JP5872042B2 - トランススプライシングリボザイム及び癌治療遺伝子を含む組換えアデノウィルス及びこの用途 - Google Patents
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Description
本発明による治療用組成物の好適な投与量は、患者の状態及び体重、疾病の度合い、薬物の剤形、投与経路及び期間によるが、当業者によって適切に選択可能である。しかしながら、好適な効果を得るために、本発明の薬学組成物は、1日につき1〜10mg/kgで、好ましくは、1〜5mg/kgで投与することが好ましい。投与は、一日につき一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
実施例1−1:細胞及びマウス
全ての細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS:fetal bovine serum)と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI培地で培養した。6週齢の雌性BALB/c及びC57/BL6マウスをSLC(日本国)から購入した。OT−1マウス(B6 background)及びRag1−/−マウス(B6 background)はジャクソンラボラトリーから入手した。全ての動物実験は大韓民国の国立癌センター(National Cancer Center、Korea)の実験動物の使用と管理に関する管理規定(Guidelines for the Careand Use of Laboratory Animals)に基づいて行った。
CMVプロモータの調節下でマウスのTERT−TR−HSVtk遺伝子を含むAd5mTRを生成するためにAdenoZAPTMとAdenoQuickTMシステムを用いた。pAVQ−CMV−mTERT AS100 Rib(+67)TKにSpeI/SacIIを処理してCMV.mTR.HSVtkを含むDNA断片を得、前記断片をpZAP1.1のSpeI/EcoRV切断部位に挿入して、pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtkを製作した。pZAP1.1.CMV.mTR.HSVtkをPacI/DraIIIで切断し、RightZAP1.2に連結した後、HEK293細胞に導入した。sPD1−Igを製作するために、PD−1の細胞外ドメインを下記のプライマーを用いたPCR方法により増幅した。
HSVtk酵素活性は、細胞でリン酸化されたGCVの蓄積量を測定して決定した。細胞増殖分析(cell proliferation assay、Dojindo Laboratories、Rockville、MD)は、標準方法を用いてアデノウィルスの細胞毒性を評価する方式により行った。要するに、細胞(3×103)を96ウェルプレートに接種し、37℃で1晩中培養した。前記培養された細胞に様々な感染多重度(MOI:multiplicity of infection)のアデノウィルスを感染させた。1日後、GCVを最終濃度200μMになるように添加した後、3日間細胞増殖を測定した。全ての実験は3回繰り返し行った。
Ad5CMV.mTR.sPD1からsPD1−Igタンパク質発現を確認するために、HEK293細胞(4×105)に2MOIのアデノウィルスを感染させた。感染後24時間が経過した時点で、培養上澄み液と細胞残留物(80μg)を抗−Pdcd−1抗体(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)を用いた免疫ブロット方法により分析した。CD8T細胞を枯渇させるために、500μgの2.43α抗−CD8抗体を、アデノウィルスを感染させる2日前に腹腔注射し、その後に15日間5日置きに腹腔注射した。
吸収性リンパノード由来のDCs(DLN−DCs)を17.5%のニコデンズ勾配を用いて増幅させ、抗−CD11cマイクロビード(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)を用いたMACSカラムで精製した。OT−1マウス由来の純粋なCD8T細胞を抗−CD8マイクロビードを用いて分離した。96ウェルプレートで72時間かけてDLN−DCs(5×104)を純粋なCD8T細胞(1×105)とともに培養した。72時間後に培養上澄み液を得、IFN−γの含量をELISA(eBioscience、San Diego、CA)で測定した。
安定的にオブアルブミン(OVA)を発現させるマウスの大腸癌細胞MC38、B6background)であるMC38/OVA細胞を6ウェルプレートで培養した。24時間かけて10MOIのアデノウィルスで感染させたHEK293の培養上澄み液からsPD1−Igを得た後、OT−1CD8Tリンパ球(1×106)が付加されたMC38/OVA細胞(1×104)に加えて72時間培養した。OT−1マウス由来の純粋なCD8+Tリンパ球を上述したMACSカラムを用いて分離した。CD8Tリンパ球から産生されたIFN−γの生成量は、マウスIFN−γCBAアッセイキット(BD bioscience、San Jose、CA)を用いて測定した。
6週齢の雌性BALB/cマウスの皮下に1×106個のCT26細胞を接種した。腫瘍が感知されるとき(7日経過)、5×108PFUのアデノウィルスを腫瘍内に注射し、GCV(75mg/kg)を14日間1日につき2回ずつ静脈注射した。アデノウィルスを7日置きに2回投与した。腫瘍の体積は、下記の公式を用いて決定した。
皮下腫瘍の形成とウィルス注射のための類似する過程をCD8T細胞枯渇実験で行った。E.G7細胞(C57/BL6 backgound;1×106)をRag1−/−マウスまたはC57/BL6マウスに注射し、アデノウィルスとGCVを上述した方法により処理した。生体外分析を行うために、Rag1−/−マウスのE.G7腫瘍に、OT−1マウスから分離されたCD8T細胞の静脈投入方法によりAd5mTR.sPD1を処理した。感染後8日が経過した時点で、末梢血単核球(PBMCs:peripheral blood mononuclear cells)を血液から得、柔細胞分析を行った。
実施例2−1:マウスのTERT−TR−HSVtkを含むアデノウィルスの製作
本発明者らは、公知の腫瘍マーカーであるTERTを用いて腫瘍特異的アデノウィルスを用いた新規なHSVtk発現戦略を開発した。前記戦略において、ヒトのTERT(hTERT)を認識し且つ切断するリボザイムを組換えアデノウィルスを用いて腫瘍細胞に伝達した。さらに、前記リボザイムはHSVtkmRNAと連結され、hTERT mRNAの3’末端で切断されるように設計したが、これは、腫瘍細胞でHSVtkmRNAの新規な解読を誘導した。この種のリボザイムは、トランススプライシングリボザイムと定義される(図1)。理論的に、トランススプライシングリボザイムによって調節されるHSVtkの発現は、腫瘍細胞を含むhTERT mRNAを高いレベルで発現させる細胞に制限される。このため、このようなシステムは、hTERTが低いレベルで発現される周りの正常組織の細胞に影響せずに、腫瘍細胞にHSVtkを伝達する効果的な方法により提案された。実際に、このような戦略は、異種移植マウスモデルに移植されたヒトの大腸癌細胞に高い効果を示す。免疫学的分析時におけるこのようなシステムの一つの問題点は、ヒトの腫瘍細胞を用いた実験が異種移植拒否反応の抑制された免疫欠乏マウスで行われたということである。このため、このようなシステムは、抗−腫瘍免疫化に対するHSVtkの効果を評価するには不向きである。このような制限点を解消するために、本発明者らは、マウスのTERT mRNA(mTERT−TR)を標的とするトランススプライシングリボザイムを用いた類似のシステムを考案し、同系のマウス腫瘍モデルを用いてTERT−TR−調節されたHSVtkの免疫学的効果を評価した。前記TERT認識配列は、HSVtkコーディング配列の近くに位置し、HSVtkの発現は、mTERT転写体の存在に依存的である(図1)。CMVプロモータによって調節されるこのような全体的な発現カセットは、E1/E3−欠乏アデノウィルスゲノムに挿入され、mTERT−TR−調節性HSVtk(mTERT−TR−HSVtk)を含むアデノウィルス(Ad5mTR)を製作した(図2a)。
DNA導入またはアデノウィルス感染による腫瘍細胞におけるHSVtkの発現は、細胞毒性CD8T細胞の抗原反応を増進させることが知られている。生体GCVの存在下でのHSVtkの発現は、たとえ腫瘍体積の全部ではないが、有意な部分で細胞死滅を誘導することができるため、死滅した細胞から誘導された腫瘍抗原は、DCsなどのAPCsによって検出可能であり、これらの細胞は、腫瘍抗原特異的T細胞に反応するリンパノードに移動する。このようなモデルが文献に提示されたが、本発明者らは、定義された抗原特異的T細胞を用いて、このような可能性を試験することにした。このような実験のために、本発明者らは、モデル腫瘍抗原としてマウスの腫瘍細胞株E.G7(オブアルブミンを安定的に発現するEL4細胞の誘導体)を用い、T細胞をモデル腫瘍−抗原(OVA)−特異的CD8T細胞群集として用いられたOVA特異的T細胞受容体形質転換マウスから精製した。OT−1マウスから精製された全てのCD8T細胞は、OVA特異的細胞毒性T細胞である。先ず、本発明者らは、同系のB6マウスに皮下注射されたE.G7腫瘍で、細胞死滅を誘導するAd5mTRの能力を試験した。腫瘍を分離し、Ad5mTRの投与後、組織学的に評価するときに、有意レベルの細胞死滅が観察され、これは、ウィルス感染後に腫瘍抗原が放出されることを意味する(図3a)。次いで、本発明者らは、腫瘍−吸収リンパノードからDCsを精製し、DC/CD8T細胞共同培養分析を用いて、IFN−γ生成のためにOVAがロードされたものであるか否かを評価した。Ad5mTRで処理された腫瘍含有マウス由来のDCsを用いて培養及び精製されたOT−IT細胞は、対照群ウィルスで処理された、腫瘍含有マウス由来のDCsを用いて培養されたOT−IT細胞よりも多量にIFN−γを産生した。このような結果は、Ad5mTRで処理されたマウス由来のDCsが、OVA抗原を十分なレベルで提供して、OVA特異的T細胞を刺激することができるということを示す(図3b)。このため、腫瘍でのHSVtkの発現と、これによるGCV誘導性細胞死滅は、腫瘍抗原の放出結果であり、これらの抗原は、腫瘍抗原特異的細胞毒性T細胞を刺激可能なDCsによって効率的に捕獲された。
これより、HSVtkの腫瘍特異的発現は、DCsを通じて抗−腫瘍T細胞活性を効果的に刺激することができるだけではなく、腫瘍細胞の細胞毒性を直接的に誘導することができるということが分かる。
Ad5mTRは、興味深い可能性が増大する抗−腫瘍CD8T細胞反応性を刺激した。腫瘍が誘導された免疫抵抗性を不活性化させるための別の戦略を有するこれらの提案の組み合わせは、抗−腫瘍T細胞反応性をさらに向上させた。PD−L1は、腫瘍細胞の表面で発現される公知の免疫抑制剤である。本発明者らは、PD−L1を中和させる前記PD−L1受容体の受容性形態であるsPD1を製作し、PD−L1媒介性T細胞抑制を除去した。生体内でsPD1の安定性を増大させるために、sPD1をIgG2aのFc領域と融合させてsPD1−Igを製作した。本発明者らは、アデノウィルスゲノムのE1領域で、mTERT−TRによって調節されるHSVtkとE3領域にあるsPD1−Igを含む二重−モジュールアデノウィルス(Ad5mTR.sPD1)を製作した(図4a)。前記Ad5mTR.sPD1でHEK293細胞を感染させ、細胞外環境でsPD1−Igを発現させて分泌させ、免疫ブロット分析法により確認した(図4b)。Ad5mTR.sPD1感染細胞でのHSVtkの発現レベルは、酵素活性によって測定された方式によりAd5mTR感染細胞のそれと比較した(図4c)。なお、本発明者らは、生体外環境で分泌されたsPD1−Igが、腫瘍細胞表面のPD−L1を中和させることにより、抗−腫瘍T細胞反応性を向上させることができるか否かを試験した。Ad5EF1α.sPD1感染された293HEK細胞の培養上澄み液に、OVAを発現する腫瘍細胞とOVA特異的OT−IT細胞の共同培養物を加え、T細胞反応性をIFN−γ分泌量に基づいて測定した。期待の通り、腫瘍細胞攻撃に反応して、抗原−特異的T細胞によるIFN−γ分泌は、sPD1−Igを含む上澄み液によって向上した(図4d)。腫瘍細胞の表面でのPD−L1の発現は、柔細胞分析によって確認された(図5)。これらの結果は、前記二重−モジュールアデノウィルスが、生体内の腫瘍微細環境で抗−腫瘍T細胞の反応性を向上させることができるということを意味する。
sPD1−Igが、生体内でHSVtkの抗−腫瘍活性を増進させることができるか否かを確認するために、CT26大腸癌モデルを用いた(図2c)。CT26細胞は、それらの細胞表面にPD−L1を高いレベルで発現させるため、前記モデルを選択した(図5)。Ad5mTR.sPD1で感染されたCT26細胞は、Ad5mTRで感染された細胞とほとんど同じレベルの生体外細胞毒性を示し、これは、sPD1−IgがHSVtkによる細胞毒性の直接的な原因にならないことを予想させた(図6a)。これに比べて、Ad5mTR.sPD1はAd5mTRと比較して有意的に腫瘍退行を促し、実際にほとんど完全な腫瘍退行が観察された(図6b)。sPD1−Igを単独で含む対照群アデノウィルス(Ad5EF1α.sPD1)は、これらのモデルでいかなる抗−腫瘍効果も示さないが、これは、腫瘍組織でsPD1−Ig発現が腫瘍退行を誘導するには不十分であり、このようなsPD1−Igの効果のために生体内でHSVtkによる抗原反応が必要であることを意味する。
HSVtkは、DCsによる抗原−特異的CD8T細胞反応を促し(図3b)、sPD1−Igは、細胞外で抗−腫瘍CD8T細胞反応性を促す(図4d)。このような結果は、生体内で向上したCD8T細胞反応性が、Ad5mTR.sPD1の向上した抗−腫瘍効果の原因であることを提示した。これらの可能性を確認するために、CT26腫瘍保有マウスに抗−CD8抗体を投与して、CD8T細胞を枯渇させた。二重−モジュールAd5mTR.sPD1による向上した腫瘍成長抑制効果が、CD8T細胞の枯渇したマウスではほとんど消失した(図7a)。興味深いことに、Ad5mTRの抗−腫瘍活性もまた減少したが、これは、CT26マウス腫瘍モデルにおけるAd5mTRの効果が、CD8T細胞によって媒介された抗−腫瘍免疫反応に依存的であることを示す。しかしながら、抗−腫瘍活性に影響するCD8の枯渇は、Ad5mTRよりもAd5mTR.sPD1に対して一層高い効果を示す(1.9倍対4.76倍)(図7b)。腫瘍−特異的CD8T細胞の役割をより直接的に評価するために、E.G7腫瘍モデルとOVA−特異的OT−IT細胞を用いた。Ad5mTR.sPD1が投与された同系のB6マウスへのE.G7腫瘍の皮下注射は、CT26モデルで観察されたのと同様に、向上した腫瘍退行結果を示す。これに比べて、同じ実験が同系のリンパ球−欠乏Rag1−/−マウスで行われる場合には、2種類のウィルスの抗−腫瘍効果が顕著に減少した(図8a)。CT26モデルでCD8T細胞枯渇の効果と一致するように、減少の度合いはAd5mTRよりもAd5mTR.sPD1に対して一層強い効果を示す(1.61倍対6.58倍)(図8b)。E.G7を含むRag1−/−マウスに静脈注射されたOT−IT細胞によって抗原−特異的T細胞反応が形成されるとき、アデノウィルス投与の前記抗−腫瘍効果が修復され、前記効果は、Ad5mTRを投与した後よりもAd5mTR.sPD1を投与するときに一層顕著になった(図8c)。特に、血中OT−IT細胞の数は、Ad5mTRと比較して、Ad5mTR.sPD1を投与したときにさらに大幅に増大した(図8d)。このような結果は、Ad5mTR.sPD1が腫瘍特異的CD8T細胞の機能を直接的に向上させることによって腫瘍退行を促すということを示す。
1次腫瘍部位へのウィルスの注射によってマウスの遠位部で2次腫瘍の成長を抑制する可能性が増大したAd5mTR.sPD1が投与されたマウスの血液内で、癌特異的T細胞が増大した。BALB/cマウスで発生したCT26腫瘍に、Ad5mTR.sPD1を3日置きに3回投与した。最初の投与日から14日後に、同じマウスの向こう側の部位で2次CT26腫瘍の発生が試みられた。このとき、Ad5mTR.sPD1が投与されたマウスでは、1次腫瘍が最小限に増殖されたのに対し、Ad5MOCKが投与されたマウスでは、大きなサイズ(>600mm3)の1次腫瘍が発生した。このため、正常なBALB/cマウスの新たな集団が、2次腫瘍発生のための対照群として用いられた。対照群では2次腫瘍が順調に成長したが、Ad5mTR.sPD1が投与されたマウスでは成長しなかった(図9a及び9c)。同じ結果がE.G7腫瘍モデルを含むB6マウスで確認された(図9b及び9c)。したがって、二重モジュールアデノウィルスの注射は、抗癌免疫性を向上させて抗癌効果を導き出した。
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- 癌特異遺伝子であるテロメア逆転写酵素(TERT)mRNA(配列番号1)に作用する、トランススプライシングリボザイム−単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSVtk)複合体をコードするポリヌクレオチド及び可溶性プログラムされた細胞死1(sPD−1)をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノウィルス。
- 前記複合体をコードするポリヌクレオチドは、トランススプライシングリボザイムをコードする配列番号2の塩基配列と、HSVtkをコードする配列番号3のポリヌクレオチドを含むものである請求項1に記載の組換えアデノウィルス。
- 前記可溶性プログラムされた細胞死1(sPD−1)をコードするポリヌクレオチドは、配列番号4の塩基配列を含むポリヌクレオチドである請求項1に記載の組換えアデノウィルス。
- 請求項1から請求項3のうちのいずれか一項に記載の組換えアデノウィルスを有効成分として含む癌予防または治療用薬学組成物。
- 薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む請求項4に記載の組成物。
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