JPH04504843A - 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 該トランス作用調節因子によりコントロールされ得るシス作用調節配列を有する ポリヌクレオチド構築物、および該細胞を防御あるいは破壊に対して感受性にす るシス作用調節配列のコントロール下にあるエフェクター遺伝子、を挿入する工 程を包含する、方法。

２、前記エフェクター遺伝子が前記細胞を破壊に対して感受性にする、請求項１ に記載の方法。

３、前記エフェクター遺伝子がアンチセンスｍ　ＲＮ　Ａをコードし、該アンチ センスｍ　ＲＮ　Ａが、宿主細胞の必須タンパク質をコードする宿主細胞のｍ　 ＲＮ　Ａに結合し、そして該タンパク質の発現を特徴する請求項２に記載の方法 。

４、前記エフェクター遺伝子が細胞毒性タンパク質を特徴とする請求項２に記載 の方法。

５、前記細胞毒性タンパク質がリボゾーム阻害タンパク質である、請求項４に記 載の方法。

６、前記リボゾーム阻害タンパク質かりシンＡまたはジフテリア毒である、請求 項５に記載の方法。

７、前記エフェクター遺伝子が、宿主細胞のヌクレオシドキナーゼよりも高い割 合でジデオキシヌクレオシドアナログをリン酸化し得るヌクレオシドキナーゼを 特徴とする請求項１に記載の方法。

８、前記エフェクター遺伝子が、前記宿主細胞を保護に対して感受性にする遺伝 子産物を特徴とする請求項１に記載の方法。

９、前記エフェクター遺伝子の産物がアンチセンスｍ　ＲＮＡを含み、該ｍＲＮ Ａが前記感染または過剰増殖障害を阻害し得る、請求項８に記載の方法。

１０、前記アンチセンスｍＲＮＡが、前記感染性物質にコードされるＲＮＡまた は前記過剰増殖障害に特異的なＲＮＡに結合することにより該感染または過剰増 殖障害を特徴する請求項８に記載の方法。

１１、前記感染がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染を特徴する請求項１０に記載 の方法。

１２、前記エフェクター遺伝子産物が、前記感染または過剰増殖障害に関連する 抗原に特異的な抗体を含む、請求項８に記載の方法。

１３、前記エフェクター遺伝子産物が、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、 β−インターフェロン、γ−インターフェロン、トランスフォーミング成長因子 β、阻害ペプチド、インターロイキン２、またはそれらの組合せを特徴する請求 項８に記載の方法。

１４、前記エフェクター遺伝子産物が、感染性物質のタンバク質または前記過剰 増殖障害に特異的なタンパク質のプロセッシングを阻害するプロテアーゼインヒ ビターを含む、請求項８に記載の方法。

１５、前記エフェクター遺伝子産物が、感染性物質のタンパク質、または前記過 剰増殖障害に特異的なタンパク質のグリコジル化またはミリスチル化を阻害する タンパク質を含む、。

請求項８に記載の方法。

１６、前記エフェクター遺伝子産物がリボヌクレアーゼを含む、請求項８に記載 の方法。

１７、前記シス作用調節配列が少なくとも２つの連なったコピーで存在する、請 求項１に記載の方法。

１８、請求項１に記載の方法であって、前記エフェクター遺伝子がポリヌクレオ チド配列の少なくとも２つのコピーと強力な終結領域とを有し、 該ポリヌクレオチド配列の少なくとも２つのコピーが、前記感染性物質または過 剰増殖障害の調節エレメントに相同であって、そして、該感染性物質または該過 剰増殖障害に関連するトランス作用因子に結合する能力を有し、該相同なポリヌ クレオチド配列が、該トランス作用因子について、該感染性物質調節エレメント の領域または該過剰増殖障害の調節エレメントと拮抗する、 方法。

１９、前記感染性物質がＨＩ　Ｖ−１またはＨＩＶ−ＩＩを含み、そして前記活 性化物質がｔａｔを含む、請求項１８に記載の方法。

２０、過剰増殖障害または感染性物質による感染について、宿主細胞を処置する ためのポリヌクレオチド構築物であって、該感染または過剰増殖障害が、ＤＮＡ の発現を調節し得るトランス活性化因子により特徴づけられ、該トランス作用調 節因子によりコントロールされ得るシス作用調節配列、 該細胞を保護あるいは破壊に対して感受性にするシス作用調節配列のコントロー ル下にあるエフェクター遺伝子、を有する構築物。

２１、哺乳動物細胞内で前記構築物を安定に保持するためのポリヌクレオチド保 持配列を特徴とする請求項２ｏに記載の構築物。

２２、前記保持配列がウィルスベクターを含む、請求項２１に記載の構築物。

２３、前記ポリスクレオチド構築物が、ワタシニア、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２， アデノウィルス、またはアデノ関連ウィルスから選択される組み換えウィルスベ クターを含む、請求項２０に記載の構築物。

２４、前記ウィルスベクターが複製欠陥レトロウィルスベクターを含む、請求項 ２２に記載の構築物。

２５、前記複製欠陥レトロウィルスベクターが、ＭＩＶ−１またはＨＩＶ−２由 来のｇｐ１６０”ゞ糖タンパク質を特徴とする請求項２４に記載の構築物。

２６、前記保持配列が遺伝子標的ベクターを含む、請求項２１に記載の構築物。

２７、前記シス作用調節配列がＨＩＶ　ｔａｔタンパク質に応答し得る、請求項 ２０に記載の構築物。

２８、前記エフェクター遺伝子が細胞毒性タンパク質を特徴とする請求項２７に 記載の構築物。

２９、前記細胞毒性タンパク質が、リシンＡまたはジフテリアトキシンを含む、 請求項２８に記載の構築物。

３０、前記エフェクター遺伝子が、宿主細胞のヌクレオシドキナーゼよりも高い 割合でジデオキシヌクレオシドアナログをリン酸化し得るヌクレオシドキナーゼ を特徴とする請求項２１に記載の構築物。

３１、前記ヌクレオシドキナーゼが、Ｈ３Ｖ−１チミジンキナーゼを特徴する請 求項３０に記載の構築物。

３２、ｐＭＸＳＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋである請求項３１に記載の構築物。

３３、過剰増殖障害または感染性物質による感染について宿主細胞を処置するた めの組成物であって、請求項２１に記載のポリヌクレオチド構築物、および薬学 的に受容され得るキャリア、 を含有する組成物。

３４、前記薬学的に受容され得るキャリアがリポソームを特徴する請求項３３に 記載の組成物。

３５、前記リポソームが処置されるべき宿主細胞に特異的な抗体をさらに含有す る、請求項３４に記載の組成物。

３６、生体内の選択された細胞集団を感染または過剰増殖性の形質転換から防御 するだめの方法であって、該細胞にポリヌクレオチド構築物を導入する工程を包 含し、該構築物が、実質的に選択された該細胞集団にのみ見出されるトランス作 用因子の存在下でのみエフェクター遺伝子の発現を促進させるシス作用配列：お よび該シス作用配列のコントロール下にあり、該細胞を防御するか、または防御 に対して感受性にするエフェクター遺伝子を有する、方法。

３７、前記エフェクター遺伝子がヌクレオシドキナーゼを有する、請求項３６に 記載の方法。

３８、前記ヌクレオシドキナーゼが、Ｈ３Ｖ−１ｔｋ。

グアニンキナーゼ、または植物ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを特徴す る 請求項３７に記載の方法。

３９、請求項３８に記載の方法にあって、ジデオキシヌクレオシド抗ウイルス性 物質に抗ウィルス作用を有するのに効果的な量で、該細胞に半ビボで投与する工 程をさらに包含する、方法。

４０、前記シス作用配列がリンパ球内で活性を有する、請求項３９に記載の方法 。

４１、前記抗ウイルス性物質がＡＺＴである、請求項４０に記載の方法。

４２、生体内の選択された細胞集団を感染または過剰増殖性の形質転換から防御 するためのポリヌクレオチド構築物であって、 実質的に選択された該細胞集団にのみ見出されるトランス作用因子の存在下での みエフェクター遺伝子の発現を促進させるシス作用配列；および 該シス作用配列のコントロール下にあり、該細胞を防御するか、または防御に対 して感受性にするエフェクター遺伝子を有する、 構築物。

４３、前記エフェクター遺伝子が、ヌクレオシドキナーゼを有する、請求項４２ に記載の方法。

４４、前記ヌクレオシドキナーゼが、）（ＳＶ−１ｔｋ。

グアニンキナーゼ、または植物ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを特徴す る請求項４３に記載の構築物。

４５、前記シス作用配列がリンパ球内で活性を有する、請求項４４に記載の方法 。

明細書 、　および゛・蜘　の１．の　え　゛ 」 可１−皿 本願は、本明細書に参考としてその全てが援用されている、１９８９年１月２３ 日に出願された同時係属中の米国特許第３００．６３７号の一部継続である。

遺亙立互 本発明は、遺伝子工学に関し、そして過剰増殖障害および感染の処置に関する。

１豆旦！見 ウィルス感染の療法は、まだ初期の段階である。細菌感染は、感染生物と宿主の 代謝の違いを利用して、例えば抗生物質のような物質で代表的には処置される。

しかしウィルスは、その複製を行うにあたって、宿主自身の酵素を大いに用いる 為、薬理学的介入の余地があまりない。ウィルスは、強力な調節エレメントを用 いることにより、宿主の遺伝子を犠牲にして、自分の転写および翻訳を行う。

哺乳類中では、細胞毒性のＴリンパ球が、ウィルス感染を自然に防いでいる。こ のＴリンパ球は、宿主細胞の表面に発現したウィルスのタンパク質を認識し、感 染した細胞を溶解する。感染細胞を破壊することで、ウィルスの新たな複製は防 がれる。他の防御には、タンパク質の合成とウィルスの出芽を阻害するインター フェロンの発現、および体液から遊離ウィルス粒子を取り除く抗生物質の発現が 含まれる。しかし、これらの自然の機構を誘導するには、ウィルスタンパク質を 免疫系に曝す必要がある。例えば単純ヘルペスウィルス１（Ｈ３Ｖ−１）のよ・ うな多くのウィルスは、休止期あるいは潜伏期があり、その間、タンパク質合成 はほとんど、あるいは全く行われない。ウィルス感染は、このような時期におい ては、実質的に免疫系から認識されない。

レトロウィルスは、ＲＮＡ鎖の形で、感染性のゲノムを有している。感染によっ て、ＲＮＡゲノムはＤＮＡに逆転写され、次に代表的には、宿主の染色体ＤＮＡ の中にランダムに組み込まれる。時によって組み込みは、必須の細胞レセプター あるいは成長因子をコードする遺伝子を切断する様な部位に起こるか、またはそ のような遺伝子を、強力なウィルスのシス作用調節エレメントの下流に配置する ような部位に起こる。後者の場合、細胞は、悪性の状態へと形質転換される。

ウィルスはまた、宿主細胞調節配列へのトランス作用調節因子の作用によっても 、腫瘍形成性であり得る。実際、腫瘍形成性は、最初にヒトに感染することが知 られたレトロウィルスの発見の手がかりとなった特徴であった。ＨＴＬＶ−Ｉお よびＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　（ヒトＴ−リンパ栄養性ウィルスＩおよびＩＩ）は、成 人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の患者の血液細胞の中に確認され、トランス活性化因 子のリンパ球プロモーター領域に及ぼす作用によって、腫痛形成の形質転換を誘 発すると思われている。ＨＴＬＶ〜■および■■は、ヒトリンパ球に選択的に感 染し、時によって、それを形質転換で悪性に変える。′それ以来、さらに２つの ヒトに感染するレトロウィルス：　エイズの原因物質であるＨＩＶ−ＩおよびＨ ＩＶ−ＩＩ、が見つけられた。しかし、ＨＩＶ−ＩおよびＩＩは、その免疫抑制 効果によってのみ、がんに寄与するようである。

ＨＩＶ−ＩおよびＩＩは、ＣＤ４表面タンパク質を発現する細胞に感染するよう である。このタンパク質は、胸腺細胞およびあるＴ−リンパ球に豊富に存在し、 ある抗原存在細胞にもある程度存在する。ＨＩＶ感染は、インフルエンザ様の症 状に始まり、その後５年から１０年続（長い潜伏期に入る。

活動期にはいると、ＨＩＶ感染は、「ヘルパー」Ｔ−リンパ球（ＴＨ）の数の急 激な減少を招く。このことは、通常Ｔ４◆／Ｔ８”　（ＣＤ４”／ＣＤ８”）Ｔ −リンパ球の割合の減少によって認識される。患者は典型的には、激しい下痢を 経験し、もし中枢神経系に感染したなら、痴呆症になる。ＴＨ細胞の消耗により 免疫系が機能しな（なり、患者は、例えば、Ｐ、ｃａｒｉｌユあるいはサイトメ ガロウィルスあるいはカポシ肉膿などのような日和見感染に倒れる。自然の免疫 系は、潜伏期の間、典型的には、中和血清抗体価が存在するにもかかわらず、Ｈ ＩＶ感染に対抗することは全（できないように見える。

Ｍ、Ｓ、Ｈｉｒｓｃｈの、Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ（１９８ｇ）ｌｊユニ４２ ７−３１で、ＧＭ−ＣＳＦ　（顆粒球単球コロニー刺激因子）あるいはαインタ ーフェロンとＡＺＴとの組み合せによるＨＩＶへの共同作用的な阻害が報告され てはいるが、ＨＩＶ感染自体に対する現在の療法は、主にウィルスの進行を阻害 するＡＺＴの投与に限られている。ＡＺＴ　（３°−アジド−３°−デオキシチ ミジン）は、ジデオキシヌクレオシド（ｄｄＮ）抗ウィルス物質の群の代表であ る。これらの物質は、宿主ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＮを拒否する能力、および ウィルスのポリメラーゼがｄｄＮを受け入れて、複製しているポリヌクレオチド 中に取り込む傾同に依存している。ｄｄＮが取り込まれると、次のホスホジエス テル結合に必要な３′側の水酸基が欠如しているために、重合反応が停止する。

ｄｄＮは、代表的には、投与されるときは不活性型であり、活性型三リン酸ｄｄ ＮＴＰへの変換は、宿主細胞の酵素によるリン酸化に依存する。

Ｈ，Ｍｉｔｓｕｙａらは、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）　３２５　ニア７３−７８ で、ＨＩＶゲノムの構成を開示し、ＨＩＶ療法の開発のための様々な戦略を提案 した。予想される療法には、ウィルスの転写を阻害するためにアンチセンスＲＮ Ａ　（遊離の鎖としてか、あるいは「アンチウィルス」にコードされる）を投与 すること、グリコジル化阻害剤を投与すること、ウィルスの出芽を阻害するため にインターフェロンを投与すること、およびウィルスの複製を阻害スるためにジ デオキシヌクレオシドのアナローブを投与することが含まれる。ＨＩＶ療法に有 用なジデオキシヌクレオシドアナローブ（例えばＡＺＴＳ　ｄｄＣなど）は、リ ン酸化による活性化のための宿主細胞の酵素によって決まる。

Ｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅは、Ｎａｔｕｒｅ（１９ｇ＋１）３３５：３９５−９６ で、骨髄細胞を、感染している被験体から取り除き、骨髄の抽出物中の造血細胞 に、ＨＩＶの増殖を防ぐことのできるＲＮＡあるいはタンパク質をコードしてい るＤＮＡあるいはウィルスをトランスフェクションすることによって、エイズを 治療することを提案している。このＤＮＡは、ＨＩＶＩｉ節タンパク質、アンチ センスＲＮＡ、変異ウィルスポリペプチド、あるいは調節機能の欠如したウィル スＤＮＡ結合タンパク質に結合するＲＮＡをフードし得る。トランスフェクショ ンされた細胞は、次に被験体に再び導入され、広く行き渡るような選択的な利点 を提供される。

Ａ、　ｉ、Ｄａｙｔｏｎらは、ｃ！ｇＪｉ（１９８６＞４４：９４１−４７で、 ＨＩＶのｔａｔ遺伝子が、ウィルスタンパク質の合成と複製に必須であることを 開示した。Ｄａｙｔｏｎは、あるものは、ｔａｔを妨げることによって、それ以 外には宿主の細胞に影響を与えることな（、ＨＩＶを阻害し得ることを示した。

Ｍ、　Ａ、　Ｍｕｅｓｉｎｇらは、Ｃｅ１ｌ（１９８７）４８：６９１−７０１ で、ｔａｔタンパク質（ｔａｔのｍＲＮＡ単独ではなく）が、トランス活性化に 必須であることを開示した。ＭｕａｓｉＢはまた、ｔａｔ−ａｒｔ融合（ｔａｔ （７）Ｃ末端に、７個のヌクレオチドを欠失させることによって融合させた１１ ４個のアミノ酸を持つ）は、ｔａｔの活性を完全に持っていることを見つけた。

Ａ、Ｄ、　Ｆｒａｎｋｅｌらは、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０　ニア０− ７３で、ｔａｔが、インビトロにおいて金属に結合したダイマーを形成すること を開示し、エイズの為の可能性のある処置法には、金属イオンのキレート化ある いはｔａｔモノマー結合の拮抗を含み得ることを提案した。Ａ、　Ｄ、　Ｆｒａ ｎｋｅｌらは、Ｌｒｏｅ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８８）８５ ：６２９７−３０で、ｔａｔの金属結合性を保持しているＨＩＶ−１ｔａｔ断片 の合成を開示した。この断片は、原型のｔａｔとへテロダイマーを形成し、ホモ ダイマーのｔａｔに置き換わり得る。Ｆｒａｎｋｅｌは、ｔａｔ断片をｔａｔの 二量体形成を阻害するために用いること、リポソームをペプチドあるいはｔａｔ 断片遺伝子を輸送するために用いることを提案した。ＨＩＶ−１の株の１つから のｔａｔで報告されているアミノ酸の配列は以下の通りである：Ｍｅｔ　Ｇｌｕ 　Ｔ’ｒｏ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒ。

Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 ＴｈｒＡｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｐｈ ｅ　ｌｉｅ　ＴｈｒＬｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅａ　Ｇｌｙ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ 　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅ ｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｌｙｓ　ＧｌｕＯｌ低Ｏタンパク質が、ＨＩＶ−２でも見つけられている。

シスに作用し、ＨＩＶ　ｔａｔによって調節されているｔａｒ配列は、ＨＩＶ− １ゲノムの中のヌクレオチドのおよそ＋１９位から＋８２位に見つけられた。こ の配列は、二つの広範なインバーテツド繰り返しを含み、従って、ステムループ 構造を形成し得ると予想される（Ｍｕｅｓｓｆｎｇ、前出）。ＨＩＶ−２は、類 似の領域を持つ。

Ｈａｓｅｌ　ｔ　ｔｎｅは、米国特許第４，７３８，９２２号で、ＨＴＬｖ　Ｉ およびＩＩ’ＬＴＲプロモーター領域を開示し、そしてそれらをトランス活性因 子（ｌｕｋ）と共にベクターに用イ、異種のタンパク質の発現を増幅し、クロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）によって、例証すること を開示した。ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲは、構成的な発現を促進し、そしてこれは更 に、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉｕｋの存在によって増幅される一方、ＨＴＬＶ−１ｆ　Ｌ ＴＲは、発現のためにＨＴＬＶ−ＩＩ　ｌｕｋを必要としているようである。Ｈ ａｓｅｌｔｉｎｅは、ウィルスのトランス作用因子は、宿主細胞の遺伝子および ウィルス遺伝子の発現を変え得ると述べた。

Ｈａｓｅｌ　ｔｉｎｅはまた、異種の遺伝子に融合したＨＴＬＶ　ＬＴＲを有す るベクターを、ＨＴＬＶゲノムを有する細胞にいれると、異種遺伝子のトランス 活性化およびその産物の過剰発現が起こるという考えを開示した。Ｈａｓｅｌｔ ｉｎｅは、空の牛ヤブシドワクチンを産生ずるために、Ｉｕｋの非存在下で、Ｈ ＴＬＶ　ＬＴＲを利用すること開示し、そしてモノクローナルあるいはポリクロ ーナル抗体による細胞の破壊を招（ように、抗原の発現にＨＴＬＶ　ＬＴＲを用 いることを提案した。

Ｅ、Ａ、Ｄｚｉｅｒｚａｋらは、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３ｊｌ：　３５−４ １で、マウスの基本的な遺伝子療法を開示した。Ｄｚｉｅｒｚａｋは、マウスか ら骨髄細胞を取り出し、そのマウスを致死的な放射線に曝し、そしてヒトβ−グ ロビン（ＢＧ）遺伝子を、レトロウィルスベクターであるｐＳＶ　（Ｘ）ｎｅｏ を用いて、その取り出した骨髄に導入した。このＢＧ遺伝子は、プロウィルスの 転写とは逆方間から読まれるように挿入され、ウィルスＬＴＲエン／％ンサー領 域の存在および非存在の両方の構築物が調製された。

次にマウスに造血幹細胞を含む組換え体の骨髄を再導入した。

Ｄｚｉｅｒｚａｋは、ヒトβグロビンが、上記の結果生じた組換えマウスの中で 発現されたこと、および発現は、赤血球系列の細胞の中でのみ見いだされたこと を発見した。Ｊ−Ｋ　Ｙｅｅらは、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ（１９８７）８４：５１９７−２０１で、メタロチオネインプロモーターある いはヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのどちらの制御のもと でもＨＰＲＴをコードするレトロウィルスベクターの構築について開示した。

Ｙｅｅは、転写調節配列がレトロウィルスＬＴＲのＵ３Ｏ域から削られたときに 、ＨＰＲＴの発現は２倍になることを見いだした。

Ｓ、　−Ｆ、　Ｙｕらは、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１ ９８６）　８３：３１９４−９８で、自己不活性（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａ ｔｉｎｇ、”ＳＩＮ”）レトロウィルス遺伝子伝達ベクターの構築を開示した。

ＳＩＮベクターは、３′側ＬＴＲのＵ３領域からプロモーター配列およびエンハ ンサ−配列を取り除くことによって構築された。５′側ＬＴＲの機能的なＵ３領 域は、組換えウィルスゲノムが、適当なパッケージング細胞の中で発現できるよ うにする。しかし、このゲノムＲＮＡの発現、およびｃ　ＤＮＡへの逆転写によ って、もとのプロウィルスの５′側ＬＴＲのＵ３領域は、削除され、３′側ＬＴ ＲのＵ３領域に置き換えられる。従って、ＳＩＮベクターが組み桧みを行うとき 、機能しない３″側ＬＴＲのＵ３領域が、機能的な５″側ＬＴＲのＵ３領域に置 き換わり、ウィルスは、完全な長さのゲノム転写産物を発現できなくなる。Ｙｕ は、Ｍｏ−ＭｕＬＶ　ＬＴＲ領域と、パッケージング（ｐｓｉ）配列を用いて組 換えウィルスを構築した。

そして、選択マーカーとしてネオマイシン耐性（Ｎ　ｅ　ｏ）　遺伝子をメタロ チオネインプロモーター（ウィルスＭＴ−Ｎ）、ＨＳＶ　ｔｋプロモーター（ウ ィルスＴＫ−Ｎ）、あるいはＳＶ４０プロモーター（ウィルス５Ｖ−Ｎ）のいず れかの制御の下流に挿入した。Ｙｕはまた、ヒトメタロチオネインプロモーター （ｈＭＴ）の制御下のヒトｃ−ｆｏｓ遺伝子をＴＫ−Ｎに挿入し、組換えウィル スで感染させた後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のなかでｃ−ｆｏｓの転写が誘導される ことを示した。

Ｓ、Ｌ、Ｍａｎｓｏｕｒらは、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−５２ で、直鎖状トランスフェクションベクターで、相同組換えの後に細胞を選抜する 方法を開示した。直鎖状のベクターは、目的の遺伝子と相同性の領域、相同性の 領域のエクソンに挿入したネオマイシン耐性遺伝子、および相同的な領域以外に ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を持つように調製した。特異的相同組換えによって、形質転 換された細胞には、目的の領域およびＨＳＶ−ｔｋの表現型は現れず、ネオマイ シン耐性の表現型は現れる（目的部位への相同組換えによって、目的部位の遺伝 子は中断され、ｔｋ遺伝子の取り込みはできなくなる）。相同組換えを持つ細胞 と非特異的組み込みを持つ細胞との表現型の違いは、後者は、目的の遺伝子、Ｈ ＳＶ−ｔｋおよびネオマイシン耐性の表現型を示すことである。ネオマイシン耐 性は、ネオマイシンの中で細胞を培養することによって確かめられ、一方ｔｋ“ は、ガンシクロビア（ｔｋによる毒性の産物におおわれている）の中で培養する ことによって確かめられる。

Ｒ，Ｄ、Ｐａ１ｍ１ｔｅｒらは、Ｃｅ１ｌ　（１９８７）８０　：４３５−４３ で、エラスターゼプロモーターの制御のもとにあるジフテリアＡ鎖をコードする ＤＮＡ構築物を有するトランジェニックマウスの調製を開示した。エステラーゼ プロモーターは、膵臓線屑細胞の中でのみ活性があり、エステラーゼの発現を促 進する。ＤＮＡ構築物は、マウス卵子にマイクロインジェクトされ、できた子供 を調べた。この構築物が活性型であるトランスジェニックマウスでは、正常な膵 臓組織を形成できなかった。

Ｍ、Ｅ、５ｅｌｓｔｅｄらは、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ（１９８５）７６： １４３１ｉ−３９で、３つの関連した、ヒト好中球抗菌ペプチド（ＨＮＰＳ）と 呼ばれる、ヒト細胞毒性エフェクターペプチドのアミノ酸−次配列を開示した。

３つのＨＮＰは、２９−３０個のアミノ酸残基を有し、細菌、菌類および単純ヘ ルペスウィルスに対抗する活性を持ツ（Ｔ、Ｇａｎｔｚら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎ ｖｅｓｔ　（１９８５）　７６：１４２７−３５）。

Ｔ、　Ｌ、　Ｗａｓ＋ｏｏｅｎらは、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８８）　 ２６３：１２５５９−６３で、ヒト好酸球顆粒主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ） のアミノ酸−次配列を開示した。ＭＢＰは、１１７個のアミノ酸残基を有し、ｐ Ｉが１０．９のエフェクターポリペプチドで、哺乳類の細胞および寄生体に対し 細胞毒性活性を持つ。

Ｍ、　Ａ、　Ａｄａｍらは、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ（１９８８）　６２：３８０２−０ ６で、ｐｓｆ＋配列を持ち、効率的なＲＮＡパッケージングを行う、レトロウィ ルスベクターを開示した。Ｒ，Ｄ、　Ｃｏｎｅらは、Ｍｏｌ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ（１９８７）ヱ：８８７−９７で、ヒトβ−グロビン遺伝子を含むレトロウィ ルスベクター（ｐＳＶＸ）の構築およびヒトβ−グロビンの発現をマウス赤白血 病細胞の中で行わせるための、そのベクターの利用を開示した。　Ａ、Ｄ、Ｍｉ ｌｌｅｒらは、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ（１９８６）６：２８９５−９０２ で、不完全複製レトロウィルスベクターのパッケージングに有用な細胞株を開示 した。

Ｇｕｉ　ｌｄらは、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ（１９８８）６２：３７９５−８０１で、Ｍ 　ｏ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　ＶＬＴＲｓおよびｐｓｉ（パッケージング）配列を用い、 遺伝子全体を哺乳類の細胞に移入するのに有用なレトロウィルスベクターを開示 した。Ｇｕｉｌｄは、βアクチンおよびヒストンプロモーター（本質的に全ての 細胞内で活性がある）を用いてｎｅｏ’（選択マーカーとして）の転写を行なわ せた。

ｎｅｏ’の発現は、ウィルス感染した骨髄細胞を致死量の放射線を浴びたマウス の再構成に用いた後、インビボで行われた。

Ａ、　ｏ、　Ｆｒ　ｉｅｄｍａｎらは、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８８）　３３５： ４５２−５４で、　ｔｋ−マウス細胞のＨＳＶ−１ｔｋおよびＨＳＶ−Ｉ　ＶＰ １６発現のプラスミドによる形質転換を開示した。ＶＰ１６は、単純ヘルペスウ ィルス（ＨＳＶ−１）の極初期遺伝子の転写の為のトランスアクティベーターと して作用する。ＶＰ１６ブラスミド上では、プロモーターはＭｏ−ＭＳＶプロモ ーターに置き換えられ、ＶＰ１６のＣ末端は除去された。その結果生じたプラス ミドは変異ＶＰ１６タンノ寸り質をコードし、このタンパク質は、野生型のＶＰ １６とＤＮＡ結合において拮抗する。形質転換した細胞は、その後の感染による ＨＳＶ−１の複製に耐性を示す。Ｆｒｉｅｄｍａｎは、ＨＩＶ）ランスアクチベ ータータンパク質（ｔａｔ）の優性変異体の形質転換によって、ＨＩＶへの耐性 を誘導し得ることを提案した。

Ｊ、５ｏｄｒｏｓｋｉらは、５ｃｔｅｎｃｅ　（１９８５）　２２９ニア４−７ ７で、ＨＩＶｔａｔ遺伝子の位置を開示した。Ｊ、　５ｏｄｒｏｓｋｔらは、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２７：１７１−７３テ、ＨＩＶ　ＬＴＲ（７ ）制御ノらトニＣＡＴを有するプラスミドの構築を開示した。ＨＩＶ　ＬＴＲは 、ｔａｔによって誘導されるトランス活性化領域（ｔａｒ）遺伝子を含む。５ｏ ｄｒｏｓｋｉは、トランス活性化因子がＨＩＶ　ＬＴＲの制御のもとにある遺伝 子の転写を誘導することを見いだした。Ｂ、　Ｍ、　Ｐｅｔｅｒｌｉｎ　らは、 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８６）８３：９７３４− ３８で、ＨＩＶｔａｒ遺伝子を持つプラスミド、および、ｔａｔによるトランス 活性化に及ぼされるｔａｒの配向および位置の影響を開示した。Ｐｅｔｅｒｌ　 ｉｎは、ｔａｒは、プロモーターおよびエフェクターの下流に位置して０る時に 、最もよく機能することを見いだした。ｔａｔの活性化によって、ＲＮＡへの転 写が高まった。Ｇ、Ｊ、Ｎａｂｅｌらは、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９１１１８’） 　２３９：１２９９−３０２で、ＨＩＶ　ｔａｔ−ＩＩＩ−ＣＡＴ融合プラスミ ドがＨＳＶおよびアデノウィルストランス作用因子によって活性化され得ること を開示した。

Ｂ、　Ｋ、　Ｆｅ１ｂｅｒらは、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２３９：１８ ４−８７で、ＨＩＶＬＴＨの制御のもとにあるクロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子でトランスフェクションを行ったＣＤ４発現 細胞株を用いたＨＩＶの為のアッセイを開示した。ＨＩＶの感染によって、トラ ンスフェクションされた細胞株は、ウィルスの存在量に比例して、ＣＡＴを発現 する。Ｆｅ１ｂｅｒは、このアッセイを、ウィルス増殖を阻害する能力を持つ可 能性のある抗ＨＩＶ剤のスクリーニング、および抗ｔａｔ剤の同定の為の手段と して用いることを提案した。

１五二肌丞 本発明の１つは、感染あるいは過剰増殖障害の宿主細胞を処置する方法である。

この方法は、ＤＮＡの転写を制御し得る調節因子の発現、調節因子によって活性 化される調節領域を持つポリヌクレオチド構築物の宿主細胞への挿入、およびそ の細胞を防御あるいは破壊に対して感受性にする、調節領域の制御のもとにある エフェクター遺伝子、によって特徴づけられる。その遺伝子産物は、細胞毒の場 合のように直接細胞を破壊し得るか、あるいは細胞の薬理学的な物質による破壊 への感受性を高め得る。その他には、その遺伝子産物□は、直接、例えば結合部 位への拮抗、アンチセンスＲＮＡの結合、タンパク質阻害剤あるいは抗体の発現 、配列特異的リボザイムの発現、および抗ウィルス化合物を活性化する酵素の発 現等によって、感染性あるいは悪性の物質を阻害し得る。例えば、活性化領域は 、ＨＩＶ　ｔａｒ領域に相同であり得、エフェクター遺伝子は、リシンＡある０ はＨＳＶ−１チミジンキナーゼをコードし得る。ＨＩＶによる感染で、ＨＩＶ　 ｔａｔタンパク質は、ｔａｒ領域を活性化し、リシンＡの転写と発現を誘導し、 結果として細胞が死ぬか、あるいは）ＩＳＶ−１ｔｋの転写と発現の誘導で、ガ ンシクロビアのようなジデオキシヌクレオシド剤で処置されたとき、結果として 細胞毒性となる。　本発明の他の１つは、本発明の方法を成し遂げるＤＮＡ構築 物である。

本発明の他の１つは、本発明のＤＮＡ組成物を宿主細胞（こ導入するのに有用な 構成物である。

本発明の他の１つは、ある生物の特定の細胞集団を、その集団の細胞の中に、シ ス作用配列を含むポリヌクレオチド構築物を挿入することによってウィルス感染 から防御する方法である。このシス作用配列は、実質的に選抜された細胞集団に しか見いだされないトランス作用因子が存在するとき↓このみ近くの遺伝子の発 現を促進し、そしてこのシス作用配列の制御のもとには、細胞を防御するかある いは防御に対して感受性にするエフェクター遺伝子が存在する。好ましくは、こ のシス作用配列は宿主に由来する。このエフェクター遺伝子は、好ましくは）（ ＳＶ−１チミジンキナーゼのようなヌクレオシドキナーゼである。

本発明の他の１つは、選抜された細胞集団を感染から防御するのに有用なポリヌ クレトチド構築物である。この構築物は、実質的に選抜された細胞集団にしか見 いだされな０トランス作用因子が存在するときにのみ近くの遺伝子の発現を促進 するようなシス作用配列を含み、そしてこのシス作用配列の制御のもとには、細 胞を防御するかあるいは防御ζこ対して感受性にするエフェクター遺伝子が存在 する。好ましくは、このシス作用配列は宿主に由来する。このエフェクター遺伝 子は、好ましくはＨＳＶ−１チミジンキナーゼのようなヌクレオシドキナーゼで ある。

区工！ＪロＩＬＩ咀 第１図は、本発明の一般的なポリヌクレトチド構築物の図である。

第２図は、ベクターｐＴＢ１の図である。

第３図は、ベクターｐＭＸＳＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋの図である。

第４図は、実施例５に記載の実験の結果をグラフ（こしたものである。

第５図は、実施例４に記載の実験の結果をグラフζこしたも本明細書の用語「処 置」は、被験体の症状を減少ある１、Ｎま緩和すること、症状の悪化あるいは進 行を防ぐこと、原因物質の阻害あるいは除去を行うこと、または症状のない被験 体の感染あるいは障害を防ぐことを意味する。従って、例えばがん患者の処置と は、膿瘍の大きさを減少させること、悪性の細胞を除去すること、転移の防止を すること、あるいは治癒した患者の再発を防ぐことであり得る。感染の処置には 、感染物質の破壊、成長あるいは成熟の阻害または妨害、および病的な影響の中 和などが含まれる。

本明細書の用語「感染」は、ウィルス、細菌、菌類、または住血鞭毛虫およびマ ラリア寄生体のような他の寄生体による感染を包含する。本発明の範囲で「感染 性物質」とは、ＨＩＶ−Ｌ　ＨＩＶ−Ｉ　Ｌ　ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｌ 単純ヘルペスウィルス（Ｈ９Ｖ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタ インパールウィルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウィルス（ＨＰ　Ｖ）、Ｂ型肝 炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、およびポリオウィルス 等のようなウィルス；　Ｂ　ｅｒｔｕｓｓｔｓ、　および破傷風、ジフテリア、 コレラのような細菌；　Ｍ　ｔ　ｕ　ｂ　ｅ　ｒ　ｃ　ｕ　１な酵母および菌類 ；マラリアのＰｌａｓｍｏｄｉａ、およびｇｉａｒｄｆａの様な寄生体を含む。

本発明のある方法および構築物は、ウィルス、マラリアなどのような細胞内感染 性物質に最も適しており、他の方法および構築物は、細胞外感染に適している。

用語「過剰増殖障害」は、例えばがん、乾せん、過形成等のような細胞の異常な 、あるいは病的な増殖によって特徴付けられる障害を言う。

用語「シス作用調節配列」は、トランス作用因子に反応し得、シス配置の遺伝子 の転写を高め得るポリヌクレオチド配列のことを言う。最も適当なシス作用調節 配列は、これから対抗する感染性の物質の由来である。例えば、ＨＩ　Ｖ−ＩＬ ＴＲのｔａｒ領域は、ＨＩ　Ｖ−１の処置に適するシス作用調節配列である。細 胞の型に特異的な発現が望まれる場合、例えば、Ｔ細胞には、ＣＤ２抗原（Ｇｅ ｎｂａｎｋ　ＨＵＭＡＴＣＣＤ２）、ＩＬ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＩＬ２ Ａ）、ＩＬ−２受容体（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＩＬ２Ｒ１）、ＣＤＩ抗原（Ｇ ｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＨＴＡＩ）、ＣＤ３抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＡＴＣ Ｔ３１）、ＣＤ４抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＡＴＣＴ４）、Ｔ細胞プロテア ーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＭＵＳＳＰＴＣ８）；　Ｂ細胞には、ＩｇＧ　（Ｇｅｎ ｂａｎｋ　ＨＵＭＩＧＣＡＩ）、ＭＭＣ−１抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＭＨ Ａ２）；マクロファージには、Ｍａｃ−１抗原（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＬＡＰ ）、■Ｌ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＵＭＩＬＩＰ）などの様なシス作用配列を用 い得る。シス作用調節配列は、内性的なシス作用調節部位との拮抗性を高めるた めに、多数の連なったコピーで用い得る。過剰増殖障害（特にがん）の処置に適 する配列は、知られている腫瘍形成タンパク質の結合部位から得られるか、ある いは発現が腫瘍形成遺伝子によって変更されることが知られているタンパク質の 同定によって得られる。シス作用調節配列は、細胞が、防御あるいは破壊に感受 性になるに十分なエフェクター遺伝子の発現をさせ得るものである必要がある。

この時、この調節配列は、トランス作用因子不在下では実質的な構成的発現を行 なわず、トランス作用因子によって活性化される。シス作用配列の選択は、処置 するべき感染あるいは障害と関連しているトランス作用因子、および選択したエ フェクター遺伝子に依存する。例えば、ＨＩＶＬＴＲは、ＨＩＶｔａｔに特異性 の高いｔａｒ領域および内性的な核因子ＮＦ−にＢによって活性化される領域（ ＬＴＲはＮ　Ｆ　−Ｋ　Ｂ結合領域の連なりを有する）の両方を含む。ｔａｒ配 列は、ｔａｔの非存在下では、発現を強く抑制している（例えばＭｕｅｓｉｎｇ 、Ｐｅｔｅｒｌｆｎ、前出）が、ｔａｒ配列の上流にあるシス作用エレメントは 、ｔａｔの不在中に起こる構成的発現（漏れ）の程度に影響を与える。

ｔａｔ不在下における漏れの程度は、ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲの中のシス作用エレメ ント（例えばＮＦ−にＢ結合部位）の欠失あるいは置換によって制御し得る。ｔ ａｒ配列をリシンＡ（細胞内の非常に低い濃度で効果的である）のようなエフェ クター遺伝子と共に用いるために、宿主細胞にベクターを導入する前にＮＦ−に Ｂ結合部位を制限酵素を用いて取り除き得る。

これに対して、エフェクター遺伝子が宿主細胞に対して特に毒性がないような産 物をコードする（例えば、休止期のＴリンパ球に見いだされたｒｐｔ−１タンパ ク質：　Ｐａｔａｒｃａ、前出を参照のこと）が、ウィルスの阻害に影響するた めにはより高い濃度を必要とする場合、誘導によって強力な発現を行うようなシ ス作用配列を用いる必要があるが、ある程度の低いレベルの構成的発現は有り得 る。

［防御あるいは破壊に対して感受性がある］という言葉は、感染あるいは過剰増 殖障害の発生において、宿主細胞のエフェクター遺伝子の存在が、細胞を以下の いずれかの状態にする＝　（ａ）感染性の物質あるいは過剰増殖の状態を阻害し 得る、あるいは（ｂ）エフェクター遺伝子が宿主細胞を殺すかあるいは細胞を追 加の外来性毒性物質に対して感受性にする。

追加の「毒性物質」には、宿主の免疫系あるいは抗体は含まれない。これは、免 疫が、感染あるいは過剰増殖の疾患に対して、抑制されるかあるいは効果がない こ・とが多いからである。感染の阻害は、感染性物質にとって必要な栄養あるい は代謝物（たとえばプリンヌクレオチドあるいはピリミジンヌクレオチド、炭水 化物、リン酸塩など）、感染性物質に必要な負の調節を行う宿主の酵素（たとえ ば、リボゾーム群の酵素、内在性プロテアーゼ、タンパク質折りたたみ酵素、輸 送タンパク質など）、感染性物質に用いられる負の調節を行う宿主細胞調節因子 （例えば、活性化リンパ球に見いだされ、ＨＩ　Ｖ　−１転写の正の調節をする ＮＦ−にＢ核因子）、宿主細胞を有糸分裂のサイクルにおける静止期にとどめお （（あるウィルスおよび過剰増殖障害において）ことによって、ウィルス遺伝子 の発現を抑制するようなウィルスあるいは宿主細胞の正の調節を行う因子、等の 細胞内におけるレベルを減らすことによってなされ得る。

阻害はまた、例えば、重要な感染物質調節因子に結合して阻害あるいは不活性化 を起こすような因子を発現すること、感染物質の発現の負の調節を行うような宿 主調節因子あるいは感染物質調節因子を発現すること（例えば、潜伏期のあるウ ィルスは、強力な調節領域によって、構成的発現を防ぐ因子を持つ必要がある。

）、非感染性で、感染性物質のコート、エンベロープ、あるいはキャプシドタン パク質の欠陥変異体を発現すること、ポリヌクレオチド結合配列の多数のコピー をコードすること（その配列が、感染性物質調節物質と結合を拮抗し、その結果 その物質の転写を制限するように）、感染性物質のタンパク質、脂質、あるいは 炭水化物を破壊するような（好中球好機生物タンパク質、好酸球顆粒主要塩基性 タンパク質など）、または感染性物質酵素群によるプロセッシングを阻害あるい は防止するような因子の発現などのような、感染性物質の生活環を妨害すること によってもなされ得る。その他には、感染性物質を妨害するあるいは阻害し得る 、または例えばインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー 刺激因子、形質転換成長因子（αおよびβ）、表皮成長因子等のような細胞毒性 で有り得るサイトカインをコードし得る。サイトカインの発現はまた、過剰増殖 障害の処置に有用である。例えば、サイトカインは、腫瘍を直接阻害あるいは殺 し得、または最終（悪性でない）段階への分化を誘導し得る。過剰増殖障害はま た、適当な任意の前記の他の方法を用いても処置され得る。例えば、細胞機能（ 例えば有糸分裂のサイクル、蛋白の発現など）の阻害は、増殖を阻害し得る。

細胞毒性技術には、リシンＡ１　ジフテリア毒等のような細胞毒の直接の発現が 含まれ得るか、あるいは前記の方法のいずれかを細胞を死なせる程度に用い得る （例えば細胞の呼吸の完全な阻害）。その他では、細胞を、付加する物質に対し て感受性にするような酵素あるいはタンパク質を発現し得るかあるいはＡＺＴの ような抗ウイルス物質の効力を高め得る。

前者の例としては、例えばヌクレオシドキナーゼの発現が高められると、宿主細 胞は、ガンシクロビアあるいはアシクロビアの作用に対して感受性になる。Ａ　 Ｚ　Ｔ、ジデオキシシチヂン、アシクロビア、ガンシクロビアなどのようなジデ オキシヌクレオシドアナローブ（ｄｄＮ）は、リン酸化されていない形では比較 的毒性が少ない。しかし、特異的なウィルスあるいは細胞内酵素は、ｄｄＮを対 応する三リン酸化物の形に変え得、その時その物質は、転写あるいは複製の途中 で、鎖の停止反応を起こす。ｄｄＮの利用は、以下の事実に基づ＜：　（１）ウ ィルスのポリメラーゼは、哺乳類のポリメラーゼより、ｄｄＮに対して高い親和 性を示す；　および（２）あるウィルスヌクレオシドキナーゼは、哺乳類のキナ ーゼより、ｄｄＮのリン酸化を高い割合で行う。従って、ウィルス酵素（および それに一致するウィルス遺伝子）は、哺乳類の酵素および遺伝子よりも鎖の停止 反応が起こりやすい。ＨＳＶ−１チミジン牛ナーゼ（ＨＳＶ−１ｔｋ）は、効率 よくｄｄＮを対応する三リン酸化物に変え、従って、活性型ＨＳＶ−１ｔｋを持 つ細胞を、ｄｄＮに対してより感受性に変える。

（以下　余白） 用語「エフェクター遺伝子」とは、発現（トランス作用因子のシス作用調節配列 上に及ぼす作用による）すると、上記に定義されているように、宿主細胞を防御 あるいは破壊に対して感受性にするようなポリヌクレオチド配列のことをいう。

本発明の範囲において、細胞毒性タンパク質とは、通常のウィルス調節領域によ って制御される毒性になり得るウィルスのタンパク質を含まない。エフェクター 遺伝子は、使用するシス作Ｍ調節領域に自然には制御されない遺伝子でなければ ならない。適切なエフェクター遺伝子の一クラスには、ヌクレオシドキナーゼを コードする遺伝子が含まれる。このキナーゼは、ジデオキシヌクレオシドアナロ ーブをリン酸化し得るし、その活性は宿主細胞のヌクレオシドキナーゼより高い 。

例としては、ＨＳＶ−１チミジン牛ナーゼ、グアニンキナーゼ、植物ヌクレオシ ドホスホトランスフェラーゼ、Ｌａｉｓｈｍａｎンスフェラーゼ、およびヌクレ オシド抗ウィルス剤あるいは化学療法剤を活性化し得るヌクレオシドの代謝に関 与している他の適切な酵素が挙げられる。エフェクター遺伝子の他のクラスには 、アンチセンスｍ　ＲＮ　Ａ、　およびリボザイムのようなｍＲＮＡレベルで機 能する遺伝子が含まれる（Ｖ、　Ｗａｌｂ。

ｔら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８８）　３３４：１９６−９７）。エフェクター遺 伝子の別のクラスには、抗ウィルスあるいは抗過剰増殖障害に有用なサイトカイ ン、例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γイン ターフェロン、トランスフォーミング成長因子−β、阻害ペプチド、およびイン ターロイ牛ン２、をコードする遺伝子が含まれる。本発明における他のエフェク ター遺伝子には、必須タンパク質のプロセシングを阻害し得るプロテアーゼイン ヒビター、およびウィルスのタンパク質におけるグリコジル化、リン酸化、ある いはミリスチル化の阻害剤が含まれる。リボヌクレアーゼも適当テある。

代わりに、多数のシス作用配列を強い終結配列と共に供給することによってトラ ンス作用因子を「中和」し得る。

細胞特異的発現という面においては、エフェクター遺伝子は細胞に対し、破壊に ではなく防御に対する感受性を与えなければならない。すなわち、ＴＨ細胞クラ スのようなりラスの全細胞の削除が避けられる。この技術がＡＺＴのような４１ の抗ウィルスおよび化学療法剤の治癒比を高めるのに用いられ得る。例えば、Ａ ＺＴはＨＩＶの複製を阻害するが、骨髄細胞に対して比較的毒性である。Ｔリン ８球はＨＩＶ感染で通常感染し、ＡＺＴに対してより耐性である。Ｔリン８球中 でのみ、例えば、ＨＳＶ−１ｔｋを発現するポリヌクレオチド構築物（例えば、 ＣＤ４抗原プロモーターの制御下に）を、骨髄吸引液にトランスフェクションし て、これラノ細胞を被検体へ再導入して、そして通常の投与量より少量のＡＺＴ を投与することにより、（骨髄内の）感受性幹細胞内のリン酸化ＡＺＴのレベル を増加させることなく、耐性１９７８球におけるリン酸化ＡＺＴの細胞内濃度を 高め得る。

本発明のポリヌクレオチド構築物は、シス作用配列およびエフェクター遺伝子を 用いることによって、自己免疫疾患の処置のためにも設計され得る。用いられる シス作用配列は、処置される特定の自己免疫疾患に関係する特殊な免疫細胞に特 徴的なトランス作用因子に応答し、用いられるエフェクター遺伝子は、これらの 細胞の活性を抑制する。

用語「アンチセンスｍＲＮＡＪとは、ｍＲＮＡの「センス」鎖と相補的であり、 それと２本鎖ＲＮＡ複合体を形成し得るｍＲＮＡのことをいう。ｍＲＮＡのハイ ブリッド形成は、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻害する。従って、 アンチセンスｍＲＮＡは、非常に特異的なタンパク質合成の阻害剤として作用す る。アンチセンスｍＲＮＡは、例えば、ウィルスタンパク質のｍＲＮＡあるいは 活性型腫瘍遺伝子から転写されるｍＲＮＡに相補的ならば、防御的に機能し得る 。

アンチセンスｍＲＮＡは、例えば、有効な代替経路を有しないハウスキーピング 酵素のような宿主細胞の必須の酵素に相補的である場合、あるいは宿主細胞を代 替経路を阻害する薬剤に対し感受性にする場合、破壊的であり得る。オリゴデオ キシヌクレオチドを用いてレトロウィルスの複製および腫瘍増殖を阻害すること を開示している、Ｇ、ＺｏｎらのＥＰ２８８．１８３も参照。

用語「リボザイム」とは、特定の配列におけるＲＮＡ切断を触媒し得る触媒的な ＲＮＡポリヌクレオチドのことをいう。

リボザイムは特殊なｍＲＮＡ分子を攻撃するのに有用である。

例えば、慢性骨髄性白血病では、ｂｃｒおよびａｂｌ遺伝子（フィラデルフィア 染色体）に関係する染色体の転座によって、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質が発 現する。これにより、ａｂｌ腫瘍タンパク質が異常に機能する結果となると考え られる。ｂｃｒおよびａｂｌ遺伝子の融合が２つのイントロンのうちの１つに起 こるため、スプライシングされたｂｃｒ−ａｂｌ融合転写産物はｂｃｒとａｂｌ エキソンの間のスプライシング接合の所にただ２つの可能な配列を含有する。ｂ ｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡはこの膿瘍形成性染色体転座が起こったリンパ細胞だけ に存在するため、ｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡの２つのスプライシング接合箇所 のいずれかに特異的なりボザイムが調製され、従って、対応する腫瘍タンパク質 の発現を阻害し得る。

本明細書の用語「ベクター」は、シス作用調節配列および選択されたエフェクタ ー遺伝子をコードし得、これらの遺伝子を適当な標的細胞に導入し得るポリヌク レオチド構築物のことを指す。ベクターは、直鎖状あるいは環状であり、２本鎖 あるいは１本鎖であり得る。ベクターは、ＤＮＡ５　ＲＮＡ。

ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および化学的に修飾された塩基をもつＤＮＡおよ び／あるいはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。本発明の範囲内の適切なベク ターには、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片、プラスミド、組換えウィルス（例えば、組 換えワクシニアウィルス、アデノウィルス、アゾン関連ウィルス、など）、複製 欠陥レトロウィルスベクター（ヒト、サル、ネズミ、などを含む）、複製能力の あるレトロウィルスベクターの適切な非病原性誘導体、その他が含まれる。複製 欠陥レトロウィルスベクターは、ここで好ましい。

Ｂ、二肢五呈立ま ポリヌクレオチド構築物の調製は、当分野において一般的に知られている方法を 用いて行われる。感染性物質あるいは過剰増殖障害が処置するために選択された ならば、第一の段階は関連のトランス作用因子、適当なシス作用配列およびエフ ェクター遺伝子を同定することである。

いくつかのウィルスのトランス作用因子は既に知られ、性質が調べられている。

他のウィルスのトランス作用因子はクローン化されたウィルスゲノムの欠損解析 により同定され得る。例えば、新規のウィルスが、標準的な技術を用いてクロー ン化され、塩基配列が決定され得、読み取り枠が同定され得る。次に、欠損突然 変異体が制限酵素を用いて調製され、突然変異ウィルスが適切な宿主細胞におけ る転写能力がアッセイされる。非常に低いｍＲＮＡの転写を示す突然変異体はお そらく、トランス作用因子をコードする遺伝子あるいはシス作用調節配列のいず れかを欠損している。欠損がトランス作用因子あるいはシス作用配列のどちらに 影響を与えているかは、ゲノム配列の位置および成分を調べることにより一般的 に決定され得る（例えば、ウィルスのシス作用調節配列は一般的に読み取り枠の 上流に存在する）。ウィルスのシス作用領域の配列は既知のシス作用領域との相 同性が比較され得る。相同のシス作用配列は同一のトランス作用因子と作用し得 るので、従って適切な内在性トランス作用因子が同定され得る。あるいはウィル スのタンパク質が適切な宿主（例えば、バクテリア、酵母、哺乳類動物培養細胞 ）で組換え体によって発現し、精製した抽出液を標識し、そしてウィルスのゲノ ムライブラリーに対する結合性を指標にスクリーニングし得る。このようにして 、適切なトランス作用因子／シス作用配列の組合わせが同定され得る。その組合 わせの適合性は以下においておよび実施例において詳述されるＣＡＴ発現アッセ イ法を用いて評価され得る。これらのアッセイでは、シス作用配列が適切なベク ターにクローン化され、そして適切なレポーター遺伝子（例えば、ＣＡＴ、βガ ラクトシダーゼ、など）が、シス制御を与えるためにそのシス作用配列に連結さ れる。次に、テスト構築物が適切な宿主細胞（例えば、哺乳類動物培養細胞）に 導入され、トランス作用因子の存在下および非存在下においてレポーター遺伝子 の発現がアッセイされる。適切なエフェクター遺伝子は当分野において知られて いるか、あるいは標準的な技術を用いてクローン化され得る。

細胞内寄生体（ウィルスを含む）がインターフェロンの発現をしばしば誘導する 。従って、インターフェロンのシス作用配列の単離によって抗寄生体応答に関与 するトランス作用因子の同定、および本発明の適切なポリヌクレオチド構築物の 調製が可能になる。

過剰増殖障害は不適切な遺伝子制御あるいは遺伝子産物の活性によって特徴づけ られる。これらは代表的には細胞増殖あるいは分化因子を含み、そして時には構 造タンパク質をコードする遺伝子を含む。不適切な遺伝子制御は、機能不全のト ランス作用因子（例えば、先端の切断あるいは突然変異が因子による阻害を除去 した因子、あるいは不可逆的に結合する因子、など）の発現、トランス作用因子 あるいはレセプターの大量発現（例えば、転座により強力なプロモーターに並置 されるため）、あるいは他の欠陥により引き起こされ得る。

いずれにせよ、この障害の特徴は、トランス作用因子が正常細胞に存在する因子 と異なるか、あるいは異常に大量に存在することにある。過剰増殖障害と関連す るウィルス（例えば、ＨＴＬＶ−ＩＳＨＴＬＶ−Ｉ　Ｌ　ＨＰＶ１６型および１ ８型のＥ６およびＥ７遺伝子）にコードされているトランス作用因子は、ここで 記述されているように、エフェクター遺伝子の発現を制御するのにも用いられ得 る。影響を受けたシス作用配列が同定されたならば、適切なエフェクター遺伝子 が選択され得る。特徴的なトランス作用因子は一般的に正常なトランス作用因子 と少なくともある程度相同であるので、シス作用配列は正常細胞の内在性のトラ ンス作用因子によりおそらくある程度制御される。従って、過剰増殖障害の処置 に好ましいエフェクター遺伝子は、低濃度では宿主細胞に対し比較的毒性のない ものである。しかしながら、過剰増殖障害においてはトランス作用因子の活性は 構成的に高くなり得るが、一方正常細胞では活性はく細胞周期の間のように）よ り低く、変動し得る。この相違を利用して、エフェクター遺伝子産物を過形成細 胞中に高レベルに蓄積させ得る。

同様にして、多（の細胞型特異的トランス作用因子およびシス作用調節配列は既 に発見され、文献に記載されている。

さらに多くのシス作用調節配列は上記に概略した方法を用いて決定され得る。い くつかの例においては、過剰増殖障害と関連するトランス作用因子およびそのシ ス作用調節配列が正常な細胞型特異的トランス作用因子および調節配列と同一で あり得ることに留意されたい。このような場合には、過剰増殖障害は代表的には 過剰濃度のトランス作用因子によって引き起こされる。従って、エフェクター遺 伝子は注意深く選択されなければならない。

図１に、本発明の一般的なレトロウィルスベクターが示されている。このベクタ ーは、レトロウィルスの５′側ＬＴＲおよびプライマー結合部位（上）、ｐＳｉ エンキャプシデーシ１ン（パブケージング）シグナル配列（１）、任意の３′Ｒ ＮＡプロセシングシグナル配列（ｉ）、エフェクター遺伝子（４）、プロモータ ーを含む５′　シス作用調節配列（１）、任意のプロモーター（１）および選択 マーカー遺伝子（７）、およびレトロウィルスの３′側ＬＴＲおよびプライマー 結合部位（８）を包含する。配列上〜ｌはベクターのレトロウィルス部分を構成 し、配列１は代表的にはプラスミド由来であり、培養細胞におけるベクターの保 持に機能する。５′側ＬＴＲ（１）および３′側ＬＴＲ（８）は逆転写およびベ クターの宿主細胞ゲノムへの挿入に働く。適切なＬＴＲはモロニーマウス白血病 ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）　（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８ １）　２９３＋５４３）、ハーウ゛エイマウス肉腫ウィルス（Ｈａ　−Ｍ　Ｓ　 Ｖ）　（’／ａｎ　Ｂｅｖｅｒａｎら、釦１ユ（１９８１）　２７：９７）、　 ＨＴＬＶ−ＩＳＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ−１、およびＨＩＶ−２由来のものを含 む。複製欠陥レトロウィルスでは、３′側ＬＴＲ（８）のＵ３領域が不活性化さ れている。ベクターがパッケージング細胞株で産生されるウィルスキャプシドに 包まれるために、ｐＳｉ配列（２）は含まれなければならない。

その代わりに、一旦宿主ゲツムに組み込まれるとこの配列は不活性になる。適切 なｐｓｉ配列は、Ｃｅｐｋｏら（Ｃｅｌ　１　（１９Ｂ４）３７　：１０５３− ６２）、Ｇｕｊｌｄら（前記）およびＫｒｉｅｇｌｅｒら（二（１９８４）　３ ８：４８３）によって述べられている。ベクターがレトロウィルス性でなく、感 染ではな（トランスフェクションにより挿入される場合、ＬＴ、Ｒ配列およびｐ Ｓｉ配列は省略され得る。エフェクター遺伝子（±）は上述の通りである。「内 部プロモーター」を有する組換えレトロウィルスベクターにおいては、エフェク ター遺伝子（４）は自分自身のプロモーター／シス作用調節配列（５）および終 結配列／ポリアデニル化配列（４）が供給されている（ただし、終結配列および ポリアデニル化配列はエフェクター遺伝子由来であり得る）。

エフェクター遺伝子はいずれの方向にも配置され得るが、通常はＬＴＲ読み取り 枠の反対方向に配置される。「エン／％ンサー置換」を有する組換えレトロウィ ルスベクターにおいては、エフェクター遺伝子（±）はＬＴＲと同方向に配置さ れ、別のシス作用調節配列（１）あるいは終結配列／ポリアデニル化配列（±） が供給されていない。その代わりに、シス作用調節配列が３°側ＬＴＲ（８）の Ｕ３領域内に供給される。その結果、逆転写の後にのみエフェクター遺伝子はシ ス作用調節領域により制御される。

選択マーカー（Ｌ）が存在する場合、トランスフェクションされた細胞を選抜す る条件下において、そのマーカー配列を発現している細胞の生存を可能にする形 質をコードする。

選択マーカーは代表的には抗性物質、例えば、クロラムフェニコール、ネオマイ シン（５ｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ａ　Ｉ　Ｇ　ｎ（１９８２）　ｉ：３ ２７−４１）、あるいはヒゲｃｒｖイシン（Ｇｒｉｔｚら、江肚（１９８３）　 ２５：１７９−８８）に対する耐性を与える酵素をコードする。

選択マーカーは、使用された場合、通常トランスフェクションした／感染した細 胞の選抜時にマーカー遺伝子を発現させる自分自身のプロモーター（６）をもつ 。適切なマーカー遺伝子のプロモーターにはヒストンプロモーター、ＨＳＶ−１ ｔｋプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが含まれる。

配列ｌは、ポリヌクレオチド保持配列であり、産生細胞内でのベクターの安定な 保持に働く。代表的には、配列ｌはプラスミド由来であり、複製起点（例えば、 ｐＢＲ３２２。

ｒｉ、あるいは酵母　２μ　ｏｒｉｇｉｎ）、および（通常）抗生物質耐性マー カーを与える。適切な保持配列は、ｐＸｆ３、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＭ Ｌなどを含む。標的挿入に使用される直鎖状ＤＮＡ断片の場合、ベクターは配列 １内の１カ所で直鎖化され得る。ＬＴＲ領域上およびｌは、所望の標的とする組 換えの配列と相同な配列で置き換えられる。

配列ｌは削除される。配列１は、微生物宿主において保持および複製に機能する ポリヌクレオチド配列を含み、さらに（非特異的組み込みが起きたトランスフェ クションされた宿主細胞を除くように働（）対抗選択マーカーを含む。

°　システムの 細胞毒性薬剤の活性化のための原型システムとして、単純ヘルペスウィルス１型 のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−１ｔｋ）を選んだ。ＨＳＶ−１ｔｋは、種 々のジデオキシヌクレオシドアナローブ（ｄｄＮ）を（５°）モノホスフェート 類に変換することで活性化し得る。ｄｄＮＭＰは細胞内のヌクレオチドあるいは ヌクレオシドキナーゼの拮抗阻害剤として働き、細胞内のヌクレオチドプールを 枯渇させ得る。

ｄｄＮＭＰは細胞内酵素によってトリホスフェート類に変換された後、ｄｄＮＴ Ｐは合成中のＤＮＡ鎖（および時にはＲＮＡ鎖）に取り込まれ、核酸鎖の伸長の 終結を引き起こし得る。

ＨＳＶ−１ｔｋによって活性化される最もよく調べられたｄｄＮの１つはアシク ロビア（ａ　ｃｙｃ　１　ｏ−Ｇ）である。

アシクロビアの安全性および効能は、主にＨＳＶ−１ｔｋによる選択的活性化に 基づいている。細胞内のチミジンキナーゼよりＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ｔ ｋ）の方が、数千倍効率よ＜ａｃｙｃｌｏ−Ｇをａｃｙｃｌｏ−ＧＭＰに変換す る（ＨＳＶ−１ｔｋのＫｍ＝０．００５Ｘ　Ｋｍ　Ｖｅｒｏ　ｔｋ；　Ｖｒｅｌ 　ＨＳＶ−１ｔｋ＝３，０００，０００Ｘ　Ｖｒｅｌ　Ｖｅｒｏ　ｔｋ）、細胞 内酵素は次にａｃｙｃｌｏ−ＧＭＰをａｃｙｃｌｏ−ＧＴＰに変換し、ａｃｙｃ ｌｏ−ＧＴＰはＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡに取り込まれ、ウ ィルスＤＮＡ合成の終結を引き起こす。

ａ　ｃｙｃ　ｌ　ｏ−ＧＴＰは、細胞内ＤＮＡ合成を同様に阻害するのに必要な 濃度の約１／２０の濃度で、ＨＳＶ−ＩＤＮＡ合成を阻害する（Ｐ、Ａ、　Ｆｕ ｒｍａｎら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　（１９７９）　３２ニア２−７７）シス作用調節 配列が同定されると、その配列はモデルシステムにおける効果が調べられる。例 えば、シス作用調節配列は、ＣＡＴあるいはβガラクトシダーゼのような適切な レポーター遺伝子をもつプラスミドにクローン化され得る。次に、このプラスミ ドを適切な細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ、ＨＵＴ７８、ｔ：ど）にト ランスフェクションする。トランス作用因子は、トランス作用因子を発現する宿 主細胞株を選抜することによるか、あるいは異なる（誘導的あるいは構成的）プ ロモーターの制御下にトランス作用因子をコードするプラスミドで宿主細胞株を 同時にトランスフェクションすることによって供給され得る。さらに、このトラ ンスフェクションされた宿主細胞はレポーター遺伝子の発現についてアッセイさ れる。

ＨＳＶ−１ｔｋのようなエフェクター遺伝子の適合性は、適切なプラスミド内に 選択したシス作用調節領域の制御下にこの遺伝子をクローン化することによって 評価される。このプラスミドは、好ましくは選択マーカーも有し、ベクターによ り遺伝的に形質転換された細胞を選抜することを可能にする。

チミジンキナーゼベク　−の−　、な　。

組換えレトロウィルスを形成するのに用いられ得る、シス作用調節エレメントに 連結するエフェクター遺伝子を有するレトロウィルスベクターの一般的な構造は 図１に示されている。ＨＳＶ−１ｔｋを発現させるための基礎的なレトロウィル スベクターはモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ　−ＭｕＬＶ）由来である。

完全な複製欠陥ウィルスを産生ずるのに、全てのＭｏ−ＭｕＬＶ遺伝子（ｇａｇ Ｓ　ｐｏｔおよびｅｎｖ）がベクターから除去された。残りの成分は、ウィルス ＲＮＡの発現およびパフケージング、逆転写および組み込み、標的細胞でのｔｋ 遺伝子（および、所望ならばマーカー遺伝子）の転写のために必要とされる。こ れらの成分は、Ｍｏ−ＭｕＬＶのＬｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔｓ （ＬＴＲ）、プラスおよびマイナス鎖のプライマー結合部位、およびＲＮＡエン キャプシデーシ１ンシグナル（Ｐｓｉ配列）からなる。

ＨＳＶ−１ｔｋの細胞型特異的発現を調節するために、ハイブリッド転写単位が 構築される。このハイブリッド転写単位では、細胞型特異的転写単位のコード配 列がＨＳＶ−１ｔｋをコードする配列に置き換えられている。

これらのベクターを用いたＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子の発現は２通りの方法で達成さ れ得る。最初のベクター型は、ＨＳＶ−１ｔｋの発現を調節するために別のエン ハンサ−／調節エレメントを用いる。この型のベクターでは、ＨＳＶ−１ｔｋの 転写がプロウィルスのプラス−センスに対して逆方向に進行する（図１参照）。

ｔｋ遺伝子は自分自身のポリアデニル化シグナルを有し、そして所望ならば、ｔ ｋをコードする配列とポリアデニル化シグナルの間にイントロンを有することも 可能である。この最初のクラスのベクターにおいて、このベクターの３°側ＬＴ Ｒからエンハンサ−／調節エレメント配列を除去することによって、転写干渉の 可能性が減少され得る。３°側ＬＴＲのＵ３配列のみがウィルスＲＮＡに転写さ れるので、これらの配列が結果として生じるプロウィルスの両方のＬＴＲを形成 する。これにより、プロウィルスｃＤＮＡが挿入されるが、プロウィルスの両方 のＬＴＲからエンハサーおよび調節エレメントが欠失する結果となる。

第２のベクター型（エンハンサ−置き換えベクター）では、Ｍｏ−ＭＬＶ＜７） ＬＴＲは、ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子の発現を制御するエンハサーおよび調節エレメ ント配列を有する。Ｍｏ　−Ｍ　Ｌ　ＶのＬＴＲは種々の細胞型（造血幹細胞を 除いて）において異種遺伝子の発現を起こせるが、Ｔ細胞においテ最も効率が良 い。ＨＳＶ−１ｔｋの細胞型特異的遺伝子発現の制御は、３°側Ｍｏ−ＭＬＶの ＬＴＲ内のエンハンサ−／調節エレメント配列を特定のエンハンサ−／調節エレ メント配列で置換することによって達成され得る。５°側Ｍ　ｏ　−Ｍ　Ｌ　Ｖ のＬＴＲは感染性ウィルスを産生ずるのに用いられるパッケージング細胞株での ウィルスＲＮＡの発現を効率よく行わせるため、ベクターに保持される。

形貫転換細胞のインビトロの選抜を可能にするために、選択マーカー遺伝子がこ れらのベクターのＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子の３°側に組み込まれ得る。マーカー遺 伝子の発現は自分自身の調節エレメントによって与えられる。一般的に、この調 節エレメントは、全ての組織において構成的に発現する適度の活性を有する細胞 内遺伝子由来のものである。細胞質βアクチンプロモーター、ヒストンプロモー ター類、および解糖酵素のプロモーター類はこのような調節エレメントの例であ る。

第２のベクター型はＨＳ　Ｖ　−１ｔ　ｋの発現を調節するために異なるエンハ ンサ−／調節エレメント配列を用いる。このベクター型では、ＨＳＶ−１ｔｋの 転写がプロウィルスのプラス−センスの逆方向に進行する。このｔｋ遺伝子は自 分自身のポリアデニル化シグナルを有し、そして所望ならば、ｔｋをコードする 配列とポリアデニル化シグナルとの間にイントロンも有し得る。この第２クラス のベクターの転写干渉の可能性を、このベクターの３°側ＬＴＲからエンハンサ −／調節エレメント配列を除去することによって、減少させ得る。

これにより、プロウィルスｃ　ＤＮＡが組み込まれるが、プロウィルスの両方の ＬＴＲからエンハサーおよび調節エレメントが欠失する結果となる。

選択マーカーが、最初のベクターのクラスと同様に、供給され得、ＨＳＶ−１ｔ ｋの逆方向に転写される。従って、組み込まれたプロウィルスの中心から転写が 始まり、ヒトアデノウィルス類のＥ２／Ｅ３遺伝子の転写と類似する挙動で、逆 方向に進行する。

礼１乱よ旦反二 本発明のポリヌクレオチド構築物は構築物の形態によって調合され得る。例えば 、ベクターが効力のある（感染性）ウィルスである時、生ウイルスワクチンと同 様に調合され得る。

このような調合物は、代表的には、注射用の緩衝剤で処理した生理食塩水、ある いは緩衝化副処理の経口調合物であり、いずれも必要に応じて抗生物質を含有し 得る。ワボンーム調合物は標準的な方法で調製され得る。例えば、クロロホルム 中に脂質を浮遊させ、容器の壁土にこの脂質を乾燥し、そしてこのポリヌクレオ チド構築物の含む溶液で脂質を水和する。

適切な脂質は当分野では知られており、ホスファチジルセリン、ホスファチジル グリセロール、レジシン、などが含まれる。ポリヌクレオチドトランスフェクシ ョンのための特に有用な合成脂質はＮ−［１−（２，３−ジオレロキシ）プロピ ル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドであり、Ｌｉｐｏｆｅｃ ｔｉｎＲという南品名で市販され（ＢＲＬ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤから市販されている）、Ｐ、　Ｌ、　Ｆｅｌ ｇｎｅｒら（旦ｒｏｅ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓａｔ　ＵＳＡ　＜１９１１７＞旦 ニア４１３）によってｇ８述されている。

組換えレトロウィルスベクターは、インビボ投与のためにも調合され得る（複製 欠陥の場合）。ＨＩＶ−１あるいはＨＩＶ−２に基づ（ベクターは、原型のウィ ルスと同様の細胞同性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示し、従ってＨＩＶ−１あるいはＨ ＩＶ−２による感染の処置において、適切な細胞集団をインビボ標的にするため の効率的な広範囲の手段を供給する。

ＨＩＶに基づくベクターは、異種遺伝子の発現制御のために、ＨＩＶ　ＬＴＲプ ロモーター、ｔａｒ配列、およびｔａｔ遺伝子を使用し得る。ベクターの標的細 胞特異性は適切なパッケージング構築物（例えば、ｅｎｖ遺伝子）の選択によっ て改良され得る。例えば、ＨＩ　Ｖ　−Ｉ　ＳＦ＋６２株（Ｍ、　Ｑｕｉｒｏｇ ａら、−Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　Ｎｅｗ　Ｖａｃｅｉｎｅ ｓ−（１９８９，Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）　ｐ、　８０）は、自然にマクロファージに感染し、そのため、ＨＩ　Ｖ 　−Ｉ　ＳＦ＋８２由来のエンベロープ内にベクターをパッケージングすること によって、マクロファージへのターゲツティングを実行し得る。同様に、Ｂ型肝 炎つイルス（あるいはＨＡＶ、あるいはＨＣＶ）由来のエンベロープあるいはキ ャプシド由来の配列を組み込む組換えエンベロープ遺伝子を用いて、ベクターを パッケージングするト肝細胞への標的配達が得られる。ＨＩＶ−２由来のエンベ ロープタンパク質を発現するパッケージング細胞株を用いることニヨッテ、本発 明ノヘクターヲ、ｇｐ１６０１１ｎｖのＣＤ４°に対する親和性（Ｓ＋ｗｉｔｈ ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）　２３８：１７０４−０６）により、Ｔｎ細 胞防御の有効な方法に用い得る。

本発明のポリヌクレオチド構築物の投与形態はベクターの性質に依存している。

例えば、レトロウィルスベクターは接種、非経口あるいは経口によって投与され 得る。ベクターが感染性組換えウィルスである場合、腸管外注射、経口投与ある いは鼻内投与、およびその他によって投与され得る。リポソーム調合物は、好ま しくは鼻内噴霧あるいは静脈注射によって投与される。ここで好ましい投与の方 法は、欠陥レトロウィルスベクターを自己骨髄細胞あるいは１９７８球吸引液と 半ピボインキユバートした後、処理された細胞を標準的な技術で再導入すること である。簡単に説明すると、骨髄細胞移植の分野で知られている技術により骨髄 細胞を吸引し、一般的には骨盤から吸引する。所望ならば（特に、白血病および 他の過形成障害の処置では）、感染した細胞あるいは過剰増殖細胞による苦しみ を軽減するために、被験体を骨髄吸引の後に化学療法あるいは放射線療法で処置 し得る。好ましくない物質（例えば、腫瘍細胞、バラフチリア、ウィルス粒子、 など）を除去するため、吸引物を、例えば、免疫沈降法、免疫吸着法、補体結合 免疫反応、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ８）およびその他の方法によってスクリ ーニングし得る。理想的には、幹細胞特異的モノクロナール抗体を用いて、造血 幹細胞が標識され、単離される。スクリーニングされた吸引物を、次に本発明の 構築物によってトランスフェクションするか、あるいは感染される。１つの感染 の方法では、吸引した細胞を、効率的な接種が確実に得られるのに充分な期間、 感染し得る力価の複製欠陥レトロウィルスベクターと接触させ培養する。造血細 胞の成長因子（例えば、ＩＬ−３）を同時培養中に添加し得る（Ｅ、Ａ、　Ｄｚ ｉｅｒｚａｋｓ　前記）。マウス細胞で知られているリン酸カルシウムによるト ランスフェクション技術を利用し得る（例として、Ｅ、Ａ、　Ｄｚｉｅｒｚａｋ 、前記；　Ｓ−Ｆ、　Ｙｕら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　 （１９８６）　８３：３１９４−９８を参照）。

構築物はエレクトロポレーシヨンによっても導入され得る（Ｓ、　Ｍａｎｓｏｕ ｒ、前記）。あるいは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ”のようなトランスフェクション 用薬剤が用いられ得る。ベクターがマーカーを含有する時、所望ならば、感染細 胞をスクリーニングあるいは選抜し得る。感染細胞を次に、自己骨髄移植に用い られる方法、代表的には、静脈注入あるいは注射によって被験体へ再導入する。

本発明の構築物を用いて、リンパ球をインビボあるいは半ビボのいずれかでトラ ンスフェクションあるいは感染する。ＭＬＶに基づ（構築物を用いる場合、この ウィルスのエンベロープがヒト補体によって不活性化されるため、感染は好まし く半ビボで行われる。モノクロナール抗体を用いて所望のサブセットを選別する か、あるいは当分野に知られている他の方法によって、リンパ球細胞集団の特定 ノサブセットを選択し得る（　Ｐ、　’？１．　Ｋａｎｔｏｆｆら、Ｐｒｏｃ　 ＮａｔＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８６）　８３：６５６３−６７を参照 ）。

所望ならば、ｇａｇ−ｐｏｔおよびｅｎｖをコードするウィルス遺伝子の発現を 可能にする独立の構築物を挿入した後、本発明のベクターを挿入することによっ て、いくつかのリンパ球あるいは骨髄細胞をパッケージング細胞に転換し得る（ ０、Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８８ ）　８５：６４６０−６４）。

自己パッケージング細胞が被験体に再導入される時、複製欠陥レトロウィルスが 細胞の生活環中で連続的に発現し、本発明の治療用の構築物を多数の宿主細胞に 伝達する結果となる。

（以下　余白） 実施例１ 組　えレトロウィルスベクター 組換えＤＮＡ操作の標準技術（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ ８２））を使用して、レトロウィルスを構築した。レトロウィルスベクターの構 築に使用したプラスミドは、以下から得た。２ＭＸ１１１２Ｓ”／Ｎｅｏは、Ｍ 、ＭｃＭａｎｎ　（ＵＣＳＦ）から譲渡されたものであり、５Ｖ−Ｎは、Ｅ、　 Ｇ１１ｂｏａから譲渡されたものである（Ｙｕの前出に記載されている方法で構 築した）。

ｎｅｏ’に連結したＳＶ４０初期プロモーターのＣ１ａ−Ｃ１ａ断片をプラスミ ドｐＭＸ１１１２に挿入することによって（Ａ、　Ｍ、　Ｃ，Ｂｒｏｗｎら、“ ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　 ｖｏｌ、３　（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７）の −Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ−、ｐｐ、１８９−２１２に記載され るように）プラスミドＩ）ＭＸ１１１２ＳＶＮｅｏを構築する。

５Ｖ４０−ｎｅｏ’遺伝子を、プラスミド上のｐｓｉ”ツケージング配列と３° 側Ｍｏ−ＭｕＬＶ　ＬＴＲ領域との間に配置する。５°側Ｍｏ−ＭｕＬＶ　ＬＴ Ｒの上流にあるＥｃｏＲ１部位を除去し、Ｘｈｏ１部位にＥｃｏＲＩリンカ−を 挿入し、新しいＥｃｏＲ（部位とＨｉｎｄｌ１１部位との間にｐＵｃ１８ポリリ ンカーを加えることによって、プラスミドｐＭＸｓＶＮｅｏ１８を９ＭＸ１１１ ２ＳＶＮｅｏから調製した。プラスミドｐＴＡＲ１は、ＨＩＭ　５°側ＬＴＲ（ ｔａｒ配列を含む）、ＣＡＴをコードする遺伝子、およびＳＶ４０ポリアデニル 化シグナルとｔイントロンを含み、ＨＩＶ−１（ＳＦ２）　（Ｒ，５ａｎｃｈｅ ｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８２）　２２ユニ４８４−９ ２）　のｘｈｏｆ−Ｎａｒｌ断片をｐＭＬにクローニングすることにより構築し た。

合成ポリリンカーをＮａｒ１部位に加え、ＣＡＴ遺伝子および５Ｖ４０ＲＮＡプ ロセツシングシグナルを含むｐｓＶ２ｃＡＴ　（Ｃ，Ｍ、　Ｇｏｒｍａｎら、Ｐ ｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８２）　７９：６７７７− ８１）の５ｔｕｌ−Ｂａｎ旧断片を挿入してｐＴＡＲｌを得た。ｐＴＡＲｌをＡ ｓｐ７１８とＸｈｏｌで切断し、得られた断片をｐＭＸｓＶＮｅｏｌｇにクロー ニングして、第２図に示したｐＴＢｌを得た。ＳＶ４０　ＥＰの制御下に旧Ｖ　 ｔａｔ遺伝子を入れ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを側面に配置して、プラ スミドｐＴＡＴ１を構築した（Ｐｅｔｅｒｌｉｎら、前出）。プラスミドｐＲＴ は、ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子、プロモーター、およびＲＮＡプロセッシングシグナ ルを含む。プラスミドｐｔａｒ／ｌｋは、ＣＡＴ遺伝子の代わりにｐＲＴのＢｇ ｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＴＡＲｌにクローニングすることによって、調 製した。プラスミドｐＭＸｓＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋは、ｐｔａｒ／ｌｋのＡｓ ｐ７１８−ＥｃｏＲ１部分をｐＭＸｓＶＮｅｏ１８ポリリンカーにクローニング することによって、構築した（　ｐＭＸｓＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋは、第３図に 示される）。

ヒト細胞に感染し得る側屈性の（ａ＋ｎｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウィルスを 標準技術（Ｒ，Ｍａｎｎら、Ｃｅ１ｊ　（１９８３）　３３：１５３−５９）に よって調製した。すなわち、ＣａＰＯａ共沈技術（Ｒ９Ｇｒａｈａｍら、■ｒｏ ｌ　（１９７３）■：　４５６−６７）を使用して、側屈性のパッケージング細 胞株ＰＡ−３１７（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８６ ）　Ｌ：　２１１９５−９０２；　ＡＴＣＣＣＲＬ　９０７ｇ）をプラスミドベ クターによりてトランスフェクションした。ＣａＰＯａとの共沈物として、１０ μｇのプラスミドベクターと２５μｇのサケの精子ＤＮＡキャリアを、６０ｔｏ ｎ組織培養皿中の５ＸＩＯ５のＰＡ−３１７細胞に８から１６時間あてがつた。

沈澱物を除去し、単層をダルベツコリン酸緩衝溶液で洗浄した。新鮮な培地（１ ０％の胎児ウシ血清および抗生物質を添加したダルベツコ変法イーグル培地、Ｄ ＭＥＭ）を用意し、細胞を増殖させて２日後に回収した。次いで、トランスフェ クションした細胞をトリプシンで処理し、１５ｏＩＩ＋ｌ１１２丁フラスコに移 し、０．８　ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含む培地中で１０−１４８増殖させた。得 られたＧ４１８耐性コロニーをトリプシンで処理し、９６ウ工ル組織培養プレー ト中で限界希釈法によってクローニングした。個々のクローンによって生産され た組換えレトロウィルスを、ウィルス力価を測定するためにヒト細胞株（ＨｅＬ ａ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　２：ＨＵＴ７８．　ＡＴＣＣＴＩＢ　１６１）に感染さ せ、そして正確なプロウィルス構造物の生成を行うことによって特徴付けた。

ＰＡ−３１７の代わりに外層性（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）のパフケージング細胞株 Ｐｓｉ−２（Ｒ，Ｍａｎｎ、　前出）を使用したこと以外は上記と同様に、外層 性の組換えレトロウィルスを調製した。

実施例２ えレトロウィルスによる　の 標準の手法（Ｒ，Ｍａｎｎ、前出）を使用して、細胞株を組換えレトロウィルス で感染した。すなわち％５Ｘ１０’個の細胞を６０ｍｍ組織培養皿に蒔き、１６ 時間増殖させた。プラスミドベクターを含むパッケージング細胞から得た、細胞 を含まない上溝を、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、６から８時間目的の 細胞にあてがった。０４１８耐性マーカーを持つウィルスの場合、細胞を増殖さ せ、選択し、上記のバッキングクローン調製で記載したようにクローニングした 。）ＩＳＶ−１ｔｋを持つが、０４１８耐性マーカーを欠くレトロウィルスをｔ ｋ−細胞株：外題性ウィルスにはＬ−Ｍ（ｔｋ−）　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１．３ ）、側屈性のウィルスには１４３Ｂ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　８３０３）を使用し て力価を測定した。ＨＡＴ培地を使用して、ｔｋ＋コロニーを選択した。

実施例３ 旧Ｖ　ｔａｔによるトランス活性　のアッセイＨＩＶ　ｔａｒシス作用調節配列 の制御の下でＣＡＴをコードする、プラスミドｐＴＡＲ１、ｐＴＢｌおよびｐＴ Ｂ２　（ｐＴＢｌとは反対方向の旧ＶＬＴＲ領域を有する）をＨｅＬａ細胞にト ランスフェクションした。

ＨＩＶｔａｔトランス作用物質を発現するプラスミドｐＴＡＴ１を、ＨｅＬａ細 胞の半分にトランスフェクションした。４８時間後、細胞を溶解し、１４Ｃ−ク ロラムフェニコールを溶解物とインキュベートシた。生産物をＥｔＯＡｃで抽出 し、薄層クロマトグラフィーによって分析した。

その結果、ｔａｒをコードするプラスミドおよびｔｘｔをコードするプラスミド の両方を含むＨｅＬ　ａ細胞中では、ＣＡＴが発現されたが、ｐＴＡＴＬプラス ミドを欠（ＨｅＬａ細胞中ではＣＡＴが発現されなかったことが示された。ｐＴ ＡＲｌ、ｐＴＢｌおよびｐＴＢ２の間では構成的発現（漏れ）レベルはほとんど 差がないが、ｐＴＡＲｌ　（Ｍｏ−ＭｕＬｌ／　ＬＴＲｓおよびＳＶ４０エンハ ンサ−を欠（）細胞中よりもｐＴＢｌおよびｐＴＢ２を含む細胞中の方が、ＨＩ Ｖ　ｔａｔに応答するＣＡＴ発現率は高かった。

実施例４ 几つィルス細　１性工フエクター゛伝 両屈性ＭＸＳ’／Ｎｅｏ−ｔａｒ／ｌｋレトロウィルスを生産し、ＨＵＴ７８細 胞（ＡＴＣＣＴＩＢ　１６１）を感染するのに使用した。Ｌ　ｍｇ／ｍＬのＧ４ １８を使用して形質転換細胞（ＨｕＴ−ｔｋ細胞）を選択した。大量培養したＨ ＵＴ−ｔｋ細胞のアシクロビアに対する感受性を、様々な濃度の薬物を含む培地 中で増殖させることによって決定した。

ｐＭＸＳＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋ　（ＨＵＴ−ｔｋ細胞）を含むＨＵＴ７８細胞 を沈澱させ、ポリブレン（２μｇ／ｍｌ）に３７’Ｃで３０分間さらした。次い で、細胞を沈澱させ、１ｍＬ当り１０５個の細胞を再懸濁し、旧Ｖ（（ＳＦ２） に３７０Ｃで１．５時間さらした。次いで、細胞を沈澱させ、１０％のウシ胎児 血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で５０μＬ当り１０４個の 細胞を再懸濁した。次いで、４５．１００または２００μＭ　アシクロビアを有 する１　ｕ＋Ｌの培地を含む２４ウエルプレートのウェルに、５０μＬの細胞懸 濁液を分配した。Ｈ１’／−５Ｆ２を（７日間のインキユベーシヨンの後、ｐ２ ５　ｇａｇ　ＥＬＩＳＡ中に３０Ｄを提供するのに十分な量で）加え、７日間増 殖させ、次いで抗ｐ２５ｇａｇ　ＥＬＩＳＡによってアッセイした。通常のＩ（ ＵＴ７８細胞を、ＨＳＶ−１ｔｋの影響のコントロールとして用いた。これらの 実験の結果を第５図に示す。

Ｈ１ｌＴ７Ｂ細胞中の旧Ｖの複製は、アシクロビアによってあまり影響されなか ったが、複製は、ＨＵＴ−ｔｋ細胞中のアシクロビアによってかなり（１００μ Ｍ　ａｃｙｃｌｏｖｆｒで約６０％）阻害された。

細胞変性／細胞毒性効果は、両方の細胞型において明白であった（データは示さ れていない）。ＨＵＴ−ｔ　ｋの単一細胞クローンの分析によって、アシクロビ アに対する感受性の相蓮を示したが、大量培養されたＨＵＴ−ｔｋ細胞は、ウィ ルス複製をかなり制限し得た。

実施例５ Ｈ［Ｔ／　のアッセイ ＨＳＶ−１ｔｋ陽性表現型に形質転換された旧ｖＨＡ染性細胞は、抗ウィルス活 性および細胞毒性のあるヌクレオチドアナローブをスクリーニングするために使 用され得る（Ｍｉｔｓｕｙａ、前出）。

ｐＭＸｓＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｌｋ　（ＨＵＴ−ｔｋ細胞）を含むＨＵＴ７８細胞 を限界希釈法によってクローニングし、構成的ｔｋ発現の測定として、様々な濃 度のアシクロビアに対する感受性をアッセイした。

特に感受性の強いクローンをＴ１．５と名付け、高レベルのｔにを発現して、Ａ ＺＴを活性化し、旧Ｖ感染に抵抗する細胞の能力をテストするために選択した。

ＨＵＴ７１１、大量培養されたＨＵＴ−ｔｋ　（実施例４から得た）、およびＴ Ｋ、　５細胞を沈澱させ、ポリブレン（２μｇ／ｍＬ）に３７００で３０分間さ らした。次いで、細胞を沈澱させ、１　ｍＬ当り１０５個の細胞を再懸濁し、Ｈ ＩＶ−１（ＳＦ２）　ニ３７°Ｃで１．５時間サラシタ。次イで、細胞を沈澱さ せ、血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で、５０μＬ当り１０ ５個の細胞を再懸濁した。次いで、５０μＬの細胞懸濁液を、０．１．５または １０μＭ　ＡＺＴを含むＬ　ｍＬの培地を含む２４ウエルプレートの個々のウェ ルに分配した。感染細胞を７日間培養し、次いで、ウィルス複製を抗ｐ２５ｇａ ｇ　ＥＬ［ＳＡによってアッセイした。結果を図４に示す。

実施例６ 、　的チミジンキナーゼベクターの　築ＨＳＶ−１ｔｋを含む様々なレトロウィ ルスベクターの構造を第１図に示す。これらのベクターの機能的特性および処置 上の応用を以下に説明する。

５ＩＮ−ｔａｒ／１ｋ−Ｈ４Ｎｅｏ　：　このベクターは、ＨＩＶ　ｔａｒシス 作用配列および■５ｖ−ｔ　ｔｋエフェクター遺伝子を使用し、Ｈ４ヒストンプ ロモーターの制御下でネオマイシン耐性を含む、Ｙｕによって記載されている自 己不活性ベクターを使用する。このプラス５ＩＮ−ＣＤ４／ｌｋ　（−Ｈ４Ｎｅ ｏ）　：このベクターは、ｔａｒシス作用配列が、ＴＨ細胞中のＣＤ４抗原の発 現を促進するシス作用配列と置換されていることを除いて、上記の５ＩＮ−ｔａ ｒ／１ｋ−Ｈ４Ｎｅｏベクターと同一である。ヒストンプロモーター／ネオマイ シン耐性マーカーは、任意である。このベクターは、すべてのＣＤ４＋細胞のｄ ｄＮｓに対する感受性を供与する。ＣＤ４抗原は、現在、旧Ｖへの侵入形態とし て重要であると思われるため、このベクターもまた、旧Ｖ惑染の処置に有用であ り得る。

ＳＩＮ−Ｍａｃｌ／ｌｋ　（−Ｈ４Ｎｅｏ）　：このベクターは、ＨＩＶ　ｔａ ｒシス作用配列が、マクロファージにおいてＭａｃｌ抗原発現を調節するシス作 用配列によって置換されており、５ｒＮ−ｔａｒ／１ｋ−Ｈ４Ｎｅｏと同様であ る。ヒストンプロモーター／ネオマイシン耐性マーカーは、任意である。このベ クターは、旧Ｖに対して宿主細胞としての役割を果たす、すべてのマクロファー ジにｄｄＮｓに対する感受性を供与する。

Ｓ　ＩＮ−ｔａｒ／ｒＡ−ｔ（４Ｎｅｏ　：　このベクターは、リシンＡエフェ クター遺伝子を制御する旧１／−１ｔａｒシス作用配列を使用し、選択し得るマ ーカーとしてｎｅｏ’を使用する。

Ｓ　ＩＮ−ｆｏｓ／ｐｐｔ　：　このベクターは、Ｙｕによって記載される自己 不活性ベクターを使用し、植物ホスホトランスフェラーゼエフェクター遺伝子を 使用する包ｌ瘍形成遺伝子シス作用配列ＣＲ，丁ｒｅｉｓｍａｎ　Ｃｅ１ｌ　（ １９８６）　４６：５６７−７４）を使用する。このベクターは、ｄｄＮと組み 合わせると、組型悪性腫瘍の処置に有用であり得る。

５ＩＮ−ｐｃｎａ／ｌｎｆ　：このベクターは、増殖細胞核抗原（Ｊ、Ｅ、　５ ｅｌｆｓ、　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　（１９８８）　２：５６１−６０１）および腫 瘍壊死因子エフェクター遺伝子を調節するシス作用配列を使用する。Ｐ　ＣＮＡ は、すべての細胞において発現されるが、この発現は一時的なものであり、細胞 分化中においてのみ発生する。従って、ベクターで感染した通常の細胞は、有毒 な濃度のＴＮＦを生産することはないが、常に細胞分裂の状態である悪性過剰増 殖細胞は、有毒な濃度を発現し得る。

ＳＩＮ−ａｃｇ／ｉｆｎ　：　このベクターは、β−インターフェロンエフェク ター遺伝子と共にαコリオゴナドトロピン（Ｓ、　Ｅ、　Ｇｏａｌｚ、５ｃｉｅ ｎｃｅ　（１９８５）　２２８二１８７−９０）を発現するシス作用調節配列を 使用する。このベクターは、前述のベクターのように、ａｃｇが通常細胞におい てあまり頻繁に発現されないという事実に依存しており、がんの処置には有用で あり得る。

５ＩＮ−１３Ｇ／Ｒｂｚ　：　このベクターは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に おいて発生するｂｅｔ／ａｂｌスプライス部位に特異的なりボザイムエフェクタ ー遺伝子と共に、ＩｇＧからのシス作用配列を使用する。ＩｇＧは、Ｂ細胞にお いて発現されるため、ＣＭＬに対する細胞型の保護が得られる。

Ｓ　ＩＮ−ｅ７／Ｌｄ　：　このベクターは、Ｌｅｔｓ　ｍａｎｆａ　ｄｏ　ｏ ｖａｎｉプリン２°−デオ牛シリボヌクレオシダーゼ遺伝子と共にあるヒトパピ ローマウィルス１６型（１’［ＰＶＬ６）のＥ７遺伝子に応答するシス作用配列 を使用する。ＲＰＭＩ６　Ｅ７遺伝子の発現は、子宮頚のがんと関連しており（ Ｐｈｅｌｐｓら、Ｃｅ１ｌ　（１９８８）　５３：５３９−４７）、このベクタ ーは（薬物６−メチルプリン２−デオキシリボシドと組み合わさって）　Ｅ７遺 伝子が発現される細胞を破壊する。

ＨＩＶ−２／ｌｋ　：　、：　ノヘクターは、ＨＩＶ−２由来でありｐｓｉ（４ −＋ブシドに包まれた）シグナルおよびａｎｙ遺伝子からのｒｅｖ応答エレメン トと重なるｇａｇ遺伝子の部分を除いて、すべての内部遺伝子が欠失している旧 Ｖ−２から得られる。ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子をｐｓｉ配列の３゛側に挿入し、旧 Ｖ−２ＬＴＨの制御下で発現させる。所望されるなら、ＨＩＶ−Ｌ　ｔａｒ配列 を［Ｖ−２ｔａｒ配列と交換してもよい。このベクターは、Ｈｎ’　ｇａｇ配列 ＡＴＧコドンを欠失または改変しくＧｕｉｌｄら、前出）、ＡＴＧ開始コドンか ら■５Ｖ−１ｔｋ遺伝子の発現を得ることによって、ゲノムの長さのＲＮＡから ＨＳＶ−１ｔｋを発現させるのに用い得る。あるいは、ｇａｇ開始コドンを改変 させることなく、ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子の５°側にＨＩＭ−２ｅｎｖスプライス アクセプターを含み得、このようにして、スブライスしたサブゲノムｍＲＮＡを 介してＨＳＶ−１ｔｋの発現を得る。いずれの場合においても、Ｉ（ＳＶ−１ｔ ｋの発現は、常在性器Ｖ−１プロウィルスまたは重複感染器Ｖ−１ウィルスから のｔｘｔによる相補に依存する。ＡＣＶまたはＧＣＶの投与と組み合わせてｔｋ を発現させると、抗ウィルス剤の有毒なレベルが活性化され、このようにして感 染細胞が破壊される。これらの構築物は、ＨＩＶ−４ｘンベローフマタはＨＩＶ （ｓｐ＋ａ２エンベロープのいずれかにパッケージングされ得、後者は、感染し たマクロファージを標的とし破壊するのに有用である。

旧１／−２／ＴＣＲ−ｔｋ　：この構築物は、内部にＴ細胞受容体プロモーター を取り入れてＨＳＶ−１ｔｋの発現を促進し、ＨＩＶ−２ｇａｇ遺伝子の５°末 端側にｅｎｖおよびｐｓｉシグナルからのＲＲＥを含む。グルココルチコイド応 答ＭｏＭＬＶの構築についてのＪ、　０ｖｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ 　（１９８５）　５４：１３３−３４によって記載される原理に従って、ＴＣＲ ａ不変領域エンハンサ−配列を（Ｈａら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　ＡｃａｄＳｃｉ　 ＵＳＡ　（１９８９）　８６：６７１４によって記載されるように）挿入するこ とによって、ベクターの３°側ＬＴＲを修飾する。ＨＩＶ−２／ＴＣＲ−ｔｋベ クターは、インビボでＣＤ４“細胞に感染し、そして遺伝的にトランスフェクシ ョンするのに使用され得る。通常、ベクターもＴ４細胞もｔｘｔを含まないため 、ウィルスＬＴＲ中で開始する転写産物の発現は、旧■による感染がなくては起 こらない。

転写の開始（ｔｋの発現）は、内部ＴＣＲプロモーターから起こる。

このプロモーターからの発現は、プロウィルスＬＴＲに導入されたＴＣＲαエン ハンサ−の存在によって促進される。このベクターは、遺伝的に形質転換された ＴＨリンパ球においてｔｋの構成的発現を提供し、抗ウイルス物質（すなわち、 ＡＣＶ、　ｄｄｅ等）を活性化する。これによって、ＡＣＶおよび細胞中の関連 化合物は、それらが通常は効力を発揮しない細胞において使用され得る。第４図 に示されるように、低濃度でのＡＺＴの効力も高められる。様々な抗ウィルス剤 を使用するには、ＨＩＶによる薬物耐性の増加の可能性を減少させなければなら ない。類似ベクターは、使用されるＨＩＶ配列の代わりにＭＬ’／ウィルス成分 を使用し、ＭＬＶ両屈性バッケジング細胞株を使用することによって調製され得 る。

実施例７ のインビボ （Ａ）ＨＩＶ−ベースのベクターのパッケージング細胞株は、以下のように構築 される： ｇａｇ−ｐｏ　１　コード配列を、ＩＩＩＶ−１またはＨＩＶ−２から単離し、 発現ベクターのヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）主要極初期（ＭＩＥ）プロ モーター制御下に挿入する。適切なポリアデニル化配列、例えば、ＳＶ４０ポリ Ａコード配列のように、ｇａｇ−ｐｏｌ挿入体の３゛側に提供する。核持ち出し を行うために、ｇａｇ−ｐａｌおよびｅｎｖ配列は両方とも、ｅｎｖコード領域 に存在するｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含んでいなければならない（Ｍ、 Ｈ，Ｍａｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）３３８：２５４−５７）。

最終的に生じるベクターの最終特異性を決定するｅｎｖ配列（ＲＲＥを含む）を 、選択されたＨＩＶ−Ｌ、ＨＩＶ−２または５ＩＶ−１株から得、別々の発現ベ クターのＣＭＶ　ＭＩＥプロモーターの制御下に挿入する。この構築において、 β−グロビンポリＡ配列を使用する。マーカーまたはリポータ−遺伝子（例えば 、ｎｅｏ’　）のコード配列を任意に含むｅｎｖコード配列の５°側にイントロ ンを挿入する。

個々の類似ベクターを構築して、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下に、ｔａｔ 　ｃＤＮＡおよびｒｅｖ　ｃＤＮＡを挿入する。これらのベクターは、ＳＶ４０ 　ポリＡ配列を使用する。　ｇａｇ−ｐｏＩｓ　ｅｎｖ。

ｔａｔおよびｒｅｖのコード配列を分離することによって、機能ＨＩＶウィルス を再生するための組換えの可能性が最小になる。

次いで、発現ベクターを使用して、例えば旧Ｈ−３Ｔ３、ＨｅＬａ等の適切な細 胞株をトランスフェクションすることによって、パッケージング細胞株を構築す る。ＨＩＶ−２／ＴＣＲ−ｔｋのような本発明のレトロウィルスベクターでトラ ンスフェクションすると、真の旧Ｖ感染中（主として、ＴＨ細胞）に感染する宿 主細胞の集団を感染し得る本発明の保護構築物が調製される。ＡＺＴ。

Ａｃｔ／、　ｄｄＣ等の適切な抗ウイルス物質と共に投与すると、この処置物は 、感染旧Ｖ複製から感染細胞を保護する。

（Ｂ）マクロファージ／単球栄養性構築物を上記のセクションＡの手法に従って 、但し、ｅｎｖタンパクを提供するためにＨＩＭ−１ｓＦ＋ａｚｅｎＶ遺伝子を 使用して調製する。ＨＩＶ−２／ｌｋのような本発明のベクターでトランスフェ クションすると、ＨＩＶと感染の保有宿主細胞、特にマクロファージおよび単球 を重複感染および破壊し得る除去構築物（ａｂｌａｔｉｖｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃ ｔ）が提供される。

ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ 国際調査報告 ＰＣＴ／ＬＩＳ６９１００４４５ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ｌｓＡ／２１０　（ｓｅｃｏ ｎｄ　５ｈｅｅｔ）　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ−ｐａｇｅ　２ＰＣＴ／ｌＪｓ８９１ ００４４５ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０　（ｓｅｃｏ ｎｄ　５ｈｅｅｔ）　ｃｏｎｔｌｎｕｅｄ−ｐａｇｅ　３ａｒｔｉｃｌｅ ＰＣＴ／ＵＳ６９１００４４５ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０　（ｓｅｃｏ ｎｄ　５ｈｅｅｐ）　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ−ｐａｇｅ　４ＰＣＴ１０５８９１０ ０４４５ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ＩｓＡ／２１０　（ｓ＠ｃｏ ｎｄ　５ｈｅｅｔ）Ｐａｒｔ　ＩＩＩ　（Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ　ｃｏｎｓｉｄｅ ｒｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｒｅｌｅｖａｎｔ）ＣａｔｅｇｏｒｌｊＣ１ａｉｍｓ

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．過剰増殖障害または感染性物質による感染について、宿主細胞を半ビボで処 置する方法であって、該感染または過剰増殖障害が、遺伝子の発現を調節し得る トランス作用調節因子により特徴づけられ、 該細胞に、 該トランス作用調節因子によりコントロールされ得るシス作用調節配列を有する ポリヌクレオチド構築物、および該細胞を防御あるいは破壊に対して感受性にす るシス作用調節配列のコントロール下にあるエフェクター遺伝子、を挿入する工 程を包含する、方法。
2. ２．前記エフェクター遺伝子が前記細胞を破壊に対して感受性にする、請求項１ に記載の方法。
3. ３．前記エフェクター遺伝子がアンチセンスｍＲＮＡをコードし、該アンチセン スｍＲＮＡが、宿主細胞の必須タンパク質をコードする宿主細胞のｍＲＮＡに結 合し、そして該タンパク質の発現を阻害する、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記エフェクター遺伝子が細胞毒性タンパク質をコードする請求項２に記載 の方法。
5. ５．前記細胞毒性タンパク質がリポゾーム阻害タンパク質である、請求項４に記 載の方法。
6. ６．前記リボゾーム阻害タンパク質がリシンＡまたはジフテリア毒である、請求 項５に記載の方法。
7. ７．前記エフェクター遺伝子が、宿主細胞のヌクレオシドキナーゼよりも高い割 合でジデオキシヌクレオシドアナログをリン酸化し得るヌクレオシドキナーゼを コードする、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記エフェクター遺伝子が、前記宿主細胞を保護に対して感受性にする遺伝 子産物をコードする、請求項１に記載の方法。
9. ９．前記エフェクター遺伝子の産物がアンチセンスｍＲＮＡを含み、該ｍＲＮＡ が前記感染または過剰増殖障害を阻害し得る、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記アンチセンスｍＲＮＡが、前記感染性物質にコードされるＲＮＡまた は前記過剰増殖障害に特異的なＲＮＡに結合することにより該感染または過剰増 殖障害を阻害する、請求項８に記載の方法。
11. １１．前記感染がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染を包含する、請求項１０に記 載の方法。
12. １２．前記エフェクター遺伝子産物が、前記感染または過剰増殖障害に関連する 抗原に特異的な抗体を含む、請求項８に記載の方法。
13. １３．前記エフェクター遺伝子産物が、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、 β−インターフェロン、γ−インターフェロン、トランスフォーミシグ成長因子 β、阻害ペプチド、インターロイキン２、またはそれらの組合せを包含する、請 求項８に記載の方法。
14. １４．前記エフェクター遺伝子産物が、感染性物質のタンバク質または前記過剰 増殖障害に特異的なタンパク質のプロセッシングを阻害するプロテアーゼインヒ ビターを含む、請求項８に記載の方法。
15. １５．前記エフェクター遺伝子産物が、感染性物質のタンパク質、または前記過 剰増殖障害に特異的なタンパク質のグリコシル化またはミリスチル化を阻害する タンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
16. １６．前記エフェクター遺伝子産物がリポヌクレアーゼを含む、請求項８に記載 の方法。
17. １７．前記シス作用調節配列が少なくとも２つの連なったコピーで存在する、請 求項１に記載の方法。
18. １８．請求項１に記載の方法であって、前記エフェクター遺伝子がポリヌクレオ チド配列の少なくとも２つのコピーと強力な終結領域とを有し、 該ポリヌクレオチド配列の少なくとも２つのコピーが、前記感染性物質または過 剰増殖障害の調節エレメントに相同であって、そして、該感染性物質または該過 剰増殖障害に関連するトランス作用因子に結合する能力を有し、該相同なポリヌ クレオチド配列が、該トランス作用因子について、核感染性物質調節エレメント の領域または該過剰増殖障害の調節エレメントと拮抗する、 方法。
19. １９．前記感染性物質がＨＩＶ−ＩまたはＨＩＶ−ＩＩを含み、そして前記活性 化物質がｔａｔを含む、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．過剰増殖障害または感染性物質による感染について、宿主細胞を処置する ためのポリヌクレオチド構築物であって、該感染または過剰増殖障害が、ＤＮＡ の発現を調節し得るトランス活性化因子により特徴づけられ、該トランス作用調 節因子によりコントロールされ得るシス作用調節配列、 該細胞を保護あるいは破壊に対して感受性にするシス作用調節配列のコントロー ル下にあるエフェクター遺伝子、を有する構築物。
21. ２１．哺乳動物細胞内で前記構築物を安定に保持するためのポリヌクレオチド保 持配列をさらに有する、請求項２０に記載の構築物。
22. ２２．前記保持配列がウイルスベクターを含む、請求項２１に記載の構築物。
23. ２３．前記ポリヌクレオチド構築物が、ワクシニア、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２， アデノウイルス、またはアデノ関連ウイルスから選択される組み換えウイルスベ クターを含む、請求項２０に記載の構築物。
24. ２４．前記ウイルスベクターが複製欠陥レトロウイルスベクターを含む、請求項 ２２に記載の構築物。
25. ２５．前記複製欠陥レトロウイルスベクターが、ＨＩｖ−１またはＨＩＶ−２由 来のｇｐ１６０ｅｎｖ糖タンパク質をさらに有する、請求項２４に記載の構築物 。
26. ２６．前記保持配列が遺伝子標的ベクターを含む、請求項２１に記載の構築物。
27. ２７．前記シス作用調節配列がＨＩＶｔａｔタンパク質に応答し得る、請求項２ ０に記載の構築物。
28. ２８．前記エフェクター遺伝子が細胞毒性タンパク質をコードする、請求項２７ に記載の構築物。
29. ２９．前記細胞毒性タンパク質が、リシンＡまたはジフテリアトキシンを含む、 請求項２８に記載の構築物。
30. ３０．前記エフェクター遺伝子が、宿主細胞のヌクレオシドキナーゼよりも高い 割合でジデオキシヌクレオシドアナログをリン酸化し得るヌクレオシドキナーゼ をコードする、請求項２１に記載の構築物。
31. ３１．前記ヌクレオシドキナーゼが、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼを包含する、 請求項３０に記載の構築物。
32. ３２．ｐＭＸＳＶＮｅｏ−ｔａｒ／ｔｋである請求項３１に記載の構築物。
33. ３３．過剰増殖障害または感染性物質による感染について宿主細胞を処置するた めの組成物であって、請求項２１に記載のポリヌクレオチド構築物、および薬学 的に受容され得るキャリア、 を含有する組成物。
34. ３４．前記薬学的に受容され得るキャリアがリボソームを包含する、請求項３３ に記載の組成物。
35. ３５．前記リボソームが処置されるべき宿主細胞に特異的な抗体をさらに含有す る、請求項３４に記載の組成物。
36. ３６．生体内の選択された細胞集団を感染または過剰増殖性の形質転換から防御 するための方法であって、該細胞にポリヌクレオチド構築物を導入する工程を包 含し、該構築物が、実質的に選択された該細胞集団にのみ見出されるトランス作 用因子の存在下でのみエフェクター遺伝子の発現を促進させるシス作用配列；お よび該シス作用配列のコントロール下にあり、該細胞を防御するか、または防御 に対して感受性にするエフェクター遺伝子を有する、方法。
37. ３７．前記エフェクター遺伝子がヌクレオシドキナーゼを有する、請求項３６に 記載の方法。
38. ３８．前記ヌクレオシドキナーゼが、ＨＳＶ−１ｔｋ、グアニンキナーゼ、また は植物ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを包含する、 請求項３７に記載の方法。
39. ３９．請求項３８に記載の方法にあって、ジデオキシヌクレオシド抗ウイルス性 物質に抗ウイルス作用を有するのに効果的な量で、該細胞に半ビポで投与する工 程をさらに包含する、方法。
40. ４０．前記シス作用配列がリンパ球内で活性を有する、請求項３９に記載の方法 。
41. ４１．前記抗ウイルス性物質がＡＺＴである、請求項４０に記載の方法。
42. ４２．生体内の選択された細胞集団を感染または過剰増殖注の形質転換から防御 するためのポリヌクレオチド構築物であって、 実質的に選択された該細胞集団にのみ見出されるトランス作用因子の存在下での みエフェクター遺伝子の発現を促進させるシス作用配列；および 該シス作用配列のコントロール下にあり、該細胞を防御するか、または防御に対 して感受性にするエフェクター遺伝子を有する、 構築物。
43. ４３．前記エフェクター遺伝子が，ヌクレオシドキナーゼを有する、請求項４２ に記載の方法。
44. ４４．前記ヌクレオシドキナーゼが、ＨＳＶ−１ｔｋ、グアニンキナーゼ、また は植物ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを包含する、請求項４３に記載の 構築物。
45. ４５．前記シス作用配列がリンパ球内で活性を有する、請求項４４に記載の方法 。