JPH05505527A - タンパク質キナーゼが関連する悪性疾患の処置のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質キナーゼが関連する悪性疾患の処置のための方法及び組成物 且土圀団 本発明は一般的に、タンパク質チロシンキナーゼが関連する悪性疾患の処置のた めの方法において利用するための組成物に向けられている。より詳しくは、本発 明はタンパク質チロシンホスファターゼ又はこの酵素の突然変異型をコードする ＤＮＡ配列を用いた癌治療に関する。

主班（２）！ｌ 真人なる費用及び人件の投資にもかかわらず、癌は死の主たる原体細胞遺伝子の 突然変異が正常細胞から悪性細胞への形質転換をもたらす一般的な主たる事象と 考えられている。突然変異した遺伝子よりコードされるこの悪性表現型特性は、 細胞分裂の際に基づいてこの形質転換化細胞の子孫へと受け継がれる。形質転換 に関与するの相同性遺伝子は一般に癌遺伝子又はプロト−癌遺伝子と称されてい る。

多数の癌遺伝子ウィルスはタンパク質チロシンキナーゼをコードすることにより 作動すると考えられている。この酵素はタンパク質におけるチロシル残基のリン 酸化を触媒する。タンパク質におけるチロシル残基のリン酸化の状況の変化は癌 遺伝子の形質転換に関与すると考えられてきた。このタンパク質の基質の同−性 及びこのリン酸化が仲介する表現型の応答のメカニズムは明らかにすべきであり 続けている。

癌治療の開発の手法は一般に、正常と悪性の細胞との間での特徴の相違の利用に 向けられている。より詳しくは、正常と癌細胞との比較は、細胞膜の表層に滞在 している分子における形質転換依存性変化に向けられている。これらの分子には 糖脂質、タンパク質及び糖タンパク質が含まれる。ある分子は癌遺伝子の形質転 換に基づいて消失もしくは少なくとも減少し、そして他の分子は増大することが 分っている。この分野における進歩にもかかわらず、腫瘍関連細胞表層分子を標 的にすることによる癌細胞の処置は限られた結果に遭遇している。

癌治療に対する現状の手法における困難性に基づき、改善された方法及び組成物 が当業界において必要とされている。本発明はこの要望を満足せしめ、更にその 他の関連の利点を提供する。

主五■監！ 簡単に述べると、本発明は組成物であって、その利用性が、タンパク質チロシン キナーゼが悪性疾患に関連する温血動物における悪性疾患を処置するための方法 に含まれる組成物を提供する。ある観点において、本組成物は悪性細胞に感染す ることができる遺伝子搬送ビヒクルを含んで成り、ここでこの遺伝子搬送ビヒク ルは、レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮ Ａ分子を含んで成るＤＮＡ構造体を有する。ある態様において、このＤＮＡ分子 は省略された（　ｔｒｕｃａ　ｔｅｄ　）カルボキシル末端を有するレセプター 非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードする。他の態様において、 このＤＮＡ分子はレセプター非結合化タンパク譬チロシンホスファターゼをコー ドし、ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは２９７〜３２１個の間の アミノ酸残基のアミノ酸配列を含んで成り、そしてここでこのアミノ酸配列は図 少なくとも約８０％の類似性の部分を含んでいる。他の態様において、本組成物 は悪性細胞に感染できる遺伝子搬送ビヒクルを含んで成り、ここでこの遺伝子搬 送ビヒクルはレセプター結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードする ＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡ構造体を有する。ある態様において、このＤＮＡ 分子は省略されたカルボキシル末端を有するレセプター結合化タンパク質チロシ ンホスファターゼをコードする。両方の態様のだめの好ましい遺伝子搬送ビヒク ルは組換えレトロウィルス又は組換えワクチンウィルスを含む。

他の！！様において、本発明は省略されたカルボキシル末端を有するレセプター 非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードする種々の単離したＤＮＡ 分子を提供する。ある１！様において、このＤＮＡ分子はレセプター非結合化タ ンパク質チロシンホスファターゼをコードし、ここでこのタンパク質チロシンホ スファターゼは実質的に２９７〜３２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列より成 り、そしてここでこのアミノ酸配列は図１のアスパラギン（アミノ酸４２）から グルタミン酸（アミノ酸２７４）のアミノ酸配列と類似の長さ及び少なくとも約 ８０％の配列類似性を有する部分を含む。

他の態様において、このＤＮＡ分子はレセプター非結合化タンパク質チロシンキ ナーゼをコードし、ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは図１のメチ オニン（アミノ酸１）から、ロイシン（アミノ酸２９７）とアルギニン（アミノ 酸３１７）の間に位置するアミノ酸のアミノ酸配列より成る。関連の態様におい て、このＤＮＡ分子はレセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼを コードし、ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは実質的に図１のメチ オニン（アミノ酸１）から、アルギニン（アミノ酸３１７）のアミノ酸配列より 成る。他のＢ様において、このＤＮＡ分子はレセプター非結合化タンパク質チロ シンホスファターゼをコードし、ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼ 番よ実質的に図１のメチオニン（アミノ酸１）からグルタミン酸（アミノ酸３７ ６）とセリン（アミノ酸３９６）の間に位置するアミノ酸までのアミノ酸配列よ り成る。

本発明のこのような及びその他の態様は以下の詳細の説明及び添付図面を参照す ることにより明らかとなる。

凹皿■旦員仄脱所 図１は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｇｅ）をコードするヒト Ｔ細胞ｃＤＮＡのシーケンシング手法、ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列 を示す。このオーブンリーディングフレームの予測のアミノ酸配列はヌクレオチ ド配列の下に示した。このライブラリーをスクリーニングするために用し）たオ リゴヌクレオチド配列をドツトで示した［例えば、ヌクレオチド４２５と４７９ のに２つの考えられるポリアデニル化部位ＡＡＴＡＡＡを含む３′非翻訳端が続 く、垂直に向いた矢印は２３６−残基コアセグメントを区画する。ヌクレオチド 配列の下の図式は利用したシーケンシング手法を示す。白ヌキのバーはオープン リーディングフレーム；斜線のバーは３′非翻訳端である。水平の矢印は種々の シーケンシング用オリゴヌクレオチドプライマーから得た配列の長さを示す。Ｅ はＥｃｏＲＩ　；　Ｈは旧ｎｄｌＩ［；Ｓは５ｓｔＩ；ＸはＸｂａｌである。下 のスケールは２００ヌクレオチド（ｋｂｐで示す）を示している。

図２は、ＰＤＧＦ刺激後のホスホチロシン−免疫沈殿化タンパク質のウェスタン プロットの写真図である。ホスホチロシン−含有タンパク質及びＰＤＧＦ−刺激 化細胞は抗−ホスホチロシン抗体により免疫沈殿した。この沈殿したタンパク質 を分離するためにＳＤＳ／７，５％のラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）ゲルを用い、 プロントにおけるプローブとしてのこの抗−ホスホチロシン抗体によりウェスタ ンプロット分析にかけた。結合の検出は１２５Ｉ−ラベル化プロティンＡをａｓ ｅを発現する細胞；３はこの省略形態を発現する細胞である。４８ｈｒの血清− 奪取（ｓｅｒｕｍ−ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）に続＜ＰＤＣＦ刺激の時間を示す （０，２又は５分）、ｋＤａでの標準分子量マーカー（２００はミオシン；９２ はホスホリラーゼＢ；６９はウシ血清アルブミン；そして４６はオバルブミン） も示す。

図３はＴ−細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅにおけるカルボキシル末端領域の疎水性プロ ントを示す。Ｔ−細胞ＰＴＰａｓｅのカルボキシル−末端セグメントにおけるア ミノ酸残基３２６−４１５の疎水性値はにｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　（Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５７：　１０５　１３２．１９８２）に詳細の通り に決定した。コンピューター発生プロットをデフオールドウィンドウ７を用いて 得た。０値より上及び下の数字はそれぞれ疎水性及び親水性アミノ酸を示す；ｙ 軸における単位はＫｙ　ｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅに定義の通りである。プロッ トより上のバーは、残基３７７と３８１の間の予測のＡｒｇ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ 　−Ｌｙｓ−Ａｒｇ核認識シグナル（ＶａｎＥ　ｔ　ｔｅｎ　ら、堕旦　５８　 ：　６６９−６７８．１９８９　）　（斜線）及びこの分子のカルボキシル−末 端を示す疎水末端領域（３９６−４１５）　（斜線：１９個の残基を一文字コー ドで示す）である。

又ユ皇立史五主所 前記した通り、本発明はタンパク質チロシンキナーゼが関連する悪性疾患の処置 のための方法にその利用が含まれる組成物に向けられている。本発明の開示内容 はタンパク質チロシンホスファターゼをコードするヒトＤＮＡのトランスフェク ションによる悪性形質転換体の復帰を示す。

本発明のある１！様において、タンパク質チロシンキナーゼが関係する悪性疾患 は、悪性細胞が怒染できる遺伝子搬送ビヒクルによって処置されることができ、 ここでこの遺伝子搬送ビヒクルはタンパク質チロシンホスファターゼ又はこの酵 素の突然変異型をコードするＤＮＡ配列を含んで成る。この治療は温血動物、例 えばヒトにおいて見い出せる広範囲にわたる種々の悪性疾患に有用である。本発 明において、タンパク質チロシンホスファターゼ（このＤＮＡ配列は悪性細胞の 中に取り込まれる）によるチロシル残基の脱リン酸化要はない。

タンパク質チロシンホスファターゼ（’ＰＴＰａｓｅ　Ｊ　）　ヲコードする種 々のＤＮＡ配列が本発明において適する。このＤＮＡ配列はレセプター非結合化 ＰＴＰａｇｅ又はレセプター結合化ＰＴＰａｓｅをコードしうる。後者のタイプ のＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅは細胞表層レセプターの特徴を抱えるドメインを成す更な るアミノ酸配列を有する。レセプター非結合化Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅは典型的には 約ｓｏ、ｏｏｏ以下の分子量を有する。レセプター結合化ＰＴＰａｓｅは典型的 には高分子量、例えば１５０，０００−２５０．０００を有し、広範囲ニわたる 種々の外来性ドメインを示す。

本発明において有用なりＮＡ配列のある態様において、この配列は野性型（即ち 天然型）のＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅをコードする。野性型のレセプター非結合化ＰＴ ＰａｓｅＤＮＡの代表例は、ヒトＴ細胞ＰＴＰａｓｅについて図１において示す 配列である。他の例にはヒト胎盤のＰＴＰａｇｅをコードするＤＮＡ配列が含ま れる。野性型のレセプター結合化ＰＴＰａｓｅ　ＤＮＡの代表例はヒト白血球に おけるＣＤ４５をコードするＤＮＡ配列である。

他のＢ様において、本発明におけるＤＮＡ配列は省略されたカルボキシル末端を 有するＰＴＰａｓｅ　、即ち、野性型ＰＴＰａｇｅの配列におけるカルボキシル 末端に通常見い出せる又はその付近のアミノ酸残基が欠如しているものコードす る。本発明の開示内容は、省略されたＰＴＰａｓｅをコードするＤＮＡ配列の代 表例を提供する。このＤＮＡは標準の分子生物学技術を用いて、Ｔ細胞ＰＴＰａ ｓｅをコードするｃＤＮＡ（図１）のヌクレオチド配列を変えることにより作ら れる。

簡単に述べると、部位特異的突然変異誘発によって数個のヌクレオチドの欠失を 野性型ｃＤＮＡに導入する。この配列変更はｃＤＮＡのオーブンリーディングフ レームにおける早期翻訳停止シグナルの配備をもたらす、この改ｉｉ　ｃ　Ｄ　 Ｎ　ＡはＴ細胞において正常に生産される４８，０００の分子量のタンパク質に 対して省略されたカルボキシル末端を有するＰＴＰａｇｅ　（分子量約３７，０ ００）をコードする。この省略ＰＴＰａｓｅは図１のメチオニン（アミノ酸）か らアルギニン（アミノ酸３１７）のアミノ酸配列を有する。この省略ＰＴＰａｇ ｅを発現するトランスフェクトされた細胞により示される酵素活性はコントロー ル細胞における活性よりも高かった。

省略されたカルボキシル末端を有するＰＴＰａｓｅをコードする種々のＤＮＡ配 列が本発明において利用できることが当業者にとって明らかであろう。−所に、 得られるタンパク質がＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ活性の有意な低下を示さない限り、あ らゆる数のアミノ酸残基をこのカルボキシ末端から除去してよい。この省略Ｐ　 Ｔ　Ｐ　ａｓｅの酵素活性は、例えばラベル化基質から放出されるリポータ−基 の測定に基づくアッセイによって測定されうる。適切なアッセイには、以下に示 す、還元されたカルボキシアミドメチル化マレイル化−リゾチーム（ｃａｒｂ− ｘｙａｍｉｄｏ＋５ｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｍａｌｅｙｌａｔｅｄ−１ｙｓｏｚｙ ｍｅ）から放出させる３２Ｐのからアミノ酸２７４（グルタミン酸）のＴ細胞Ｐ 　Ｔ　Ｐ　ａｓｓにより量定される２６３−アミノ酸残基コアがある。例えば、 Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅと胎盤ＰＴＰａｓｅｌＢは、このコアの約６５％の配列同一 性及び約８０％の配列類似性を保有する（この２つの配列を適切に並べた後）。

Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの省略型は、このカルボキシル末端から始まり、そして２３ ６残基のコア迄遡るアミノ酸の削除により作られる。適切なりＮＡ配列は、２９ ７〜３２０のアミノ酸残基（これらを含む）の間のアミノ酸配列を含んで成るＰ 　Ｔ　Ｐ　ａｇｅをコードし、ここでこの配列は、この２３６−残基コアに対し て類似の長さであり、且つ約８０％の配列類似性を有する部分を含む。この配列 の部分は、同一の長さである必要はなく そしてこの２つの配列の整列を適切化するために、この配列をシフトさせること 及び／又はギヤングを挿入すること（その中に又は図１の配列の中に）が必要で ありうる。配列類似性は配列同一性及びアミノ酸の保存的置換に基づく、保存的 置換は、バリンとイソロイシン、ロイシンとイソロイシン、アスパルギン酸とグ ルタミン酸及びその他の類似な性質のもの同志の交換を含む、好ましいＤＮＡ配 列は、図１のメチオニン（アミノ酸１）から、ロイシン（これを含む）（アミノ 酸２９７）とアルギニン（アミノ酸３１７）の間に位置するアミノ酸までを含ん で成る省略Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅをコードする。

野性型又は省略Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅをコードする適切なりＮＡ配列の単離又は調 製に続き、この配列を遺伝子搬送ビヒクルに挿入する。適切な遺伝子搬送ビヒク ルには、組換えレトロウィルス又はｍ換えワクチンウィルスが含まれる。

レトロウィルスは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの作用を介して直ちに、Ｄ ＮＡを介して複製できるＲＮＡウィルスである。

ＤＮＡ型にあるとき、それらは宿主細胞ゲノムの中に安定的に組込まれ、そして 親細胞からその子孫へと受け継がれうる。従って、レトロウィルスは宿主細胞の 中への外来ＤＮＡのための搬送ビヒクルとして適切である（Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎ ｏ　ａｎｄ　Ｔｅｍ１ｎ　”Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔ−４ｏｕ ｓ　Ｐｒｏｇｅｎｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ａｆｔｅｒ　Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ ｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｔｈｙｍｉｄ−ｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｇｅｎｅ 　１ｎｔｏ　ＤＮＡ　ｏｆ　ａｎ　Ａｓ１ａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ、”Ｃｅ １ｌ　２６：６７−７７、１９８１を参照のこと；更に、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ 　ａｎｄ　Ｔｅｍ１ｒ＋＋　”Ｌｏｓｓｏｆ　Ｉｎｔｅｒｖｅｎｒｎｇ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｏｔｓｒｃ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｌｐｈａ−Ｇｌｏｂｉ ｎ　ＤＮＡＩｎ５ｅｒｔｅｄ　ｉｎ　ａｎ　Ｔｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｒｅｔｒｏ ｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒ、　”　Ｎａｔｕｒｅ　２９９　：２６５−２６８． １９８２を参照のこと；更に、Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｓｍａｎ、　”Ｉｍ ｐ−ｒｏｖｅｄ　ｌ？ｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ＶｅｃｔｏｒＳｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　 Ｔｒａｎｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　’Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉ　 ｕｅｓ　ユニ９８０−９９０．１９８９を参照のこと）。

このレトロウィルス搬送ビヒクルが複製可能であるとき、得られる活性ウィルス は治療目的に適当でなく、その理由はこれも複製可能であり、従って健康を害す ることを示すからである。ところで、復製可能でない、外来ＤＮＡを含むレトロ ウィルスを提供できるレトロウィルス搬送ビヒクルをデザインするための種々の 方法が利用できる（米国特許第４，６５０．７５４号（Ｔｅ＋ｗｉｎら）、第４ ，８６１，７１９号（Ｍｉｌｌｅｒ）　、第４．４０５，７１２号（Ｖａｎ　ｄ ｅ　Ｗｏｕｄｅら）及び第４．８８５，２３８号（Ｒｅｄｄｅｌら）を参照のこ と。これは本明細書に参考として組入れる。更にＪａｃｏｂら、ヨーロッパ特許 出願公開番号、第０．１７８，２２０号、ヨーロッパ特許出願公開番号第０．２ ４３，２０４号、ＰＣＴ国際公開番号Ｗ　Ｏ８５１０５６２９号、ＰＣＴ国際公 開番号Ｗ　Ｏ１０３４５１号、ＰＣＴ国際公開番号８９１０７１５０号及びＰＣ Ｔ国際公開番号Ｗ　Ｏ８９１０９２７１号も参照のこと）、ネズミサルコマウィ ルス（ＭＳＶ）及びモロニーネズミ白血病ウィルスは（ＭｏＭＬＶ　）を含む、 種々のレトロウィルスが本発明において利用できる。更に、エンベロープ配列は 両性ウィルス、例えばウィルス４０７０Ａに由来しうろことが当業者にとって明 らかであろう。

簡単に述べると、本発明の一つの態様において、レトロウィルスのｅｎｖｉｊ域 における約３５０のヌクレオチド（Ｓｈａｎｋ　ａｎｄ　Ｌｉｎ１ａｌ。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６　（２）　：　４５０−４５６．１９８０）の欠失を 含むモロニーネズミ白血病ウィルスの突然変異体を作製した。これは、ウィルス ＲＮＡのカプセル化又はパッケージングにおいて欠陥を有するウィルス（ｇａｇ ”、　ｐａｌ”、　ｅｎｖ→を提供し、これは、所望の外来遺伝子を含むカプセ ル化陽性レトロウィルスベクターＣｇａｇ“＋　ｐｏｌ−、ｅｎｖっと一緒にト ランスフェクトせしめたとき、この外来遺伝子を提供し続けるが複製が可能でな いレトロウィルスの生産をもたらす（Ｔｅｓｉｎら、米国特許第４．６５０．７ ６４号を参照のこと）。

しかしながら、ｇａｇ−＋　Ｉ’ＯＩ−＋　ｅｎｖ”ベクターとｇａｇ”　＋　 ｐｏｌ”　。

ｅｎｖ−ベクター間の組換えの可能性が残っている。従って、外来遺伝子のため の安全な搬送ビヒクルである組換えレトロウィルスベクターをデザインスするこ とが特に好ましい、簡単には、このレトロウィルスゲノム又はプロウィルスは、 プロモーター、翻訳及び終止シグナル、並びにエンハンサ−を含む、レトロウィ ルス転写の開始及び終止に関する配列をコードする２種の長い末端反復（Ｌｏｎ ｇ　Ｔｅｒ…１ｎａｌＲｅｐｅａｔｓ）　（Ｌ　Ｔ　Ｒ）を含む。このＬＴＲは ３つの領域：Ｕ３．Ｒ及びＣ５を有する。好ましい態様において、ＬＴＲの右側 のこのＵ３領域（プロモーター及びエンハンサ−セグメントを含んでいる）は欠 失され、自己−不活性化であるレトロうイルスベクターがもたらされるＣＹｕ　 ら、”Ｓｅｌｆ−Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔ ｏｒｓ　Ｄｅｓ−ｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　Ｗｈｏｌａ　Ｇｅｎｅｓ　Ｉｎｔｏ　Ｍ ａ＋＋ｎａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：３１９４　３１９８．　１９８６；Ｍａ ｒｋｏｗｉｔｚ　ら、”Ａ　ＳａｆｅＰａｃｋａｇｉｎｇ　Ｌｉｎｅ　ｆｏｒ　 Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　：　Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　Ｖｉｒａｌ　Ｇｅｎ ｅｓ　ｏｎＴｗｏ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ、　”　Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　（６２）　：　１１２０−１１２４．１９８８を参照のこと）。この ベクター（プロモーター及び外来遺伝子を含む、即ち、Ｕ３．Ｒ，Ｃ５−・−・ ・プロモーター、遺伝子、Ｕ３（欠）、Ｒ，Ｃ５）をヘルパー細胞のトランスフ ェクトのために用いる。

ウィルス転写はＲで始まるＬＴＲの左側から出発し、そしてＵ　Ｓ　ｅＩ域の左 側も右側も含まない配列（即ち、Ｒ，０５・・・−プロモーター。

遺伝子−−−−−、Ｕ　３　（欠）、Ｒ）を転写する。従って、このレトロウィ ルスは自己不活性化であるが、にもがかわらず、内部プロモーターを含むため、 外来ＤＮＡの転写を可能とする。

ワクチンウィルスは宿主細胞の細胞質において完全に再生する真核ＤＮＡウィル スである。このウィルスは庖遺に対する種痘のためのワクチンにおいて約２００ 年間にわたって用いられている。このウィルスは非癌遺伝子であり且つ比較的温 和であると考えられている。天然のワクチンゲノムは組換えワクチンを作るため に、天然ゲノムの転位により、ゲノムからのＤＮＡの除去により、及び／又はゲ ノムの中への外来ＤＮＡの導入により、改質されうる（米国特許第４，７６９， ３３０号及び第４，８８６，７８２号を参照のこと。これらは本明細書に参考と して組入た）。従って、組換えワクチンウィルスは、真核細胞にＰＴＰａｓｅを コードするＤＮＡ配列を導入するための、本発明における有用な比較的無害な真 核細胞クローニングヘクターを提供する。

以下の実施例は例示であって限定ではない目的のために提供する。

実施例 実施例１ ヒトＴ細胞タンパク質−チロジン−ホスファターゼの作製全ての制限及び改質酵 素並びに試験管内の転写及び翻訳システムは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　 Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａより購入した。オリゴヌクレオチドはＡｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋＊ｓ　３８０Ａ　ＤＮＡ　シンセサイザー（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｙｏｓｙｓｔｓｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉ ｆ　）により合成した。

放射性ヌクレオチドはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　（Ｂｏｓｔｏ ｎ＋　Ｍａｓｓ、）より入手した。シーケナーゼはＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　（Ｃ１ｅｖｅｌａ−ｎｄ＋　０ｈｉｏ）より入手し た。溶液、例えばデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ）溶液はＭａｎｉａｔｉｓ　 ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ＋　Ｎ、Ｙ、　１９８２に詳細の通りに調製した。

相補性の重複オリゴヌクレオチドのセットをそれぞれ、Ｌ、　Ｃｈａｒ−ｂｏｎ ｎｅａｕ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６ 　：　５２５２−５６．１９８９の方法に従い、ヒト胎盤ＰＴＰａｇｅｌＢ由来 のタンパク質セグメントＬｙｓ　−１２０−Ａｓｎ−１３９及びＧｌｙ　２０９ −Ｐｈｅ−２２５のために合成した。ＤＮＡ配列の推定は、ヒトアミノ酸配列デ ータについての最通コドン選択に基づ＜　（Ｒ，Ｌａｔｈｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１． 　Ｂｉｏｌ、　１８３　：　ｌ　−１２゜１９８５を参照のこと）。

七ソ）　１　（５’　−ＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＡＧＴＡＣＴＧＧＣＣＧＣＡＧＡ ＡＧＧＡＡ−３’及び５　’　−ＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴ ＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴ（：ＣＴＴＣＴＧＣ−３’　）　、又はセント２　（ ５’　−ＧＧＴ（：ＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧ（１：ＡＧＴＧＣＴＧＧ Ｔ−３’及び５　’　−ＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧＴＧ　ＣＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧ ＣＡＣＴＧ−３”）におけるヌクレオチドを、”ＰｄＡＴＰ及び”ＰｄＣＴＰ並 びにＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを用いてアニール及びラベル し、４　ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｐｓ／ｐｓｏｌ　ｂｐを比活性を有する放射活性二本 鎖ＤＮＡを作った。

ｓｏｏ、ｏｏｏ個のファージを含むλｇｔ　１０組換えｃＤＮＡファージライブ ラリーを、Ｌｉｔｔｍａｎ　ら、Ｃｅ１ｌ　４０：　２３７−４６．１９８５の 方法に従ってヒト末梢Ｔ細胞ポリ　（Ａ）°から作り、そしてプレート当りｓｏ 、ｏｏｏファージの密度にて平板培養した。各プレートから二重でニトロセルロ ースフィルターリフトを取り、そして２０％のホルムアミド１５ｘの５ＳＣ（ｌ ｘのＳＳＣは１５０ｍＭのＮａＣｌ／　１５　ｍＭのクエン酸ナトリウムである ）／２．５ｘのデンハーツ溶液／１ｍＭのビロリン酸ナトリウム１５０ｍＭのリ ン酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ６，８中において前記の通りに調製したオリゴヌク レオチドプローブ（フィルター当り２．５Ｘ１０”ｃｐ＋＊　）と、３７°Ｃで １８時間ハイブリダイズした。このフィルターを２ｘのＳ　Ｓ　Ｃ１０，２％の ＳＤＳ中で４２°Ｃで洗い、そして増強スクリーンを伴い、−７０°Ｃで３日間 オートラジオグラフィーにかけた。

あらゆる組換えファージが各プローブとハイブリダイズする力（、重複陽性クロ ーンのみが両方のオリゴヌクレオチドと結合する。

Ｂ、旦Ｘ人配五光梶 約１０Ｉ０個のＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞を上記で選別した組換えファー ジによって感染せしめ、そしてアルカリ法Ｃ３ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ１１第２版、 −Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ＋ 頁１．２５−１．２８．１９８８を参照のこと）により溶解した。この増幅ファ ージをＣｓＣ１密度遠心により精製した。

精製したファージ由来のＤＮＡを抽出し、そしてＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア ーゼにより消化した。ＥｃｏＲ［フラグメントをアガロースゲル電気泳動によっ て分析し、これは２種類のＤＮＡフラグメント（３２及び１ｌｋｂ）及び長さに おいて２．３キロヘースペア−（ｋｂｐ）のクローン化ｃＤＮＡフラグメントを 分解した。

２．３ｋｂのＥｃｏＲＩインカートｌｏｏｎｇ及びブルースクリプト（Ｂｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ）クローニングヘクター１００　ｎｇ　（Ｓｔｒａｔａｇｎｅ、　 Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

Ｃａ１ｉｆ）をＥｃｏＲＩにより切断しくその部位はβ−ガラクトシターゼ遺伝 子内にある）　、５０　ｍＭ（Ｄト’）ス（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ（７）１ １ｇＣ，，１０−Ｍのジチオスレイトール及び２　ｍＭのＡＴＰを含む反応混合 物中でリゲートさせ、そしてエッシュリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒ−ｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｔ）宿主（ＸＬ−Ｂｌｕｅ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換せし めた。

白色のコロニー（ｃＤＮＡインサートを含む）を選び、そしてプラスミドＤＮＡ のミニプレデを調製し、次いでインサートの存在を確認するためにアガロースゲ ル上に流した。このインサートを含む細胞を選別し、そしてＬ　Ｂ　（Ｌｕｒｉ ａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記、ρＡ、　１を参照のこ と）中で１２時間増殖させた。アルカリ法により細胞を溶解させ、そして閉環し たプラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＣｓＣ１遠心により精製した。

精製したＤＮＡを、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−６４６７、１９７７）の鎖−停止方法に従う図 １において図示する手法を利用してシーケンス化した。簡単に述べると、シーケ ンシング反応はデオキシ（”ＰｄＡＴＰを含む）とジデオキシヌクレオチドの混 合物を含む。シーケンス化するＤＮＡを煮沸によって変性させ、そしてクローニ ング部位に隣接するｃＤＮＡ又はベクター配列における精密な配列を認識する１ ８−ｍｅｒの一零値プライマーとアニールさせる。このＤＮＡはシーケンシング キット（ｔｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃ−ｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ、 、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ）に備っているシーケナーゼ酵素を用いて のプライミング部位がらコピーした。デオキシとジデオキシヌクレオチドの正確 な比率は、その供給者により決定されており、そしてそれに従って利用した。

配列分析（図１）は、Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅ　ｃＤＮＡが１３０５ヌクレオチドの オープンリーディングフレームを含むことを示している。

真核系開始部位に関する共通配列ＣＣ（ＡＧ）ＣＣＡＵＧ（Ｇ）　（にｏｚａｋ 、担匹上恒工Ａｃ１ｄｓ−力やエ　１２：　８５７−８７３．１９８４に詳細） は、推定開始メチオニンをコードするヌクレオチド５６−６４に見い出せる。こ のオーブンリーディングフレームは、９７８ｂｐの３′非翻訳端が続＜ＴＡＡ停 止コドンで終結する。しかしながら、ポリアデニル化部位も３′ポリ（Ａ）°テ ールも見られなかった。停止コドンを超えて２１３及び３６９ｂｐの部位（それ ぞれヌクレオチド１５２１−１５２６及び１６７７−１６８２　）に２つの可能 性のあるＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナル（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　ａｎｄ　 Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　２６５　：　２１１−２１４．１９７６を 参照のこと）がある。

Ｃ，Ｔ−ＰＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡの−量Ｔ細胞ｃＤＮＡを含むブルースクリプト プラスミドをＨｉｎｄ　［１制限エンドヌクレアーゼ消化により線状にした。ｍ ＲＮＡを１μｇのプライミングＤＮＡより試験管内において、ブルースクリプト クローニングベクターにおけるＴ細胞ＰＴＰａｓｅ　ｃＤＮＡインサートに対し て５′側に位置するＴ７ボリメラーゼプロモーターを用いて合成した。ｍＲＮＡ の合成はＤＮＡ、ＲＮＡに必要なヌクレオチド３リン酸、緩衝液及びＴ７ボリメ ラーゼ（全ての試薬はＳ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅより供給）の存在下において行 った。３７℃で１時間の合成の後、このＤＮＡをＤ　Ｎ　Ａａｓｅ　Ｉ　（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）により分解し、そしてそのタンパク質はプロテイナーゼＫ　 （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により６８°Ｃで１時間消化した。次にＲＮＡをフェ ノール：クロロホルム（１：　１）で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。こ の５ＲＮＡ　（ｌ　ｔｌｇ　）を、３５３メチオニンの存在下において２０μｌ のウサギ鋼状赤血球翻訳系に加え、そしてタンパク質合成を３０分間進行させた 。コントロールの反応混合物は線状ベクターから作った＋＊ＲＮＡを含ませた。

この生成物をＬａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５． １９７０　）の方法に従う１０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し 、そして１８時間オートラジオグラフィーにかけた。Ｍｒが４８　、０００と評 価されたタンパク質生成物が生成された。

Ｄ、ノーザンプロ・ト 全ＲＮＡを、サルの脳、肺臓及び胸腺からＣａｔｈａｌａら、ＤＮＡ　２　：３ ２９−３３５．１９８３の方法に従って抽出し、ヒトＲＮＡは胎盤及びＴ細胞か ら抽出した。ポリ（Ａ）′″　−ＲＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ　ら、前記、Ｐ２Ｓ ５の方法に従ってオリゴ（ｄＴ）カラムクロマトグラフィーによって精製した。

脳、膵臓、胸腺及び胎盤からのポリ（Ａ）＋ｗＲＮＡ（１０％ｇ）並びに２０　 ｕｇの全Ｔ細胞ｍＲＮＡを０．８％のホルムアルデヒドアガロースゲルにおいて 電気泳動にかけ、そ乙てニトロセルロースフィルター紙に、Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ら、前記、ｐ２０３に詳細の拡散法によって移した。ＲＮＡを含むこのフィルタ ー（ノーザンプロット）をハイブリダイズし、そして変性させた。Ｔ細胞クロー ンから精製した３ｚｐ−ラベル化ｃＤＮＡインサートをプローブとして用いた。

このハイブリダイゼーション条件はライブラリーのスクリーニングに関して詳細 したものと同しであるが、但しこのプロットは０．１ｘの５ＳＣ１０，２％のＳ ＤＳ中で５０°Ｃにて洗った。

このゲルをフィルムに、増強フィルターを用いて一７０°Ｃで３日間暴露せしめ た。

プロットの分析は複数のハイブリダイゼーションのバンドを示した。最も豊富な 転写体（〜２．３ｋｂ）は前記の組織全てにおいて見い出せたが、脳における発 現のレヘルは比較的低かった。胸腺ポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡのＴ細胞全ｍＲＮＡ との比較は、少す＜トも２０倍豊富な転写体を示した。アガロースゲルにおいて 正確な長さのが決定できなかった主たるメンセージは、Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅ　ｃ ＤＮＡを表わすものと考えられ、その理由はこの転写体の予測の長さは２０〇− 塩基のポリ（Ａ）°テールを含んで少なくとも２．５ＫＤであるからである（Ｐ ｅｒｒｙ、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、旦：　６０５−６２９゜１ ９７６を参照のこと）。

Ｅ、サザンブロ・ト ヒトゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａｇ　ＨＩ、　ＥｃｏＲＩ及びＨ ｉｎｄ　ｍにより切断した。このフラグメントを０，８％のアガロースゲルで分 け、そして拡散によってニトロセルロースフィルター紙に移した（　Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　、前記を参照のこと）。ＤＮＡを含むフィルター（サザンプロント）を Ｔ細胞ｃＤＮＡの変性３Ｚｐ−ラベル化インサートはハイブリダイズさせ、そし てこれをノーザンブロント分析に詳細の通りに洗い、そして増強スクリーンを用 い一７０゛Ｃで３０日間オートラジオグラフィーにかけた。このフ゛ロットのオ ートラジオグラフィーは複数のハイプダイゼーションのバンドを示し、この遺伝 子が非常に大きいか（＞７０ｋｂｐ；多数のイントロンを有する）又はこの種に おいて複数の遺伝子があることを示唆した。次にこれを前記と同じハイブリダイ ゼーション条件を用いてラベル化ｃＤＮＡと再プローブし、但しより弱い緊張条 件、例えば２ｘの５ＳＣ１０，２％のＳＤＳで４５°Ｃのもとで洗った。新たな ハイブリダイゼーションのバンドは検出されなかった。

Ｆ、ブースミドへのヒトＴ　ＰＴＰａｓｅクローンのＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　 ｍフラグメント（１，３２８ｋｂｐ　）を上記によって得たヒトＴ細胞ｃＤＮＡ 　ＰＴＰａｓｅクローンから単離した。このフラグメントはＰＴＰａｓｅ　ｃＤ ＮＡのコード領域全体を表わす；５′非翻訳領域から６０ｐ、ｂ、及び３′非翻 訳領域から２２ｂ、ｐ、を含む。

この制限酵素により作った一本鎖の末端をヌクレアーゼＳ１消化によって除去し た。

ＤＮＡインサートを発現させるのに適切な、ｐＭ　Ｇ　Ｆ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ 、　Ｎ、Ｊ、）及びｐＮｕｔ　（Ｒ４ｃｈａｒｄＰａ１ｍｉｔｅｒ＋　ワシント ン大学より入手；　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒら、釦旦　５０　：　４３５−４３３．１ ９８７を参照のこと）を含む、多数のプラスミド構造体−が当業者に知られてい る。このｐＮｕ　を発現ヘクターをＳｓ＋ａ　Ｉにより切断し、そしてアガロー スゲル上に流した。５．５　ｋｂｐのフラグメン・トをこのアガロースゲルから 、緩衝液へのＤＮＡの電気溶離によって単離した。このフラグメントはサルのウ ィルス４０　（ＳＶ４０）プロモーター及びＺｎ”メタルオチロネイン（ｍｅｔ ａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ）　１プロモーター（これは新たに挿入したｃＤＮ Ａの生体内転写のために必要）の調節下にあるジヒドロホレートリダクターゼを コードする。このプラスミドｐＮＵＴ、ＴｃＰＴＰは、１．３ｋｂｐのＴ細胞Ｐ ＴＰａｓｅｃＤＮＡフラグメントとＳｅａ　Ｉ　ｐＮｔｌＴベクターフラグメン トとリゲートさせることにより作った。

実施例２ Ｔ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの省略型の作製ＰＴＰａｓｅ　ｃＤＮＡの突然変異誘 発は、Ｋｕｎｋｅ　ｌら、”Ｒａｐｉｄ　ａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔ　５ｉｔｅ −５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｐｈｅｎｏｔ ｙｐｉｃ　５ｅｌ−ｅｃｔｉｏｎ、”Ｍｅｔｈ＋可ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ Ｕ−”１５４　：　３６７−３８２．１９８７の方法に従って行った。簡単に述 べると、２．３　ｋｂｐのｃＤＮＡ　ＥｃｏＲＩインサートをＭ１３ｎ＋ｐ１８ ヘクターのＥｃｏＲＩ部位にリゲートさせる。

リゲートしたＤＮＡをＥ、コリ宿主に形質転換せしめ、そしてＭ１３ファージプ ラークをアガロースプレート上に作る。これらのファージプラークのＤＮＡは一 本鎖であり、そしてＤＮＡシーケンシングのため、又は部位特異的突然変異誘発 のために利用できる。特に、このＤＮＡを精製（Ｓａｎｇｅｒ、前記を参照のこ と）し、そしてオリゴヌクレオチド５　’　−ＧＧＧ　ＡＡＣＡＧＡ　ＴＡＧ　 ＡＡＧ　ＡＡＧ　−３’　とハイブリダイズさせる。このオリゴヌクレオチドは Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ＡＤＮＡシンセサイザーにより 合成し、そしてこれは野生型ｃＤＮＡにおける７個の塩基の欠失を伴うヌクレオ チド１００４−１０２５を表わし、翻訳オーブンリーディングフレームへの停止 コドン（ＴＡＧ）の配備をもたらす。プライムせしめた一本鎖Ｍ１３　ＤＮＡを 二本鎖ＤＮＡを作るための鋳型として用い、その一方はこの欠失を有していた。

この新たに合成したヘテロダイマー二本鎖ＤＮＡをＥ、コリ宿主に形質転換し、 そしてアガロースプレート上で平板培養し、Ｍ１３組換ファージの増殖を行った 。欠失を有するＭ１３ファージを３２ｐ−ラベル化オリゴヌクレオチドとのｉｎ 　５ｉｔｕ　プラークフィルターハイブリダイゼーション（Ｗｏｏｄ　ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：　１５８５−１５ ８８．１９８５）　、それに続＜６ｘのＳＳＣにより４８°Ｃでの洗浄により選 別した。１，６ｋｂｐのフラグメントが、突然変異Ｍ１３プラスミドＤＮＡのＴ ｈｅＩ及び５ｓｐｌ制限酵素消化に基づいて作られた。このフラグメントを単離 し、そしてｐＮＵＴ発現ヘクターのＳｎ＋ａ１部位の中に挿入した。全てのプラ スミド構造体をＳａｎｇｅｒら（前記）の鎖停止方法を用いるＤＮＡ配列分析に よって評価した。

実施例３ ＰＴＰａｓｅアッセイ 細胞抽出物又は精製酵素を、ラベル化基質からのｆｆ！ｐの放出の測定に基づく 、Ｔｏｎｋｓ　らの“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　−ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ　ｏｆ　Ｈｕ ＋ｓａｎ　Ｐｌａｃｅｎｔａ”　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ。

（２３６）　：　６７２２−６７３０．１９８８に詳細の方法を用い、チロシン ホスファターゼについてアンセイした。還元したカルボキシアミドメチル化マレ イル化（ＲＯＭ）−リゾチームのリン酸化は計算値でないため、濃度はｘｔｐホ スホチロシンで表現した。簡単に述べると、０．０２ｍ１のＰＴＰａｓｅ（ｌｉ Ｉ衝Ａに１ユニット／ｍｌ以下に希釈）及び０．０２ｍ１の緩衝液Ｂを３０°Ｃ で５分間温めた。ｉ衝液Ａは２５ｗＭのイミダゾールＨＣＩ　（ｐＨ７，２）　 、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカブトコタノールより 成る。反応は３０°Ｃで既にプリインキュベートせしめた”　Ｐ−ＴｙｒＲＣＭ リゾチーム（最終濃５μＭ）０．０２ｍ１の添加により開始した。この反応を約 １０分後に、２０％（Ｗ／Ｖ）のトリクロロ酢酸の０．１８ｍ１と２５ｍｇ／ｍ ｌのＢＳＡＯ，０２ｍ１（担体タンパク質として加えた）の添加により停止させ た。この懸濁物を混合し、氷上に１０分間放置し、そして１２．５００×ｇで３ 分間遠心した。小分けしたこの上清液０．２■ｌをアクアゾールシンチラント（ Ａｑｕａｓｏｌ　５ｃｔｎｔｉｌｌａｎｔ）　１ｅｌに加え、そしてＢｅｃｋ＋ ｇａｎ　ＬＳ　７０００　シンチレーションカウンターにおいてカウントした。

脱リン酸化は時間及び酵素濃度に比例する。最大５０％の３ｔＰが放出された。

ブランクのインキュベーションは、ＰＴＰａｓｅを緩衝液Ａで代替して行い、そ して全３！Ｐは０．０２＋＊ｌの基質をカウントすることにより決定した。ブラ ンクにおける放射活性は常にこのアッセイにおける全：＋ｚｐの２％以下であっ た。放出されたｆｆＺｐは、Ｆｏｕｌｋｅｓ　ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１３０ 　：１９７−２００．１９８１のモリプデート／イソブチルアルコール／ヘンゼ ン抽出工程により、放射性ペプチドではなく、無機リン酸でることが確認された 。１ユニツトのＰＴＰａｓｅ活性は、１分間当りに１０繻Ｏ１のリン酸塩を放出 する量として定義した。

トリプシンを必要とするアッセイに関し、２０μｌの細胞抽出物を緩衝液中で１ ：２に希釈し、そして１ｌｇのトリプシンで５分間、３０°Ｃで処理した。トリ プシン消化は６μｇのリマ豆トリプシンインヒビターを加えることにより停止さ せ、その後直ちに２０μｍの基質を加えた。

実施例４ 抗ペプチド血清の調製 ペプチドＣＮＲＮＲＹＲＤＶＳＰＦＤＨＳＲＩＫ　（−文字アミノ酸コートを参 照すること）を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチドシンセサイザ ー（Ａｐ９１ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｓｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ ｈｆ）において合成した。この配列はアミノ酸末’４８１域に由来する（胎盤Ｐ ＴＰａｓｅｌＢ酵素の残基Ａｓｎ４３〜Ｌｙｓ６０　）　（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅ ａｕらＰｒｏｔ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６　：　５２ ５２−５２５６．１９８６を参照のこと）、このペプチドは担体タンパク質とし てのウサギ血清アルブミンへの架橋を促進せしめる更なるソスティン残基を含む 。ポリクローナル抗体は、常用技術を用いるウサギの免疫化、その後のこの血清 の回収により得た。この血清をアフィニティー精製するか、又はセルロースＡｆ ｆｉ　−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ／ＤＥ５２カラム（１：１に混合）上に載せ、そして ２０５ＭのトリスｐＨ８，０，２０ｍＭのＮａＣ１で溶出させた。両分を集め、 そしてタンパク質について分析した。この抗体は、２個のアミノ酸の置換がその ドメインにおいて見い出されたにもがかわらず（Ｐｈｅ　−５２に対するチロシ ン及びｌ１ｅ−５７に対するバリン）、Ｔ細胞酵素を認識した。Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａ ｓｅに対する抗体の特異性はペプチド競合実験により評価した。

実施例５ 野性型及び省略されているＴ−細胞ＰＴＰａｓｅの発現Ａ、旦且に！開 赤ん坊のハムスターの腎１ｍ（ＢＨＫ）細胞を、１０％（容量／容り熱不活性化 仔牛血清を含む、ダルベツコの改良イーグル培地の中で通常に増殖させた。この 細胞を、Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅ　ＤＮＡ又は省略されたＴ細胞ＰＴＰａｓｅ　ＤＮ Ａのいづれかを含む１０μｇのｐＮｕ　ｔプラスミドにより、リン酸カルシウム 沈殿法（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１６　：　７７２　７８５．１９７４　） を利用してトランスフェクトせしめ、そして２４時間、２５０μ門のメトトレキ セートを含む選択培地に移した。

集密した安定的にトランスフェクトされた細胞を８０μ門のＺｎＳＯ４によって １２時間処理し、メタロチオニンプロモーターを介するＲＮＡにおけるＰＴＰａ ｓｅの転写を誘発させた。このプレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗 い、そして細胞をかき出した。この細胞を低速遠心（５００％ｇ）で５分間によ りベレット化し、そしてこのベレットを低塩緩衝液（ＬＳＢ）（２５ｓＭのイミ ノダゾール（ｐＨ７，Ｏ）、２　ｓＭのＭｇＣＬｚ、■−ＭのＥＤＴ＾、ｌ−Ｍ のＥＧＴＡ　、０．１％のβ−メルカプトエタノールＰＭＳＦ、０．］、ｓ＋Ｍ のベンザミジン、１ｌｇ／ｍｌのロイペプチン、２５０ｍＭのスクロースＬ　Ｌ ＳＢ−）リドンＸ−　１　０　０ｗｌ衝液（ＬＳＢ及び０．５％のトリトンＸ− ｔｏｏ）、又はＫＣＬ／ＣＨＡＰＳ暖衝液（ＫＣＢ）（ＬＳＢと同じであるが、 但しスクロースを含まず、０．６ＭのＫＣＬ，１．０％のＣＨＡＰＳを含む）の いづれかにおいて溶解せしめた。このホモシアート品をテフロン（商標）ホモジ ナイザーにより３０分間処理し、次いで５，０００％ｇで５分間遠心し、低速遠 心ベレット（’５ＰＪ）を得た。この上清液を１００，０００×ｇで４°Ｃにて ３０分間再び遠心し、高速遠心上清液（　ｒｌｏＯｓ　Ｊ　）及びペレット（　 ｒｌｏｏ　ＰＪ　）を得た。

ＰＴＰａｓｅアッセイ（実施例３に詳細の通り）を種々の両分（表１）において 行った。

表　１ ＢＨＫ細胞におけるＰ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性ＢＨＫ細胞を詳細の通りに分画した （５Ｐ，１００Ｐ又は１００Ｓ画分）。このＰＴＰａｓｅは、コントロールプラ スミド（コントロール）又は全長４Ｂ−ｋＤａＴ−細胞ＰＴＰａｓｅ　（ＴＣ， 　ＰＴＰａｓｅ）もしくは省略型（ＴＣΔＣ　ｌ　１．　ＰＴＰａｓｅ　）のＤ ＮＡのいづれかを発現する細胞において測定した。全活性ユニットは、各画分に おける一定量のタンパク質として標準化せしめた。記号「−」又は「＋」はそれ ぞれ、アッセイにおいて１ｌｇのトリプシンを伴わないか又は伴うアッセイを示 す。「％全ユニット」は各両分において見い出せる全細胞活性のパーセンテージ を表わす。

実質的に全ての内因性及び発現したＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅ活性（全長４８−ｋＤａ ヒトＴ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅを発現するＢＨＫ細胞の）は、５Ｐペレツトと一 緒に沈降下し、それらは０．５％のトリシンＸ−１００１０、６ｍＫＣＬによっ て放出されることができた。トリトン単独では部分的に有効であるのみであり、 そして高速遠心での塩類のみでは全体的に無効であった．１００Ｐペレツトにお いて見い出された低いレベルの活性及びタンパク質についてはこれ以上考察しな かった。

トランスフェクトされた細胞における酵素のレベルがはじめ、このコントロール におけるそれよりもそれほど高（なかったにもかかわらず、一定のトリプシン処 理に基づいてかなり上昇した（コントロール及びトランスフェクト細胞に関して それぞれ、５ｅ画分において６−及び２〇−倍）、このような条件のもとで、ト ランスフェクト細胞における全活性はコントロールにおけるそれよりも１０倍高 かった。

０、５％のトリトンｘ−ｉｏｏ抽出物をスペローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２ 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲル濾過にかけた。

コントロール及びトランスフェクト細胞の両方において、このＰ　Ｔ　Ｐ　ａｓ ｓ活性は高分子量（＞６　５　０　ｋＤａ　）画分において現れた。

ＣＣＬｘＣＯＯＨ沈殴及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ後のこの物質のウェスタンブロンド 分析は、４Ｂ−ｋＤａの免疫反応性タンパク質の存在を示した。類似の結果が、 この細胞を１％の３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１− プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）１０．６　ＭのＫＣＬ中で抽出し、その後 、ゲル濾過の前に低−塩緩衝液に対して透析することによって界面活性剤を除去 した場合にも得られ、この高分子量複合体の形成が界面活性剤の存在に基づいて いないことを示唆した。

このトリトン−溶解性抽出物をゲル濾過の前にトリプシンにより処理すると、Ｐ ＴＰａｇｅは見かけ上約３５ｋＤａの分子量で溶出した。ウェスタンプロット分 析も約３３ｋＤａでバンドを示し、このカルボキシル末端にて切断が生じている ことを示唆し、なぜなら用いた抗体はこの酵素のアミン末端付近の配列を認識す るからである。

コントロール細胞由来の抽出物の予備トリプシン処理も、低分子量タンパク質を 含む両分において溶出した新たな活性のピークをもたらした。以上のデーターは 、トリプシン処理によるこの酵素からのカルボキシル−末端セグメントの除去は 水溶性の、低分子量の構成的活性酵素をもたらすことを示唆する。

カルボキシル末端より１１　ｋＤａのセグメントが欠失している省略されている ＰＴＰａｓｅを発現するＢＨＫ細胞（ＴＣΔＣ１１゜ＰＴＰａｓｅ−）ランスフ エクト化細胞）の抽出物を前記の通りに分画し、そしてトリプシン前処理せずに アッセイしたとき、約５０％のＰＴＰａｓｅ活性のみが５Ｐ画分と一緒に沈降し 、そして残りは１００Ｓ上清液にあった（表１）。しかしながら、５Ｐベレント に存在する酵素はトリプシン処理なしで完全に活性であり、そして０．５％のト リトンＸ−１００又は０．６ＭのＫＣＬのいづれかによって抽出されることがで き、これは全長ＰＴＰａｓｅはど特定の画分に強く結びついていないことを示唆 する。この省略酵素を発現する細胞における全ホスファターゼ活性はコントロー ルにおけるそれと同じであったが、１００Ｓ画分においては異なり、８倍高かっ た。この省略ＰＴＰａｇｅを発現するＢＨＫ細胞をトリ１−ン緩衝液により抽出 せしめ、そしてスペローズ１２ゲル濾過にかけたとき、わずかな活性が高分子量 複合体に配分された；事実、ウェスタンブロア）分析により確認した通り、これ は約３５ｋＤａの低分子量画分のみにおいて検出された。ＰＴＰａｓｅのこの省 略型によりトランスフェクトされたＢＨＫ細胞はコントロール細胞又は野生型酵 素によりトランスフェクトされた細胞の増殖速度の約５０％のみを示した。

生体内におけるこの酵素の活性の状態を調べるため、両方の型のＴ細胞ＰＴＰａ ｓｅを発現する細胞をＰＤＣ，Ｆにより刺激し、そしてタンパク質−チロジンリ ン酸化における変化を調べた。ＢＨＫ細胞を８０μＨのＺｎＳＯ４で処理し、次 いで培地における４８一時間インキュベーション、その後の０９１％の熱不活性 化仔牛血清中での４８時間にわたるインキュベーションを行い、この細胞は休止 状態となった。血清奪取細胞を１曽ｌ当り４０ｎｇの血小板−由来成長因子（Ｐ ＤＧＦ）（＾ｍｇｅｎ　Ｂｔｏｌｏｇｉｃａｌｓ）によって３７℃にて種々の時 間にわたり処理し、次いで水冷ＰＢＳにより直ちに洗った。５０ｗＭのＨｅｐｅ ｓ　（ｐＨ７，５）　、１５０　ｍＭのＮａＣＬ、１０％（容量／容量）のグリ セロール、１％のトリトンＸ−１００，１，５ｍＭのＭｇｃｔ、ｚ、１　喝Ｍの ＥＧＴＡ、１曽ｌ当り１０μｇのアプロチニン、１１当り２μｇのロイペプチン 、０．００２％のフェニルメチルスルホニルクロリド、２００μ門Ｍのナトリウ ムオルトパンデート、１０μＨのピロリン酸ナトリウム及び１００ｍＭのＮａＦ を含む。溶解結衝液（１曽ｌ）をこのプレートに加え、これを氷の上で約２０分 間インキュベートした。このリゼートを１０，０００　Ｘ　ｇで５分間、４°Ｃ にて遠心し、次いでこのタンパク１ｔ′ａ度をＢｒａｄｆｏｒｄ　（Ａｎａｌ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２　：　２４Ｂ−２５４，１９７６）に詳細の通りに測 定した。アガロース結合比マウスモノクローナル抗−ホスホチロシン抗体ビーズ （Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｍａｎｈａｓｓｅｔ、　Ｎ、Ｙ、　）の懸濁物３０μｌを、等量の各免疫沈殿物 におけるリゼートタンパク質に加え、次いでこの混合物を４°Ｃで一夜攪拌させ た。このビーズを遠心により集め、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ１，５／１５０ ｍＭのＮａＣＬｌｏ、１％トリトンＸ−１００／１０％のグリセロール／２００ μ門のオルソパンデートにおいて２回洗い、次いで同一の緩衝液であるが塩濃度 が０．５ＭのＮａＣＬまで上昇させた緩衝液により２回、そして最後に１５０＋ ＊ＭのＮａＣＬを含むこの緩衝液により洗った。このビーズを３０μｌのラエム リサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：　６８０　６ ８５．１９７０）中で２分間煮沸した。この免疫沈殿化タンパク質を抗−ホスホ チロシン抗体によってウェスタンプロ・７ト分析にかけた（Ａｕｓｕｂｅｌ、　 Ｆ、Ｍ、ら編、販郵並［肚廷匹蛙り頭」虹匹虱肛」圏圏■、　Ｗｉｌｅｙ、　Ｎ 、Ｙ、、第２巻。

１９８８）。抗体結合を検出するため、１２ｓｉ−ラベル化プロティンＡ（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、　；　１ ０　＋ａＭのトリス、ｐＨ７，４／１５０ｍＭのＮａＣＬ　／　１％牛清アルブ ミン中において５００．０００　ｃｐｎ＋／ｍｌ）をこのプロットに２時間にわ たり付与し、そして１０　ＩＩＭのトリスｐＨ７，４／１５０　ｍＭのＮａＣＬ ｌｏ、０５％のトリトンＸ−１００中で洗った。次にこのプロットを室温で２− ５日間にわたりオートラジオグラフィーにかけた。

上記に詳細の通り、血清奪取りｌ（Ｋ細胞をＰＤＧＦにより刺激し、そしてパナ デートの存在下において種々の時間にて抽出し、そしてチロシル残基上でリン酸 化されたタンパク質を抗−ホスホチロシン抗体によって免疫沈殿させた。沈殿し たタンパク質をＳＯＳ／ＰＡＧＥにかけ、その後第２抗−ホスホチロシン抗体に よるウェスタンブロンドにおいて分析した。このプロントのオートラジオグラフ ィー（図２）は、ＰＤＧＦ刺激の２分後に、コントロール細胞における約１８０ ．１４０，１１６．９２及び６０ｋＤａのタンパク質において劇的なチロシンの リン酸化の上昇があることを示している。一方、野性型又は省略Ｔ−細胞Ｐ　Ｔ 　Ｐ　ａｓｅのいづれかを過剰発現する細胞において、複数のタンパク質ハンド 、特にＰＤＧＦレセプターである考えられる１８０−ｋＤａのタンパク質を除＜ １４０，１１６及び６０ｋＤのタンパク質においてかなり低いレベルのリン酸化 があった。この１１６−及び６Ｏ−ｋＤａのタンパク質はこの時間内においてコ ントロール細胞由来の抽出物において脱リン酸化を受けたものと考えられ、内因 性Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅが活性化されていることを示唆する。類似のリンタンパク 質が、ＰＤＧＦにより処理した休止フィブロプラスト又はバナデートにより予備 処理した正常フィブロブラスト由来のホスホチロシン免疫沈殿物において検出さ れた。

まとめると、過剰暴露せしめた全長４Ｂ−ｋＤａＴ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｓは低 速で沈降する微粒子の画分に見い出せた。この酵素は、この百分をトリプシンで 予備処理しない限り、ＲＣＭ−リゾチームに対して試験管内で不活性である。こ の現象はこの分子の１ｌ−ｋＤａのカルボキシル−末端セグメントに起因しうる 。この酵素は試験管内で活性である。この活性にもかかわらず、ベクターを単独 で発現する細胞と比べて、ＢＨＫの増殖速度又は全体の形状には影響はほとんど なかった（位相差顕微鏡による；しかしながら細胞骨格には影響が及んだ）。こ の酵素は細胞内において高く調節される及び／又はある区画に区分されて、そこ でこの活性が特定の基質に限定されていることが考えられる。この結果は、過剰 発現した３７　ｋＤａの省略型が成長酵素と異なる作用を示すことをも示した。

この省略型は構成的に活性であり、そして精製の際に粒状と可溶性画分とに均− に分配される。発現させたこのＢＨＫ細胞は遅い速度で増殖し、そして全体的な 形状変化を示した。従って、このカルボキシル末端セグメントは酵素活性の場所 及び調節に関与することが考えられる。

疎水性プロット（図３）は、このセグメントが実質的におよそ最後の２０残基ま で親水性であることを示唆し、この地点からこのポリペプチド鎖は疎水性となり 、その疎水性指数はトランメンプランセグメント又はシグナルペプチドのそれに 近い、疎水性及び疎水性残基の類似の分布が低分子量ヒト胎盤及びラット脳Ｐ　 Ｔ　Ｐ　ａｓｅのカルボキシル末端セグメントにおいて（これらのセグメントの 一次構造は、それらの保存された２３６−残基コア構造内よりも可変性であるに もかかわらず）も見い出された。スクロース密度勾配遠心はＴ−細胞ＰＴＰａｓ ｅと胎盤の膜との連結の証拠を示さなかった。しかしながら、このＰＴＰａｇｅ はその他の細胞成分（核、ゴルジ又は小胞体）又は細胞骨格と相互作用すること があり、なぜなら可溶化のために高い塩濃度及び界面活性剤の両方を必要とする からである。

Ｂ、べＬユ立土止ム及 野性型Ｔ細胞ｃＤＮＡ及び省略Ｔ細胞ｃＤＮＡを、Ｓｕｍｍｅｒ　ａｎｄＳｍｉ ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｅｘ　ｅｒｉ＋ｍｅｎｔａｌ　 ５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｔｉｎ　Ｎｏ。

１５５５、１９８７の方法に従って５Ｆ９（エフ１．、Ｎ　ｌ”７”エラー　フ ルギペルダ［５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ］　）昆虫細胞に導 入した。簡単に述べると、Ｔ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ及び省略Ｔ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ 　ａｓｅをコードするｃＤＮＡを、バクロウィルス発現プラスミドにおけるポリ へドロンプロモーターの３′にあるＢａ５ＨＩ部位に挿入した。この組換えバク ロウィルスＤＮＡを宿主Ｓｆ９昆虫細胞の中に正常バクロウィルスケツムと一緒 にトランスフェクトした（Ｓｕ＋ｓｍｅｒｓ　ら、前記を参照のこと）。ＤＮＡ はこの細胞に取込まれ、この組換えプラスミド及びバクロウィルスＤＮＡを試験 管内での遺伝子組換えにかけ、そして組換えウィルスを作り上げた。これらのウ ィルスを、３２Ｐ−ラヘル化Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅ　ｃＤＮＡの昆虫細胞リゼート へのハイブリダイゼーションにより選別した。ＰＴＰａｓｅタンパク質をコード するｍＲＮＡはウィルスポリペドロンプロモーターから転写され、そしてそのタ ンパク質は感染Ｓｆ９宿主細胞によって合成された。この昆虫Ｓ［９細胞により 生産される全タンパク質の３０％がＰＴＰａｇｅの生産に基づいた。

より詳しくは、全長４３−ｋＤａＴ細胞ＰＴＰａｓｅ（ＴＣ，ＰＴＰａｓｅ　） 及び３７−ｋＤａの省略化Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅ　（ＴＣΔＣ１１゜ＰＴＰａｓｅ ）のオーブンリーディングフレームを、Ｔｈａｒ／５ｓｐＩ補完した後にプラス ミドｐＶＬ９４１の固有ＢａｍＨＩ部位（Ｌｕｃｋｏｗａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ 、−ｙｊ」−４ｓ口【Σ１ど７０　：３１−３９．１９８９）にクローン化せし めた。挿入の正しい配向はＤＮＡ配列分析（Ｓａｎｇｅｒら　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　７４　：５４６３−５４６７、１９７７）に よって確認した。

Ｓｆ９細胞を（Ｓｕ＋ｍ＋５ｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　１９８７　）詳細 の通りに単層培養において維持した。細胞を、３．３ｇ／Ｌのイーストレート（ Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＭＩ　）　、３．　３　ｇ／　Ｌ のラクトアルブミンヒドロリゼート（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ 、　ＭＩ　）、１０％の仔牛血清（Ｈｉｎｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２６　：　４ ４６　４６７、１９７０　）及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００　ｐｇ／ 鴎ｌのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍｌのフンギシン（フンギバクト 抗生物質混合物、Ｉｒｖｉｎｇ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

５ａｎｔａ　Ａｎａ＋　Ｃａ１ｉｆ）の添加したブレース　アンセラ（Ｇｒａｃ ｅｓ　Ａｎｔｈ−ｅｒａｅａ　）培地（Ｇｒａｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ　１９５　： 　７８８−７８９．１９６２　；Ｇｉｂｃｏ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）中で増殖させた。Ｓａｎｇｅｒｓ及び Ｓｍ１ｔｈ、　１９８７に詳細の通りに、細胞を１μｇのＡｃ　−ＮＰＶ　ＤＮ Ａ及び２Ｍｇのプラスミド（ｐＡＣ−Ｔｃ、ＰＴＰａｓｅ　）により共トランス フェクトせしめた。最終ウィルス懸濁物の純度は３２ｐ−ラベル化オリゴヌクレ オチドプローブとのハイブリダイゼーションによりチェックした。この配列は、 ｐＶＬ９４１発現ヘクターにない部分である。

Ａｃ−ＮＰＶポリヘトリン遺伝子（Ｉｄｄｅｋｉｎｇｅ　ら、ｕ皿圏■１３１： 　５６１−５６５．１９８３　）の３７−６６のヌクレオチドより成る、純粋な 組換えウィルスにより感染されたＳｆ９細胞の抽出物はこのオリゴヌクレオチド とハイブリダズしない。

細胞を高い多重度（〉３）の感染により感染せしめ、そして増殖させた。感染せ しめた後いろいろな時間にて、細胞を５．ＯＯＯＸｇで５分間遠心により集めた 。以下の緩衝液は抽出のために通常用いられる：（ａ）２５ｓＭのイミダゾール ｐＨ７，２，２ｍＭのＥＧＴＡ。

０．１％のコーメルカブトエタノール、１　ｍＭのベンザミジン、０．００２％ のフェニルメチルスルボニルフルオリド、２Ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１Ｍｇ ／ｍｌのペフ゛スタチン、５カリクレインＵ／謹ｌのアプロチニンより成る低塩 緩衝液、（ｂ）０．５％のトリトンＸ−１００を含む低塩緩衝液；　（Ｃ）Ｏ， １ＭのＫＣＬ及び０．５％のトリトンＸ−１００又は１％のＣＩ（ＡＰＳを含む 高温緩衝液。

細胞を低塩緩衝液に懸濁しく３Ｘ１０’細胞／＋ｗｌ）、次いで氷上でダンス（ Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーにおいて３０ストロークにより破砕せしめた。１ ０，０００　Ｘ　ｇでの遠心で１０分後、このベレットを０．５％のトリトンＸ −１００を含むもとの容量の半分の低塩緩衝液に再懸濁せしめた。この懸濁物を 前記の通りにホモジナイズし、そして１０，０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心した 。最後に、このベレットを０．５％のトリトンＸ−１００又は１％のＣｔｌＡＰ Ｓを含む高温緩衝液に再懸濁せしめた。このホモジネート品を再び１０，０００ 　Ｘ　ｇで１０分間遠心した；この上清液をウェスタンプロット分析、タンパク 質ＭＮ及びＰＴＰａｓｅアッセイのために用いた。ウェスタンプロット分析に関 しては、タンパク質をＬａｅ＋ｗｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　２ｉＬ：　６８０　 ６８５゜１９７０）　詳細の通りに５ＤＳ−ＰＡＣ，Ｅにかけ、次いでニトロセ ルロースに電気泳動的に移した。ＰＴＰａｓｅｌＢのアミノ末端領域に由来する 合成ペプチドに対して発生せしめたウサギ抗体８１７２　（以下の実施例４を参 照のこと）を、ウェスタンブロンドにおける検出のために用いた。アルカリ性ホ スファターゼにコンジユゲートされたヤギ抗−ウサギＩ　ｇ　Ｇ　（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆ、）をそ の製造者の仕様書に従って第２抗体として用いた。

ＴＣｏＰＴＰａｓｅの精製のため、このトリトン／ＫＣＬ抽出物を硫酸アンモニ ウム中で２０％とし、そして１００．０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心した。この沈 殿物と０．５％のトリトンＸ−１００を含む２００μｌの高温緩衝液に再懸濁さ せ、次いでこれと同じ緩衝液で平衡化せしめたスペローズＬ２ＦＰＬＣカラムに 適用した。Ｃ−末端の省略された酵素の精製のため、この低塩緩衝液抽出物をセ ファデックスＧ７５超微細カラム（２，６ｃｍＸ　８２．５　ｃｍ、流量ｃａ、 １０ｍ１／ｈ）に直接適用した。ピーク画分をグリセロール中で２０％とじ、そ して−７０°Ｃで凍結させた。

ＰＴＰａｓｅ活性を前記の実施例３に詳細の通りに測定したが、但し、いくつか のアッセイにおいては基質としてのチロシルリン酸化ＲＣＭ−リゾチーム（ＲＣ ＭＬ）の代りにリン酸化ミニリン塩基性タンパクｆ（ＭＢＰ）を飽和濃度におい て用いた。トリプシン処理はＰＴＰａｓｅ　（＜０．２５Ｕ／−１）を４０μｌ のアッセイ緩衝液中にて、１μｇのトリプシンと５分間、３０°Ｃでインキュベ ートすることによって行った。６μｇのリマ豆トリプシンインヒビターの添加に より阻害し、そしてホスファターゼ反応を基質の添加により開始させた。

バクロウィルス系（Ｈｓｕ　ら、Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ、ｌ　 ：　１９１−２００゜１９９０）において発現される表皮成長因子レセプター（ ＥＣＦＲ）の内在キナーゼドメインを、２０　ｕＦ＋　（７）　ＨＥＰＥＳ　ｐ Ｈ７，５，０，１％の２−メルカプトエタノール ペプスタチン、５力リクレインＵ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌのロイペ プチン、５　ｍＭの酢酸マンガン及び０．１ｍＭのＡＴＰ（　２　、２　Ｘ　１ 　０　’　ｃｐｓ／ｐｓｏｌ）中で３０°Ｃで１０分間自己リン酸化させた。こ のキナーゼ反応を、ＥＤＴＡを１０ｍＭの濃度となるまで加えることによって停 止させた。この自己リン酸化レセプター（８０ｎｇ）を次に緩衝液と、又は１０ ０ｎｇのＴＣ．ＰＴＰａｓｅもしくはＴＣΔＣＬ１．　Ｐ　Ｔ　Ｐａｓｅのいづ れかと、それぞれ３０″Ｃで２０分間インキュベートした．サンプル緩衝液を加 え、そしてこの反応物を７．５％のＳＤＳ−ｐＡＧＥに泳動させた。このゲルを 乾かし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。

前記した通り、Ｓｆ９細胞をｐＡＣ　”ｒｃ，ＰＴＰａｓｅプラスミドＤＮＡ及 びＡｃ−ＮＰＶ野性型ＤＮＡにより共トランスフェクトせしめた。感染後種々の 時間にて、細胞を集め、そして溶解せしめた．このリゼートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ 及びイムノプロット分析にかけた．感染せしめなかった細胞又は野性型（ｗｔ） Ａｃ−ＮＰＶにより感染せしめた細胞をコントロールとした，ＴＣ，ＰＴＰａｓ ｅ及びＴＣΔＣ１１．　Ｐ　Ｔ　Ｐａｓｅ両者の発現レベル（ウェスタンブロン ド分析により観察）は２〜５日間定常的に上昇し；５日後、はとんどの細胞がウ ィルス感染に基づいて溶解した。より高いＭｒの更なるバンドが３日後に現れ、 これはおそらくある程度の翻訳後改質に基づくのであろう。両タンパク質の一定 のトリプシン処理は約３３ｋＤａのトリブチツクフラグメントを発生せしめた。

抗体８１７２はこの酵素のＮ−末端付近の配列を認識するため、主たるトリブチ ツク切断はこのタンパク質のＣ末端領域において生じたのであろう。

感染せしめていない細胞又はＷＬウィルスにより感染せしめた細胞において何ら 交差物質は検出されなかった。感染Ｓ　ｆ　ｑ細胞由来のプシン処理の後にのみ 見い出せた。

これらの細胞をまず低塩緩衝液中で抽出し、そしてこの懸濁物を遠心した。この ペレットを０．５％のトリトンＸ−１００を含む緩衝液により再抽出せしめ；こ の懸濁物を再遠心し、そしてこの第２のペレットを同一のトリトン緩衝液である が０．６ＭのＫＣＬが存在しているものにより抽出した。この全長酵素はこのよ うな塩類と界面活性剤の組合せによってのみ可溶化した。一方、省略型は水性緩 衝液中で容易に溶解した。

トリトン／ＫＣＬ抽出物由来のＴＣ，ＰＴＰａｓｅを、硫酸アンモニウムを２０ ％飽和となるまで加えることにより沈殿させた．この懸濁物を遠心し、そしてこ のペレットをトリトン／ＫＣＬＩＩ衝液に溶かした。回収率は約５０％にすぎな いが、この工程はこの酵素の濃縮に必要である。このタンパク質溶液をスベロー ズ１２ＦＰＬＣカラムに適用した，ＴＣ．ＰＴＰａｓｅはひきずったシタルダー を伴いながら、活性の１つの主要ピークとして溶出した．両方由来の両分（１８ −２０及び２１−２４）を集めたとき、各プール中の物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥに おいて同じにバンドパターンをもたらし、４８ｋＤａにて二重のバンド、そして ４０ｋＤａにてわずかなバンドが示された。夾雑物に基づき、ひきずった据の物 質の比活性はその前方のピークのそれのおよそ半分であった。モノマー分子（４ 　８　Ｋ）について予測されたものより大きい分子量にて溶出した両方の両分（ ２　２　Ｏ　Ｋ及び１６０Ｋ、それぞれ）は、会合、界面活性剤のミセルへの入 り込み又は非対称性（ａｓｙｍｍｅ　ｔｒｙ）を意味する。

タンパク質の会合は直接的に実証することができない。ポリアミン又はＭＢＰに よるこの酵素の活性化が解離によるものと仮定して、こＣＤ　全長Ｐ　Ｔ　Ｐ　 ａｓｅを同じＦＰＬＣスベローズ１２カラムにおいて、このカラムを２　ｍＭの スペルミンにおいて平衡化した後、又は１０倍のモル過剰量の非リン酸化ＭＢＰ とプレインキユヘーションした後に、クロマトグラフィーにかけた。更に、ジメ チルスペリミデートとの架橋での試みはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４により大き いＭｒを有するタンパク質物質を示さず、しかし同一の条件のもとてのコントロ ールとしてのヘモグロビンの架橋は有効であった。

界面活性剤の可能な影響を調べるため、トリトンＸ−１００（約９　０　ｋＤａ 　）より小さいミセル（約５　ｋＤａ　）を形成するＣＨＡＰＳにおいてもクロ マトグラフィーを行った。しかしながらここでも、この酵素は予想よりも大きい Ｍｒで溶出した（約１　７　０　Ｋ）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見られる３つの全てのバンドはＴＣ。

Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの異なる形態に対応し、なぜならそれらは抗体８１７２及び Ｔ−細胞ＰＴＰａｓｅの異なるセグメント（残基３４２−３５７及び３６９−３ ８１）に特異的な２種類の他の抗体により認識されるからである。この酵素の更 なる特徴付けを、ピーク画分１９及び２０より得られる物質に基づいて行った。

９０％のＴＣΔＣ１１．　Ｐ　Ｔ　Ｐａｓｅが水性緩衝液中に分布しているため 、この抽出物をセファデンクスＧ７５ｍ微細カラムに直接適用することができる 。全長タンパク質に比べ、ＴＣΔＣ　１１　ＰＴＰａｓｅは予測の分子量にて溶 出した．表２はＴ−細胞ＰＴＰａｓｅの両方の型の精製をまとめる．これらは有 意な活性を損失を伴わずに、−７０°Ｃにて２０％のグリセロールの存在下にお い数ケ月保存できた。

表　２ 発現したＴＣ．ＰＴＰａｓｅ　（Ａ）及びＴＣΔｃ１１。

ＰＴＰａｇｅ　（Ｂ）の精製 Ａ　容量　全活性１タンパ　比活性１精製　収率（鋼１）　（ユニット）　（＋ ＊ｇ）　（ユニット）　（倍率）　（χ））’Ｊ）ン／ＫＣＩ　抽出物　１．０ 　１２，０００　４．６　２．６５０　１　１００（ＮＨ４）　ｚｓＯａ沈渣　 ０．２　６，４００　２．３　２，８５０　１　５３スベｏ−ス　１２　の　ビ ーフ　０．５　３，２５０　０．３　１０．７００　４　２７Ｂ　容量　全活性 　タンパ　比活性　精製　収率（ｍｌ）　（ユニ５））　（ｍｇ）　（ユニット ）　（倍率）　（χ）抽出物　３．２　１４，９００　４．６５　３．２００　 １　１００ａ．５ｍＭのＥＤＴＡの存在下において、基質としてのＭＢＰにより 測定した活性 す、５　ｇ＋ＭのＥＤＴＡの存在下において、基質としてのＲＣＭＬにより測定 した活性 両方のＴ−細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの型は全体としてホスホチロシル残基に特異 的であり、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ−依存性タンパク質キナーゼによりリン酸化されたＭ ＢＰ又はヒストンに対してほとんど活性を示さなかった。このＰ　Ｔ　Ｐ　ａｇ ｅの省略型はチロシルリン酸化ＲＣＭＬに対して２６．０００　Ｕ／ｍｇの比活 性を示した。対照的に、全長酵素はより低い活性であり（８５００／−ｇ）　、 この酵素活性はＣ−末端セグメントによって抑制されることを示唆する（表３） 。一定のトリプシン処理及び早期停止コドンの導入によるこの分子の省略化はＲ ＣＭＬに対して３０倍上昇した活性をもたらす。全長酵素の活性はその基質の性 質に大いに依存する。リン酸化ＭＢＰの存在においては、これは１０、３００　 Ｕ　／　ｍｇの比活性を示し、それに比べ省略型は４，７００Ｕ／露ｇしか示さ なかった。これらのデーターは、ＭＢＰがＣ−末端セグメントと相互作用し、酵 素の活性化をもたらすことが示唆される。Ｔ細胞ＰＴＰａｓｅの両方の型はＥＧ ＦＨの可溶性キナーゼドメインを、その自己リン酸化の後に容易に脱リン酸化せ しめる。

表　３ ＰＴＰａｇｅ形態の酵素的性質 ｆｉ　ＲＣＭ　Ｌ　Ｍ　Ｂ　Ｐ 比活性１　Ｋ■　比活性’　Ｋｍ （１ニフト、／ｗｇ）　（ｎＭ）　（Ｉニフト／ｍｇ）　（ｎＭ）ＴＣ，ＰＴＰ ａｓｅ　８５０土１７０　２００　１０．３００±１．３００　５００トリプシ ン処理後　２３，３００土３．８０Ｏｎ、ｄ、　３．６００±１．００Ｏｎ、ｄ 。

ＴＣΔＣ１１，ＰＴＰａｓｅ　２６，０００±３．０００　５０　４，７００± ５００　１２５０トリシン　処理後　１５，３００±２，６００　ｎ、ｄ、　１ ．９００±　２０Ｏｎ、ｄ。

ａ、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下における基質飽和の条件のもとでの、３つの別々 の調製品についての平均及び橿準偏査Ｔ細胞酵素の両方の型はマイクロモラー濃 度での伝統的なインヒビター、バナデートＣＳｗａｒｕｐら、ｕ更上現ユ影」仇 ■ユ力臣、伽μ咀ＬＪ　：　１１０４−１１００．１９８２）、モリブデート及 びＺｎ”°（Ｂｒａｕｔｉｇａｎら、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２５６　 ：　６５１９−６５２２．１９８１）によって阻害された（表４）。カルシウム 及びマグネシウムは実質的に効果を及ぼさなかった０両方の型のＴ細胞酵素はナ ノモラー濃度でのポリアニオンにより阻害された；この効果は基質としてＲＣＭ Ｌによってのみ観察された。この酵素はＥＤＴＡにより活性化されたが、ＰＴＰ ａｇｅＩＢはど強くはなかった。この全長酵素は、基質として陰電荷されたＲＣ ＭＬを用いたときのみ、ポリカチオン化合物によってめざましく活性化された（ スペルミンによって７倍に、そして非リン酸ＭＢＰによって３倍に）、一方、こ れらの化合物によるこの酵素の省略型の活性化は最大で３０％であり、このポリ カチオン分子はＣ−末端領域に相互作用することが示唆された。

表　４ Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性のエフェクター活性は、エフェクターを用いていないコ ントロールに対して放出されたリン酸塩のパーセンテージとして示す、全てのア ッセイは５μＨの基質の存在下において二重で行った。

酵素形態　ＴＣ，ＰＴＰａｓｅ　ＴＣΔＣ１１，ＰＴＰａｓｅ基質　ＲＣＭＬ　 ＭＢＰ　ＲＣＭＬ　ＭＢＰなし　１００　１００　１００　１１００１００ｔＩ バナデート　００　２１ １０μＭモリブデート　０　１　２　２１００、ｃｒＭＺｎ”　３３　１０１　 １５　６６０．０１μＭヘパリン　９６　１２０　５８　１０２１μＭ　〃８　 １０８　８　７５ １０ｔＩＭ〃５　７３　１　９０ ０．０１　ｕ　Ｍポリ　Ｇｌｕ　：　Ｔｙｒ４　：　１　６６　１１９　７０　 １０２１μＭポリ　Ｇｌｕ　：　Ｔｙｒ４　：　１　１８　１３３　１７　１０ ４１０　μＭポリ　Ｇｌｕ　：　Ｔｙｒ４　：　１　６　５８　１１　１２７５ 曽ＭＥＤＴＡ　１２４　１３７　１７０　１５０２　ｍＭスペルミン　７２７　 ６２　１１０　９７２ｍＭ　〃２４９　４３　１３２　１０８１μＭ非リン酸化 ＭＢＰ　１２２　６２　１１０　９７１０μＭ　〃２９７　４３　１３２　１０ Ｂ５０μＭ〃２７９１５　１０６６ 上記の方法の他に、米国特許第４．８９７，２３６号；第４，８７０，０２３号 ；及び第４，７４５．０５１号（本明細書に参考として組入れる）は組換えバク ロウィルス及び昆虫細胞のそれらの感染についての方法を開示し野性型Ｔ細胞Ｐ ＴＰａｓｅ　（４８ｋＤａ　）のｃＤＮＡ又はＣ−末端の省略されたＰＴＰａｓ ｅのｃＤＮＡをＭｉｌｌｅｒとＲｏｓａ＋ａｎ　（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｉ−凹７　 ：　９８０−９９０．１９８９）の方法に従って細胞に導入した。対象のｃＤＮ ＡとベクターＬＸＳＮ　（叶、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｆｒｅｄ　［Ｉｕｔｃｈｉｎ ｓｏｎＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｃｂ　Ｃａｎｔｅｒの好意により提供された） にリゲートさせ、そしてレトロウィルスパッケージング細胞系（ＰＨ５０１）　 （叶−Ｍｉｌｌｅｒより提供）の中にリン酸カルシウム沈殿方法によってトラン スフェクトせしめた。ＤＮＡを含む細胞は薬剤Ｇ４１８に対針であり、従って培 地中における１、５ｍｇ／ｓ＋１のこの薬剤の存在下におし１て増殖するその能 力によって選別した０個々のクローンを単離し、そして組換えレトロウィルスを 含むその上清液を保存した。

多数の細胞を、それらが感染性であり、そして生体内にお＆ＮてＰＴＰａｓｅを 生産するかどうかを試験するために用意した。これらには、ＮＩＨ３Ｔ３　；Ｎ ＩＨスイス［）ｌ；ｖ−ｓｒｃにより形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３；ラット２及 びｖ−ｆ■Ｓにより形質転換されたラント２が含まれる。約１０Ｓ個の細胞を平 板培養し、レトロウィルス生産性細胞系のそれぞれのコロニー由来のレトロウィ ルス上滑液１００μｌにより感染せしめた。陽性感染体をＧ４１８培地における 選別により試験した。Ｉ＆後、全ての０４１８−耐性細胞を、特異的な抗−Ｔ細 胞ＰＴＰａｓｅ抗体（例えば実施例４の抗血清）による免疫沈殿により、４３ｋ Ｄａ又はＣ−末端省略ＰＴＰａｓｅのし４づれかの発現について分析した。

実施例６ Ｔ細胞ｃＤＮＡによるトランスフェクションにょるＢＨＫ細胞の悪性形質転換体 の復帰 ４ＢｋＤａ型のＴ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅの改質型をコードするＤＮＡを赤ん坊 のハムスター腎１ｉｄ（ＢＨＫ）細胞に導入した。このｃＤＮＡの改質は１１　 ｋＤａのカルボキシル末端伸長物の欠失であり、これはこの酵素が試験管内での ４０，０００ユニット／鶴ｇの比活性を有する非常に活性なものとする。この改 質Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの発現はＢＨＫ細胞にとって毒性ではない。更に、この酵 素を発現するＢＨＫ細胞は、それらがこれ以上形質転換されない変異した表現型 を示した。

赤ん坊のハムスター腎１１（ＢＨＫ）細胞の形質転換の性質は未知である。癌遺 伝子を調べる２通りの標準技術は、（１）細胞が接触阻止しないようにソフトア ガー中で細胞を増殖させること、及び（２）細胞をヌードマウス（即ち、胸腺を 有さす、従って細胞を拒絶できないマウス）に注入し、そして注射による腫瘍の 増殖を調べることである。これらの試験はＢＨＫ細胞、発現ベクターによってト ランスフェクトされたＢＨＫ細胞、４８ｋＤａ型のＴ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅに よりトランスフェクトされたＢＨＫ細胞に対して陽性であったが、Ｃ−末端省略 型Ｔ細胞Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅを高レベルで発現する細胞に対しては陰性であった 。

例えば、コントロール細胞は２週間においてソフトアガーの中にコロニーを示し 、それらは直径において２μＩよりもかなり大きく、ここで省略Ｐ　Ｔ　Ｐ　ａ ｓｅを発現する細胞を含む全ての細胞は２μ曙より小さい。このことはソフトア ガー中で１ケ月まで増殖させた細胞にとっても事実であった。コントロール細胞 、即ち、ベクター又は４８ｋＤａの酵素のいづれかを発現する細胞２．５Ｘ１０ ’個を注入せしめた。ヌードマウスにおいて１ケ月後に形成された腫瘍の容量は 、それぞれ１．５ｍｌ及び２．１１であり、そしてこれらの大きな腫瘍は血管形 成を受けた。Ｃ−末端省略型のＴ細胞ＰＴＰａｓｅを発現する細胞５Ｘ１０ｈ個 を注入せしめたヌードマウスにおける容量は０．２１〜０．３８ｍ１に範囲し、 そしてこのような小さな増殖物は血管形成をうけなかった。

以上より、本発明の態様を例示の目的で詳細してきたが、本発明の範囲を逸脱す ることなくあらゆる改良を行うことができることが明らかであろう。

９１　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＣＧＣＴＧＧ　ＣＡ Ｇ　ＣＣＧ　ＣＴＧ、ＴＡＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＡＴＴＧｌｕ　Ｌｅｕ　ＡｓＩ＋ 　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｖｒ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　１１ｅ　２５１３１＞　Ｃ１’；Ａ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣ ＣＣＡＴ　ＧＡＣＴＡＴ　ＣＣ了ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＣＣＡＡＧ　ＴＴ Ｔ　ＣＣＡ八ｒへ　Ａｓｎ　ｉ；＋ｕ　ＳＬ！ｒ　Ｈａｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐ ｒｏ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　４p ２２６　ＣＡＣＡＧＴ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＣＭ　ＡＡＴ　ＧＣ Ｔ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＡＴｒ　ＡＴＴＨｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ 　Ｔｙｒ　１１ｅ　Ａｓｎ　７０２７１　ＧＣＣＡＧＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＧＡ ＣＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＴＡＣＡＴＣＴＴ Ａ＾１ａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＶＡＴ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔ、ｖｒ　ＩＴｅ　Ｌｅｕ　Ｂ５３１６　ＡＣＡ　 ＣＡＧ　［’ｉＧ丁　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＭＣＡＣＡ　ＴＳＣＴＧＣＣＡ Ｔ　ｎＣＴＧＧ　ＣＴＴ　ＡＴＧＴｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｆ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒｇ　ＡＳｎ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　ｓ ｅｔ　Ｔｏ。

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国際調査報告 ｍ、、１．ＩａｅｅｌＩｌ−ｍｌ１Ｍ　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０１７４Ｂ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ 分子（ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは実質的に、図１のメチオ ニン［アミノ酸１］から、ロイシン［アミノ酸２９７］とアルギニン［アミノ酸 ３１７］の間に位置するアミノ酸基のアミノ酸配列より成る）。
2. ２．レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ 分子（ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは実質的に、図１のメチオ ニン［アミノ酸１］からアルギニン［アミノ酸３１７］迄のアミノ酸配列より成 る）。
3. ３．レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ 分子（ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは実質的に２９７から３２ ０個のアミノ酸残基の間のアミノ酸配列より成り、そしてここで前記アミノ酸配 列は図１のアスパラギン［アミノ酸４２］からグルタミン酸［アミノ酸２７４］ 迄のアミノ酸配列と類似の長さであり、且つ約８０％の配列類似性を有する部分 を含んでいる）。
4. ４．レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ 分子（ここでこのタンパク質チロシンホスファターゼは実質的に、図１のメチオ ニン［アミノ酸１］からグルタミン酸［アミノ酸３７６］とセリン［アミノ酸３ ９６］との間に位置するアミノ酸基のアミノ酸配列より成る）。
5. ５．レセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ 分子を含んで成るＤＮＡ構造体を保有する、悪性細胞に感染できる遺伝子搬送ビ ヒクル。
6. ６．前記ＤＮＡ分子が、省略されているカルボキシル末端を有するレセプター非 結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードする、請求項５に記載の遺伝 子搬送ビヒクル。
7. ７．前記ＤＮＡ分子がレセプター非結合化タンパク質チロシンホスファターゼを コードする（ここで、このタンパク質チロシンホスファターゼは、２９７〜３２ １個の間のアミノ酸基のアミノ酸配列を含んで成り、そしてここで前記アミノ酸 配列は図１のアスパラギン［アミノ酸４２］からグルタミン酸［アミノ酸２７４ ］迄のアミノ酸配列と類似の長さであり、且つ約８０％の配列類似性を有する部 分を含んでいる）、請求項５に記載の遺伝子搬送ビヒクル。
8. ８．請求項１，２又は４のいづれか１項に記載のＤＮＡ分子を含んで成るＤＮＡ 構造体を保有する、悪性細胞に感染することができる遺伝子搬送ビヒクル。
9. ９．レセプター結合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ分 子を含んで成るＤＮＡ構造体を保有する、悪性細胞に感染することができる遺伝 子搬送ビヒクル。
10. １０．前記ＤＮＡ分子が省略されているカルボキシル末端を有するレセプター結 合化タンパク質チロシンホスファターゼをコードする、請求項９に記載の遺伝子 搬送ビヒクル。
11. １１．前記遺伝子搬送ビヒクルが組換えレトロウイルス又は祖換えワクチンウィ ルスを含んで成る、請求項５−１０のいづれか１項に記載の遺伝子搬送ビヒクル 。
12. １２．タンパク質チロシンホスファターゼが悪性疾患に関連する温血動物におけ る悪性疾患を処置するための方法における利用のための、請求項５−１１のいづ れか１項に記載の遺伝子搬送ビヒクル。