KR101293620B1 - 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 상기 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의해 암 세포에 대한 선택성을 나타낼 뿐만 아니라, 암치료 유전자에 의한 상승된 항암활성을 나타내므로, 암의 효과적인 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도{Recombinant adenovirus comprising trans-splicing ribozyme and therapeutic genes having anti-cancer activity and the Use thereof}

본 발명은 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 상기 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

암은 국내 사망 원인의 1위를 차지하는 중대 질환으로 암을 정복하기 위한 수많은 연구가 있어 왔지만 아직까지 정복되지 않고 있는 난치병이다. 암에 대한 기존의 치료법으로는 수술, 화학 요법 및 방사선 치료 등이 있으나, 각각의 방법에 한계가 많아 최근에는 이러한 치료법들과는 개념이 다른 치료법들이 연구되고 있는데 그중에서 특히 유전자 치료법이 활발히 연구되고 있다.

유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.

암에 대한 유전자 치료는 인체 내의 면역반응을 유도하는 면역학적 유전자 치료법과, 사용된 유전자가 직접 암세포를 파괴하거나 사멸을 유도하는 유전자 치료법으로 구분될 수 있다. 후자의 경우에는 유전자를 세포 내로 운반하고 발현시키는 벡터의 역할이 매우 중요한데 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달의 높은 효율, 미분화세포로 유전자를 전달하는 능력 및 높은 역가의 바이러스 저장물 제조의 용이성으로 인해 가장 유망한 유전자 치료용 벡터 중의 하나로 인정받고 있다.

일반적으로 사용되는 유전자 치료용 아데노바이러스 벡터는 복제에 필수적인 일련의 유전자들을 삭제시키고, 프로모터 활성의 수준이 높은 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 사르코마 바이러스(RSV) 프로모터를 넣어 치료 목적 단백질을 생체 내에 높은 효율로 발현시킨다.

최근에는, 유전자 치료에 활용될 수 있는 표적 유전자들의 다수가 세포분열을 많이 하는 일반 세포에도 발현함으로 인해서 발생하는 부작용을 줄이기 위한 노력으로 암세포 특이적인 치료(cancer tissue targeted therapy)가 시도되고 있다(Fukuzawa et al., Cancer Res 64: 363-369, 2004). 이를 위해 CMV나 RSV 대신 조직 특이적(tissue-specific) 프로모터를 쓰는 방법이 고려되고 있으나, 특이성이 높아지는 대신 치료 효능이 떨어지는 단점으로 인해 실용화에 이르지 못하고 있는 실정이다.

상기와 같은 단점을 해결하기 위해 최근에는 조직 특이적 프로모터 이외의 인자를 이용하여 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스를 개발하려는 연구가 진행되고 있는데, 대표적인 예로서, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 등을 사용하는 방법이 개발되고 있다.

상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 이용한 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스의 개발에 관한 연구는 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 라이보자임이 실험관 내에서뿐만 아니라 박테리아 나아가 인체 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 수행함으로써 별도로 존재하는 두개의 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 밝혀지면 주목받게 되었다.

구체적으로, 이러한 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 질환과 관련된 유전자 전사체 또는 질병 세포에서만 특이적으로 발현되는 특정 RNA를 표적으로 하여, 이들을 정상적인 RNA로 보정하거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환되도록 재 프로그램을 유발할 수 있어, 질환 특이적이며 안전한 유전자 치료 기술이 될 수 있을 것이라 예상되고 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 질환 특이 RNA를 제거함과 동시에 우리가 원하는 치료용 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있으므로 치료 효과를 배가시킬 수 있다.

특히, 최근 연구에 있어 암 조직에서 특이적으로 작용할 수 있는 hTERT(human Telomerase reverse transcriptase)를 타겟하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 알려지면서, 이를 이용한 암치료제를 개발하려는 시도가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 뚜렷한 결과는 알려져 있지 않다.

유전자 치료 방법에 있어 사용되어지는 치료용 유전자로는 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제(이하, HSVtk로 약칭함), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(CD) 및 대장균의 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(이하, PNP로 약칭함) 유전자 등이 알려져 있다. 이들을 이용한 유전자 치료는 유전자 지향성 효소 프로드럭 치료(gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT)라 불리우며, 모두 프로드럭을 사용하는 공통점이 있다. GDEPT에 사용되는 프로드럭으로는 간사이클로비르(GCV), 5-플루오로우라실(5-FU) 및 6-메틸퓨린-2-데옥시리보사이드(6-MeP-dR)가 각각 HSV-TK, CD 및 PNP와 같이 사용되고 있다. 세포 독성이 없는 프로드럭은 도입된 유전자들에 의해 세포에 독성이 있는 약물로 변환되는데 주로 인산화에 의해 활성이 생긴다. 자살 유전자를 이용한 유전자 요법의 장점은 이들 유전자가 도입된 세포에서 활성화된 약물에 의해 인접한 세포도 사멸시키는 소위 방관자 효과가 크다는데 있는데, 이는 유전자의 도입 효율이 낮은 상태에서 취할 수 있는 최선의 전략으로 일컬어지는 기술이다.

이러한, 유전자 치료 전략에 있어 HSVtk를 이용하는 것은 상당히 보편화되어 있다. 구체적으로, HSVtk/GCV 시스템은 자살 유전자 요법 중에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나로 WO 90/07936, US 5,837,510, US 5,861,290, WO 98/04290, WO 97/37542 및 US 5,631,236 등에 개시되어 있다. HSVtk 유전자를 발현하는 세포는 간사이클로비르(GCV)를 인산화할 수 있고, 그 결과 DNA를 복제하는 작용을 방해하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이 방법은 현재 다양한 인간 암의 유전자 치료시 30가지 이상의 임상 시험에 사용되고 있다. 그러나, 이 또한 증식되는 세포만이 사멸할 수 있고 방관자 효과가 탁월한 편이 아니며, 다량 사용시 세포 독성 문제도 야기할 수 있다는 문제점을 갖고 있으므로, 현재는 세포 사멸 효과와 방관자 효과를 향상시키기 위해 두 가지 이상의 프로드럭을 사용하여 암을 정복하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, PD-1(programmed death-1)은 55kDa의 제I형 경막 단백질로서, Ig 상관 유전자의 일부를 이루고 있으며, 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려져 있다. 즉, PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에 발현되는 수용체의 CD28 군(예를 들어, CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA 포함)에 속하는 억제 인자의 일원이다. PD-1에 대한 리간드로는 PD-L1 및 PD-L2가 있으며, 이들은 PD-1과 결합할 때 T 세포의 활성화를 하향 조절하는 것으로 알려져 있다. PD-1은 일반적인 T 세포에서는 정상 상태일 때 발현되지 않다가 상기 세포가 활성화되면 발현이 증가한다고 알려져 있다. 또한, PD-L1은 다수의 인간 암에서 다량 발견되며, PD-1과 PD-L1의 상호작용은 T 세포에 자극 또는 억제 신호를 전달한다. 즉, PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인하여 종양 침습성 림프구가 줄어들고, T 세포 수용체 매개 증식이 감소하며, 암 세포에 의한 면역 회피 현상이 발생하게 된다. 따라서, 최근 연구에 있어 PD-1 또는 PD-L1의 신호 전달을 차단함으로써 항암 면역반응을 효과적으로 유도하여 암을 치료하려는 연구가 진행 중에 있다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 조직 특이성과 치료 효능이 동시에 향상된 암 치료 유전자 치료 방안을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 암 조직 특이적 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이에 의해 HSVtk 유전자와 sPD-1 유전자가 조절되어 발현되도록 디자인한 재조합 아데노바이러스가 암 조직에 특이적인 우수한 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 유전자 치료에 따른 부작용을 현저히 줄일 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명의 용어 "아데노바이러스"는 아데노바이러스 벡터와 동일한 의미가 있고, 아데노비리디아에 속에 속하는 바이러스를 의미한다. 상기 아데노비리디아에는 마스트아데노바이러스 속의 동물성 아데노바이러스를 모두 포함한다. 특히, 인간의 아데노 바이러스는 A-F 아속(subgenera) 및 이의 개개의 혈청형을 포함하며, A-F 아속은 인간의 아데노바이러스 제1형, 제2형, 제3형, 제4형, 제4a형, 제5형, 제6형, 제7형, 제8형, 제9형, 제10형, 제11형(Ad11A 및 Ad11P), 제12형, 제13형, 제14형, 제15형, 제16형, 제17형, 제18형, 제19형, 제19a형, 제20형, 제21형, 제22형, 제23형, 제24형, 제25형, 제26형, 제27형, 제28형, 제29형, 제30형, 제31형, 제32형, 제33형, 제34형, 제34a형, 제35형, 제35p형, 제36형, 제37형, 제38형, 제39형, 제40형, 제41형, 제42형, 제43형, 제44형, 제45형, 제46형, 제47형, 제48형 및 제91형이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "암 특이 유전자"는 본 발명에 따른 암세포에서만 특이적으로 발현되거나 또는 현저하게 과발현되는 유전자를 의미한다. 상기 암 특이 유전자는 본 발명에 따른 라이보자임이 암특이적으로 작용할 수 있는 특징을 부가할 수 있다. 이러한 암 특이 유전자의 대표적인 예로는, TERT(Telomerase reverse transcriptase)의 mRNA, AFP(alphafetoprotein) mRNA, CEA(carcinoembryonic antigen) mRNA, PSA(Prostate-specific antigen) mRNA, 또는 CKAP2(Cytoskeleton-associated protein 2) mRNA 등이 사용 가능하나, 바람직하게는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) mRNA를 사용하는 것이다.

본 발명의 용어 "TERT(Telomerase reverse transcriptase)"는 암 세포의 영속성(immortality) 및 증식(proliferation) 능력을 조절하는 가장 중요한 효소 중의 하나로서, 염색체에 말단소립 구조를 형성해 염색체 끝을 보호하는 역할을 통해 세포의 노화를 억제하는 효소를 의미한다. 정상적인 세포에서는 세포가 분열할 때마다 말단소립의 길이가 조금씩 줄어들어 결국 유전물질이 손실되고, 세포가 사멸하게 되는 기작을 갖는다. 그러나, 암세포에서는 이 효소가 말단소립을 계속적으로 연장시켜 주기 때문에 세포가 사멸하지 않으며, 암세포의 불멸성에 직접 기여함으로써 암을 치료하는데 중대한 장애 요소로 알려져 있다. 이러한, 텔로머라제(telomerase)는 무한히 복제되는 생식세포, 조혈세포 및 암세포에서 80 내지 90%의 텔로머라제 활성을 갖고 있지만, 암세포 주변의 정상세포들은 그 활성을 갖지 않는 특징을 갖는다. 본 발명에서는 암 특이 유전자로서 TERT mRNA(서열번호 1)를 사용함이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "라이보자임"은 트랜스-스플라이싱 활성 및 셀프-스플라이싱 활성을 나타내는 효소활성이 있는 RNA분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 라이보자임은 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 결과적으로는 선택적인 항암효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암치료 유전자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암 특이 유전자를 불활성화시키고, 암치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 활성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다. 바람직하게는 암에 특이적인 TERT(Telomerase reverse transcriptase)의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 hTERT 표적 트랜스-스플라이싱 그룹 I 라이보자임을 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 Rib67 라이보자임(서열번호 2)을 사용하는 것이다.

한편, 본 발명자들은 상기 라이보자임과 함께 암치료 유전자를 발현시킬 수 있는 재조합 아데노바이러스를 고안하였다.

본 발명의 용어 "암치료 유전자(anti-cancer therapeutic gene)"는 암 세포 내에서 발현시에 치료학적 효과를 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 암치료 유전자는 상기 라이보자임과 접합된 형태로 발현되거나 또는 독립적으로 발현되어, 항암활성을 나타낼 수 있다. 이러한 암치료 유전자의 예로는, 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자, 항신생 혈관 생성 유전자 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않을 뿐만 아니라, 본 발명에서는 상기 암치료 유전자를 단독적으로 사용하거나 또는 둘 이상 복합적으로 사용할 수도 있다.

상기 약제감수성 유전자(drug-sensitizinggene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자로 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 대표적으로 HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소(cytosine deaminase, CD) 유전자와 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)가 가능하다.

상기 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되어 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

상기 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 등이 있다.

상기 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 일예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 등이 있다.

상기 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, VHL 유전자 및 sPD-1(programmed death-1)가 포함된다.

상기 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53이 포함된다.

상기 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 GM-CSF, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2b) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함된다.

상기 항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

본 발명자들은, TERT를 표적으로 작용하는 라이보자임에 접함된 형태로 암치료 유전자의 일종인 HSVtk를 발현시킬 수 있는 재조합 아데노바이러스 Ad5mTR(도 1의 B)와 추가로 치료 유전자 sPD-1을 포함하는 Ad5mTR.sPD1(도 1의 C)를 제작하였고, 제작된 재조합 아데노바이러스들을 암세포 및 동물의 암에 처리하였을 때, 직접적인 암세포 독성(도 5 내지 도 7) 및 항암 면역 활성(도 8 내지 도 13)을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 결과를 통해 상기 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 다수의 암치료 유전자를 발현시킬 경우, 암 치료 효과가 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 사이토카인 유전자 및 항신생 혈관 생성 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 암치료 유전자를 포함하고, 더욱 바람직하게는 암치료 유전자로 HSVtk(Human Simplex Virus thymidine kinase) 및 sPD-1(soluble Programmed Death-1)을 포함하는 것이다.

본 발명의 용어, "HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)"은 단순 포진 바이러스으로부터 유래되는 티미딘 인산화 효소를 의미한다. 이 효소는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키므로서, 그 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 하는 약제감수성 유전자의 대표적인 하나이다. 본 발명에 있어 HSVtk 유전자는 본 발명에 따른 라이보자임에 접합된 형태로 발현되어 항암활성을 나타내는 암치료 유전자로 사용되어질 수 있다. 이러한 HSVtk 유전자는 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 진뱅크(genbank) 등록번호 AAP13943, P03176, AAA45811, P04407, Q9QNF7, KIBET3, P17402, P06478, P06479, AAB30917, P08333, BAB84107, AAP13885, AAL73990, AAG40842, BAB11942, NP_044624, NP_044492, CAB06747 등에 기재된 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "sPD-1(soluble programmed death-1)"은 면역글로불린 분자군에 속하는 T 세포의 보조저해분자로 잘 알려진 55kDa의 제I형 경막 단백질인 PD-1(programmed death-1)의 세포외 도메인을 의미한다. 일반적으로 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인하여 종양 침습성 림프구가 줄어들고, T 세포 수용체 매개 증식이 감소하며, 암 세포에 의한 면역 회피 현상이 발생하게 되지만, 최근의 연구에 있어 PD-1의 유리된 양태인 sPD-1이 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용으로 인한 면역 회비 현상을 억제하여 항암 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있다는 것이 보고되었다. 따라서, 본 발명에 있어 sPD-1 유전자는 본 발명에 따른 라이보자임의 트랜스-스플라이싱 활성에 의해 암 특이 유전자에 접합되어 암 세포에 치료유전자로 사용되어질 수 있다. 이러한 sPD-1 유전자는 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "암"은 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로는 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키 상태를 의미하며, 이러한 예로 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양 등을 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 강황 또는 울금 추출물, 이로부터 분리된 리나로올 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학 조성물은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용되어 질 수 있다.

본 발명의 용어 "인간을 제외한 동물"은 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가진 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 치료용 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함할 수 있다. 또한, 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 암 특이 유전자에 작용하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임에 의해 암 세포에 대한 선택성을 나타낼 뿐만 아니라, 암치료 유전자에 의한 상승된 항암활성을 나타내므로, 암의 효과적인 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 재조합 아데노바이러스 벡터의 구성을 나타내는 개략도이다.
도 2는 Ad5MOCK , Ad5mTR 및 Ad5mTR.sPD1 재조합 아데노바이러스 벡터의 유전자 지도를 나타내는 개략도이다.
도 3은 재조합 아데노바이러스들에 의한 세포 내 HSVtk의 발현 여부를 기질의 인산화 정도를 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 재조합 아데노바이러스들에 의한 세포 내 sPD-1의 발현 여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 재조합 아데노바이러스들의 암세포에 대한 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 재조합 아데노바이러스의 HSVtk 유전자에 의한 동물모델에서의 CT26 암세포의 시간의 경과에 따른 크기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 재조합 아데노바이러스의 치료 유전자에 의한 동물모델에서의 CT26 암세포의 시간의 경과에 따른 크기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 재조합 아데노바이러스에 포함되는 HSVtk 치료 유전자 발현에 따른 암세포의 항원성 증가 여부를 확인하여 나타내는 그래프이다.
도 9는 재조합 아데노바이러스에 포함되는 치료 유전자 sPD-1에 의한 항암 면역 활성을 확인하여 나타내는 그래프이다.
도 10은 정상 면역계를 갖는 B6 마우스와 T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암의 크기 변화를 확인하여 나타내는 그래프이다.
도 11은 정상 면역계를 갖는 B6 마우스와 T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암세포의 생육도를 확인하여 나타내는 그래프이다.
도 12는 CD8-고갈 항체(CD-depleting antibody)를 투여하여 인위적으로 CD8+ T 세포의 작용을 억제한 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암의 크기 변화를 확인하여 나타내는 그래프이다.
도 13은 일반 마우스와 CD8-고갈 항체(CD-depleting antibody)를 투여하여 인위적으로 CD8+ T 세포의 작용을 억제한 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암세포의 생육도를 확인하여 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 및 실험 동물의 처리

마우스 CT26 세포, MC38OVA 대장암 세포 및 EG7OVA 림프종 세포는 10% FBS 와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 RPMI 배지를 이용하여 배양하였다. 유출림프절-유도된 수지상 세포(Draining lymph node-derived dendrite cells, DLN-DCs)는 17.5% 니코덴즈(Nycodenze)에 의해 준비된 시료를 CD11c+ 마이크로비드가 충진된 MACS 컬럼(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 사용하여 분리하여 사용하였다. 또한, OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포는 OT-1 Rag1-/- 마우스로부터 CD8+a 마이크로비드가 충진된 MACS 컬럼(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 사용하여 분리하여 사용하였다.

BALB/c 마우스는 6 내지 9주령 수컷을 중앙 실험 동물(Central Lab. Animal Inc.)에서 구입하여 사용하였다. 모든 동물 실험은 국립 암센터의 실험동물 사용과 관리 가이드라인에 따른 조건하에서 수행하였다.

실시예 2: 재조합 아데노바이러스의 제작

CMV 프로모터를 갖는 발현카세트, 라이보자임, HSVtk 유전자 및 폴리A를 갖는 재조합 아데노바이러스는 하기와 같은 방법에 따라 제작되었다.

구체적으로, 재조합 아데노바이러스를 제작을 위해 AdenoZAPTM과 AdenoQuickTM 시스템을 사용하였다. 라이보자임으로는 TERT mRNA에 작용하는 것으로 알려진 Rib67 라이보자임을 암호화하는 서열을 사용하였다. 이 라이보자임의 내부 가이드 염기서열(internal guide sequence; IGS)에 확장된 PI와 6개의 뉴클레오티드 길이의 P10 헬릭스를 포함하고, 3' 말단 엑손 부위에 HSVtk 유전자(서열번호 3)를 포함하도록 구성하였다(도 1). 도 1은 재조합 아데노바이러스 벡터의 구성을 나타내는 개략도이다.

상기 Rib67 라이보자임을 암호화하는 서열은 pAVQ-CMV-mTERT AS100 Rib(+67) TK 벡터로부터 SpeI/SacII 제한효소를 이용하여 절단하여 얻었다. 얻어진 Rib67 라이보자임을 암호화하는 서열은 pZAP1.1 벡터 내로 삽입하였고, 다시 SpeI/EcoRV 제한효소를 이용하여 절단하여 CMV 프로모터, HSVtk 유전자, 폴리A를 포함하는 pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk 벡터의 제작에 사용하였다. 제작되어진 pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk 벡터를 다시 PfMlI 제한효소를 이용하여 절단하여, 아데노바이러스의 left ITR 및 패키징 신호 부위를 추가로 포함하는 Ad5mTR 벡터의 제작에 사용하였다.

추가적으로, 치료 유전자를 둘 이상 포함하는 재조합 아데노바이러스를 하기의 방법으로 제작하였다. 구체적으로, 상기 제조된 Ad5mTR 벡터에 추가로 치료 유전자로서 sPD-1 유전자를 인간 유전자신장 인자-1α(human elongation factor-1 α, EF1α)에 의해 조절되어 발현되도록 구성하였다. 상기 pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtk 벡터를 제한효소로 절단하여 CMV 프로모터, HSVtk 유전자, 폴리A를 포함하는 서열을 얻은 후, 이를 pE1.2 셔틀벡터의 BamHI/SpeI 제한효소 부위에 삽입하여 pE1.2CMV.mTR.HSVtk.pA 벡터를 제작하였다. 또한, EF1α.sPD1.FcmouseIgG2a 서열을 pE3.1 셔틀벡터의 EcoRI/EcoRV 제한효소 부위에 삽입하여 pE3.1.EF1α.sPD1.Fc. 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 pE1.2CMV.mTR.HSVtk.pA 및 pE3.1.EF1α.sPD1.Fc. 벡터를 이용하여 AdenoQuickTM 시스템의 제조사로부터 제공된 방법을 통해 치료 유전자로 HSVtk 유전자 및 sPD-1 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 Ad5mTR.sPD1를 제조하였다(도 2). 도 2는 Ad5MOCK , Ad5mTR 및 Ad5mTR.sPD1 재조합 아데노바이러스 벡터의 유전자 지도를 나타낸 개략도이다.

도 2에서 보듯이, 치료 유전자를 함유하고 있지 않은 아데노바이러스는 MOCK으로, 치료 유전자인 HSVtk 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스는 Ad5mTR로, 치료 유전자로 HSVtk 유전자 및 sPD-1 유전자를 함유한 재조합 아데노바이러스는 Ad5mTR.sPD1로 명명하였다.

실시예 3: 재조합 아데노바이러스에 의한 세포 내 발현 조사

재조합 아데노바이러스에 의해 세포 내로 도입된 치료 유전자들의 발현 여부를 확인하기 위해 HSVtk의 발현 여부는 이의 기질에 대한 인산화 정도를 확인하여 결정하였으며, sPD-1의 발현 여부는 웨스턴 방법을 이용하여 확인하였다.

HSVtk의 발현 확인을 위해 2 X 104 세포 농도의 CT26 세포를 24 웰 플레이트 상에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 배양된 세포를 Ad5mTR, Ad5mTR.sPD-1 또는 Ad5MOCK 각각을 다양한 농도(Mmultiplicity-of-infectivity, MOI)로 감염시켰다. 48시간 동안 감염 후, 세포를 1.0 μCi/ml의 [3H]PCV (Moravek, Brea, CA)을 포함하는 배지에 37℃에서 2시간 동안 노출시켰다. 그 후, 배지 50 ml을 회수하여 방사능을 측정하였다. 또한, 세포들은 차가운 PBS에 세 번 세척하였고, 500 ㎕의 0.1% SDS로 용해시켜 방사능을 섬광계측기(scintillation counter)로 측정하였다(도 3). 도 3은 재조합 아데노바이러스들에 의한 세포 내 HSVtk의 발현 여부를 기질의 인산화 정도를 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3에서 보듯이 Ad5mTR 및 Ad5mTR.sPD-1 재조합 아데노바이러스로 감염된 세포 내에서는 아데노바이러스의 농도에 의존적으로 인산화된 기질의 축적이 증가되었으나, 음성 대조군으로 사용되어진 Ad5MOCK으로 감염된 세포 내에서는 인산화된 기질이 거의 축적되지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스가 치료 유전자 중 하나인 HSVtk를 세포 내로 전달하여 발현되어 작동하게할 수 있음을 알 수 있다.

한편, sPD-1의 발현 확인을 위해 4 X 105 세포 농도의 HEK293 세포를 6 웰 플레이트 상에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, Ad5mTR, Ad5mTR.sPD-1 각각을 2 MOI 농도로 감염시켰다. 바이러스 감염 하루 후, 배지와 세포 분해물을 수거하였고, 피어스 BCA 단백질 검출 키트(Pierce BCA protein assay kit, Thermo, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 확인하였다. 확인되어진 단백질을 8 ㎍씩 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, 미니-프로텐 테트라 셀(Mini-PROTEAN Tetra Cell, BIO-RAD, Hercules, CA)을 이용하여 폴리비닐라덴 불화물(Polyvinylidene Fluoride, PVDF) 막으로 이동시켰다. 막의 sPD-1 단백질은 Pdcd-1(E-18) 항체 (Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA)와 당근 산화효소-접합 항-염소 면역글로불린 G 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat immunoglobulin G secondary antibody, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여, 아머샴TM ECL 플러스 웨스턴 블랏 검출 시스템(AmershamTM ECL Plus Western Blotting Detection System, GE Healthcare, Wauwatosa, WI)으로 가시화하였다(도 4). 도 4는 재조합 아데노바이러스들에 의한 세포 내 sPD-1의 발현 여부를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4에서 보듯이 Ad5mTR.sPD-1 재조합 아데노바이러스로 감염된 세포 내에서 sPD-1가 발현되고 있으며, 음성 대조군으로 사용되어진 Ad5mTR으로 감염된 세포 내에서는 sPD-1이 발현되지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스가 치료 유전자 중 하나인 sPD-1를 세포 내로 전달하여 발현할 수 있음을 알 수 있다.

상기 도 3 및 도 4의 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 치료 유전자를 효과적으로 세포 내로 전달하여 발현시킬 수 있으며, 복수의 치료 유전자를 동시에 세포 내로 전달하는데 있어서도 효과적임을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 재조합 아데노바이러스의 in vitro 상에서 암세포에 대한 세포독성 평가

재조합 아데노바이러스들의 in vitro 상에서 암세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해 세포증식법(Cell proliferation assay, Dojindo Laboratories, Rockville, MD)을 사용하여 평가하였다. 3 X 103 세포 농도의 CT26 세포를 96 웰 플레이트 상에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, Ad5mTR, Ad5mTR.sPD-1 또는 Ad5MOCK의 다양한 아데노바이러스 농도(MOI)로 감염시켰다. 24시간 동안 감염 후, 최종 농도가 196 mM 이 되도록 간사이클로비르(GCV)를 첨가하고, 처리 후 5일째 세포 증식정도를 측정하였다(도 5). 도 5는 재조합 아데노바이러스들의 암세포에 대한 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5에서 보듯이, 2.5 MOI의 Ad5mTR, Ad5mTR.sPD-1 재조합 아데노바이러스로 감염된 세포는 대부분이 사멸하였지만, 음성 대조군으로 사용된 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스로 감염된 세포는 50 MOI 농도에서도 절반 가량이 생존하는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스에 함유된 치료 유전자 중 하나인 HSVtk가 세포 내로 전달되어 암세포 내에서 세포에 직접적인 항암 효과를 나타내며, 둘 이상의 치료 유전자를 함께 포함하는 경우에도 이러한 효과가 유지됨을 암시하는 것으로 분석되었다.

실시예 5: 동물모델에서의 재조합 아데노바이러스의 항암 효과 조사

동물모델에서의 재조합 아데노바이러스의 항암 효과를 확인하기 위해 중앙 실험 동물(Central Lab. Animal Inc., 한국)에서 구입한 6 내지 9주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 마우스 양쪽 측복부에 1 x 106 농도의 CT26 암세포를 접종하고, 접종 일주일 후에, 아데노바이러스 입자의 5 x 108 PFU를 각 암 부위에 주입하였다. 주입 후, 8 내지 14일 또는 실험 완료시까지, 복강 내에 간사이클로비르(GCV)를 75 mg/kg 농도로 하루 두 번씩 투여하였다. 그런 다음, 암의 크기는 캘리퍼(caliper)를 이용하여 매주 3회 측정하였고, 측정값을 하기 식에 적용하여 암의 부피를 산출하였다(도 6 및 도 7).

부피 = 길이 x 너비2 x 0.5236

도 6은 재조합 아데노바이러스에 포함된 HSVtk 유전자가 처리된 동물모델에서 CT26 암세포의 시간의 경과에 따른 크기 변화를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 음성 대조군으로 사용한 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해, HSVtk 유전자를 발현하는 Ad5mTR를 단독으로 사용한 경우에 암의 크기가 약간 감소하는 것을 확인하였으며, HSVtk 유전자의 목적 물질인 간사이클로비르(GCV)를 함께 투여하였을 때, 그 효과가 유의적(P = 0.0113)으로 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

도 7은 재조합 아데노바이러스에 포함된 치료 유전자가 처리된 동물모델에서 CT26 암세포의 시간의 경과에 따른 크기 변화를 나타내는 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 음성 대조군으로 사용한 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해, sPD-1 유전자를 발현하는 Ad5msPD-1을 단독으로 사용한 경우에 암의 크기가 약간 감소하였고, HSVtk 유전자를 발현하는 Ad5mTR를 단독으로 사용한 경우에는 암의 크기가 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, HSVtk 유전자와 sPD-1 유전자를 동시에 발현하는 Ad5mTR.sPD-1를 처리하였을 때, 단독 치료유전자로서 우수한 효과를 보인 Ad5mTR에 비해 그 효과가 유의적(P = 0.0142)으로 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.

상기 도 6 및 도 7의 결과는, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 항암 효과가 실제 동물에 적용될 수 있음을 나타내는 것으로 분석되었다.

실시예 6: 재조합 아데노바이러스의 항암 면역 활성 평가

실시예 6-1: 치료 유전자 HSVtk 의 발현에 따른 암세포의 항원성 증가 조사

재조합 아데노바이러스들의 항암 면역 활성을 평가하기 위한 하나의 방법으로 HSVtk 유전자 발현에 따른 암세포의 항원성 증가 여부를 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포와 유출림프절-유도된 수지상 세포(Draining lymph node-derived dendrite cells, DLN-DCs)를 이용하여 IFN-γ의 발현양을 확인하는 방법을 통해 조사하였다.

실시예 1의 방법에 따라 유출림프절-유도된 수지상 세포와 OVA 특이적인 CD8+ T 세포를 각각 준비하고, 이들을 5 X 104세포수/ml의 농도로 96 웰 플레이트에 접종한 다음, Ad5mTR 또는 Ad5MOCK을 각각 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양 상층액을 회수하여 IFN-γ의 발현 양을 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, eBioscience, San Diego, CA) 방법으로 측정하였다(도 8). 이때, 1 ㎍/ml의 OVA257-264 펩타이드를 양성 대조군으로, 재조합 아데노바이러스를 처리하지 않은 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.

도 8은 재조합 아데노바이러스에 포함되는 HSVtk 치료 유전자 발현에 따른 암세포의 항원성 증가 여부를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이 음성 대조군 및 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에는 IFN-γ가 발현되지 않았으나, HSVtk 치료 유전자를 발현하는 Ad5mTR 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에는 IFN-γ가 유의적으로(Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스에 대해 P = 0.0001) 증가하여 발현되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 HSVtk 치료 유전자 발현에 의해 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포가 활성화되어 IFN-γ을 발현하도록 유도하여 항암 면역을 활성화시킬 수 있음을 나타내는 것으로 분석되었다.

실시예 6-2: 치료 유전자 sPD -1의 발현에 따른 항암 면역 활성 증가 조사

재조합 아데노바이러스들의 항암 면역 활성을 평가하기 위한 하나의 방법으로 sPD-1 유전자 발현에 따른 암세포의 항원성 증가 여부를 오브알부민(ovalbumin) 항원을 발현하는 EG7OVA 림프종 세포와 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포를 이용하여 IFN-γ의 발현양을 확인하는 방법을 통해 조사하였다.

오브알부민(ovalbumin) 항원을 발현하는 EG7OVA 림프종 세포를 1 X 104의 세포 농도로 6 웰 플레이트 상에 접종하여 24시간 동안 배양하고, Ad5mTR 또는 Ad5MOCK으로 감염시킨 세포의 배양 상층액으로부터 얻은 sPD-1을 가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 여기에 실시예 1의 방법으로 얻어진 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포를 1 X 106의 농도로 첨가하여 72시간 동안 배양한 후, 세포를 회수하여 마우스 IFN-γ 플랙스 세트 CBA 분석(mouse IFN-γ flex set CBA assay, BD bioscience, San Jose, CA) 방법을 사용하여 IFN-γ의 발현 양을 측정하였다(도 9). 도 9는 재조합 아데노바이러스에 포함되는 치료 유전자 sPD-1에 의한 항암 면역 활성을 나타내는 그래프이다.

도 9에서 보듯이 sPD-1 치료 유전자를 포함하지 않는 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해, sPD-1 치료 유전자를 발현하는 Ad5mTR.sPD-1 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 IFN-γ의 발현 양이 유의적(P = 0.02244)으로 증가하는 것을 확인하였다.

상기 결과는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 sPD-1 치료 유전자 발현에 의해 OVA 특이적인 CD8+ T(OT-I) 세포가 활성화되어 IFN-γ을 발현하도록 유도하여 항암 면역을 활성화시킬 수 있음을 나타내는 것으로 분석되었다.

실시예 6-3: 동물모델에서의 재조합 아데노바이러스의 항암 면역 효과 조사

in vivo 상에서 재조합 아데노바이러스들의 항암 면역 활성을 평가하기 위해 정상적인 면역계를 갖는 B6 마우스와 T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스를 사용하여, 실시예 5에 개시된 것과 동일한 방법으로 암의 크기 측정하였다(도 10). 도 10은 정상 면역계를 갖는 B6 마우스와 T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암의 크기 변화를 나타내는 그래프이다.

도 10에서 보듯이, 암의 크기는 HSVtk 유전자와 sPD-1 유전자를 동시에 발현하는 Ad5mTR.sPD-1를 처리하였을 때, 가장 감소되어 있는 것으로 확인되었으며, HSVtk 유전자를 발현하는 Ad5mTR를 처리한 경우 역시 음성 대조군으로 사용한 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해 암의 크기가 감소된 것을 확인하였다. 또한, 정상 면역계를 갖는 B6 마우스에서의 암의 크기(도 10의 A) T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스에서의 결과(도 10의 B)에 비해 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였다.

아울러, 상기 암을 트리판블루 배재법(trypan blue exclusion assay)을 사용하여 암세포의 생육도를 확인하였다(도 11). 도 11은 정상 면역계를 갖는 B6 마우스와 T 세포 및 B 세포가 결여된 Rag K/O 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암세포의 생육도를 확인하여 나타내는 그래프이다.

도 11에서 보듯이, 암세포의 생육도는 HSVtk 유전자와 sPD-1 유전자를 동시에 발현하는 Ad5mTR.sPD-1를 처리하였을 때, 가장 낮은 생육도를 나타내는 것으로 확인되었으며, HSVtk 유전자를 발현하는 Ad5mTR를 처리한 경우 역시 음성 대조군으로 사용한 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해 낮은 생육도를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, Rag K/O 마우스에서의 생육도에 비해 B6 마우스에서의 생육도가 Ad5mTR를 처리한 경우는 1.61배, Ad5mTR.sPD-1를 처리한 경우는 6.58배 감소됨을 확인되었다.

끝으로, CD8-고갈 항체(CD-depleting antibody)를 투여하여 인위적으로 CD8+ T 세포의 작용을 억제한 후, 상술한 바와 동일한 방법으로 암의 크기 및 암세포의 생육도를 확인하였다(도 12 및 도 13).

도 12는 CD8-고갈 항체(CD-depleting antibody)를 투여하여 인위적으로 CD8+ T 세포의 작용을 억제한 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암의 크기 변화를 확인하여 나타내는 그래프이다. 도 12에서 보듯이, Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 음성 대조군에 비해, Ad5mTR.sPD-1와 Ad5mTR를 처리한 경우 양쪽이 유사한 수준으로 암의 크기를 감소시키는 것을 확인하였다.

도 13은 일반 마우스와 CD8-고갈 항체(CD-depleting antibody)를 투여하여 인위적으로 CD8+ T 세포의 작용을 억제한 마우스에 재조합 아데노바이러스 처리 시의 암세포의 생육도를 확인하여 나타내는 그래프이다. 도 13에서 보듯이, 암세포의 생육도는 HSVtk 유전자와 sPD-1 유전자를 동시에 발현하는 Ad5mTR.sPD-1를 처리하였을 때, 가장 낮은 생육도를 나타내는 것으로 확인되었으며, HSVtk 유전자를 발현하는 Ad5mTR를 처리한 경우 역시 음성 대조군으로 사용한 Ad5MOCK 재조합 아데노바이러스를 처리한 경우에 비해 낮은 생육도를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, Rag K/O 마우스에서의 생육도에 비해 B6 마우스에서의 생육도가 Ad5mTR를 처리한 경우는 1.9배, Ad5mTR.sPD-1를 처리한 경우는 4.76배 감소되어 있는 것으로 확인되었다.

상술한 결과를 종합하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 그에 포함된 치료 유전자의 항암 효과가 암세포에 직접적인 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 항암 면역 기작을 활성화시켜서 효과적인 항암활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 아울러, 치료 유전자 중에서 sPD-1 유전자가 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 항암 면역반응을 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) mRNA에 작용하는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 라이보자임 및 HSVtk(Human Simplex Virus thymidine kinase)(서열 번호 3) 및 sPD-1(soluble Programmed Death-1)(서열번호 4)을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 Rib67 라이보자임(서열번호 2)인 것인 재조합 아데노바이러스.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 재조합 아데노바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
   
8. 제1항의 재조합 아데노바이러스를 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 암을 치료하는 방법.

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