cinco láminas de hibridación de las aproximadamente 800.000 sometidas a screening. Estos clones de cADN de placenta eran cortos y sus secuencias eran idénticas a porciones del cADN de hipocampo pGSPDE9.2. El screening de 5x105 láminas de una biblioteca de cADN de glioblastoma U118, 5x105 de una biblioteca de cADN de bazo y 5x105 de una biblioteca adrenal (Enfermedad de Cushing) no produjo láminas de hibridación.
Dada la homología entre el grueso de las secuencias de cGS-PDE humana y bovina, se decidió obtener múltiples clones de cADN independientes que contuvieran el extremo 5´ de la cGS-PDE humana para determinar si la secuencia 5´ de 0,4 kb era un artefacto. Un fragmento EcoRI-HindIII de 0,95 kb del extremo 5´ del plásmido p3cgs5 del cADN de cGS bovino se cebó al azar y se utilizó como sonda para seleccionar una cantidad de bibliotecas de cADN humano. El screening de las bibliotecas de hipocampo se efectuó en las mismas condiciones de screening que las descriptas anteriormente. Todos los restantes screening se efectuaron según se describe con respecto a los screening de bibliotecas de cADN de corazón humano en el Ejemplo VII, infra. No se obtuvo ningún positivo sometiendo a screening 5x105 láminas de una biblioteca de células T humanas (Hut78, cebadas con dT), 106 láminas de la biblioteca de cADN de hipocampo (al azar y cebada con dT), 5x105 láminas de una biblioteca de cADN de hígado humano (cebadas con dT, estiramiento 5´, Clontech), 5x105 láminas de una biblioteca de cADN de glioblastoma SW1088 humano (cebadas con dT), 5x105 láminas de la misma biblioteca de cADN de corazón (al azar y cebadas con dT) y 1,5x106 láminas de una biblioteca de cADN de pulmón humano (cebada al azar). Se obtuvieron dos positivos por screening de 5x105 láminas de una biblioteca de cADN de cerebro fetal humano (al azar y cebadas con dT, Stratagene). Estas se denominaron HFB9.1 y HFB9.2.
Los plásmidos HFB9.2 y HFB9.1 de Bluescript SK(-) se recortaron in vivo de los clones �ZAPII. El análisis de secuencia del ADN reveló que el HFB9.1 comienza aproximadamente 80 nucleótidos hacia 3´ respecto de HFB9.2 y lee dentro de un intrón aproximadamente 1,9 kb del camino hacia HFB9.2. El HFB9.2 cubre el marco de lectura abierto completo de la cGS-PDE, pero lee dentro de lo que puede ser un intrón 59 nucleótidos después del codón de stop. Ambos carecen de las 0,4 kb de 5´ y del supuesto intrón hallado en pGSPDE9.2. El marco de lectura abierto completo de HFB9.2 se aisló y ensambló al vector de expresión de levadura pBNY6N. El plásmido resultante, denominado pHcgs6n, incluye la región codificante del cADN como inserto EcoRI/XhoI. Las secuencias del ADN y de aminoácidos deducida para el inserto se proveen en SEC. ID NO: 44 y 45, respectivamente.
EJEMPLO VII Uso del cADN de CaM-PDE de Cerebro Bovino de 61 kDa para Obtener cADN de CaM-PDE Humana de 61 kDa
Los clones � CaM H6a y � CaM H3a, que son homólogos del cADN que codifica la CaM-PDE bovina de 61 kDa, se obtuvieron por hibridación utilizando una sonda de ácido nucleico derivada del cADN que codifica la enzima de la especie bovina. Una combinación de análisis de secuencia y estudios de hibridación indica que el � CaM H6a contiene la mayor parte de un marco de lectura abierto que codifica una CaM-PDE humana.
La sonda para hibridación usada para aislar el ADN humano se derivó del cADN de primera hebra del tejido pulmonar bovino por tratamiento con PCR. Más específicamente, el oligonucleótido de 23 residuos denominado PCR-2S del Ejemplo I (ver SEC. ID NO: 1) se combinó en una reacción de PCR con cADN de pulmón bovino y un oligonucleótido redundante anti-sentido de 23 residuos (PCR-5AS) basado en la secuencia del inserto pCAM con SEC. ID NO: 46
5´TCRTTNGTNGTNCCYTTCATRTT-3´ que representa la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO: 47
NMKGTTND, de acuerdo con los procedimientos generales de los Ejemplos I y III, para generar un fragmento de cADN de 1098 pb que representa una gran porción de la región codificadora del inserto pCAM-40. Los productos de la PCR se purificaron en un gel de agarosa al 1% utilizando un buffer Tris-acetato 0,4 M/EDTA 0,001 M que contenía 0,5 µg/ml de bromuro de etidio. Los ADN producidos se visualizaron con luz UV, se recortaron limpiamente del gel con una navaja de afeitar, se purificaron usando un kit de reactivos Geneclean II y se ligaron al vector de ADN pBluescript cortado con EcoRV.
Para determinar si los productos de amplificación por PCR eran cADNs de CaM PDE, los ADNs subclonados producidos por PCR se secuenciaron desde los extremos utilizando cebadores promotores T3 y T7 y kits de secuenciación Sequenase o Taq Polymerase. Aproximadamente 250 bases de cada extremo de este ADN se compararon luego con la secuencia de aminoácidos de CAM-PDE bovina, confirmando que el ADN producido por PCR era un cADN parcial de CaM PDE. Este clon se denominó pCAM1000 y contenía un inserto de 1,1 kb del ácido nucleico que corresponde a los nucleótidos 409 a 1505 del inserto de pCAM-40. El pCaM1000 se digirió con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. El fragmento de 1,1 kb se purificó por medio de electroforesis en gel de agarosa y luego se digirió con la enzima de restricción AccI. Los dos fragmentos se separaron y purificaron por medio de electroforesis en gel de agarosa. Estos fragmentos separados se marcaron con nucleótidos radioactivos por cebado al azar.
Las bibliotecas de cADN humano se plaquearon sobre cápsulas de Petri de 150 mm a una densidad de aproximadamente 50.000 láminas por cápsula y se prepararon réplicas con filtros de nitrocelulosa por duplicado. Cada sonda se hibridizó a un conjunto separado de los filtros por duplicado. Los filtros se hibridizaron toda la noche a 65ºC en 3x SSC, sarcosil 0,1%, 50 µg/ml de ADN de testículo de salmón, 10x solución de Denhardt, fosfato de sodio 20 mM (pH 6,8). Se lavaron inicialmente a 65ºC en 2x SSC que contenía SDS 0,1%.
Una biblioteca � gt10 preparada a partir de mARN de hipocampo humano produjo tres láminas de hibridación de las aproximadamente 500.000 sometidas a screening. De estas tres láminas de hibridación, dos se hibridizaron a ambas sondas y la tercera se hibridizó a la más larga de las dos sondas. El clon � Cam H6a solo contiene un inserto de aproximadamente 2 kb que es homólogo del cADN que codifica el clon bovino de pCAM
40.
El cADN � Cam H6a se subclonó en el plásmido Bluescript KS para su análisis de secuencia. Aunque la biblioteca de cADN se había construido con acopladores EcoRI, uno de los sitios EcoRI que deberían haber flanqueado al inserto de cADN no se cortó con EcoRI. De esta manera, el cADN se subclonó en dos fragmentos: un fragmento EcoRI/HindIII de aproximadamente 0,7 kb (pcamH6C) y un fragmento HindIII de aproximadamente 1,6 kb que contenía aproximadamente 1,3 kb de cADN y 0,25 kb de ADN vector �gt10 flanqueante (pcamH6B). El análisis de secuencia del ADN reveló que codificaba la mayor parte de una CaM-PDE homóloga de la CaM-PDE de 61 k bovina, excepto que al cADN humano parecían faltarle dos pares de bases en medio de la región codificadora. Estos nucleótidos faltantes corresponden a las posiciones 626 y 627 de la secuencia de cADN humano si se alinea con la CaM-PDE pCAM-40 de 61 kDa bovina (SEC. ID NO: 5) para máxima homología.
Otro de los clones de cADN de la biblioteca de cADN de hipocampo que se había seleccionado con las sondas CaM-PDE de 61 kDa bovinas era el �camH2a. Contenía un inserto de aproximadamente 1,0 kb. Como ocurrió con el cADN �camH6a, sólo uno de los dos sitios EcoRI que deberían estar presentes en los extremos del inserto se cortó. La subclonación original y el análisis de secuencia del ADN para este cADN utilizó fragmentos de PCR generados con oligonucleótidos en los brazos del vector flanqueante �gt10. este cADN se superpone mucho con el extremo 5´ del inserto de �camH6a y contenía los dos nucleótidos adicionales previstos por la secuencia bovina y requeridos para mantener el marco de lectura abierto de la PDE. El inserto �camH2a también parecía contener dos intrones: uno en 5´ de la metionina iniciadora y uno corriente abajo del sitio HindIII. El fragmento EcoRI/HindIII de �camH2a (correspondiente a la región cubierta por pcamH6C) se subclonó en el plásmido Bluescript SK y se denominó
pcamH2A-16. Esto se utilizó luego como fuente de los dos pb adicionales en la construcción de los plásmidos de expresión de levaduras descriptos más abajo.
Se construyeron dos plásmidos diferentes para la expresión de CaM-PDE humana en levaduras. Un plásmido, el pHcam61-6N-7, contienen el marco de lectura abierto completo. El segundo plásmido, el pHcam61met140, comienza en una metionina interna (empezando en la posición del nucleótido 505) y se extiende hasta el extremo del marco de lectura abierto. Estos plásmidos de expresión se construyeron modificando la porción 3´ del marco de lectura abierto y agregando luego los dos extremos 5´ modificados de manera diferente al extremo 3´. La secuencia del inserto de cADN de pHcam61-6N-7 se presenta en SEC. ID NO: 48 y la secuencia de aminoácidos deducida de la CAM-PDE codificada por el mismo se presenta en SEC. ID NO: 49. Durante la construcción del inserto de cADN, el nucleótido de la posición 826 se alteró de T a C, pero el aminoácido codificado se conservó. El plásmido pHcam61met140, como se indicó anteriormente, tenía un inserto de cADN carente de los primeros 140 codones de la región codificadora del pHcam61-6N-7 pero es idéntico al mismo en lo demás.
Un tercer cADN, el �camH3a, contenía un inserto de aproximadamente 2,7 kb. Este inserto de cADN se subclonó para el análisis de secuencia. Aunque la biblioteca de cADN se había construido con EcoRI, el cADN insertado en �camH3a no pudo cortarse con EcoRI. Presumiblemente uno de los sitios EcoRI se destruyó durante la construcción de la biblioteca. El inserto de cADN se cortó del clon � por digestión con HindIII y EcoRI. Esta digestión produce dos fragmentos relevantes: un fragmento HindIII de 0,6 kb que contiene una porción de ADN del brazo izquierdo de �gt10 unido al inserto de cADN y un fragmento HindIII/EcoRI de aproximadamente 2,4 kb que contiene el remanente del inserto de cADN. Estos dos fragmentos se ensamblaron en el plásmido Bluescript KS para producir un fragmento de aproximadamente 3 kb. La orientación del pequeño fragmento HindIII era la misma que la del clon � original. Este subclon se conoce como pcamH3EF. Aunque este cADN se hibridiza a la sonda bovina del cADN de 61 kDa de la CaM-PDE bovina, el análisis de secuencia reveló que parecía ser el producto de un gen CaM-PDE diferente. El plásmido pcamH3EF contiene lo que puede ser el marco de lectura abierto completo y codificaría una proteína aproximadamente 75% homóloga de la proteína codificada por el inserto de pHcam61-6N-7 en gran parte de su extensión. Las secuencias del ADN y de aminoácidos deducidas se presentan en las SEC. ID NO: 50 y 51, respectivamente. La secuencia del ADN de la región entre el nucleótido 80 y el 100 de pcamH3EF es incierta. Esta área está a 5´ del codón iniciador de metionina y, de este modo, no afecta al marco de lectura abierto.
Un fragmento de aproximadamente 2,4 kb del pcamH3EF se purificó en gel a continuación de la digestión con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI. Este fragmento se utilizó para seleccionar bibliotecas de cADN humano adicionales de manera similar a la selección descripta anteriormente. El screening de aproximadamente 5x105 láminas de una biblioteca de cADN de corazón humano (Stratagene) produjo dos láminas que se hibridizaron a la sonda pcamH3EF. El plásmido Bluescript SK´ pcamHella se recortó in vivo de uno de estos clones �ZAPII positivos. Las secuencias del ADN y de aminoácidos deducidas para el inserto de cADN se presentan en las SEC. ID NO: 52 y 53, respectivamente. El análisis de secuencia de pcamHella demostró que el inserto comenzaba en la posición del nucleótido 610 de pcamH3EF y era casi idéntico hasta la posición 2066, punto en el cual la secuencia de ADN divergía de la de pcamH3EF. El inserto de cADN de pcamHella continuaba por aproximadamente 0,6 kb. La consecuencia de esta divergencia es alterar el extremo carboxilo terminal de la proteína que sería codificada por el marco de lectura abierto dentro del cADN. El cADN pcamH3EF podría codificar una proteína de 634 aminoácidos (PM 72.207). Suponiendo que el extremo 5´ del cADN pcamHella sea igual que el extremo 5´ de pcamH3EF (desde 5´ hasta la posición del nucleótido 610), pcamHella podría codificar una proteína de 709 aminoácidos. Estos extremos 3´ divergentes pueden ser la consecuencia de un splicing (procesamiento) alternativo, falta de splicing o de secuencias de ADN no relacionadas que se yuxtapongan durante el proceso de clonación.
EJEMPLO VIII Expresión de cADNs de PDE Humanos para la Complementación de Defectos Fenotípicos de Levaduras
El presente ejemplo se refiere a la expresión de clones bovinos y de PDE en levaduras que demuestran la capacidad de los productos de expresión funcional de PDE para suprimir el fenotipo de choque térmico asociado con la mutación de los genes de fosfodiesterasa de levaduras y también se refiere al ensayo bioquímico de los productos de expresión. Las células huésped utilizadas en estos procedimientos fueron cepas 10DAB (No. de acceso de ATCC 74049) e YKS45 de la levadura S. cerevisiae, las cuales fueron pde1-pde2-, dando lugar a un fenotipo caracterizado por la sensibilidad al choque térmico, es decir la incapacidad de las células para sobrevivir a la exposición a temperaturas elevadas del orden de los 55-56ºC. En estos procedimientos de complementación, se observó que el producto génico insertado modificaba notoriamente el fenotipo del choque térmico. Esta capacidad, a su vez, demuestra la factibilidad de los sistemas diseñados para probar los compuestos químicos en lo que hace a su capacidad para modificar (y especialmente la capacidad para inhibir) la actividad enzimática in vivo de las nucleótido cíclico-fosfodiesterasas estimuladas por Ca2+/calmodulina y estimuladas por cGMP en mamíferos.
A. Complementación Fenotípica de Levadura por Expresión de un cADN que Codifica una CaM-PDE
Un fragmento de cADN de 2,2 kb, adaptado para su inserción a plásmidos de expresión de levadura pADNS (No. de acceso ATCC 68588) y pADANS (No. de acceso ATCC 68587) se derivó del plásmido pCAM-40 (Ejemplo I) por reacción en cadena de la polimerasa. Resumidamente, se empleó la siguiente amplificación por PCR para alterar el inserto de ADN pCAM-40 para alinearlo adecuadamente con el promotor ADHl en los vectores.
Un oligonucleótido cebador (Oligo A) utilizado en la reacción de PCR SEC. ID NO: 54
5´-TACGAAGCTTTGATGGGGTCTACTGCTAC-3´ se templa con el clon de cADN pCaM-40 en las posiciones de los pares de bases 100116 e incluye un sitio HindIII antes del codón de metionina inicial. Un segundo oligonucleótido cebador (Oligo B) SEC. ID NO: 55
5´-TACGAAGCTTTGATGGTTGGCTTGGCATATC-3´ se diseñó para templarse en las posiciones 520-538 y también incluye un sitio HindIII dos bases antes de un codón de metionina. El tercer oligonucleótido SEC. ID NO: 56
5´-ATTACCCCTCATAAAG-3´ se templó a una posición en el plásmido que era la 3´ del inserto. Para una reacción, el Oligo A y el Oligo C se usaron como cebadores, con pCAM-40 como molde. El ácido nucleico producto de esta reacción incluía el marco de lectura abierto completo. Una segunda reacción usó el Oligo B y el Oligo C como cebadores sobre el molde pCAM-40 y produjo un ácido nucleico producto que carecía de la porción de la secuencia del cADN que codifica el dominio de unión a la calmodulina. Estos productos amplificados se digirieron con HindIII y NotI y se ligaron a los vectores de expresión de levadura pADNS y pADANS digeridos con HindIII/NotI. Los clones de plásmido que contenían insertos se seleccionaron y transformaron en la cepa 10DAB de S. cerevisiae por transformación con acetato de litio.
La levadura transformada se dispuso en parches sobre placas de agar que contenían un medio sintético carente del aminoácido leucina (agar de SC-leucina) y se desarrolló durante 3 días a 30ºC. Se prepararon réplicas de esta placa de agar con tres tipos de placas de agar: una réplica sobre agar de SC-leucina, una réplica sobre agar YPD a temperatura ambiente, y tres réplicas sobre placas de agar YPD que se habían calentado a 56ºC. las tres placas calentadas se mantuvieron a 56ºC durante 10, 20 ó 30 minutos. Estas réplicas se dejaron luego enfriar a temperatura ambiente y luego todas las placas se colocaron a 30ºC. Las levaduras transformadas con plásmidos construidos para expresar la CaM-PDE fueron resistentes al pulso térmico. Más específicamente, ambos constructos diseñados para expresar el marco de lectura abierto completo y el diseñado para expresar la proteína trunca (incluyendo la región catalítica pero no el dominio de unión a la calmodulina), tanto en los pADNS como en los pADANS, complementaron el fenotipo de sensibilidad al choque térmico de las células huésped 10DAB, es decir las hicieron resistentes al pulso de temperatura de 56ºC.
De manera similar, los plásmidos pHcam61-6N-7 y pHcam61met140 (Ejemplo VII) se transformaron en la levadura huésped 10DAB. Los fenotipos del choque térmico fueron suprimidos en ambos transformantes.
B. Ensayo Bioquímico de los Productos de Expresión
El producto de expresión CaM-PDE bovino también se evaluó preparando extractos libres de células a partir de células de levadura 10DAB y midiendo la actividad bioquímica de fosfodiesterasa de los extractos. Para tal propósito, se desarrollaron cultivos de 200 ml de levaduras transformadas en SC-leucina líquida hasta una densidad de alrededor de 6 millones de células por ml. Las células se recogieron por centrifugación y los pélets de células se congelaron. Se prepararon extractos descongelando las células congeladas sobre hielo, mezclando las células con 1 ml de PBS y un volumen igual de cuentas de vidrio, agitándolas para producir disrupción de las células de levadura y centrifugando las células fraccionadas a aproximadamente 12.000 x g durante 5 minutos para eliminar residuos insolubles. Sobre el sobrenadante se ensayó la actividad de fosfodiesterasa.
Se ensayó la actividad de fosfodiesterasa en ensayos de células de levadura de hasta 50 µl en Tris 50 mM (pH 8,0), EGTA 1,0mM, 0,01 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino), nucleótidos cíclicos arcados con 3H (4-10.000 cpm/pmol) y MgCl2 5mM, en un volumen final de 250 µl a 30ºC en tubos de ensayo de vidrio de 10 x 75 mm. Las incubaciones se interrumpieron por agregado de 250 µl de carbonato de sodio 0,5 M de pH 9,3, NaCl 1M y SDS 0,1%. Los productos de reacción de la fosfodiesterasa se separaron del nucleótido cíclico por cromatografía sobre columnas de 8 x 33 mm de gel de ácido borónico BioRad Affi-Gel 601. Las columnas se equilibraron con bicarbonato de sodio 0,25 M (pH 9,3) y NaCl 0,5 M. Las reacciones se aplicaron a las columnas. Los tubos de ensayo se enjuagaron con bicarbonato de sodio 0,25 M (pH 9,3) y NaCl 0,5 M y este enjuague se aplicó a las columnas. Las columnas de boronato se lavaron dos veces con 3,75 ml de bicarbonato de sodio 0,25 M (pH 9,3) y NaCl 0,5 M, seguido de 0,5 ml de acetato de sodio 50 mM (pH 4,5).el producto se eluyó con 2,5 ml de acetato de sodio 50 mM (pH 4,5) que contenía sorbitol 0,1 M y se recogió en viales de centelleo. El eluato se mezcló con 4,5 ml de Cóctel de Centelleo Ecolite y se midió la radiactividad mediante espectrometría de centelleo líquido.
Tanto el constructo diseñado para expresar el marco de lectura abierto completo y el diseñado para expresar una proteína truncada, en pADNS o en pADANS, expresaron una proteína activa según se determinó por ensayo bioquímico de fosfodiesterasa de extractos celulares. Los extractos de 10DAB que albergaban al pcam61met140 produjeron una actividad de fosfodiesterasa medible (ver, infra, el segundo método de la parte D), mientras que el extracto de células 10DAB que albergaban al pcam61-6N-7 carecían de actividad detectable.
C. Complementación del Fenotipo de Levaduras por Expresión de un cADN que Codifica una cGS-PDE
El plásmido p3CGS-5, que contiene un fragmento de ADN de 4,2 kb, que codifica la CGS-PDE bovina, se adaptó para clonación en pADNS y pADANS por reemplazo de las primeras 147 bases del cADN con un sitio de restricción adecuado para usar en la inserción a plásmidos. El oligonucleótido BS1, con la secuencia: SEC. ID NO: 57
5´TACGAAGCTTTGATGCGCCGACAGCCTGC, codifica un sitio HindIII y se templa a las posiciones 148-165 del inserto de cADN. Un oligonucleótido denominado BS3 SEC. ID NO: 58
GGTCTCCTGTTGCAGATATTG, se templa a las posiciones 835-855 exactamente en 3´ de un sitio NsiI único. El fragmento generado por PCR resultante tras la digestión con HindIII y NsiI se ligó luego a p3CGS-5 digerido con HindIII y NsiI reemplazando de este modo el extremo 5´ original del cADN bovino. Un plásmido derivado de esta ligación se digirió con HindIII y NotI para liberar el inserto de cADN modificado. El inserto se clonó en pADNS y pADANS en sus sitios HindIII y NotI. Estos plásmidos se transformaron luego en la cepa 10DAB de levadura por el método del acetato de litio y las células transformadas se cultivaron y sometieron a temperaturas elevadas como en la Sección A anterior. Las levaduras transformadas con plásmidos construidos para expresar la cGS-PDE bovina resultaron resistentes al pulso térmico.
De manera similar, el plásmido pHcgs6n (Ejemplo VI) se transformó en la cepa huésped YKS45 de levadura por transformación con acetato de litio. El análisis de choque térmico se efectuó como se indicó anteriormente excepto que las placas se cultivaron inicialmente dos días a 30ºC y las placas calentadas se mantuvieron a 56ºC durante 10, 20, 30 y 45 minutos. La levadura transformada con el plásmido diseñado para expresar la cGS-PDE humana de longitud total resultó resistente al pulso térmico.
D. Ensayo Bioquímico del Producto de Expresión
La expresión de la cGS-PDE bovina también se evaluó preparando extractos libres de células a partir de la levadura y midiendo la actividad bioquímica de fosfodiesterasa de los extractos. Para tal propósito, se desarrollaron cultivos de 50 ml de levaduras 10DAB transformadas en SC-leucina líquida hasta una densidad de alrededor de 10 millones de células por ml. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986). Las células se recogieron por centrifugación, los pélets de células se lavaron una vez con agua, y los pélets de células finales se congelaron. Para preparar un extracto, las células congeladas se descongelaron sobre hielo, se mezclaron con 1 ml de PBS y un volumen igual de cuentas de vidrio, se agitaron para producir disrupción de las células de levadura y se centrifugaron para eliminar residuos. Sobre el sobrenadante se ensayó luego la actividad de fosfodiesterasa como en la Sección B anterior. Los constructos, tanto en pADNS como en pADANS, expresaron una proteína activa según se determinó por ensayo bioquímico de fosfodiesterasa de extractos celulares
Las levaduras YKS45 transformadas con el plásmido pHcgs6n se cultivaron en medio SC-leu hasta alcanzar las 1-2x107 células/ml. Las células se cosecharon por centrifugación y los pélets de células se congelaron. Un pélet de células congelado, que contenía típicamente 1010 células, se mezcló con buffer de lisis (Tris HCl 25mM a pH 8, EDTA 5mM, EGTA 5mM, o-fenantrolina 1mM, AEBSF 0,5mM, 0,01 mg/,l de pepstatina, 0,01 mg/ml de leupeptina, 0,01 mg/ml de aprotinina, 2-mercaptoetanol 0,1%) para llevar el volumen total a 2,5 ml. La mezcla se descongeló sobre hielo y luego se agregó un volumen igual de cuentas de vidrio. Las células se fraccionaron mediante ciclos de agitación y enfriamiento sobre hielo, luego se mezcló buffer de lisis adicional con las células fraccionadas para llevar el buffer de lisis agregado a un total de 5 ml. La suspensión se centrifugó durante 5 minutos a 12.000 x g. El sobrenadante se eliminó y se ensayó inmediatamente o se congeló rápidamente en un baño de hielo seco/etanol y se conservó a –70ºC.
Se ensayó la actividad de fosfodiesterasa mezclando una alícuota de extracto de células en (Tris-HCl 40mM, pH 8,0, EGTA 1,0mM, 0,1 mg/ml de BSA) que contenía MgCl2 5mM y sustrato radioactivo, incubando a 30ºC durante hasta 30 minutos e interrumpiendo la reacción con buffer de corte (etanolamina 0,1M, pH 9,0, sulfato de amonio 0,5M, EDTA 10mM, SDS 0,05% de concentración final). El producto se separó del sustrato de nucleótido cíclico por cromatografía sobre BioRad Affi-Gel 601. La muestra se aplicó a una columna que contenía aproximadamente 0,25 ml de Affi-Gel 601 equilibrado en buffer de columna (etanolamina 0,1M, pH 9,0, conteniendo sulfato de amonio 0,5M). la columna se lavó cinco veces con 0,5 ml de buffer de columna. El producto se eluyó con cuatro alícuotas de 0,5 ml de ácido acético 0,25M y se mezcló con 5 ml de Ecolume (ICN Biochemicals). El producto radioactivo se midió por recuento de centelleo. Los extractos de levaduras que expresan la cGS-PDE humana hidrolizaron tanto el AMP como el GMP cíclicos, según cabía esperar para esta isoenzima.
EJEMPLO IX Estudios de Expresión en Tejidos que Involucran a los Polinucleótidos de CaM-PDE y cGS-PDE
A. Análisis de Transferencia Northern
Los ADNs aislados en los Ejemplos I, III y IV anteriores se emplearon para desarrollar sondas para detectar ARNs totales o poli-A seleccionados aislados de una variedad de tejidos y los resultados se resumen a continuación.
1.
Se efectuó un análisis Northern sobre mARN preparado a partir de una variedad de tejidos de corteza adrenal, médula adrenal, corazón, aorta, corteza cerebral, ganglios basales, hipocampo, cerebelo, médula/columna vertebral, hígado, corteza renal, médula renal, papilas renales, tráquea, pulmón, bazo y linfocitos T, utilizando un fragmento de cADN radiomarcado de aproximadamente 3 kb aislado del plásmido p3CGS-5 tras la digestión con EcoRI y SmaI. Se detectó una única especie de mARN de 4,5 kb en la mayoría de los tejidos. El tamaño del mARN de cGS-PDE parecía ser ligeramente mayor (aproximadamente 4,6 kb) en ARN aislado de la corteza cerebral, los ganglios basales y el hipocampo. El mARN de cGS-PDE abundaba sobre todo en la corteza adrenal. También era abundante en la médula adrenal y el corazón. Parecía expresarse de modo diferencial en regiones anatómicamente diferentes del cerebro y riñón. Entre los ARNs aislados de cinco regiones diferentes del cerebro, el mARN de cGS-PDE era especialmente abundante en el hipocampo, la corteza cerebral y los
ganglios basales. Se detectó muy poca transcripción de cGS-PDE en los ARNs del cerebelo o médula y columna vertebral. Aunque el mARN de cGS-PDE se detectó en todas las regiones del riñón, pareció ser más abundante en la médula roja externa y en las papilas. El mARN de cGS-PDE también se detectó en el ARN de hígado, tráquea, pulmón, bazo y linfocitos T. se detectó muy poco mARN de cGS-PDE en el ARN aislado de aorta.
2.
Se prepararon sondas de ADN radiomarcado a partir de fragmentos cebados con hexámeros al azar extendidos sobre fragmentos de 1,6 kb desnaturalizados por calor con endonucleasa de restricción EcoRI del inserto de cADN del plásmido pCAM-40. En el análisis Northern, las sondas de ADN se hibridizaron con mARNs de 3,8 y 4,4 kb en cerebro y en la mayoría de los otros tejidos analizados, incluyendo corteza cerebral, ganglios basales, hipocampo, cerebelo, médula y columna vertebral, corazón, aorta, médula renal, papilas renales y pulmón. La hibridización de la sonda con el mARN de 3,8 kb del hígado, corteza renal y tráquea sólo se detectó después de una exposición autorradiográfica más prolongada.
3.
El análisis de transferencia Northern del mARN de varios tejidos del sistema nervioso central se llevó a cabo utilizando un fragmento de ADN p12.3a subclonado y marcado (que contenía la mayor parte del dominio catalítico conservado de la PDE). La señal de hibridización más intensa se observó en el mARN de los ganglios basales y también se observaron fuertes señales en el mARN de otros tejidos, incluyendo las papilas renales y la médula adrenal.
B. Protección de la ARNasa
1. Se construyeron tres ribosondas antisentido. La sonda III corresponde a la región codificadora del dominio catalítico de p3cGS-5 (273 pb correspondientes a las bases 2393 a 2666 de la SEC. ID NO: 38); la sonda II a la región codificadora del dominio de unión al cGMP (468 pb correspondientes a las bases 959 a 1426); y la sonda I, al extremo 5´ y a porciones de la región codificadora amino terminal (457 bases correspondientes a las bases 1 a 457).
Los ARNs totales extraídos de todos los tejidos examinados protegieron completamente las sondas II y III. También se observó protección casi completa (457 bases) de la ribosonda I con ARNs aislados de la corteza adrenal, médula adrenal e hígado. Sin embargo, el ARN aislado de la corteza cerebral, los ganglios basales y el hipocampo sólo protegía un fragmento de aproximadamente 268 bases de la ribosonda I. Una proporción relativamente pequeña de sonda I parcialmente protegida idéntica en tamaño con los principales fragmentos observados en las muestras de ARN cerebral se detectó también en ARNs aislados de todos los tejidos examinados excepto el hígado. Resulta interesante que el ARN de corazón produjo tanto la ribosonda completamente protegida (457 bases) como, al igual que el ARN cerebral, un fragmento de 268 bases. A diferencia del patrón de protección observado utilizando ARNs aislados de cualquiera de los otros tejidos, sin embargo, la ribosonda I parcialmente protegida parecía ser más abundante. Los resultados sugieren que se expresan dos especies de ARN de cGS-PDE diferentes.
2.
Se construyeron ribosondas radiomarcadas antisentido correspondientes a una porción del dominio de unión a CaM o del dominio catalítico de CaM-PDE a partir de fragmentos de escisión con endonucleasas de restricción (AccI/SstI y Tth111I/HincII) de pCAM-40cDNA. Los ARNs totales aislados de cinco regiones diferentes del cerebro (corteza cerebral, ganglios basales, hipocampo, cerebelo y médula/columna vertebral) protegieron completamente las ribosondas antisentido que codifican tanto el dominio de unión a Cam como el catalítico. Los ARNs totales de corazón, aorta, pulmón, tráquea y riñón protegieron completamente la ribosonda correspondiente al dominio catalítico pero sólo protegieron aproximadamente 150 bases de la ribosonda del dominio de unión a CaM, sugiriendo que una isoforma estructuralmente relacionada con la CaM-PDE de 61 kDa se expresa en estos tejidos.
3.
Se generaron ribosondas antisentido basadas en el plásmido p12.3a y correspondientes a las bases –1 a 363 y 883-1278 de la SEC. ID NO: 26. La primera sonda incluía 113 bases de la secuencia 5´ no codificadora como así también desde el codón de metionina inicial hasta el dominio putativo de unión a CaM, mientras que la segunda codificaba el dominio catalítico. Entre todos los tejidos ensayados, el ARN de los ganglios basales era el que más fuertemente protegía cada sonda. Fuertes señales de un tamaño correspondiente a la sonda que representa el extremo amino terminal se observaron en la protección por parte del ARN de corteza cerebral, cerebelo, ganglios basales, hipocampo y médula adrenal. Esta sonda no recibió ninguna protección del ARN de papila renal o testículo aunque el tejido mostró señales en el análisis de transferencia Northern y en la protección de la ARNasa de la sonda del dominio conservado, sugiriendo que una isoenzima estructuralmente relacionada se expresa en este tejido.
Aunque la presente invención se ha descrito en términos de composiciones y métodos específicos, se entiende que para expertos en la técnica tendrán lugar variaciones y modificaciones tras la consideración de la invención. Por lo tanto, solamente tales limitaciones como aparecen en las reivindicaciones adjuntas se deben poner sobre ellas. Por lo tanto, se pretende en las reivindicaciones adjuntas cubrir todas tales variaciones equivalentes que caen dentro del alcande de la invención según se reivindica.
LISTADO DE SECUENCIAS
(1)
INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE: Beavo, Joseph A. Bentley, Kelley Charbonneau, Harry Sonnenburg, William K.
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN Codificador de Fosfodiesterasas de Mamíferos
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 58
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A)
DESTINATARIO: Marshall, O´Toole, Gerstein, Murray & Bicknell
(B)
CALLE: Two First National Plaza, 20 South Clark Street
(C)
CIUDAD: Chicago
(D)
ESTADO: Illinois
(E)
PAÍS: Estados Unidos
(F)
CÓDIGO POSTAL: 60603
(v)
FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:
(A)
TIPO DE MEDIO: disco Floppy
(B)
COMPUTADORA: compatible con PC IBM
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
(C)
CLASIFICACIÓN:
(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/688.356
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04 DE ABRIL DE 1991
(viii) INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
(A)
NOMBRE: Noland, Greta, E.
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35.302
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 27866/30822
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
(A)
TELÉFONO: (312) 346-5750
(B)
TELEFAX: (312) 984-9740
(C)
TELEX: 25-3856
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:1:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:1: AARATGGGNA TGAARAARAA
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:2: Lys Met Gly Met Met Lys Lys Lys 15
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:3:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:3: ACRTTCATYT CYTCYTCYTG CAT
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:4:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:4 Met Gln Glu Glu Glu Met Asn Val 15
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 2291 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 100..1689
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:5:
imagen1
imagen1
imagen1
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:6:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 530 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:6:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:7:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:7: Met Asp Asp His Val Thr Ile 15
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:8:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:8: ATGAGRAGRC AYGTHACNAT
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:9:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:9: Leu Arg Cys Leu Val Lys Gln 15
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:10:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(iv)
ANTI-SENTIDO: SÍ
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:10: CTGCTTCACT AAGCATCTTA G
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:11:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 75 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:11:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:12:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:12:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:13:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(iv)
ANTI-SENTIDO: SÍ
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:13:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:14:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:14:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:15:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:15:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:16:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 2656 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 136..1677
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:16:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:17:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 514 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:17:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:18:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:18:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:19:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (C)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:19:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:20:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:20:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:21:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:21:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:22:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 412 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 1..412
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:22:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:23:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 137 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:23:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:24:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:24:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:25:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:25:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:26:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1844 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 114..1715
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:26:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:27:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 534 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:27:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:28:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:28:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:29:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:29:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:30:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:30:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:31:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:31:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:32:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:32:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:33:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:33:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:34:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:34:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:35:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:35:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:36:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:36:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:37:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:37:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:38:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 4131 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 148..2910
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:38:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:39:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 921 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:39:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:40:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 249 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:40:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:41:
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 250 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(iv)
ANTI-SENTIDO: SÍ
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:41:
imagen1
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:42:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 3789 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 181..3006
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:42:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:43:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 942 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:43:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:44:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 3044 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 12..2834
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:44:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:45:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 941 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA. ID NO:45:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:46:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(iv)
ANTI-SENTIDO: SÍ
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:46:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:47:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:47:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:48:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1625 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 12..1616
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:48:
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
rt
imagen1
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:49:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 535 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:49:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:50:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 2693 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 176..2077
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:50:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:51:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 634 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:51:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:52:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 2077 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
(B)
UBICACIÓN: 2..1693
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:52:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:53:
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 564 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:53:
imagen1
imagen1
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:54:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:54:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:55:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:55:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:56:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:56:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:57:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:57:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:58:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico (C)CARÁCTER DE LA CADENA: única (D)TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:58:
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
111

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una secuencia polinucleotídica purificada y aislada que codifica un polipéptido de fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano, donde la secuencia polinucleotídica se selecciona del grupo que consiste en los insertos de ADN presentes en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584).
  2. 2.
    Una secuencia polinucleotídica purifica y aislada, que consiste en una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico humano, donde el polinucleótido codifica el mismo polipétido que los insertos de ADN humano en los vectores pGSPDE 6.1 (ATCC 68583), pGSPDE 7.1 (ATCC 68585) y pGSPDE 9.2 (ATCC 68584) mediante codones degenerados.
  3. 3. Una secuencia de ADN genómico de acuerdo con la reivindicación 1.
  4. 4.
    Un vector de ADN que tiene inserto en el mismo una secuencia de ADN, de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
  5. 5.
    Un método para transformar una célula huésped procariota o eucariota con la secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
  6. 6.
    Una célula huésped de levadura transformada establemente con un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.
  7. 7.
    Una célula huésped de E. Coli transformada establemente con un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
  8. 8.
    Un polipéptido codificado por la secuencia polinuleotídica de la reivindicación 1 ó 2.
  9. 9.
    Un anticuerpo que es específicamente inmunoreactivo con el polipéptido de la reivindicación 8.
  10. 10.
    Un método para producir un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico, comprendiendo dicho método:
    (a)
    transformar o transfectar establemente una célula huésped procariota o eucariota con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2; y
    (b)
    cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia de ADN en dicha célula huésped.
    112
  11. 11.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que incluye además el paso de aislar el producto polipeptídico de expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicha célula huésped.
  12. 12.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.
  13. 13.
    Un método de ensayo para identificar un agente químico que modifica la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico de mamífero, comprendiendo dicho método:
    (a)
    transformar establemente, con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, una célula huésped procariota o eucariota que tenga un carácter fenotípico susceptible de alteración por expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho huésped;
    (b)
    cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicha célula huésped acompañada de la correspondiente alteración en el fenotipo de la célula huésped;
    (c)
    poner en contacto las células huésped cultivadas de acuerdo con el paso (b) con un agente químico a ensayar; y
    (d)
    determinar cualquier modificación en la alteración del fenotipo de dichas células huésped puestas en contacto con dicho agente químico en el paso (c).
  14. 14.
    Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.
  15. 15.
    Un método de ensayo para identificar un agente químico que modifica la actividad enzimática de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico estimulada por GMP cíclico de mamífero, comprendiendo dicho método:
    (a)
    transformar establemente, con una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, una célula huésped procariota o eucariota que tenga un carácter fenotípico susceptible de alteración por expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho huésped;
    (b)
    cultivar la célula huésped formada en el paso (a) en un medio nutriente en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en dicho fenotipo de la célula huésped;
    (c)
    identificar dichas células huésped que tengan un fenotipo alterado;
    (d)
    fraccionar dicha célula huésped;
    (e)
    aislar citosol de dicha célula huésped fraccionada;
    (f)
    poner en contacto citosol con dicho dicho agente químico; y
    (g)
    determinar si dicha actividad enzimática se ha alterado.
    113
  16. 16. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha célula huésped es una célula huésped de levadura.
ES03018317T 1991-04-19 1992-04-20 Adn que codifica fosfodiesterasas de mamíferos. Expired - Lifetime ES2348458T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68835691A 1991-04-19 1991-04-19
US688356 1991-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2348458T3 true ES2348458T3 (es) 2010-12-07

Family

ID=24764099

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03018317T Expired - Lifetime ES2348458T3 (es) 1991-04-19 1992-04-20 Adn que codifica fosfodiesterasas de mamíferos.
ES92911337T Expired - Lifetime ES2204891T3 (es) 1991-04-19 1992-04-20 Adn que codifica fosfodiesterasas de mamiferos.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES92911337T Expired - Lifetime ES2204891T3 (es) 1991-04-19 1992-04-20 Adn que codifica fosfodiesterasas de mamiferos.

Country Status (10)

Country Link
US (10) US5389527A (es)
EP (2) EP0535216B1 (es)
JP (2) JP3354149B2 (es)
AT (2) ATE250629T1 (es)
CA (1) CA2085881C (es)
DE (2) DE69233785D1 (es)
DK (1) DK0535216T3 (es)
ES (2) ES2348458T3 (es)
HK (1) HK1013297A1 (es)
WO (1) WO1992018541A1 (es)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2693200B1 (fr) * 1992-07-01 1994-08-19 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations.
WO1994017181A1 (en) * 1993-01-29 1994-08-04 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclic nucleotidase and process for producing the same
CA2363537C (en) * 1993-05-27 2010-07-06 Board Of Regents Of The University Of Washington Cyclic gmp-binding, cyclic gmp-specific phosphodiesterase materials and methods
US5672509A (en) * 1993-08-25 1997-09-30 Pfizer Inc. hPDE IV-C: a human phosphodiesterase IV isozyme
US5605797A (en) * 1994-09-15 1997-02-25 Board Of Trustees Operating Michigan State University Bovine β-mannosidase gene and methods of use
IL115177A0 (en) * 1994-09-16 1995-12-31 Immunomedics Inc Phosphorus-32 labeling of antibodies for cancer therapy
US5885834A (en) * 1996-09-30 1999-03-23 Epstein; Paul M. Antisense oligodeoxynucleotide against phosphodiesterase
US5858694A (en) * 1997-05-30 1999-01-12 Cell Pathways, Inc. Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions
JP2001518624A (ja) 1997-09-26 2001-10-16 ユニバーシティ・オブ・ワシントン 同時の粒子分離および化学反応
EP1060251B1 (en) * 1998-02-23 2006-06-28 ICOS Corporation Phosphodiesterase 10
JP2995464B2 (ja) * 1998-05-15 1999-12-27 株式会社島精機製作所 横編機における編目ループの預け置き装置
WO2000077040A2 (en) * 1999-06-16 2000-12-21 Incyte Genomics, Inc. Human intracellular signaling molecules
GB9922125D0 (en) * 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
GB9922124D0 (en) * 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US7087736B1 (en) 1999-10-05 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tyrosine DNA phosphodiesterases (TDP) and related polypeptides nucleic acids vectors TDP producing host cells antibodies and methods of use
WO2001025407A2 (en) * 1999-10-05 2001-04-12 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tyrosine-dna phosphodiesterases (tdp) and related polypeptides, nucleic acids, vectors, tdp-producing host cells, antibodies and methods of use
US20030211513A1 (en) * 2000-06-08 2003-11-13 Henry Yue Intracellular signaling proteins
AU2002211228A1 (en) * 2000-09-14 2002-03-26 Mount Sinai School Of Medicine Screening methods to identify g-proteins and other compounds which modulate phosphodiesterase (pde) activity
US6376225B1 (en) * 2001-01-05 2002-04-23 Pe Corporation (Ny) Isolated human phosphodiesterase proteins, nucleic acid molecules encoding human phosphodiesterase proteins, and uses thereof
MXPA03009580A (es) * 2001-04-20 2004-12-06 Sinai School Medicine Tir3, un receptor de sabor novedoso.
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
US6479493B1 (en) 2001-08-23 2002-11-12 Cell Pathways, Inc. Methods for treatment of type I diabetes
US20040038223A1 (en) * 2001-10-02 2004-02-26 Glennda Smithson Novel proteins and nucleic acids encoding same
US20040092461A1 (en) * 2002-11-11 2004-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of phosphodiesterase 1B expression
AU2003276009A1 (en) * 2002-10-01 2004-04-23 Bayer Healthcare Ag Regulation of human 3', 5' cyclic nucleotide phosphodiesterase pde1c
WO2004031391A1 (en) * 2002-10-01 2004-04-15 Bayer Healthcare Ag Regulation of human pde1a
US7132274B2 (en) * 2003-05-08 2006-11-07 Mcgill University Method for identifying modulators of CLK-1 and UbiF activity
JP2006133164A (ja) * 2004-11-09 2006-05-25 Fyuuensu:Kk カルモデュリンの構造変化を検出する方法、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法
US8637528B2 (en) 2007-03-27 2014-01-28 Omeros Corporation Use of PDE7 inhibitors for the treatment of movement disorders
CN113930434A (zh) * 2021-12-08 2022-01-14 河北农业大学 磷酸二酯酶基因及其蛋白的制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4980281A (en) * 1988-02-10 1990-12-25 Housey Gerard M Method of screening for protein inhibitors and activators
US6080540A (en) * 1990-04-20 2000-06-27 Cold Spring Harbor Laboratory Cloning of mammalian genes in microbial organisms and methods for pharmacological screening

Also Published As

Publication number Publication date
DE69233214T2 (de) 2004-07-01
EP1386967B1 (en) 2010-05-26
CA2085881A1 (en) 1992-10-20
EP1386967A2 (en) 2004-02-04
US5389527A (en) 1995-02-14
DK0535216T3 (da) 2004-02-02
EP1386967A3 (en) 2004-02-25
DE69233214D1 (de) 2003-10-30
DE69233785D1 (de) 2010-07-08
EP0535216A1 (en) 1993-04-07
JP3354149B2 (ja) 2002-12-09
US20060275871A1 (en) 2006-12-07
ES2204891T3 (es) 2004-05-01
JP3408526B2 (ja) 2003-05-19
US5800987A (en) 1998-09-01
HK1013297A1 (en) 1999-08-20
US5789553A (en) 1998-08-04
US20020151024A1 (en) 2002-10-17
US5580771A (en) 1996-12-03
ATE469228T1 (de) 2010-06-15
US5602019A (en) 1997-02-11
WO1992018541A1 (en) 1992-10-29
EP0535216B1 (en) 2003-09-24
CA2085881C (en) 2002-06-25
JPH05508079A (ja) 1993-11-18
JP2002051776A (ja) 2002-02-19
US7122363B2 (en) 2006-10-17
ATE250629T1 (de) 2003-10-15
US5776752A (en) 1998-07-07
US7842478B2 (en) 2010-11-30
US6642040B2 (en) 2003-11-04
EP0535216A4 (en) 1995-08-30
US6015677A (en) 2000-01-18
US20040126866A1 (en) 2004-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2348458T3 (es) Adn que codifica fosfodiesterasas de mamíferos.
JP4450767B2 (ja) サイクリックｇｍｐ結合性、サイクリックｇｍｐ特異的ホスホジエステラーゼの材料および方法
Holzman et al. Identification, molecular cloning, and characterization of dual leucine zipper bearing kinase. A novel serine/threonine protein kinase that defines a second subfamily of mixed lineage kinases.
CA2383244A1 (en) Protein kinases
WO2001046394A2 (en) Mammalian protein phosphatases
US5512434A (en) Expression cloning of a human phosphatase
US5677428A (en) RNA editing enzyme and methods of use thereof
WO1996039527A1 (en) Cell-cycle regulatory proteins from human pathogens, and uses related thereto
US20040157306A1 (en) Mammalian protein phosphatases
US20030027308A1 (en) Novel human protein phosphatases identified from genomic sequencing
US20020090703A1 (en) Mammalian protein phosphatases
US20050084877A1 (en) Mammalian protein phosphatases
CA2395093A1 (en) Mammalian protein phosphatases
EP1299525A2 (en) Mammalian protein phosphatases
WO2003042390A1 (en) Mammalian protein phosphatases