JP5091669B2 - チミジンキナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、実質的にスプライシングされないチミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸および治療におけるその使用に関する。
遺伝子治療における代謝性自殺遺伝子の使用は大変注目されている。多数の自殺遺伝子が文献に記載されており、それは、例えば、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはチミジンキナーゼをコードする遺伝子である。これらの遺伝子のうち、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV−tk)をコードする遺伝子は治療的観点から特に有利である。HSV−tk遺伝子は酵素を発現し、それがヌクレオシドアナログであるガンシクロビルと組み合わせて使用されると、分裂細胞を特異的に排除することができる。特に重要なのは、HSV−tk/ガンシクロビルの使用に伴って、伝播性の毒性効果(「巻き添え(bystander)」作用)が存在することである。この効果は、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子が組み込まれている細胞だけでなく、隣接細胞もまた破壊される現象として現れる。
本発明は、既に開示されているHSV−tk遺伝子と比べて高い割合のスプライスされない(unspliced)mRNAを発現するHSV−tk遺伝子を提供することによって上述の問題を克服する。本発明者らは、既に特定されているアクセプター部位の14塩基対上流にスプライスアクセプター部位を特定した。本発明者らは、既に特定されているドナー部位およびアクセプター部位を改変することによってスプライシングを阻害する先行する試みによって、本アクセプター部位およびその後の遺伝子スプライシングを活性化することができることを示す。驚くべきことに、HSV−tk遺伝子をある特定のヌクレオチド位置で改変すると、実質的にスプライスされないmRNAを発現する能力を有するHSV−tk遺伝子が得られることを本発明者らは実証する。特に、本発明者らは、スプライスドナー部位のヌクレオチドのうち少なくとも1つを突然変異させることによってスプライシングを実質的に妨げることができることを示す。
本発明の第1の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、スプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも1つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していないポリヌクレオチドを提供する。
(i)本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物;および
(i)チミジンキナーゼによって毒性薬剤(物質)に変換される、実質的に無毒な薬剤
を含んでなるキットを提供する。
(i) 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ;および
(ii)該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と、同時に、分離して、または連続的に接触させるステップ。
(i) 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ;
(ii)該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
(ii)該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させるステップ。
(i) 本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ;
(ii)チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を、同時に、分離して、または連続的に該患者に導入するステップ。
(i) 本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ;
(ii) 該ポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に取り込ませるステップ;
(iii)該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
(iv) チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に導入するステップ。
(i) 患者由来の細胞またはドナー細胞を取り出すステップ;
(ii) 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターをex vivoで該細胞に導入するステップ;
(iii)該改変細胞を該患者に導入するステップ;
(iv) 該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
(v) チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に投与するステップ。
(i) 本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含むように遺伝子操作されたT細胞を宿主に投与するステップ;および
(ii)実質的に無毒な薬剤とチミジンキナーゼとの相互作用により該遺伝子操作されたT細胞を死滅させるのに有効な量の該薬剤を、移植片対宿主病が発生する前に該宿主に投与するステップ。
以下、本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を非限定的な例として記載する。
本明細書中で使用される用語「変化していない」とは、野生型配列(Tk wt)から変化していないことを意味する。
本発明のチミジンキナーゼ突然変異体は種々の技術を使用して構築することができる。例えば、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に突然変異を導入することができる。その変異配列に制限部位を隣接させて、それによりネイティブ配列の断片にライゲーションすることを可能とすることができる。ライゲーション後に得られる再構築配列は所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
スプライシング中に除去(または「スプライスアウト」)されるRNAの一部分は通常はイントロンと称され、スプライシングによって連結されるイントロンの両側の2片のRNAは通常はエキソンと称される(図2)。
本発明で使用されるポリヌクレオチドはDNAまたはRNAを含む。それらは一本鎖または二本鎖であってよい。当業者には、遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一ポリペプチドをコードしうることが理解される。さらに、当業者は、通常の技術を使用して、本発明で使用されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を施し、前記ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映することができることが理解されよう。当技術分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変してよい。本発明のポリヌクレオチドのin vivo活性または寿命を向上させるためにかかる改変を実行することができる。
本明細書中で使用される用語「タンパク質」には、一本鎖ポリペプチド分子ならびに複数ポリペプチドの複合体が含まれる。その複合体では、個々の成分であるポリペプチドが共有結合または非共有結合によって連結されている。本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」および「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、それらがペプチド結合またはジスルフィド結合によって連結されているポリマーを表す。サブユニットおよびドメインという用語もまた、生物学的機能を有するポリペプチドならびにペプチドを表す場合がある。
本明細書中で記載される具体的なタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はその変異体、誘導体、アナログ、ホモログおよび断片の使用をも包含する。
当技術分野において周知であるように、ベクターはある環境から別の環境への物質の移動を可能にするかまたは促進するツールである。本発明にしたがって、かつ一例として、組換えDNA技術で使用されるいくつかのベクターは、物質、例えばDNAのセグメント(例えば異種DNAセグメント、例えば異種cDNAセグメント)を宿主および/または標的細胞に移動することを可能にする。その目的は、本発明で使用されるヌクレオチド配列を含むベクターを複製させること、および/または本発明で使用されるタンパク質を発現させることである。組換えDNA技術で使用されるベクターの例には、非限定的に、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが含まれる。
一実施形態では、本発明で使用されるベクターは、ウイルスが標的細胞に侵入した後、複製できず、子孫の感染性ウイルス粒子を産生できないように遺伝子操作されているレトロウイルスに基づくベクターである。組織培養条件および生存生物中の両方における遺伝子の送達に広く使用される多数のレトロウイルスが存在する。その例には、マウス白血病ウイルス(MLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、フジナミ肉腫ウイルス(FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MLV)、FBRマウス骨肉腫ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo−MSV)、アベルソンマウス白血病ウイルス(A−MLV)、トリ骨髄球腫症ウイルス−29(MC29)、およびトリ赤芽球症ウイルス(AEV)およびレンチウイルスをはじめとするすべての他のレトロウイルス科が含まれるが、それらに限定されない。レトロウイルスの詳細なリストはCoffinら, 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus(編) pp 758-763に見出すことができる。
好ましくは、本発明で使用されるレトロウイルスベクターはマウス白血病ウイルス(MLV)ベクターである。広宿主性モロニーマウス白血病ウイルス(MLV−A)由来のレトロウイルスベクターは世界中の臨床プロトコルで一般に使用される。これらのウイルスは細胞表面リン酸輸送体受容体を侵入に使用し、次いで増殖性細胞の染色体に恒久的に組込まれる。その後、前記遺伝子は細胞の寿命期間にわたって維持される。MLVに基づく構築物上の遺伝子活性は制御が容易であり、長期間にわたって有効でありうる。これらMLVに基づく系を用いて行われる臨床試験では、その耐容性が良好であり、有害な副作用がないことが示されている。
一実施形態では、本発明のベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターの大きな群の一部分である。レンチウイルスの詳細なリストはCoffinら("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus (編) pp 758-763)に見出すことができる。簡単には、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類することができる。霊長類レンチウイルスの例には、非限定的に:ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。非霊長類レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」ビスナ/マエディウイルス(VMV)、ならびに関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)およびさらに最近報告されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)が含まれる。
別の実施形態では、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは二本鎖の直線状DNAウイルスであり、RNA中間体を経由しない。50種を超える種々のヒト血清型のアデノウイルスが存在し、遺伝子配列のホモロジーに基づいて6亜群に分類される。アデノウイルスの天然の標的は呼吸上皮および胃腸上皮であり、一般に軽度の症状しか生じさせない。アデノウイルスベクター系では、血清型2型および5型(95%の配列ホモロジーを有するもの)が最も一般に使用され、通常それらは若年者の上気道感染症に関連する。
本発明にしたがってポックスウイルスベクターを使用してよい。その理由は、そのゲノムに大きいDNA断片を容易にクローニングすることができるからである。また、組換え弱毒化ワクシニア変異体が報告されている(Meyerら, 1991; Smith and Moss, 1983)。
本発明のベクターはワクシニアウイルスベクター、例えばMVAまたはNYVACであってよい。最も好ましいのは、ワクシニア株の改変型ウイルスであるアンカラ(MVA)またはその派生株である。ワクシニアベクターの代替物には、アビポックスベクター、例えば鶏痘またはALVACとして公知のカナリア痘およびその派生株が含まれ、それらはヒト細胞に感染し、組換えタンパク質を発現することができるが、複製することができない。
本発明は、本発明の突然変異体tkポリヌクレオチドに関する送達系をさらに提供する。
本発明のベクターおよびポリヌクレオチドは、そのベクター/ポリヌクレオチドを複製し、ならびに/あるいは本発明のポリヌクレオチドによってコードされるTKを発現する目的で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、細菌細胞または真核細胞、例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞であってよい。
本発明の一態様では、細胞を破壊する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する:
(i) 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ;
(ii)該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させるステップ。
本明細書中のすべての、治療への言及には、治癒的、緩和的および予防的治療が含まれることが理解されよう。哺乳動物の治療が特に好ましい。ヒトおよび動物の治療はともに本発明の範囲内である。
(i) 本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ;
(ii) 該ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを該細胞に取り込ませるステップ;
(iii)該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
(iv) チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に導入するステップ。
(i) 患者由来の細胞またはドナー細胞を取り出すステップ;
(ii) 本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターをex vivoで該細胞に導入するステップ;
(iii)該改変細胞を該患者に導入するステップ;
(iv) 該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ;および
チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に投与するステップ。
(i) 本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むように遺伝子操作されたT細胞を宿主に投与するステップ;および
(ii)実質的に無毒な薬剤とチミジンキナーゼとの相互作用により、該患者において移植片対宿主効果をもたらす能力を有する遺伝子操作されたT細胞を死滅させるのに有効な量の該薬剤を、移植片対宿主病が発生する前に該宿主に投与するステップ。
医薬組成物は、治療上有効量の製薬上活性な薬剤を含むか、あるいはそれからなる組成物である。医薬組成物は、好ましくは、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤(それらの組み合わせを含む)を含む。治療用途に関して許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro 編 1985)に記載されている。製薬用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準の製薬上の実務に鑑みて選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいはそれに加えて、任意の適切な結合剤(群)、滑沢剤(群)、懸濁化剤(群)、コーティング剤(群)、可溶化剤(群)を含んでよい。
TaqMan 7700システムを使用して、HSV−tkのそれぞれの型に特異的な2種類の定量的リアルタイムRT−PCR(上清由来のRNA)またはPCR(形質導入されたリンパ球由来のDNA)によって、スプライス型の相対出現頻度(スプライス型/スプライス型+非スプライス型(%))を評価した。
SFCMM−3レトロウイルスベクター
GP+envAm12(Am12)から誘導した産生細胞株であるSFCMM−3クローン35(Am12/SFCMM−3#35)を、2mMグルタミンおよび10%の放射線照射済みFBS(Hyclone)を含有するDMEM(Cambrex)培地中で5日間増殖させた。2mMグルタミンを添加したX−VIVO 15培地(Cambrex)中でコンフルエントになったフラスコからレトロウイルス上清を回収した。回収は、細胞を33℃で24時間インキュベートした後に行った。ウイルス含有上清をろ過し、次に使用するまで−80℃で保存した。
健康なドナーから末梢血単核細胞を収集し、Lymphoprep(Nycomed)で遠心分離することによって単離した。
QIAamp DNA Mini kit(Qiagen)を製造元のプロトコルにしたがって使用して1〜2×106個の細胞からDNAを精製し、OD260を測定することによって収量を決定した。QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)を製造元のプロトコルにしたがって使用して140μlの上清からRNAを精製した。13.5μlの精製RNAをまず25℃で20分間のDNアーゼ処理に付し、95℃で5分間、DNアーゼを失活させた。次いでDNアーゼ処理RNAの半分を42℃で1時間逆転写した。その逆転写では、M−MLV逆転写酵素(Invitrogen)およびオリゴdTを使用した。合成されたcDNAを5倍希釈してから、リアルタイムPCRで使用した。
非スプライス型および切断型のHSV−tkをpCR2.1 TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングすることによってDNAの標準曲線を作成した。Primer ExpressTM 1.5ソフトウェア(PE Applied Biosystems)を使用して、非スプライス型およびスプライス型のHSV−tkを選択的に増幅して検出できるように、2つの異なる組のプライマーおよびプローブを設計した。TaqMan/ABI PRISM 7700配列検出システムを使用して、HSV−tkのそれぞれの型に特異的な2種類の定量的リアルタイムPCRを準備した。
結果は表1に示される通りである。6種類の臨床用グレードのロットのSFCMM−3ベクターの上清、ならびに形質導入されたリンパ球の9種類の調製物について分析した。
材料および方法
scSFCMM−3レトロウイルスベクターおよび産生細胞株
ベクターDNA TK3(TK3(Molmed)およびTK3は同一プラスミドscSFCMM−3の異なる調製物であり、Chalmers 2001, Molecular Therapy 4:146-148に記載されている)を、リン酸カルシウム共沈によって、エコトロピックパッケージング細胞株GP+ E−86(E86)にトランスフェクトした。E86細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清をろ過し、それを使用してAm12細胞株を感染させた。免疫磁気選択を使用することによってTK3を含有する細胞のフラクションを単離し、得られたAm12/TK3バルク培養を増殖させた。Am12/TK3バルク培養を限界希釈した後、高い増殖能力およびTリンパ球に対する形質導入効率に基づいて、クローン#53、#71、および#80を選択した。
複数の健康なドナーから末梢血単核細胞を収集し、Lymphoprep(Nycomed)で遠心分離することによって単離した。
バルクの産生細胞株(Am12/TK3bulk2)ならびに限界希釈によって得られた単一産生細胞クローン(Am12/TK3#53、#71および#80)を分析した。感染性ウイルス粒子を含有する培養上清からRNAを抽出した。
自動蛍光DNAシーケンス装置を使用して、Am12/TK3#53上清からHTK4+/HTK2−プライマーで増幅された産物の下側のバンドをシーケンシングした。シーケンシングはPRIMM(Milan, Italy)によって行われた。
培養上清のRNAからのHSV−tk RT−PCR
Am12およびE86パッケージング細胞株によって産生されたSFCMM−3ならびにTK3ベクター由来のRNAを分析すると2種類のPCR産物が検出された(図3)。TK3ベクターは、報告されているscSFCMM−3ベクター(Chalmers, 2001)と一致する。主要な産物(上側のバンド)は、すべてのサンプル中で非スプライス型のHSV−tk(HTK4+/HTK2−プライマーの場合は1020塩基対(bp);TKA1/TKB1プライマーの場合は401 bp)に相当する。SFCMM−3サンプル中の少ない方の産物(下側のバンド)のサイズは、227 bpが欠失している報告されているスプライス型に相当する(Garin 2001, Blood 97:122-129)。
SFCMM−3ならびにTK3で形質導入されたPBL由来のDNAを分析すると2種類のPCR産物が検出された(図4)。主要な産物(上側のバンド)は、非スプライス型のHSV−tk(TK2S/TKASプライマーの場合は644 bp;HTK4+/HTK2−プライマーの場合は1020 bp)に相当する。SFCMM−3サンプルでの下側のバンド(報告されているスプライス型に相当する)のサイズは、TK2S/TKASプライマーの場合は417 bpであり、HTK4+/HTK2−プライマーの場合は793 bpである。
SFCMM−3とTK3におけるHSV−tk遺伝子の重要部分の配列は図5に示される通りである。スプライス型のSFCMM−3およびTK3で欠失する遺伝子セグメントは斜体で示される。対応するスプライシングドナー部位およびアクセプター部位には下線が付してある。
材料および方法
野生型SFCMM−3ベクターから出発して、HSV−tk遺伝子中に種々の突然変異を有する組換えプラスミドを部位特異的突然変異誘発によって作製した(図6)。3番目の塩基の縮重変化を導入したが、すべての事例でHSV−tk酵素の野生型アミノ酸配列が保存された。
pcDNA3.1−tkプラスミドを作製するために、SFCMM−3プラスミドをEcoRIおよびXhoIで消化し、EcoRI/XhoIで消化したpcDNA3.1(Invitrogen)にそのEcoRI/XhoI断片をライゲーションした。
10% FBS(Hyclone)および2mMグルタミンを添加したRPMI 1640(Hyclone)中でCEM A301細胞を培養した。SFCMM−3 HSV−tk突然変異体2および234を含有するAm12培養上清でCEM A301細胞を感染させた。形質導入前日に5×105細胞/mlで培養した。次いで細胞上にレトロウイルスベクター粒子の1回の遠心サイクルを施すことによって形質導入を実施した。形質導入段階の後、細胞を収集し、実際に形質導入された細胞のパーセンテージをFACS分析によって評価した。3つの異なるドナー由来のPBLに対して、SFCMM−3 HSV−tk突然変異体2ならびにSFCMM−3を含有するAm12上清で(実施例2の材料および方法の項に記載の通り)形質導入を行った。
E86上清中のHSV−tk突然変異体のスプライシング特性
非スプライス型のHSV−tk(401 bp)に相当する主要な産物(上側のバンド)は、陰性対照(トランスフェクトされていないE86細胞、E86 C−由来の上清)を除くすべてのサンプル中で検出される(図7)。
陰性対照(非感染細胞、Am12 C−由来の上清およびH2O)を除くすべてのサンプル中で、非スプライス型のHSV−tkが検出される(図8)。TkMut4(突然変異4)およびTkMut34(突然変異3+4)突然変異体では下側のバンドが検出され、それぞれ、TK3およびSFCMM−3サンプルの下側のバンドに相当する。臭化エチジウムシグナルの強度はTK3およびSFCMM−3と比較して弱く、その突然変異体ではスプライスされた産物が目立たないことが示される。TkMut2(突然変異2)、TkMut234(突然変異2+3+4)およびTkMut24(突然変異2+4)突然変異体では、このバンドは検出されない。実際には、TkMut2、TkMut234およびTkMut24突然変異体では、約100および200 bpの2つの非常に弱いバンドが検出される。
TkMut2およびTkMut234突然変異体ならびにSFCMM−3およびTK3上清で形質導入されたCEM A301由来のゲノムDNAを、TKA1/TKB1プライマーを使用してPCRによって分析した。陰性対照(形質導入されていない細胞、CEM NT、およびH2O)を除くすべてのサンプル中で、非スプライス型のHSV−tk(401 bp)が検出される(図9)。TK3およびSFCMM−3の選択前および選択後サンプルでは下側のバンドが検出され、それらはスプライス型のHSV−tk遺伝子に相当する。TkMut2およびTkMut234突然変異体で形質導入されたCEMでは、選択前も選択後も、下側のバンドが観察されない。
Claims (32)
- チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号1に示す野生型配列(Tk wt)の329位および330位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも1つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していない、上記ポリヌクレオチド。
- 329位および330位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 330位に対応するヌクレオチドがTからCに換わっている、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号1に示す野生型配列(Tk wt)の329位および330位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも1つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ配列番号1に示す野生型配列の554位および555位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチド、ならびに662位および663位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドは変化していない、上記ポリヌクレオチド。
- 329位および330位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 330位に対応するヌクレオチドがTからCに換わっている、請求項4または5に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号2に示すTkMut2配列を含むポリヌクレオチド。
- チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号1に示す野生型配列(Tk wt)の329位および330位にあるヌクレオチドに対応するスプライスドナー部位ヌクレオチドのうち少なくとも1つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ配列番号1に示す野生型配列の541位および542位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも1つが別のヌクレオチドに置き換えられている、上記ポリヌクレオチド。
- 541位および542位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- 329位および330位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項8または9に記載のポリヌクレオチド。
- 330位に対応するヌクレオチドがTからCに換わっている、請求項8〜10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 541位に対応するヌクレオチドがAからTに換わっている、請求項8〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 542位に対応するヌクレオチドがGからCに換わっている、請求項8〜12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1に示す野生型配列の554位および555位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも1つもまた別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている、請求項8〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 555位に対応するヌクレオチドがGからAに換わっている、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号3に示すTkMut23配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号7に示すTkMut234配列を含むポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド置換が前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの配列を変化させない、請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 医療における使用のための、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- 医療における使用のための、請求項20に記載のベクター。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項20もしくは21に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 医療における使用のための、請求項22に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項20もしくは21に記載のベクター、または請求項22もしくは23に記載の宿主細胞と、製薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
- 医療における使用のための、請求項24に記載の医薬組成物。
- (i) 請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項20もしくは21に記載のベクター、または請求項22もしくは23に記載の宿主細胞、または請求項24もしくは25に記載の医薬組成物、および
(ii)チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される、無毒な薬剤
を含んでなるキット。 - 前記無毒な薬剤が、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、1−[2−デオキシ,2−フルオロ,β−D−アラビノフラノシル]−5−ヨードウラシル、ara−A、ara1、1−β−Dアラビノフラノシルチミン、5−エチル−2’デオキシウリジン、5−ヨード−5’−アミノ−2,5’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、AZT、AIV、ジデオキシシチジン、AraC、およびブロモビニルデオキシウリジン(BVDU)のうちいずれか1つである、請求項26に記載のキット。
- 破壊の必要がある細胞を有する患者の治療における同時の、分離した、もしくは連続的な使用のための、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項20もしくは21に記載のベクター、請求項22もしくは23に記載の宿主細胞、または請求項24もしくは25に記載の医薬組成物と、無毒な薬剤とを含む製品であって、該無毒な薬剤はチミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換されるものである、上記製品。
- 前記無毒な薬剤が、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、1−[2−デオキシ,2−フルオロ,β−D−アラビノフラノシル]−5−ヨードウラシル、ara−A、ara1、1−β−Dアラビノフラノシルチミン、5−エチル−2’デオキシウリジン、5−ヨード−5’−アミノ−2,5’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、AZT、AIV、ジデオキシシチジン、AraC、およびブロモビニルデオキシウリジン(BVDU)のうちいずれか1つである、請求項28に記載の製品。
- 患者における細胞の破壊のための医薬の調製における、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項20もしくは21に記載のベクター、または請求項22もしくは23に記載の宿主細胞の使用。
- 癌の治療のための医薬の調製における、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項20もしくは21に記載のベクター、または請求項22もしくは23に記載の宿主細胞の使用。
- 移植片対宿主病の予防のための医薬の調製における、請求項1〜19のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項20もしくは21に記載のベクター、または請求項22もしくは23に記載の宿主細胞の使用。
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