JPH09509851A

JPH09509851A - ヒトホスホジエステラーゼ型ｉｖｃ、並びにその生産および使用

Info

Publication number: JPH09509851A
Application number: JP8520292A
Authority: JP
Inventors: オーウェンズ，レイモンド，ジョン; ペリー，マーチン，ジョン; ラム，サイモン，マーク
Original assignee: セルテックセラピューティックスリミテッド
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 1997-10-07
Also published as: CA2182946A1; EP0746619A1; WO1996020281A1; GB2301363A; GB2301363B; AU4270596A; GB9616183D0; US5851784A; US6291199B1

Abstract

(57)【要約】組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCと、それを暗号付けるＤＮＡが記載される。哺乳類または昆虫細胞内のヒトホスホジエステラーゼ型IVC ＤＮＡの発現によって得られるＲ−およびＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマーを含む、酵素の特定のコンフォーマーが識別される。組み換え酵素は酵素の作用を抑制することのできる化合物を選別するスクリーンに、または抗体を発生させる免疫原として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトホスホジエステラーゼ型IVC、並びにその生産及び使用本発明はヒトホスホジエステラーゼ型IVCとその生産、コンフォーマー、類縁体とそれらの断片、酵素を暗号付けする核酸、および医薬品の選別における酵素、および免疫原としての酵素の使用に関するものである。第２のメッセンジャーとしての環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の役割はよく認識されている。それはホルモンや神経伝達物質を始めとする、各種の細胞外信号の効果の形質導入に責任を持つ。細胞内ｃＡＭＰのレベルはアデニルシクラーゼによるその合成と環式ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）による分解の両方によって調節される。ＰＤＥはｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに対する親和性、亜細胞局在化(sub cellular localisation)と調節が異なる少なくとも７つの酵素イソタイプ（I-VI I）の群を形成する（Beavo J.A．and Reifsnyder D.H．（1990）Trends Pharmac ol．Sci．11 150-155; Conti M．et al．（1991）Endocrine Rev．12 218-234）。ｃＡＭＰ合成を制御するレセプターが選択性治療剤の開発の機会を提供したのと同様に、ＰＤＥは医薬品開発に同様の可能性を与えるであろう。事実、数多くの医薬品の臨床的効果は特定のＰＤＥイソタイプの選択性を基礎に合理化される。例えば、強心剤ミルリノン(milrinone)とザプリナスト(zaprinast)はそれぞれＰＤＥIIIおよびＰＤＥV阻害剤である。 (Harrison S.A．et al.（1986）Mol． Pharmacol. 29 506-514;Gillespie P.G．and Beavo J．（1989）Mol．Pharmacol ．36 773-781）。抗抑鬱剤のロリプラム(rolipram)は選択的ＰＤＥIV阻害剤として働く。（Schneider H.H．et al.（1986）Eur．J．Pharmacol．127 105-115.）。ＰＤＥイソタイプ選択的阻害剤の利用可能性は様々な細胞種類におけるＰＤＥの役割の調査を可能にした。特にＰＤＥIVが好塩基球（Peachell P.T．et al.（ 1992）J．Immunol．148 2503-2510）および好酸球（Dent G．et al.（1991） Br．J．Pharmacol．103 1339-1346）などの多くの炎症性細胞内のｃＡＭＰの分解を制御し、このイソタイプの阻害が細胞活性の阻害と関係があることが確定された。従って、ＰＤＥIV阻害剤は、潜在的抗炎症剤として、特に、非選択的ＰＤＥ阻害剤であるテオフィリンが治療効果を有することが証明された喘息の治療のために現在開発されている。分子クローニングをＰＤＥの研究に適用することによって、それぞれのイソタイプについて１つ以上のイソフォームがあることが明らかにされた。ＰＤＥIVについては、４つのイソフォーム（A，B，CおよびD）があり、それぞれ齧歯類(Swi nnen J.V．et al.（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86 5325-5329)とヒト（ Bolger G．et al.（1993）Mol．Cell Biol．13 6558-6571）の両方で別個の遺伝子によって暗号化されることが示された。多数のＰＤＥIVが存在することから個別のイソフォームに対して選択的な阻害剤を獲得し、それによってかかる阻害剤の作用の特異性を増すことが考えられる。ここで異なるＰＤＥIVイソフォームは官能的に判別されるものとする。これを裏付ける間接的証拠はこれらのイソフォームが異なる組織内に選択的に分布し（ Swinnen et al.,1989; Bolger et al. 1993; Obernolte R．et al.（1993）Gene 129 239-247，前掲書）異なる種のイソフォームの間で高い程度で配列が保存されることである。イソフォームの選択的阻害剤の開発を継続するために、評価用にそれぞれの酵素タイプが入手できることが必要である。今日までに、全長のｃＤＮＡがヒトＰＤＥ IVA、BおよびD（Bolger et al. 19 93前掲書；Obernolte et al. 1993前掲書；Mclaughlin M．et al.（1993）J.Bio l．Chem．268 6470-6476）とラットＰＤＥ IVA、BおよびD（Davis R．et al.,（ 1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86 3604-3608; Swinnen J.V．et al.，（19 91）J．Biol．Chem．266 18370-18377）について報告され、適切な宿主細胞内のｃＤＮＡの発現によって官能的組み換え酵素の生産が可能になった。これらのｃＤＮＡは従来の交雑法によって単離した。しかしながら、この方法で得られたのはヒトおよびラットＰＤＥ IVCの部分的ｃＤＮＡに過ぎない。（Bolger et al.,前掲書 1993 およびSwinnen et al．前掲書1989および国際特許明細書番号ＷＯ91／16457.）。これらの配列は官能的酵素を生産するには不十分である。ヒトのＰＤＥ IVC ｃＤＮＡは従来の交雑法ですぐに得られると思われたが、実際には得られなかった、これはおそらく他の３つのイソフォームに比較してそのｍＲＮＡの豊富さが低いためであろう（Bolger et al. 1993 前掲書）。この問題を克服するためにヒトのＰＤＥ IVC ｍＲＮＡのクローニングのための新しい戦略を工夫した（プライマー設計のアプローチに基づく、また後述の実験の部分に詳述）、それによって哺乳類、酵母および昆虫細胞内のｃＤＮＡの発現によって官能的酵素を得ることができた。これらによってこの酵素の特性を基質の反応速度(kinetics)とＰＤＥ IV選択的阻害剤による阻害についてA,BおよびDイソフォームと比較することができた。このように本発明の１つの側面によって、ヒトホスホジエステラーゼ型IVC[ＰＤＥ IVC]を暗号付けする単離された核酸分子を提供することができる。本発明による特定の核酸は後述の図１に示したヌクレオチド配列（配列識別番号：31）、類縁体およびそれらの断片を含む。「類縁体」という用語は図１に示した配列を有するが、その中の1つ以上のヌクレオチドが変化するか、１つ以上の特別なヌクレオチドが存在するすべてのＤＮＡ分子を含むものとする。「断片」という用語は、同じく図１に示した配列を有するが１つ以上の特別なヌクレオチドが欠失したＤＮＡ分子を含むものとする。この用語は１つ以上のヌクレオチドが欠失した類縁体をも意味するものとする。すぐ理解されるように、類縁体または断片が本発明によるＤＮＡ分子の資格を得るためには、官能（触媒活性）ＰＤＥ IVCを暗号付けすることができなければならない。ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは両方の組み合わせを含むことができる。本発明による核酸は本書に記載のような適切なプローブを使用して適切なヒト資源から得ることができる。得られた核酸は、本発明の核酸類縁体または断片を得るために標準分子生物学の技術および／または化学技術、例えば、オリゴヌクレオチド誘発突然変異またはオリゴヌクレオチド誘発合成技術、酵素切断または補足された(gapped)オリゴヌクレオチド内への酵素充填、などによって修飾することができる。代案として、核酸自体は従来のゲノムｃＤＮＡおよび／またはＰＣＲクローニング技術を用いて、他のヒト資源からゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの相補的コピーを得るためのプローブに使用できる。本発明によるＰＤＥ IVC核酸は、例えば、生体内でのＰＤＥ IVCの生産を修飾することが望ましい治療にも使用できるので、本発明は、かかる使用も含む。本発明による核酸の知識は、例えば、非転写ＤＮＡまたはＲＮＡの使用によって生体内でその活動を調節する能力も提供する。このように、本発明のさらに別の側面によれば、ヒトホスホジエステラーゼ型IVCのための遺伝子暗号付けの非転写ＤＮＡまたは非転写ＲＮＡが提供され、前記遺伝子は本書の図１のヌクレオチド配列、または類縁体またはそれらの断片から成る核酸を含んでいる。非転写ＤＮＡまたはＲＮＡは従来の手段を用いて、標準分子生物学技術および／または化学合成によって生産できる。所望であれば、非転写ＤＮＡおよび非転写ＲＮＡは生体内の分解を阻止し、あるいは細胞膜の通過を容易にするために化学的に修飾することができる、および／またはｍＲＮＡを不活性にすることができる物質、例えば、リボザイム(ribosyme)をそこに結合することができる、また本発明はかかる構造も含むものとする。非転写ＤＮＡまたはＲＮＡは、炎症性疾患などの、ＰＤＥ IVCの過剰または非調節産生が関与する疾患または不全の治療に使用できる。しかしながら、特に本発明による核酸はヒトＰＤＥ IVCまたは類縁体またはそれらの断片の産生に使用できる。このように、本発明のさらに別の側面によれば、組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCまたは類縁体またはそれらの断片が提供される。ＰＤＥ IVCは特に単離された酵素とすることができる、例えば細胞の上澄みの一部または細胞もしくは外部の蛋白質あるいはその他の物質がほとんどない精製酵素などの部分的に精製された細胞のない酵素である。本発明による酵素の類縁体または断片はヒトＰＤＥ IVC触媒活性を保持しているが、自然発生酵素に対して１つ以上の追加の、より少ない、あるいは異なるアミノ酸を有する蛋白質である。本発明による特に有益な蛋白質には後述の図１または２に記載のヒトＰＤＥIV Cアミノ酸配列（配列識別番号：32）および類縁体とそれらの断片が含まれる。特定の類縁体は図1に記載のアミノ酸配列とともに後述の図７に記載の追加の５ ’アミノ酸配列（配列識別番号：37）を含むものである。意外なことに、下記の実験の節に示すように、１つを越える触媒活性立体配座で本発明のヒトＰＤＥ IVC酵素が得られることがわかった、また本発明は単離された酵素の全てのコンフォーマー、類縁体とそれらの断片も含む。触媒分析で選択的阻害剤に対する感度によって区別される酵素の異なるコンフォーマーの発現を誘発する本発明のＰＤＥ IVC配列の能力は他者によって報告されたＰＤＥ IVA 、BおよびDの発現の結果からは予見できない（例えば、Bolger et al,（1993）前掲書 ; Livi et al，（1990）Mol．Cell．Biol．10，2678-2686; Maclaughin e t al （1992）前掲書）。かかる異なるコンフォーマーの有益さは、同じ分析方式で、つまりｃＡＭＰ加水分解の阻害で新規な阻害剤の効力の評価を可能にすることである。本発明によって得られる特に有益なコンフォーマーは後述のごとく哺乳類の細胞内のＰＤＥ IVC酵素の発現によって得られるものである。この種の酵素の特徴は試験管内分析において、既知のＰＤＥ IV阻害剤ロリプラムのＲ−とＳ−エナンチオマーの間の区別をする能力である。試験管内のＲ−とＳ−ロリプラムによる阻害剤の立体選択性を維持する、かかるコンフォーマーは、例えば、酵母内の酵素の発現によって得られるような他の非選択的コンフォーマーとは区別され、後述のごとく試験管内選別でＰＤＥ IV阻害剤の特性評価に用いるのに特に有益である。本書に用いられる「コンフォーマー(conformer)」の語は阻害剤に対する触媒応答によって区別されるあらゆる形のＰＤＥ IVC酵素を意味し、例えば、燐酸化形およびその他の酵素の修飾形などの翻訳後修飾を移入することのできる酵素の形も含む。ＰＤＥ IVC蛋白質、類縁体またはそれらの断片はこの技術において周知の方法（参照、″Current Protocols in Molecular Biology″，Vol．I and II，Ansub el,F.M．et al（ed），Wiley Interscience，1992、など）を用いて、あるいは後述の実験の節に記載の方法を用いて、適切な原核生物または真核生物宿主細胞内の発現ベクターを用いて対応する核酸の発現によっても得られる。所望の場合、酵素は細胞溶菌液(cell lysates)から単離され、従来の技術、例えば、イオン交換およびその他のクロマトグラフィー技術を用いて随意に精製される。特定のコンフォーマーは異なる細胞タイプから得ることができる。このように、本発明によるＲ−とＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマーは例えばＣＨＯまたはＣＯＳ細胞などの哺乳類細胞内のＰＤＥ IVC酵素の発現によって得られる。代案として、このタイプのコンフォーマーはＳｆ９細胞などの昆虫細胞内のＰＤＥ IVC酵素の発現によって得られる。本書に記載の非選択的コンフォーマーは酵母細胞から得られる。本発明によるＰＤＥ IVC蛋白質は医学に使用するために、特にＰＤＥ IVCイソフォーム選択性阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤を始めとする蛋白質の作用を抑制する因子のための選別に使用できる、また本発明はかかる使用、および本発明のＰＤＥ TVC蛋白質を含む選別にも及ぶものとする。このように、本発明のさらに別の側面によれば、酵素のための基質を含む試験システム内で試験化合物と組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCを接触させ、試験化合物の存在による酵素の作用の抑制を監視することを包含するヒトホスホジエステラーゼ型IVCの作用を抑制する化合物の選択のための方法が提供される。本発明のこの側面において、組み換えＰＤＥ IVC酵素は単離された酵素、特に本書に記載のＲ−とＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマーとすることができる。代案として、酵素は本発明によるＰＤＥ IVC核酸によって転換された細胞、特に哺乳類または昆虫の細胞からの分析の操作の間に発現される。本発明のこの側面に使用する試験化合物は合成または天然とすることができる。かかる選別は医学に使用されるＰＤＥ IVCイソフォーム選択的阻害剤の選択に特に有益であり、本発明は、このようにして選択された阻害剤を含む。選別における標的酵素として本発明によるＲ−とＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマーの使用は有利な特性を備えた阻害剤の選別を提供するものと期待される、なぜなら後述の結果に基づいて、この形の酵素は非選択的コンフォーマー、例えば、酵母などの宿主内に産生されるものよりも天然酵素をより近く模倣するものと思われる。このようにして選択された阻害剤は、炎症性疾患、例えば喘息、特に喘息を併発した肺臓の炎症の予防と治療に有効である。この阻害剤は通常の慣行に従って１つ以上の薬学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤とともに医薬品組成物として処方することができる。通常の免疫および組み換えＤＮＡ技術を使用して本発明による蛋白質の１つ以上のエピトープに対する抗体も発生できる、また本発明は免疫原としての本発明によるヒトＰＤＥ IVCの使用も対象とする。このように、本発明によるホスホジエステラーゼまたは類縁体またはそれらの断片で免疫化した動物の血清から例えばポリクローン抗体を得ることができる。適切な宿主、例えば、マウスポリクローン抗体を得ることが所望であるＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫原を注射し、血清を回収し、そこから抗体を採取することができる。モノクローナル抗体は先に述べたごとく免疫化し、適切な「不死の」Ｂ− 腫瘍細胞に融合した動物の脾臓細胞に由来するハイブリドーマから得ることができる。それぞれの段階で、例えば蛋白質Ａなどを用いるクロマトグラフィー、あるいは本発明によるホスホジエステラーゼまたは類縁体またはそれらの断片を用いるその他の親和クロマトグラフィーによって標準精製およびまたは濃縮技術を使用して血清またはハイブリドーマのいずれかから抗体を回収することができる。抗体を発現する、ハイブリドーマなどの細胞ラインが得られたら、そこからｃＤＮＡをクローン化し、ＣＤＲを暗号付けする配列を含む、所望の抗体を暗号付けする可変領域遺伝子を識別することができる。そこから、少なくとも抗体の重いまたは軽い鎖の可変領域を暗号付けするＤＮＡ配列および随意に、所望のごとく重いおよび／または軽い鎖の残りの部分を暗号付けするその他のＤＮＡ配列を有する１つ以上の複製可能な発現ベクターを調製し、抗体の産生が行われる、マウスＮＳＯラインなどの非産生骨髄腫細胞ラインなどの適切な細胞ラインを転換して他の操作処理抗体(engineered antibodies)が得られる。効率的な転写と翻訳が得られるように、それぞれのベクター内のＤＮＡ配列は適切な調節配列、特に可変ドメイン配列に操作自在に結合されたプロモーターおよびリーダー配列を含んでいなければならない。このようにして抗体を産生するための特定の方法は周知であり、日常的に使用されている。例えば、基本的分子生物学的手順はMani atis et al［Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，New York， 1989]に記載の通りであり、ＤＮＡ配列はSanger et al [PNAS 74，5463，(1977) ]およびAmersham International plc sequencing handbookに記載の通りに実行でき、部位誘発突然変異はKramer et al [Nucl．Acids Res．12，9441， (1984)]の方法とAnglian Biotechnology Ltd handbookに従って実施できる。さらに数多くの刊行物があり、なかんずく特許明細書にはＤＮＡの操作によって抗体を調製するのに適した技術、発現ベクターの産出、適切な細胞の変換などが詳述され、例えばMountain A and Adair，ＪR in Biotechnology and Genetic Eng ineering Reviews［ed．Tombs，M P，10，Chapter 1，1992，Intercept，Andove r，UK］および国際特許明細書番号ＷＯ91／09967に検討されている。本発明のさらに別の特徴は、上述の一般的方法で獲得され、組み換えヒトＰＤＥ IVC、特にそのＲ−とＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマーを結合することのできるポリクローン抗体、モノクローナル抗体および操作処理抗体である。かかる抗体は、例えば、分析試験、ＰＤＥ IVC精製手順その他に有益であろう。次に、添付の図面を参照して、下記の実施例について本発明を説明する。図面の要約図１：ヒトＰＤＥ IVCのＤＮＡおよびアミノ酸配列図２：ヒトＰＤＥ IVアミノ酸配列のアラインメント図３：ヒトおよびラットのＰＤＥ IVアミノ酸配列のアラインメント図４：モノＱセファローズ(monoQ Sepharose)イオン交換クロマトグラフィーによる酵母ＰＤＥ活性からの組み換えＰＤＥ IVCの分離図５：イソプレテレノール(isopreterenol)に応答してβ２アドレナリン作動性受容体によって転位したＣＨＯ内の細胞内のｃＡＭＰの評価図６：β２アドレナリン作動性受容体＋ＰＤＥ IVCまたはＰＤＥ IVAによって転位したＣＨＯ内の細胞内のｃＡＭＰの評価に対するＲ−とＳ−ロリプラムの影響図７：ヒトＰＤＥ IVC ＭＲＮＡの代替５’末端の配列図８：酵母、ＣＯＳ細胞および酵母／ＣＯＳ細胞混合物内に産生されたＰＤＥ I VCのロリプラムによる阻害実験手順ＲＴ．ＰＣＲ分析遺伝子ＣｍＲＡＮのソースを識別するために、ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ．ＰＣＲ）に結合された逆転写によるイソフォームｍＲＮＡについて多数の細胞ラインを分析した。全ＲＮＡはＲＮＡｚｏｌ（生物発生）とオリゴｄＴセルロースを用いる親和クロマトグラフィーによって選択されたポリＡ＋ｍＲＮＡを用いて調製された。逆転写によって調製された第1の鎖のｃＤＮＡの５０ｎｇは条件94 ℃１分、55℃ １分、72℃ ３分を用いて、40サイクルの間遺伝子固有プライマーの次の対について増幅した。遺伝子Ａ遺伝子Ｂ遺伝子Ｃ遺伝子Ｄ遺伝子ＣｃＤＮＡの単離部分ＰＤＥ IVC ｃＤＮＡクローンはＲＴ．ＰＣＲを用いてＵ８７細胞ｍＲＮＡから単離された。５’ＰＣＲプライマーは遺伝子Ｃのアミノ末端に向かうアミノ酸配列の短い伸長が先にクローン化したA,B,Dイソフォームのそれと同一であるとの予測に基づいている。遺伝子のこの区分を暗号付けするＤＮＡ配列と交雑することが期待されるオリゴヌクレオチドの混合物が合成された。プライマー設計の２つの特徴が要求される異なった配列の数を有利に最小化する。最初に、コドン使用は他の３つのＰＤＥIVイソフォームの配列に基づいていた。第２に、最後の５つのコドンだけが変化した。増幅された配列を直接発現させるためにＰＤＥ配列の５’末端にＡＴＧが付加された。Ｈｉｎｄ３制限酵素クローニング部位もプライマーに組み込まれた。標的アミノ酸配列とオリゴヌクレオチドは下に示した:− ３’ＰＣＲプライマーは先に示したR5192であり、クローニングのためにＥｃｏＲ１部位を組み込まれた。増幅は上述の条件を使用して実施した。1500bpＰＣＲ産生物が得られ、プラスミドｐＤＥＵ１を産生するために市販のベクターｐＳＰ７３内にサブクローン化された。12の独立したクローンが両方の鎖の上に配列され、公表されている部分配列に照らして遺伝子Ｃとして識別された。ＰＤＥ IVCの５’末端と開始メチオニン残留物を単離するために商用のＰＣＲを基礎とする戦略の手順(５’Amplifinder^TMRace，Clontech)に従った。RACE法(r apid amplification of cDNA ends)についての最初の記載はFrohman et．al. ［(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 8998-9002］およびBelyauskey et al.［( 1989)Nucl.Acids Res.17 2919-2932]による。Clontech法はEdwards et al [(199 1)Nucl．Ac1ds Res．19 5227-5232]に記載のものの修正版であり、第１の鎖のｃＤＮＡの３’末端へのヌクレオチドアンカーの一本鎖結合が実施され、ホモポリマーテイリングが避けられる。上述の部分ＰＤＥ IVCクローン（ＰＤＥＵ１）の場合のように、第１の鎖のｃＤＮＡはプライマーオリゴヌクレオチドとしてＲ６３３３を用いてＵ８７細胞ｍＲＮＡ２μｇから合成された。１次ＰＣＲ反応は５μｌの一本鎖結合混合、５Ｕ Taqポリメラーゼ、２μｌジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、250μＭデオキシリボヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ）、0.2μＭアンカープライマー、0.2μＭオリゴヌクレオチドR6332 とＨ₂Ｏとから成り、合計量は50μｌになる。反応は下記のパラメータで35サイクル増幅した：95℃／1分、65℃／1分、72℃／1分。２次ＰＣＲ反応は２μｌの１次ＰＣＲ混合物の1／10の希釈、５Ｕ Taqポリメラーゼ２μｌＤＭＳＯ、250 μＭｄＮＴＰＳ、0.2μＭアンカープライマー、0.2μＭオリゴヌクレオチドR63 31とＨ₂Ｏとから成り、合計量は50μｌになる。増幅は１次ＰＣＲ反応と同じパラメータで実施した。２次ＰＣＲ反応の生成物は制限酵素ＥｃｏＲ１とＢａｍＨ１で消化した、それぞれ結合されたアンカーとＰＤＥ IVC配列内に含まれる部位である。断片はＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１で消化したｐｓＰ６５ベクター(Promega)内にクローン化され、組み換えコロニーはＰＣＲ選別で識別され、両方の鎖の上に配列され、ＰＤＥ IVCとして確認された。結果として得られた470bp断片を含むプラスミドはｐＤＥＲ２と命名された。ヌクレオチド配列の翻訳で残念ながら位置336bpにメチオニン残留物が識別され、解読枠は開いたままで、開始メチオニンであるか確認できなかった。しかしながら、クローンは最近記載された（Bolger et al. 前掲書 1993）上流保存領域１（ＵＣＲ１）の全てを含んでいた。今度は上述の新しい5'配列から誘導したオリゴヌクレオチドを用いて再度ＲＡＣＥ法を反復した。１次および２次ＰＣＲ反応はそれぞれオリゴヌクレオチドR6532とR6533を使用して上述と同じ条件で実施した。２次ＰＣＲ反応の生成物はＥｃｏＲ１（アンカー部位）とＢａｍＨ１（同じく遺伝子固有オリゴR6533内に含まれる）で制限し、市販のpSP65内にクローン化した。組み換えコロニーはＰＣＲ分析で識別し、プラスミドＤＮＡが単離され、両方の鎖の上に配列された。配列分析から４つ全てのクローンが同一であるが、４つのうち２つのクローンが拡張5’配列を有することがわかった。翻訳したとき、全てのクローンは同じ位置に5’終結コドンを有していた。第1の開始メチオニン残留物下流はＰＤＥＲ２に記載のメチオニン残留物に対応した。触媒活性のある全長ＰＤＥ IVC遺伝子を構成するために内部ＢａｍＨ１部位を使用して新しい5'配列を部分クローンに添加した。それぞれ1424＆470bpの２つの断片を放出するためにｐＤＥＵ１およびｐＤＥＲ２をＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１で消化した。真核生物発現ベクターｐＥＥ７ｈｃｍｖ(Stephens P.and Cockett M.[(1989)Nucl．Ac1ds Res．17 7110]はＥｃｏＲ１で消化した。３路結合を実施し、形質転換体をＰＣＲで選別してインサートの配向を決定した。プラスミドＤＮＡを精製し、両方の鎖の上に配列した。プラスミドはｐＤＥＵ７と命名された。ｐＤＥＵ７からの全長遺伝子Ｃを有するＨｉｎｄ３−ＥｃｏＲ１断片をベクターｐＤＥＵ８を得るために酵母発現ベクターｐＹＥＳ（InVitrogen）内に挿入した。遺伝子ＡのｃＤＮＡクローンの単離遺伝子Ａの部分的ｃＤＮＡは公表された配列情報（Livi G．et al．（1990）前掲書）を用いてＰＭＡ刺激U937細胞から調製したｃＤＮＡライブラリからＰＣＲによって単離した。続いて、このｃＤＮＡから保存された領域プローブを使用して交雑と穏やかな緊縮度で洗浄して(最終洗浄2×ＳＳＣ、0.5％ＳＤＳ 60 ℃)ヒト前部皮質ｃＤＮＡライブラリから全長ｃＤＮＡクローンを単離した。このクローンの配列はBolger et al.前掲書（1993）と同一であるが、わずかな相違として724bp＝でＧ＞A metからile変化、1238bpでＧ＞Ａサイレント変化。ＰＤＥ IVAについての全長遺伝子はそれぞれＣＯＳと酵母細胞内の発現についてｐＥＥ７とｐＹＥＳベクター内に導入した。ノーザンブロット分析様々なヒト組織内のＰＤＥ IVイソフォームｍＲＮＡｓの分布をノーザンブロッティングで分析した。Clontechから購入したヒトの多数の組織ノーザンブロットをそれぞれの遺伝子の３’非翻訳領域からのＰＣＲによって発生したイソフォーム固有のプローブで交雑した。HL-60ゲノムＤＮＡ（プローブＡおよびＣ）またはエオシン好性の濃縮ｍＲＡＮから調製したｃＤＮＡライブラリ（プローブＢおよびＤ）のどちらか一方を下記の対のプライマーと、上述の条件でのＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。遺伝子Ａ遺伝子Ｂ遺伝子Ｃ遺伝子Ｄ遺伝子固有プローブはランダムプライミングを用いて³²Ｐ．ｄＣＴＰで放射線標識を付けた。ＲＮＡブロットはExpresshyb^TM（Clontech）内で65℃で1時間交雑し2×SSC、0.05％SDS内で室温で40分、次いで0.1×SSC、0.1％SDS内で65℃で4 0分間洗浄した。ブロットは−70℃で最大7日まで強化スクリーンでＸ線フィルムに曝露した。ＰＤＥ IVAとＰＤＥ IVC欠失突然変異体の構造ラットＰＤＥ IVD（Jin C.（1992）J．Biol．Chem.267 18929-18939）とＰＤＥIVB (Pillai R．et al．（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90 11970-1197 4)の欠失分析は触媒活性に要求される最小酵素配列を定義した。対応する欠失をヒトＰＤＥ IV AおよびC酵素の両方に作り，ＣＯＳ細胞内の遷移発現に従って結果として生じた酵素の活性を評価した。ＰＤＥ IVA ＰＤＥ IVA遺伝子の最初の129bp（Met1からIle43）を含むプラスミド（pDEFC18）を構成するためにＰＣＲを使用した。加えて、3'BamHl制限酵素部位が配列内に導入された。ＰＣＲプライマーは次の通りであった：触媒ドメインの開始に欠失した突然変異体（Ile43-Gln 330; Bolger et al.19 93 前掲書）は下記のプライマーを使用してＰＣＲによって産生した。ＰＣＲ断片はBamH1とEcoR1で制限し、ベクターpDEFC23を産生するために上述のプラスミドpDEFC18内にクローン化した。配列決定に従ってこのベクターをHin d3とXho1で制限し、遺伝子Ａの残りの3'部分に対応するXho1/Xba1断片と共にHin d3/Xba1制限pEE7内に挿入した。最終的プラスミドはpDEFC24と名付けた。ＰＤＥ IVC ＰＤＥ IVA欠失（Met180）に対応するＰＤＥIVC内の位置で欠失した突然変異酵素は下記のプライマーを使用してＰＣＲによって産生した。ＰＣＲ増幅断片はHind3とXho1で制限し、プラスミドpDEU9を産生するためにps p73に挿入した。インサートの配列決定に続いて、このプラスミドをHind3とXho1 で制限し、遺伝子Ｃの残りの3'部分を含むpDEU7からのXho1／EcoR1断片に連結し、Hind3／EcoR1制限pEE7内に挿入した。結果として得られたプラスミドはpDEU10 と名付けた。発現システム組み換えＰＤＥ IV酵素は Whittle N．et al.（[1987)Prot．Engineering 1 4 99-505]に記載のごとく遷移発現によってＣＯＳ細胞内に産生した。簡潔に言えば5×１０⁵細胞／ｍｌを10μgのプラスミドで形質導入した。３日間培養した後、細胞はＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（50μM ロイペプチン(leupeptin )、１μM ペプスタチン(pepstatin)、１μmフェニルメチルフッ化スルフォニル、２μMベンズアミジン）を含む50mM ＴＥＳ緩衝液、ｐＨ7.6（Ｎトリス［ヒドロキシメチル]メチル）２−アミノエタンスルホン酸内で短時間、音波処理して溶菌した。細胞ホモジェネートは10分間×12000gで遠心分離し、ＰＤＥ IV活性を分析した。チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）L761細胞内の全長ＰＤＥ IVAおよびＣｃＤＮＡｓの発現のために、プラスミド、ｐＤＥＦＣ17とｐＤＥＵ7をリン酸カルシウム沈殿によって細胞内に導入した(Cockett M．et al.(1991)Nucl.A cids Res 19 319-325)。酵母細胞内のＰＤＥ IVAおよびCの発現のために、それぞれｐＤＥＦＣ17とｐＤＥＵ7ベクターから単離されたHind3/Xba1（遺伝子Ａ）またはEcoR1（遺伝子Ｃ）断片のいずれかとして２つの遺伝子をベクターｐＹＥＳ（InVitrogen）内に挿入した。得られたプラスミドはそれぞれｐＤＥＦＣ32およびｐＤＥＵ8と名付けた。酵母細胞(B7542:alpha，ura-3,trp1+，Leu2delta，pep4: His3，prBdelta 1 .6R can 1,gal)をｐＤＥＦＣ32とｐＤＥＵ8ベクターで酢酸リチウム法（Ito H.e t al.(1983)J．Bacteriol．53 163-168）を用いて転換した。Ura3正原栄養体が単離され、30℃、ＯＤ₆₀₀＝1.0で、2％のグルコースと50mg/mlのロイシンを含む最小媒体内で繁殖した。細胞は遠心分離で回収し、洗浄し、ＰＤＥ IV発現を誘発するためにガラクトース2％を含有する最小媒体内でＯＤ₆₀₀＝0.5で再懸濁した。ＯＤ₆₀₀＝1.0で、細胞を収穫し、洗浄し、4℃でガラス玉（425−600μm）で粉砕してＴＥＳ緩衝液＋プロテアーゼ（上記参照）内で破壊した。ホモジェネートは4℃で30分間100,000gで遠心分離して浄化した。ＰＤＥ IV酵素の大量生産のために、酵母細胞は流加回分発酵器（fed-batch fermenter）内で1.8Lスケールまで繁殖させ、ＰＤＥ発現はＯＤ₆₀₀＝30−40でガラクトースを添加して通常のごとく誘発し、およそ48時間後に細胞を収穫した。昆虫細胞内のＰＤＥ IVCの発現のために遺伝子は、ｐＤＥＵ7から単離したEco R1断片として、転位ベクターｐＶＬ１３９２（In Vitrogen）内に挿入した。得られたプラスミドはｐＤＥＵ16と名付けた。Sf9細胞はSummers and Smith（19 87）Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555に記載のごとく精製ＡｃＮＰＶ線形ＤＮＡ(Pharmingen)とｐＤＥＵ16転位ベクターによって同時遺伝子注入した。ウィルスの繁殖、プラーク精製および滴定は標準手順を用いて実施した。蛋白質産生のために細胞は、攪拌フラスコ内で2×１０⁶／ｍｌまで繁殖させ、１０の感染多重度で感染させ、60時間後に収穫した。酵素分折酵素反応はｐＨ7.6で10mM ＭｇＣｌ₂、3',5’ｃＡＭＰ（0.1 μＭ ³Ｈ−ラベル付0.74−1.1TBq/mmol）5'ＡＭＰ（2.5μＭ ¹⁴Ｃ、1.85−2.2 GBq/mmol）を含有する50mM ＴＥＳ緩衝液内で30℃で30分間実施した。これらの条件で物質の20 ％未満を加水分解するために十分な酵素調製物を添加した。Ｋｍ決定のために、ラベル付されていないｃＡＭＰを添加して0.1−20μＭの範囲内で基質濃縮を達成した。1％の最終濃度にトリフルオロ酢酸を添加して酵素を急速不活性化して反応を停止した。基質と反応生成物はSmith et al.[(1993)Analyt．Biochem．21 4 355-357]に記載のごとく分離し、［³Ｈ］5’ＡＭＰ生成物は閃光計数で分析した。分離の間の³Ｈ］5'ＡＭＰの損失補正は反応混合物に含まれる[¹⁴Ｃ]5’ＡＭＰを基準に実施した。ヒトβ２アドレナリン作動性受容体遺伝子の単離ヒトβ２アドレナリン作動性受容体遺伝子（Kobilka B.et al.（1987）J.Biol .Chem.262 7321-7327）は次のプライマーを使用してＰＣＲによってHL-60細胞ゲノムＤＮＡから単離した。ＰＣＲ断片はHind3とEcoR1で制限し、哺乳類細胞内に発現するためにpEE6Bg12 ネオベクター（Stephens P．and Cockett M．（1989）Nucl．Acids Res.17 7110 ）内に挿入した。プラスミドはpＲＯ144と名付けた。 β２アドレナリン作動性受容体とＰＤＥ IV AまたはCで同時遺伝子注入したイソプロテレノール刺激ＣＨＯ細胞内の細胞内ｃＡＭＰの測定遺伝子注入した細胞は非酵素細胞解離試薬(Sigma)で収穫し、3回洗浄し、0.1 ％ＢＳＡと0.1％グルコースを含むDulbeccoの燐酸塩で緩衝した塩水（DPBS＋）内に再懸濁した。これらの細胞はＤＰＢＳ＋内で10μＭ阻害剤（または溶剤制御、0,1％ＤＭＳＯ）で10分間37℃で保温した。細胞懸濁液はイソプロテレノール（0.001−1μＭ）で2分間刺激した。これらの細胞は１２０００ｇでペレットにし、４００μLの沸騰分析緩衝液(DuPont cAMP measurement kit)内に再懸濁した。サンプルは熱湯浴で10分間加熱し、凍結してから市販のｃＡＭＰ放射標識免疫検定法（DuPont）を用いてｃＡＭＰについて分析した。SDS-PAGEとウェスタンブロッティング SDS-PAGEは10％（w/v）アクリルアミドゲルを用いてLaemmli（1970）Nature 2 27 680-685に従って実施した。ウェスタンブロッティングについては蛋白質をニトロセルロースに転移しＣ−末端ＰＤＥ IVCペプチドに載せた(raised)ラビットのポリクローナル抗血清でプローブした。結果ヒトＰＤＥ IVCのクローニングと配列分析ヒトＰＤＥ IVC ｍＲＮＡの推定全量バージョンを組み立てるのに一連のＰＣＲ増幅過程を使用した。単離された３つの重なったｃＤＮＡの複合配列は図１、配列識別番号：31に示した。配列には長さが1818bpのＯＲＦが含まれ、その計算分子量がおよそ66.5kDの605アミノ酸蛋白質が予想される。位置259bp（図１）で第１の配列から派生した第２のＰＤＥ IVC ｍＲＮＡについても証拠が得られた。これはヒトＰＤＥ IVAとDの両方の代替エキソンスプライシングの点を表している（Bolger et al. 前掲書 1993）。従って、他のＰＤＥ IV遺伝子と共通のヒトＰＤＥ IVC遺伝子の１次転写はその５'配列が異なる少なくとも２つのｍＲＮＡを産生するために異なる処理を受けることが予想される。図２はヒトＰＤＥ IVC１次アミノ酸配列(配列識別番号：32)のアラインメントを３つの他のクローン化ヒトＰＤＥ IVs、遺伝子Ａ(配列識別番号：33)、遺伝子Ｂ２(配列識別番号：34)、および遺伝子Ｄ(配列識別番号：35)の配列とともに示している。ＰＤＥ IVCは特に２つの上流保存領域（Bolger et al. (1993)前掲書に定義されたＵＣＲ１とＵＣＲ２）およびアミノ酸の同一性が＞／＝90％である中央触媒領域においてＰＤＥ IVA、BおよびD配列との相同性が高い。これらの相同ドメインの外では、他のＰＤＥ IVsと共通の配列はイソフォーム固有の特に触媒ドメインのＣ末端である。ヒトＰＤＥ IVCを部分的ラットＰＤＥ IVC配列と比較するとこれらのイソフォーム固有領域は異なる種のイソフォームの間で比較的保存されたことがわかる。このように全体的にはヒトＰＤＥ IVCの配列は同じ種の異なるイソフォームよりも異なる種の同一のイソフォームにおそらくもっと一致する（図３）、配列識別番号:36。ＰＤＥ IVイソフォームのこの見かけ上の保存は機能的意味の保存が関与している。ヒトＰＤＥ IVCの代替5'末端の配列は図7、配列識別番号：31に示した。この配列はこのｍＲＮＡの開始部位を表すかもしれない位置63bpにＡＴＧを含んでいる。しかしながら、解読フレームはこのＡＴＧの上流で開いているので、これを開始部位に最終的に指定できない。ＣＯＳ細胞内の発現と触媒活性の評価組み換えヒトＰＤＥ IVCはＣＯＳ細胞内の遷移発現によって産生される。産生物は溶菌細胞の溶解性画分(×12000g上澄み)内で回収し、SDS PAGE上におよそ80 kDの見かけ分子量で転位した、これはヒトＰＤＥ IVC固有ポリクローナルラビット抗血清を用いてウェスタンブロッティングで明らかにされた。ＣＯＳ細胞内に発現したＰＤＥ IV活性はＰＤＥ IV選択阻害剤、ロリプラムおよびデンブフィリン(denbufylline)ならびに広スペクトラムＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ（表１）によって顕著に阻害された。このＰＤＥ IVCの阻害プロフィールはおなじくＣＯＳ細胞内の遷移発現によって産生したＰＤＥ IVAのそれと比較された。もっとも興味深いのは、ＰＤＥ IVC酵素がＰＤＥ IVAに比較してロリプラムおよびデンブフィリンの両方に対してかなり大きな敏感性を示したことである（表１）。加えて、ＰＤＥ IVC酵素はロリプラムのＲ−形に対する立体選択性を示したが、ＰＤＥ IVA は示さなかった。ＰＤＥ IVｓ A,BおよびDのロリプラム阻害についてＩＣ₅₀'sは 200−500ｎＭ周辺で非常に類似していることが報告されている（Livi et al．(1 990);Maclaughlin et al. (1993); Bolger et al.(1993)前掲書）。このようにＣＯＳ細胞から得られたＰＤＥ IVC酵素は他のＰＤＥ IVイソフォームとは区別される薬学的特性を示すと思われ、それはイソフォーム選択阻害剤の開発に利用できるだろう。ｍＲＮＡ組織と細胞分布ＰＤＥ IVC ｍＲＮＡ（ｓ）の分布はノーザンブロッティングとＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）に結合した逆転写の両方によって調査した。結果は表２と３にまとめた。ノーザンブロッティングデータはＰＤＥ IVイソフォームｍＲＮＡｓがヒトの組織内に広く分布し、イソフォームＣｍＲＮＡが一番豊富でないことを示している。それぞれのイソフォームは異なるサイズ(Ａ＝4.5kb,Ｂ＝4&5kb,Ｃ＝6.0kb,Ｄ＝7.5−8.0kb）の少なくとも２つのｍＲＮＡ種を産生する。脳と骨格筋は全てのイソフォームｍＲＮＡｓの中で最高レベルを有すると思われる。ヒトの組織培養細胞とラット組織の両方のイソフォームｍＲＮＡｓを検出するためにヒト遺伝子プライマーを用いるＲＴ．ＰＣＲの結果からＰＤＥ IV ｍＲＮＡｓがそれぞれのイソフォームｍＲＮＡの見かけレベルが変化するように見えても、広く分布していることが確認される。ラットの後根神経節と睾丸に由来する細胞内では遺伝子ＣｍＲＮＡはA、BまたはDよりも豊富であると思われる。後者の結果はSwinnen et al.（1989）前掲書が以前に報告したデータと一致する。興味深いことに、細胞ラインをｂｔ₂ ｃＡＭＰで処理すると、全部ではないが一部のＰＤＥ IVイソフォームｍＲＮＡｓの増加につながる。このようにヒト細胞ＨＬ―６０およびＳＫＮ．ＳＨにおいて、ＣとＤのレベルは上がるが、ＡとＢは上がらない。酵母とＣＨＯ細胞内の発現ＰＤＥ IVCとＰＤＥ IVAはともに酵母とＣＨＯ細胞内に発現した．ＣＨＯ細胞溶解物をＰＤＥ活性とロリプラムによる阻害について分析した。それぞれＣとＡについて43と287ｎＭのＩＣ₅₀'sが得られ、ＣＯＳ細胞内に産生した酵素についての結果と一致した（表１）。酵母は２つの内生的ＰＤＥ活性を発現する(Londesborough J．and Souranta K .（1983）J. Biol．Chem．258 2966-2972; Souranta K.and Londesborough J.（ 1984）J．Biol．Chem．259 6964-6971)。従って、酵母細胞溶解物は組み換えＰＤＥ IV活性を宿主細胞酵素から分離するためにイオン交換クロマトグラフィーで分画した（図４）。ロリプラムによる阻害に対してＰＤＥ IVC活性について濃縮した分画の感度を評価した。意外にも、この酵素はロリプラムのＲおよびＳ型に対して制限された鏡像異性体選択性と一般的にもっと高いＩＣ₅₀値を実証した（表４）。このように酵母内に産生されたＰＤＥ IVC酵素は哺乳類の細胞(ＣＯＳ，ＣＨＯ）内に産生されたものとは区別されるように見える。反対に、酵母内に産生されたＰＤＥ IVAはＣＯＳおよびＣＨＯ細胞内に発現した酵素に対して同様なロリプラム阻害を示した（表１と４）。これらの結果は、例えば、燐酸化などの哺乳類細胞内にだけ発生するＰＤＥIVC酵素の特異な翻訳後修飾によって説明できる。そこから、かかる修飾はＰＤＥ IVAには起こらない、またはもし起こっても、ロリプラムによって阻害される酵素の能力には影響しないことになる。いずれの場合にも、ＰＤＥ IVCの1次配列の知識がこの現象の調査に必要である。昆虫細胞内のＰＤＥ IVCの発現バクロウィルス系を使用して昆虫細胞内にＰＤＥ IVC ｃＤＮＡを発現した。Ｓｆ9細胞溶解物をＰＤＥ活性とロリプラム鏡像異性体による阻害について分析した。Ｒ−ロリプラム（104ｎＭ）とＳ−ロリプラム（600ｎＭ）についてＩＣ₅₀ 値を得た。このように酵素のこのバージョンに対するＲ−ロリプラムの有効性は酵母産生ＰＤＥ IVCよりもＣＯＳ酵素のそれに近い。酵母、ＣＯＳおよびＳｆ9細胞内に発現したＰＤＥ IVCの比較酵母、ＣＯＳおよびＳｆ9細胞内に産生されたＰＤＥ IVCの異なる調製物についてｃＡＭＰ加水分解の反応速度を比較した（表５）。全ての酵素調製物は単純なミハエリス＝メンテン型反応速度を示し、Ｋ_m値は低いμＭ範囲内にあった（表５）。酵母とＳｆ9細胞から部分的に精製した酵素についてＶ_max値は0.3および0.6μモル／分／ｍｇと推定された。これらのデータは、例えば、Wilson et al(1994)Biochem．J．304，407;Conti M et al（1995）Biochemistry 34，7979などの精製ＰＤＥ IV酵素の調製物に関する文献内の報告と一致している。ＰＤＥ IVC酵素の調製物の間の基本的な差異はロリプラムに代表される選択的ＰＤＥ IV阻害剤に対する応答にある（参照：表３と４）。これらの差異が調製物のいずれかの中の汚染物によるものでないことを示すために、混合試験を実施した。酵母とＣＯＳ細胞内に産生した同量のＰＤＥ IVC酵素活性を混合し、ロリプラムによる混合物の阻害を別個に分析したそれぞれの成分と比較した。この結果（表６と図５）は酵母とＣＯＳ細胞からのＰＤＥ IVC酵素が別のものであることが確認された、なぜなら両者の1：1の混合物がロリプラム阻害に対して中間の値を示したからである。ＰＤＥ IVCの欠失ＰＤＥ IVCの生化学的独自性の証拠は酵素欠失の影響をＰＤＥIV A、BおよびD について識別された触媒作用に要求される最小配列と比較して得られた。ＰＤＥ IV CとAの等価の欠失突然変異体を調製し、ＣＯＳ細胞内に発現した。結果は、 (表7)両方の欠失酵素が発現するが、ＰＤＥIVAだけが触媒活性を有することを示した。これはＰＤＥ IVCにおいて、他の３つのＰＤＥ IVイソフォームと異なり、触媒活性はさらに蛋白質のアミノ末端に向かう配列を要求することを示している。ｃＡＭＰ評価に続く本来の(in situ)ＣＨＯ細胞内のＰＤＥ IVの阻害本来の(in situ)特異なＰＤＥ IV遺伝子産生物の活性に対するＰＤＥ IV阻害剤の影響を評価するために組み換え細胞を基礎とする分析が開発された。クローン化ヒトβ２アドレナリン作動性受容体のＣＨＯ細胞内の遷移発現の結果、β２作用物質、イソプレテレノールに応じて容量に依存してｃＡＭＰレベルが増加した。細胞内にＰＤＥ IVCまたはＰＤＥ IVAのいずれかを同時遺伝子注入することによってアデニルシクラーゼの刺激によるｃＡＭＰのこの蓄積が阻害されたが、ｃＡＭＰのベースラインレベルは影響されなかった（図5）。この影響はロリプラムの添加によって逆転され、顕著な鏡像異性体選択性を示した(図6)。このほぼ10倍の立体選択性はAとCの両方で示され、ＰＥIVCだけがこの10倍の選択性を示した同じ細胞タイプ、ＣＨＯ内に産生した酵素に対する試験管内分析の結果と対比される（表４）。この所見の意味は試験管内と生体内の両方でロリプラムの多数の生物学的効果のために阻害剤がその効力に顕著な立体選択性を示すことである。例えばＲ−ロリプラムはＴリンパ球からのＴＮＦ放出の抑圧にほぼ50倍効果的である(Sommer N．et al. 1995 Nature Medicine 1 244-248)。同様にＲ−ロリプラムは鬱病の齧歯類モデルにおける行動応答を発生するのにＳ−ロリプラムより15-30倍有効である（例えば、Schmiechen R．et al. 1990 Psychopharmacology 102 17-20）。この後者の効果は齧歯類の前頭組織内の部位を結合するのにＳ−ロリプラムに勝るＲ−ロリプラムのより高い親和力と密接に相関している（Schmiechen et al . 前掲書；Kaulen P．et al. 1989 Brain Res．503 229-245.）。組み換えＰＤＥ TV（Torphy T．et al.，1992 J.Biol.Chem．267 1798-1804）もロリプラムに対する高い親和性結合について立体選択性を示すことが示されている。このことは生体内のロリプラムについて結合部位がＰＤＥ IV(s)に対応することを意味している。哺乳類の細胞系内に発現した組み換えヒトＰＤＥ IV酵素は酵母や細菌などの非哺乳類細胞宿主内に産生された同じ酵素よりも天然酵素をより近く模倣すると思われる。ＰＤＥ IVAとＰＤＥ IVCの両方が、またおそらくBとDが、その場で(i n situ) 評価したときＰＤＥ IV固有阻害剤ロリプラムおよびおそらく他の近い類縁体による阻害に同様な立体選択性を示すと思われる。これは例えば、抗炎症または抗鬱などの新規な治療の開発に所望される可能性のある生体内のロリプラムの生物学的効果のいくつかと相関している。しかしながら、もっとも興味深くまた意外なことは、ＰＤＥ IVC遺伝子産生物だけが遺伝子注入した細胞からの抽出に続いてこのロリプラム立体選択性を維持するという本書の所見である。このようにこの酵素は試験管内分析におけるＰＤＥ IV阻害剤の特定の評価を有利に可能にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/16 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 ＡＢＥ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペリー，マーチン，ジョンイギリス，スルーエスエル１４イーエヌ，バスロード，216，セルテックセラピューティックスリミテッド（番地なし) (72)発明者ラム，サイモン，マークイギリス，スルーエスエル１４イーエヌ，バスロード，216，セルテックセラピューティックスリミテッド（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCまたは類縁体またはそれらの断片。２．添付の図2のアミノ酸配列（配列識別番号：32）を含む請求項1に記載の組み換えホスホジエステラーゼ、または類縁体またはそれらの断片。３．請求項1または2に記載のホスホジエステラーゼのＲ−およびＳ−ロリプラム立体選択性コンフォーマー。４．哺乳類または昆虫の細胞から得られる請求項3に記載のコンフォーマー。５．酵素のための基質を含む試験システム内で試験化合物と組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCを接触させる過程と、試験化合物の存在による酵素の作用の抑制を監視する過程とを含むヒトホスホジエステラーゼ型IVCの作用を抑制する化合物の選択のための方法。６．組み換えホスホジエステラーゼが添付の図2のアミノ酸配列（配列識別番号：32）または類縁体またはそれらの断片を含む請求項5に記載の方法。７．組み換えホスホジエステラーゼがＲ−およびS−ロリプラム立体選択性コンフォーマーである請求項5または6に記載の方法。８．請求項5から7の方法によって選択されたホスホジエステラーゼ型IVCイソフォーム選択性阻害剤。９．１つ以上の薬学的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤とともに請求項 8の阻害剤を含む医薬品組成物。１０．組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCを結合することのできる抗体。１１．組み換えヒトホスホジエステラーゼ型IVCのＲ−およびS−ロリプラム立体選択性コンフォーマーを結合することのできる請求項10に記載の抗体。１２．ヒトホスホジエステラーゼ型IVCを暗号付けする単離された核酸分子。１３．添付の図１に記載のヌクレオチド配列（配列識別番号：31）または類縁体またはそれらの断片を含む請求項12に記載の核酸。１４．請求項13に記載の核酸を含む、ヒトホスホジエステラーゼ型IVCの暗号付け遺伝子の非転写ＤＮＡまたは非転写ＲＮＡ。