KR101755431B1 - 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor) 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임; (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터로부터 발현된 라이보자임, 상기 라이보자임을 발현하는 레트로바이러스 및 상기 레트로바이러스로 처리한 T 세포에 관한 것이다. 아울러, 상기 재조합 벡터, 형질전환 세포, 라이보자임, 레트로바이러스, T 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 벡터, 형질전환 세포, 라이보자임, 레트로바이러스, T 세포 또는 이들의 조합을 암치료를 필요로 하는, 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터 및 이로부터 발현되는 라이보자임은 기존의 항암 치료에 방해가 되었던 T cell의 CTLA-4를 억제함과 동시에 항암 치료가 가능하게 함으로써 더 효율적인 항암효과를 기대할 수 있는 유전자 세포 치료법으로 정상 조직에 미치는 독성은 감소시켜 치료 효과 및 안전성을 모두 높이는 효과를 나타내어 향후 유전자 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor) 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도 {CTLA-4 targeting trans-splicing ribozyme for delivering chimeric antigen receptor and use thereof}
본 발명은 (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임; (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터로부터 발현된 라이보자임, 상기 라이보자임을 발현하는 레트로바이러스 및 상기 레트로바이러스로 처리한 T 세포에 관한 것이다. 아울러, 상기 재조합 벡터, 형질전환 세포, 라이보자임, 레트로바이러스, T 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 재조합 벡터, 형질전환 세포, 라이보자임, 레트로바이러스, T 세포 또는 이들의 조합을 암치료를 필요로 하는, 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법에 관한 것이다.
암은 국내 사망 원인의 1위를 차지하는 중대 질환으로, 인체의 모든 부위에서 발생할 수 있으며, 환경적 요인, 유전적 요인 등 다양한 요인들에 의해 발생할 수 있다. 암을 정복하기 위한 수많은 연구가 있어 왔지만 아직까지 정복되지 않고 있는 난치병이다. 암에 대한 기존의 치료법으로는 외과적 수술, 화학 요법 및 방사선 치료 등이 있으며 의학의 발달로 예후가 좋아지고 있지만, 암세포 뿐 아니라 정상 세포에도 악영향을 끼칠 수 있는 한계가 많다. 특히, 현재 대부분의 암 치료는 외과적 제거(수술) 또는 항암화학요법을 이용하여 시행되고 있다. 최근에는 이러한 치료법들과는 개념이 다른 치료법들이 연구되고 있는데 특히 인체에 자연적으로 존재하는 자가 면역 체계를 이용하여 암 조직을 선택적으로 치료하여 부작용을 최소화하여 효율적으로 치료하고자하는 연구가 주목받고 있다.
효과적인 암 치료를 위해서 직접적으로 암 세포를 표적하는 cytotoxic T lymphocytes(CTL)이 중요하다는 사실이 보고되어 왔다. 지금까지 T cell therapy를 이용한 항암 치료에 대한 연구는 환자의 T cell에 특정 항원을 인식하는 TCR(T cell receptor)을 전달하거나 또는 항원을 인식하는 항체의 scFv 부분을 CD3 signalling domain에 접목시킨 Chimeric antigen receptor(CAR)를 전달하는 방법으로 시도되었다. CAR를 T cell에 접목시키면 antigen presenting cell(APC)에 의한 신호 전달과 관계없이 scFv의 특정 항원 인지만으로 T cell을 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 그러나 대부분 혈액 암에 대한 치료제로 많이 개발되어 왔으며, 고형암의 경우 암 세포 주변이 면역 작용을 억제할 수 있는 환경이 조성되어 CAR의 치료 효율이 낮게 나타났다. T cell이 활성화되면 CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)의 발현이 유도되는데, 이는 활성화된 T cell의 활성을 조절하는 regulatory T cell(Treg)의 ligand와 결합하여 T cell 내로 활성 억제 신호를 전달하게 되어 암 표적 T cell의 활성을 감소시킬 수 있다.
유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법이다. 이는, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.
한편, 최근에는 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스를 개발하려는 연구가 진행되고 있는데, 대표적인 예로서, 트랜스-스플라이싱 라이보자임 등을 사용하는 방법이 개발되고 있다.
상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 이용한 조직 특이적인 암치료용 아데노바이러스의 개발에 관한 연구는 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 라이보자임이 실험관 내에서뿐만 아니라 박테리아 나아가 인체 세포 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 수행함으로써 별도로 존재하는 두 개의 전사체를 서로 연결시킬 수 있음이 밝혀지면서 주목받게 되었다.
구체적으로, 이러한 그룹 I 인트론을 기초로 한 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 특정 조직 또는 질환과 관련된 유전자 전사체 또는 질병 세포에서만 특이적으로 발현되는 특정 RNA를 표적으로 하여, 이들을 정상적인 RNA로 보정하거나 또는 새로운 치료용 유전자 전사체로 치환되도록 재프로그램을 유발할 수 있어, 조직 및 질환 특이적이며 안전한 유전자 치료 기술이 될 수 있을 것이라 예상되고 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 특이 RNA를 제거함과 동시에 원하는 치료용 유전자 산물의 발현을 유도할 수 있으므로 특이 RNA에 해당하는 유전자를 억제하면서 원하는 치료용 유전자를 발현할 수 있어 치료 효과를 배가시킬 수 있다.
특히, 최근 연구에 있어 암 조직에서 특이적으로 작용할 수 있는 유전자(human Telomerase reverse transcriptase)를 타겟으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임이 개발되었으나, 이들이 조직 특이적인 프로모터와의 조합에 의하여 높은 조직특이성을 보이는 반면 발현 효율이 매우 낮아, 치료 효율 측면의 단점을 아직까지 극복하지 못하고 있다.
즉, 아직까지 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 이용한 유전자 치료법은 아직까지 치료 효율을 높이기 위하여 계속적인 연구 및 개발이 이루어지고 있는 상태이다.
한편, 기존의 면역 시스템을 이용하여 효율적인 항암 치료를 하고자 하는 많은 시도들이 이뤄지고 있다. T 세포에 특정 항원을 인식하는 CAR를 발현시켜줌으로써 APC에 의존하지 않고 직접적으로 암 세포를 공격하는 T 세포가 개발되었다. 하지만 지금까지 혈액암에 대한 치료제로서 많이 개발되어 왔으며, 암 조직 주변이 면역 작용을 억제하는 환경으로 조성되는 고형암에서는 CAR에 의한 치료 효과가 낮은 것으로 알려졌다. 이를 극복하기 위해서 활성화된 T 세포의 활성을 저해하는 CTLA-4를 억제하여 CAR를 발현하는 T 세포의 활성을 유지시켜 효율적인 항암 효과를 나타낼 수 있도록 하고자 하였으나, 이전 보고된 연구에서는 항암 치료제와 함께 CTLA-4에 대한 antibody를 함께 사용하여 항암 효과를 확인한 결과, CTLA-4를 전반적으로 억제하기 때문에 특이성이 낮고 부작용 또한 유발되었다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 T 세포의 CTLA-4를 억제하고 동시에 암 항원을 표적하는 CAR를 전달하여 치료 효능이 동시에 향상된 암 치료 유전자 치료 방안을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 테트라하이메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)로부터의 그룹 I 인트론 라이보자임을 이용하여 CTLA-4에 대한 트랜스-스플라이싱 반응을 유도함으로써 CTLA-4를 억제하고 유전자 치환을 통해 CAR를 발현시켜 특정 암 항원에 대한 표적 기능을 갖도록 한 결과, 기존의 항암 치료에 방해가 되었던 T 세포의 CTLA-4를 억제함과 동시에 CAR을 발현하는 T 세포를 이용한 자가 면역적 항암 치료가 가능하게 함으로써 항암 특이성과 효율성을 모두 증대시킨 효과적인 항암효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임; (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로부터 발현된 라이보자임을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 또는 라이보자임을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 또는 라이보자임을 암치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임; (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터를 제공한다.
하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 CTLA-4를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 CTLA-4의 RNA 상에서 내부 가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS) IGS32, IGS48, IGS111, 및 IGS232로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 표적으로 하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 CTLA-4를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 키메릭 항원 수용체는 암세포 특이적 항원을 인식하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 암세포 특이적 항원은 EGP2(Epithelial glycoprotein 2), EGP40(Epithelial glycoprotein 40), TAG72(Tumor associated glycoprotein 72), IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CA IX(Carbonic anhydrase IX), CD19, CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, ALK(Anaplastic lymphoma kinas), CD47, EGFRvIII, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), MUC1(Mucin 1), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), FGFR4(Fibroblast growth factor receptor 4), FAR(Fetal acetylcholine receptor), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3,5, ROR1, Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), CD70 및 VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터에 포함된 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 (iii) 상기 라이보자임의 5' 말단에 CTLA-4의 라이보자임 인지 부위 뒤쪽의 염기서열 100 내지 300 뉴클레오티드에 대한 antisense 서열의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 antisense 서열은 서열번호 5 또는 6의 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명은 상기 발현카세트는 레트로바이러스의 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 양태는, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 재조합 벡터로부터 발현된 라이보자임을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 라이보자임을 발현하는, 레트로바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 레트로바이러스로 처리한 T 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 벡터 또는 상기 라이보자임을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 간암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 백혈병, 자궁암, 림프종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 재조합 벡터 또는 라이보자임을 암치료를 필요로 하는, 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임; (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터에 관한 것이다. 구체적으로 상기 재조합 벡터는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 T 세포에 의한 면역반응을 방해하는 CTLA-4를 타겟팅하여 CTLA-4 관련 기작을 억제하는 동시에 T 세포가 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의한 신호전달 과정없이 원하는 항원을 가지는 세포를 공격할 수 있도록 하는 키메릭 항원 수용체의 발현을 유도하여, 암치료 효과가 탁월한 것을 확인한 것을 기초로, 치료 효과가 우수한 자가면역적 항암치료 수단을 개발한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 라이보자임 암호화 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써, 라이보자임 암호화 서열의 발현은 이 프로모터의 영향 또는 조절 하에 있게 된다. 2개의 핵산 서열(라이보자임 암호화 서열과 이 서열의 5' 말단의 프로모터 부위 서열)은 프로모터 작용이 유도됨으로써 라이보자임 암호화 서열이 전사되는 경우 작동 가능하게 연결된 것이며, 상기 두 서열 사이의 연결 특성이 프레임 변경 돌연변이(frame-shift mutation)를 유도하지 않으며, 발현 조절서열이 라이보자임의 발현을 지배하는 능력을 저해하지 않는 경우 작동 가능하게 연결되었다고 한다. 재조합 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서와 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며 구체적으로는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 용어 "발현 카세트"는 프로모터와 트랜스-스플라이싱 라이보자임-목적 유전자를 포함하고 있고, 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하고 있으며, 특히 CTLA-4 RNA 서열 상에서 특히 라이보자임의 타겟팅 주요 부위인 내부 가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS)을 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CTLA-4를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 CTLA-4의 RNA 상에서 내부 가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS) IGS32, IGS48, IGS111, 및 IGS232로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 표적으로 할 수 있으며, 해당 CTLA-4의 IGS를 타겟팅하는 라이보자임은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 38로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 CTLA-4 RNA에 효과적으로 작용할 수 있는 라이보자임을 제작하고자, 우선적으로 CTLA-4 RNA의 특정 서열에 특이적이고 효율적으로 인지할 수 있는 라이보자임 내부 가이드 서열 (Ribozyme Internal Guide Sequence, Ribozyme IGS) 서열을 찾기 위해 in vitro 및 in vivo 맵핑(mapping)을 수행하였다. 상기 in vitro 및 in vivo RNA 맵핑을 수행한 결과, 다양한 트랜스-스플라이싱 결과물들을 확인할 수 있었고, 상기 결과물들을 서열분석하여 다양한 인지부위를 찾았다. 이렇게 확인된 라이보자임 주요 타겟팅 부위는 IGS32, IGS48, IGS111, 및 IGS232였으며(도 1), 특히 in vitro와 in vivo 맵핑에서 공통적으로 인지부위로 확인된 부위는 IGS48이었다. 상기 확인된 인지 부위에 대한 라이보자임들(IGS32 : 서열번호 38, IGS48 : 서열번호 1, IGS111 : 서열번호 2, 및 IGS232 : 서열번호 3)을 각각 제작하였으며, 일부 라이보자임들을 이용하여 in vitro 트랜스-스플라이싱을 진행한 결과 IGS32, IGS48, IGS111 및 IGS232에서 타겟팅이 잘 일어남을 확인하였다(도 2).
본 발명의 용어 "프로모터"는 DNA의 일부분으로 전사를 개시할 수 있도록 RNA 중합효소의 결합에 관여한다. 일반적으로 표적 유전자와 동일 가닥상에 표적 유전자에 인접하여 이의 상류에 위치하며, RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 도입하는 단백질 이른바 전사인자(transcription factor)가 결합하는 자리로서 상기 효소 또는 단백질이 올바른 전사시작 부위에 위치하도록 유도할 수 있다. 즉, 센스 가닥(sense strand) 상에서 전사하고자 하는 유전자의 5' 부위에 위치하여 RNA 중합효소가 직접 또는 전사인자를 통해 해당 위치에 결합하여 표적 유전자에 대한 mRNA 합성을 개시하도록 유도하는 것으로 특정한 유전자 서열을 갖는다. 유전자의 발현을 높이기 위하여 보편적인 프로모터(universal promoter)인 레트로바이러스의 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 용어 "라이보자임"은 효소처럼 작용하는 RNA 분자 또는 그 RNA 분자를 포함하는 단백질로 구성되는 분자로 RNA 효소 또는 촉매적 RNA라고도 불린다. 명확한 3차 구조를 갖는 RNA 분자로 화학반응을 수행하며 촉매적 또는 자기촉매적 특성을 가지며, 몇몇 라이보자임은 자기 또는 다른 RNA 분자를 절단하여 활성을 저해하는 것으로 밝혀졌으며, 다른 라이보자임은 리보솜의 아미노전달효소(aminotransferase) 활성을 촉매하는 것이 확인되었다. 이러한 라이보자임에는 망치머리(hammerhead) 라이보자임, VS 라이보자임, 헤어핀(hairpin) 라이보자임, 그룹 I 인트론, 그룹 II 인트론 등이 포함될 수 있다. 본 발명에서 라이보자임은 트랜스-스플라이싱 반응을 통해 암 특이적 유전자의 활성을 저해시켜서 결과적으로는 선택적인 항암효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 암치료 유전자와 접합된 형태로 발현되어 암치료 유전자를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 암특이적 유전자를 불활성화시키고, 암치료 유전자를 활성화시킬 수 있는 활성을 나타낸다면 어떠한 형태의 것이라도 사용 가능하다. 구체적으로 상기 라이보자임은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "트랜스-스플라이싱(trans-splicing)"은 서로 다른 유전자로부터의 RNA를 연결하는 것을 의미한다. 구체적으로는 T 세포에 특이적인 CTLA-4의 mRNA를 인지하여 트랜스-스플라이싱하는 능력이 검증된 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 그룹 I 라이보자임을 사용하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명자들은 상기 라이보자임과 함께 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 재조합 레트로바이러스를 고안하였다. 즉, 상기 재조합 레트로바이러스는 T 세포에 특이적인 트랜스-스플라이싱 라이보자임을 통하여 라이보자임에 연결된 목적 유전자 발현카세트에 포함된 목적 유전자를 T 세포 특이적 유전자 전사체에 삽입하는 기능을 할 수 있다.
본 발명의 용어 "목적 유전자"는 상기 라이보자임에 의하여 세포 내 특이적 표적 암특이적 유전자의 mRNA에 연결되어 발현이 유도되는 유전자를 의미하며, 본 발명에서는 치료용 유전자 또는 리포터 유전자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
아울러, 본 발명의 발현 카세트에 포함되는 목적 유전자는 T 세포에 CTLA-4 대신 발현시키고자 하는 모든 유전자일 수 있으며, 특히 본 발명의 목적상 키메릭 항원 수용체(CAR)일 수 있다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)"는 자연적으로 T 세포가 활성화하는데 필요한 항원 제시 세포(APC)의 매개없이 원하는 항원에 결합하여 항원-항체 반응을 통해 T 세포의 활성화를 유도하고 해당 항원을 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 T 세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미할 수 있다. 곧, T 세포에 발현시 항원에 결합하여 T 세포의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 키메릭 항원 수용체는 암세포 특이적 항원을 인식하는 것일 수 있으며, 상기 암세포 특이적 항원은 EGP2(Epithelial glycoprotein 2), EGP40(Epithelial glycoprotein 40), TAG72(Tumor associated glycoprotein 72), IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CA IX(Carbonic anhydrase IX), CD19, CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, ALK(Anaplastic lymphoma kinas), CD47, EGFRvIII, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), MUC1(Mucin 1), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), FGFR4(Fibroblast growth factor receptor 4), FAR(Fetal acetylcholine receptor), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3,5, ROR1, Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), CD70 및 VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 특히 TAG72일 수 있다. 본 발명에서 키메릭 항원 수용체는 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, (주) 바이로메드에서 받은 Tag72 항원 인지 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR, 서열번호 4)가 들어있는 레트로바이러스 벡터(pMT-CAR)에 라이보자임을 클로닝하여, pMT-Rib-CAR 레트로바이러스 벡터와 함께 envelope DNA와 gag-pol DNA를 섞어서 세포에 뿌려 레트로바이러스를 생산하였다.
한편, 기존의 면역 시스템을 이용하여 효율적인 항암 치료를 하고자 하는 많은 시도들이 이뤄지고 있었다. T cell에 특정 항원을 인식하는 CAR를 발현시켜줌으로써 APC에 의존하지 않고 직접적으로 암 세포를 공격하는 T cell이 개발되었다. 하지만 지금까지 혈액암에 대한 치료제로서 많이 개발되어 왔으며, 암 조직 주변이 면역 작용을 억제하는 환경으로 조성되는 고형암에서는 CAR에 의한 치료 효과가 낮은 것으로 알려졌다.
이를 극복하기 위해서 활성화된 T cell의 활성을 저해하는 CTLA-4를 억제하여 CAR를 발현하는 T cell의 활성을 유지시켜 효율적인 항암 효과를 나타낼 수 있도록 하였다. 이전에 항암 치료제와 함께 CTLA-4에 대한 antibody를 함께 사용하여 항암 효과를 확인한 연구가 보고되었으나, 이는 CTLA-4를 전반적으로 억제하기 때문에 특이성이 낮고 부작용 또한 유발될 수 있다.
본 발명에서는 cytotoxic T cell에 CTLA-4-타겟팅 라이보자임을 전달하여 라이보자임이 CTLA-4를 억제하는 동시에 암 항원을 인식하는 CAR를 발현시킴으로써 효율성을 높이고 부작용을 감소시킬 수 있다. 이 라이보자임은 leaky expression에 의해 CAR를 발현시키고, T cell이 활성화 상태가 되었을 때 CTLA-4가 발현되면 라이보자임의 트랜스-스플라이싱에 의해 CTLA-4를 억제하고 동시에 CAR의 발현이 더 증가할 수 있도록 개발되었다.
따라서 T cell이 암 세포를 인지하고 활성화되었을 때, 그 활성이 유지될 뿐만 아니라 암 항원을 더 잘 인식하도록 CAR가 발현됨으로써 항암 효과를 더 극대화할 수 있다. 즉, 기존의 항암 치료를 저해했던 CTLA-4를 억제하고 동시에 CAR의 발현을 유도함으로써 이전의 문제점을 극복하고, 항암 특이성과 효율성을 모두 증대시킨 효과적인 항암 유전자 세포 치료제를 개발하였다.
특히, 본 발명의 라이보자임을 이용할 경우 CTLA-4의 leaky expression을 통하여 CAR의 발현이 지속적으로 일어날 수 있게 함으로써 항암 효과를 더욱 우수하게 가질 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 (iii) 상기 라이보자임의 5' 말단에 CTLA-4의 라이보자임 인지 부위 뒤쪽의 뉴클레오티드에 대한 antisense 서열의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 antisense 서열은 라이보자임 인지 부위 뒤쪽의 염기서열 50 내지 400 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 특히 antisense 서열은 서열번호 5 또는 6의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 아울러, 본 발명은 CMV, RSV 프로모터 등과 함께 antisense 서열을 사용하여 발현 증가 또는 특이성을 높일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, [CMV 프로모터-CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-CMV-CTLA-5 Rib48-CAR(CMV-Rib-CAR T) construct에 비해서 antisense 서열을 추가로 포함하는 [CMV 프로모터-antisense 100nt-CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-CMV-AS-CTLA-5 Rib48-CAR(CMV-AS-Rib-CAR T) construct의 세포 내 발현 효과가 더 우수함을 확인하였다(도 10).
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환 세포"는 숙주세포에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 세포를 의미한다. 형질전환은 상기 "도입" 방법에 의해 이루어질 수 있고, 당분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 재조합 벡터를 PEI를 이용하여 DNA를 세포 내로 주입하거나, 바이러스를 전달체로 이용하여 세포 내로 주입하여 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제조하였으며, 나아가 일시적인 형질도입이 아닌 stable cell을 제작하는 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 라이보자임을 제공한다. 본 발명에서 재조합 벡터 및 라이보자임에 관한 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 라이보자임을 발현하는, 레트로바이러스를 제공한다. 본 발명에서 라이보자임에 관한 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 레트로바이러스를 처리한 T 세포를 제공한다. 본 발명에서 T 세포는 일차 T 세포일 수 있고, 특히 인간 유래 일차 T 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 레트로바이러스를 처리한 T 세포는, 상기 라이보자임을 발현하여 CTLA-4의 발현량이 감소되고, CAR이 발현된 T 세포일 수 있으며, 이에 따라 CAR이 인식하는 항원을 발현하는 세포에 의해서 T 세포가 활성화될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예로서, 배양접시의 바닥에 레트로넥틴(retronectin)을 코팅해주었고, 레트로넥틴 코팅 배양접시(retronectin coated dish)에 레트로바이러스(retrovirus)를 붙여주었다. 일차 T 세포를 배양접시에 넣어 레트로바이러스를 처리한 T 세포를 제조하였다. 반정량 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통해 해당 T 세포에서 CTLA-4의 발현량이 감소하는 것(도 5)과 CAR이 발현하는 것(도 6 및 도 7)을 확인하였다. 다만, CAR의 발현량은 라이보자임을 이용하지 않고 단순 CAR 발현 카세트를 주입한 CAR T 세포에 비해서 현저히 적었다. 아울러 이렇게 제조한 T 세포를 CAR의 인지 항원인 Tag72를 발현하는 암세포주인 LS174T에 처리하여 세포사 유도 효과를 확인하였다. 그 결과, mock T cell에 비해 약 5배의 cytotoxicity를 보였으며, 양성대조군의 70% 정도의 효과를 보이는 것을 확인하였다(도 8). 이는 CAR 발현량이 양성대조군인 CAR T에 비해 현저히 적은 것을 고려할 때 추가적인 CTLA-4의 억제 등에 의해 개별 T 세포의 활성이 매우 우수해진 것을 시사한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "암"은 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로는 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시킨 상태를 의미하며, 구체적으로 상기 암은 폐암, 췌장암, 간암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 백혈병, 자궁암, 림프종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 암이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예로서, 본 발명의 라이보자임을 클로닝한 레트로바이러스 벡터를 1차 T 세포에 전달하고 Tag72 항원을 발현하는 세포주인 LS174T에 대해서 세포독성 효과를 나타내는지 확인하였다. 그 결과, 본원발명의 Rib-CAR T에서 양성 대조군인 CAR T의 50 내지 70 % 정도의 살상능 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 본원발명의 라이보자임이 실제적인 암세포 표적 살상능을 가짐을 확인하였다(도 8, 및 도 13).
본 발명의 라이보자임을 발현하는 T 세포는 암특이적 항원을 발현하는 암세포에 대하여 양성 대조군의 50 내지 70 %에 달할 정도로 우수한 살상능을 가질 뿐 아니라, 해당 항원을 발현하는 암세포에 대한 특이적 살상능을 가지는 우수한 효과를 가지고 있다.
특히, 본 발명의 라이보자임을 발현하는 T 세포는 in vivo에서 T 세포 비활성화인자인 CTLA-4의 발현을 감소시킴으로써 살상능을 통한 T 세포의 항암효과를 효과적으로 유지시킬 수 있다.
아울러, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제의 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 있으며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합을 개체에게 투여함으로써, 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합은 1일 1 내지 10 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 5 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합은 단독으로, 또는 공지의 항암제를 병용 투여하거나 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용하여 항암 효과를 증대시킬 수 있다. 본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 투여와 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터, 상기 형질전환 세포, 상기 라이보자임, 상기 레트로바이러스, 상기 T 세포 또는 이들의 조합의 투여와 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이 있다.
본 발명의 재조합 벡터 및 이로부터 발현되는 라이보자임은 기존의 항암 치료에 방해가 되었던 T cell의 CTLA-4를 억제함과 동시에 항암 치료가 가능하게 함으로써 더 효율적인 항암효과를 기대할 수 있는 유전자 세포 치료법으로 정상 조직에 미치는 독성은 감소시켜 치료 효과 및 안전성을 모두 높이는 효과를 나타내어 향후 유전자 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 in vitro 및 in vivo RNA 맵핑을 수행한 결과, CTLA-4 RNA 상 다양한 인지부위를 찾은 결과 라이보자임 주요 타겟팅 부위는 IGS32, IGS48, IGS65, IGS111 및 IGS232임을 나타낸 도면이다. (A)는 CTLA-4 RNA 상 라이보자임의 주요 타겟팅 부위로 확인된 IGS32, IGS48, IGS65, IGS111, IGS232 및 IGS284의 위치를 표시한 도이다. (B) 및 (C) 는 in vitro RNA 맵핑한 결과, (D) 및 (E)는 in vivo RNA 맵핑한 결과를 나타낸다.
도 2는 인지 부위에 대한 라이보자임(IGS48, IGS111 및 IGS232)을 각각 제작하여 in vitro 트랜스-스플라이싱을 진행한 결과 IGS32, IGS48, IGS111 및 IGS232에서 타겟팅이 우수하게 일어남을 확인한 도면이다.
도 3은 라이보자임의 표적 특이적 효율을 확인하기 위해 3' exon으로 리포터 유전자인 firefly luciferase 유전자를 달아주고 위에서 확인한 CTLA-4 인지 부위 중 5' UTR이면서 loop 부위에 위치한 IGS48, ORF이면서 loop 부위인 IGS111 및 232로 각각에 대한 라이보자임을 제작하였다. 이때 IGS 외에 특이성과 효율성을 높이기 위해 P1,P10 helix를 붙여주었다. (A)는 상기 제작한 라이보자임 발현카세트 및 이의 작용 기작을 나타낸 모식도이다. (B)는 상기 제작한 라이보자임의 효과를 루시퍼라제 활성을 통해 측정한 결과, 표적 RNA가 있을 때, 라이보자임이 트랜스-스플라이싱에 의해 효율이 증가하는 것을 확인하였으며, IGS48을 가지는 라이보자임(IGS48P1P10 F.luci)이 가장 효율이 높은 것을 확인한 도면이다.
도 4는 라이보자임의 표적 특이적 효율을 확인하기 위해 3'exon으로 리포터 유전자인 firefly luciferase gene을 달아주고 antisense 없이 라이보자임만 있을 경우와 CTLA-4에 대한 antisense가 각각 100nt, 300nt 있을 경우(각각 AS100-IGS48P1P10-F.luci, AS300-IGS48P1P10-F.luci)에 라이보자임의 활성을 확인한 도면이다.
도 5는 IGS48 라이보자임으로 레트로바이러스 벡터를 제작하여 클론을 수득하였으며(Rib#5, Rib#11 및 Rib#16) 이를 전달한 일차 T 세포에서 얻은 RNA를 역전사(reverse transcription)시킨 후, 세포 내의 CTLA-4 수준을 확인하기 위해서 반정량 PCR(semi-quantitative PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 IGS48 라이보자임으로 레트로바이러스 벡터를 제작하여 클론을 수득하였으며(Rib#5, Rib#11 및 Rib#16) 이를 전달한 T 세포 표면에서의 CAR의 발현 수준을 확인하기 위해서 각 세포를 FACS를 통해 측정한 도면이다.
도 7은 IGS48 라이보자임으로 레트로바이러스 벡터를 제작하여 클론을 수득하였으며(Rib#5, Rib#11 및 Rib#16) 이를 전달한 T 세포에서의 CAR의 발현 수준을 확인하기 위해서 각 세포를 웨스턴 블랏팅을 통해 측정한 도면이다.
도 8은 본 발명에서 제작한 레트로바이러스 벡터에 라이보자임-CAR을 클로닝한 것을 바이러스 (Ret-CTLA-4 Rib48-CAR, Rib#16-CAR T) 로 제작하여 일차 T cell에 전달하여 Tag72를 발현하는 암세포에 대한 세포사 유도 효과 확인한 도면으로, 라이보자임 없이 CAR를 발현하는 레트로바이러스(Ret-CAR)를 전달한 T cell (CAR T)은 양성 대조군으로 사용하였다. 해당 도면에서 E:T 비율은 target 세포(LS174T) : T 세포의 비율이다. 차례로 1:5, 1:10, 1:20 및 1:30의 비율을 의미한다.
도 9는 본 발명에서 대표적으로 사용한 CTLA4 Rib48-CAR, AS100-CTLA4 Rib48-CAR, CMV-CTLA4 Rib48-CAR 및 CMV-AS-CTLA4 Rib48-CAR의 발현 카세트 구성을 나타낸 모식도이다. 즉, antisense 서열의 도입 여부와 CMV 프로모터의 도입여부에 따라 각각 construct를 제작하였다.
도 10은 본 발명의 라이보자임을 전달한 T 세포에서 CAR의 발현을 FACS를 통해서 확인한 데이터이다. 공백 레트로바이러스를 전달한 음성 대조군(Mock T), CAR 발현 레트로바이러스를 전달한 양성 대조군(CAR T, CMV-CAR T)를 사용하였으며, 본 발명의 라이보자임 중 대표적으로 Rib-CAR T, AS-Rib-CAR T, CMV-Rib- CAR T, 및 CMV-AS-Rib-CAR T를 전달하여 CAR의 발현율을 확인하였다.
도 11은 본 발명의 라이보자임 중에서 Rib-CAR T와 CMV-AS-Rib-CAR T를 레트로바이러스로 T 세포에 전달하여 CTLA-4 RNA 수준을 확인한 도이다.
도 12는 Jurkat 세포의 CTLA-4 RNA 수준을 높이는 chemical 및/또는 본원발명의 라이보자임을 전달하는 레트로바이러스를 Jurkat 세포에 처리하여 CTLA-4 RNA 수준을 확인한 결과를 정리한 도이다. 먼저, 상단에는 각 실험군의 실험 조건을 정리한 것으로, 구체적으로 II-1 실험군은 chemical 및 레트로바이러스 모두 미처리; II-2 실험군은 chemical 미처리 및 레트로바이러스 처리; II-3 실험군은 chemical 처리 및 레트로바이러스 미처리; II-4 실험군은 chemical 및 레트로바이러스 모두 처리; II-5 실험군은 polybrene, chemical 및 레트로바이러스 미처리; II-6 실험군은 polybrene 및 레트로바이러스 미처리 및 chemical 처리하였다. 하단에는 상기 실험군의 CTLA-4 RNA 수준을 측정한 도이다.
도 13은 본 발명의 라이보자임인 Rib-CAR과 CMV-AS-Rib-CAR 각각을 레트로바이러스를 통해 1차 T 세포에 전달하고 Tag72 항원을 발현하는 암세포주 LS174T에 처리하여 세포독성 효과를 확인한 도이다. 이의 양성 대조군으로 CAR T를 레트로바이러스로 1차 T 세포에 전달한 대조군(CAR)을 이용하였으며, 음성 대조군으로 공백 레트로바이러스를 처리한 대조군(Mock)을 이용하였다. 해당 도면에서 E:T 비율은 target 세포(LS174T) : T 세포의 비율이다. 차례로 1:1, 1:5, 1:10 및 1:20의 비율을 의미한다.
도 14는 본 발명에서 이용한 group I intron ribozyme의 trans-splicing scheme 모식도이다.
도 15는 본 발명의 T 세포가 작용하는 전체적인 scheme(CTLA-4를 표적하는 ribozyme을 발현하는 retrovirus를 T cell에 전달한 후, T cell 표면에 CAR가 발현되어 Tag72를 발현하는 tumor cell을 공격)을 나타내는 모식도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 라이보자임 제작
1-1. CTLA-4 RNA에 대한 in vitro 맵핑
본 발명자들은 CTLA-4 RNA에 효과적으로 작용할 수 있는 라이보자임을 제작하고자, 우선적으로 CTLA-4 RNA의 특정 서열에 특이적이고 효율적으로 인지할 수 있는 라이보자임 내부 가이드 서열 (Ribozyme Internal Guide Sequence, Ribozyme IGS) 서열을 찾기 위해 in vitro 맵핑(mapping)을 수행하였다.
구체적으로, 트랜스-스플라이싱(Trans-splicing) 반응을 위하여 IGS를 랜덤화 한 라이보자임 라이브러리(ribozyme library) RNA와 CTLA-4 RNA의 절대량을 100 nM : 10 nM로 하여 반응시켰다. 반응에 앞서 기질인 CTLA-4 RNA (2x reaction buffer, substrate RNA, 0.2 mM dGTP, DEPC-H2O)는 37 ℃에서 미리 5분간 전가열(preheating) 시켜주고 라이보자임 RNA (2X reaction buffer, Ribozyme RNA, DEPC-H2O)는 50 ℃에서 5분간 정치시킨 후 37 ℃에서 2분간 정치시킴으로써 올바른 3차 구조 형성을 유도하였다. 상기 두 반응물(CTLA-4 RNA 용액 및 라이보자임 RNA 용액)을 잘 섞어준 다음 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다.
상기 반응물 10 ㎕와 함께 라이보자임 라이브러리 RNA의 3' 부분에 붙는 primer(RY-RT)와 정제한 total RNA를 잘 섞은 후 65 ℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 10분간 두었다. 여기에 5X RT buffer, 10mM dNTP mix(Beams bio)와 1U MMLV Reverse transcriptase(abm)와 16U RNase inhibitor(Enzynomics), DEPC dH20로 총 50 ㎕를 만들어 42 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후 95 ℃에서 5분간 반응시켜 MMLV-RT의 활성을 완전히 불활성화시킨 후 4 ℃에 두었다. 그 다음 5' primer(CTLA-4 5' UTR XhoI)와 3' primer(RT-TS)와 함께 10X taq polymerase buffer, 10mM dNTP mix(beams bio), 1U taq polymerase(Solis BioDyne)를 넣고 D.W로 20 ul를 맞춰준 다음, [95 ℃ 5min → (95 ℃ 30sec → 58 ℃ 30sec → 72 ℃ 30sec) x40cycles → 72 ℃ 5min]의 조건으로 PCR하였다. 그 결과물을 2% TAE 아가로즈 젤에 로딩한 후 모든 band를 용리한 후 서열분석을 하기 위해 T-blunt vector(Solgent)에 클로닝한 후 서열분석을 진행하였다.
1-2. CTLA-4 RNA에 대한 in vivo 맵핑
in vivo에서는 293 세포에 CTLA-4 RNA(기질, 5'UTR~exon2 region) 5 ㎍과 라이보자임 라이브러리 RNA 4 ㎍을 함께 DMRIE-C Reagent(invitrogen)으로 공-형질전환(co-transfection)한 후 24시간 뒤에 total RNA를 정제하여 얻었다. 그 다음 라이보자임 라이브러리 RNA의 3' 부분에 붙는 primer(RY-RT)와 정제한 total RNA를 잘 섞은 후65 ℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 10분간 두었다. 여기에 5X RT buffer, 10 mM dNTP mix(Beams bio)와 1U MMLV Reverse transcriptase(abm)와 16 U RNase inhibitor(Enzynomics), DEPC dH20로 총 50 ㎕를 만들어 42 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후 95 ℃에서 5분간 반응시켜 MMLV-RT의 활성을 완전히 불활성화시킨 후 4 ℃에 두었다. 그 다음 5' primer(CTLA-4 5' UTR XhoI)와 3' primer(RT-TS)와 함께 10X taq polymerase buffer, 10mM dNTP mix(beams bio), 1U taq polymerase(Solis BioDyne)를 넣고 D.W로 20 ul를 맞춰준 다음, [95 ℃, 5 min → (95 ℃, 30 sec → 58 ℃, 30 sec → 72 ℃, 30 sec) x 40 cycles → 72 ℃, 5 min]의 조건으로 PCR하였다. 그 결과물을 2% TAE 아가로즈 젤에 로딩한 후 모든 band를 용리한 후 서열분석을 하기 위해 T-blunt vector(Solgent)에 클로닝한 후 서열분석을 진행하였다.
1-3. CTLA-4 RNA 상 라이보자임 타겟팅 부위 맵핑
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 in vitro 및 in vivo RNA 맵핑을 수행한 결과, RT-PCR을 통해 여러 부위를 인지하여 트랜스-스플라이싱이 된 트랜스-스플라이싱 결과물들을 확인할 수 있었고, 상기 결과물들을 서열분석한 결과 다양한 인지부위를 찾았다. 이렇게 확인된 라이보자임 주요 타겟팅 부위는 IGS32, IGS48, IGS111, 및 IGS232였다(도 1). 특히 in vitro와 in vivo 맵핑에서 공통적으로 인지부위로 확인된 부위는 IGS48이었다.
상기 확인된 인지 부위에 대한 라이보자임들(IGS32 : 서열번호 38, IGS48 : 서열번호 1, IGS111 : 서열번호 2, 및 IGS232 : 서열번호 3)을 각각 제작하여 in vitro 트랜스-스플라이싱을 진행한 결과 IGS32, IGS48, IGS111 및 IGS232에서 타겟팅이 잘 일어남을 확인하였다(도 2).
1-4. 특이성을 증가시킨 라이보자임 제작
라이보자임의 IGS에 P1과 P10을 포함한 5' primer(IGS48P1P10 StuI)와 3' primer(RY-RT) / 5' primer(IGS111P1P10 StuI)와 3' primer(RY-RT)/ 5' primer(IGS232P1P10 StuI)와 3' primer(RY-RT)를 이용하여 PCR 한 후 StuI과 ScaI으로 digestion한 SV40 프로모터 벡터와 함께 T4 ligase(doctor protein)로 16 ℃에서 4시간 반응시켜 라이게이션하였다.
이어서 라이보자임이 클로닝된 벡터를 ScaI과 XhoI으로 double digestion한 후 5' primer(5' F.luci ScaI P10 IGS48, 5' F.luci ScaI P10 IGS111, 5' F.luci ScaI P10 IGS232), 3' primer(3' F.luci end XhoI)으로 PCR하여 얻은 Firefly luciferase 유전자를 라이게이션 하였는데, 이때 IGS232을 인지하는 라이보자임의 경우 CTLA-4 뒤에 라이게이션되어 transgene의 단백질이 올바르게 발현되도록 reading frame을 맞춰 주었다.
이후 SV40 프로모터 벡터에 클로닝한 것을 pcDNA3.1(+) 벡터에 옮기기 위해 클로닝을 하였다. 우선 pcDNA3.1(+) vector를 HindIII와 XhoI으로 double digestion하여 준비하고, 라이보자임으로부터 F.luciferase 유전자를 각각의 5' primer (IGS48 P1P10 HindIII, IGS111 P1P10 HindIII, IGS232 P1P10 HindIII)와 3' primer(3' F.luci end XhoI)로 PCR한 후 함께 라이게이션하였다. 서열분석을 통해 CMV 프로모터를 가지는 pcDNA3.1(+) 벡터에 P1과 P10 구조를 가지는 라이보자임과 그 뒤에 리포터 유전자인 firefly luciferase가 클로닝된 것을 확인하였다.
한편, CTLA-4에 대한 라이보자임 활성의 특이성 및/또는 효율성을 증대시키고자 상기 제조한 라이보자임에 CTLA-4에 대한 antisense 서열을 추가로 포함하는 라이보자임을 추가로 제조하였다. IGS48를 가지는 라이보자임의 5' 쪽에 CTLA-4의 라이보자임 인지 부위 뒤쪽의 염기서열 100nt(서열번호 5) 또는 300nt(서열번호 6)를 antisense로 클로닝하고자 하였다. PcDNA3.1(+)-CTLA-4 플라스미드에서 antisense 100nt과 300nt을 각각 5' primer(IGS48 AS100 kit F), 3' primer(IGS48 AS kit R)/ 5' primer(IGS48 AS300 kit F), 3' primer(IGS48 AS kit R)를 이용하여 PCR하여 DNA를 용리하였다. pcDNA3.1(+)-ribozyme-F.luciferase 플라스미드를 HindIII로 digestion한 후, 벡터와 insert를 각각 100 ㎍씩 사용하여 5X infusion mix(Clontech)와 함께 섞은 후 65 ℃에서 15분간 반응시킨 다음 얼음에서 잠시 식혀준 후 DH5α E. coli에 형질전환하여 벡터에 클로닝된 것을 선별하고, 서열분석을 통해 확인하였다.
실시예 2. 인지부위가 다른 라이보자임 활성 비교
맵핑을 통해 찾아진 CTLA-4 특정 부위를 인지하는 각각의 라이보자임의 세포 내 기능과 효율성을 확인하기 위해 실험을 수행하였다.
HEK-293 세포를 35 mm dish에 3 X 105으로 시딩하고 24시간 후에 무혈청 배지(serum-free media) 500 ㎕에 DNA 1 ㎍을 넣은 튜브를 준비하고 다른 튜브에 무혈청 배지 500 ㎕와 DMRIE-C(Invitrogen) 3 ㎕를 첨가하였다. DNA가 세포에 잘 들어갈 수 있는 리포좀 형태로 복합체를 이룰 수 있도록 두 튜브를 잘 섞어준 다음 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. RNA의 경우에는 무혈청 배지 1000 ㎕와 DMRIE-C(Invitrogen) 3 ㎕를 섞은 후 형질전환 직전에 RNA 5 ㎍을 빠르게 섞었다. 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 다음 FBS 10%, Penicillin/Streptomycin 1%를 넣은 MEM media(Hyclone)로 교체해주었다.
150 mM NaCl 100 ㎕에 각각의 pcDNA3.1(+)-Ribozyme-F.luciferase(0.5 ㎍)와 target DNA(2.5 ㎍)를 첨가하고 형질전환 효율을 보정하기 위해 Renilla luciferase DNA 200 ng을 함께 넣었다. 다른 튜브에 150 mM NaCl 100 ㎕에 PEI(6 ㎍)를 섞은 후 5분간 상온에서 인큐베이션하고 라이보자임과 target DNA가 섞여 있는 각 튜브에 100 ㎕ 씩 분주하여 섞은 후 20분간 상온에서 인큐베이션한 다음, DNA와 PEI가 섞은 혼합물을 각각 200 ㎕씩 HEK-293에 천천히 넣었다. 24시간 뒤에 형질전환한 세포의 배지를 모두 제거하고 1X PBS로 씻어주고 1X passive lysis buffer 200 ㎕을 넣고 상온에서 15분간 lysis시켜 주었다. Cell lysate를 1.5 ml 튜브에 옮긴 후 원심분리(centrifugation)하여 cell debris 제외한 상층액을 새 튜브로 옮겨 total protein을 얻었다. 1.5 ml 튜브에 cell lysate를 20 ㎕씩 옮겨 담은 후 LARII(Luciferase assay reagent II, promega)를 100 ㎕씩 넣고 섞은 후 Luminometer(TD+20/20)로 값을 읽었다. 그 다음에 Stop&Glo reagent mix(Stop&Glo 20 ㎕ + buffer 1 ml, promega)를 100 ㎕ 씩 넣어 동일하게 섞은 후 역시 Luminometer로 값을 읽었다. 이때, 두 reagent를 섞는 시간과 횟수를 동일하게 해주고 sensitivity level은 각각의 세포 조건에 맞춰 20%에서 60% 사이로 설정하였다.
상기 설명한 바대로 라이보자임의 표적 특이적 효율을 확인하기 위해 3' exon으로 리포터 유전자인 firefly luciferase 유전자를 달아주고 위에서 확인한 CTLA-4 인지 부위 중 5' UTR이면서 loop 부위에 위치한 IGS48, ORF이면서 loop 부위인 IGS111 및 232로 각각에 대한 라이보자임을 제작하였으며(서열번호 13, 16 및 17), 이때 IGS 외에 특이성과 효율성을 높이기 위해 P1,P10 helix를 붙여주었다.
그 결과, 표적 RNA가 있을 때, 라이보자임이 트랜스-스플라이싱에 의해 효율이 증가하는 것을 확인하였으며, IGS48을 가지는 라이보자임(IGS48P1P10 F.luci)이 가장 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표적 유전자가 없는 경우에 IGS48P1P10 라이보자임에서 leaky expression이 잘 일어남을 확인할 수 있었다. 즉, 실험 목적에 따라 라이보자임 효율이 가장 높고, leaky expression도 잘 일어나는 IGS48P1P10 라이보자임을 본 실험의 대표적으로 선정하여 이후 실험을 진행하였다(도 3).
상기 실험에 추가로 라이보자임의 표적 특이적 효율을 확인하기 위해 3'exon으로 리포터 유전자인 firefly luciferase gene을 달아주고 antisense 없이 라이보자임만 있을 경우와 CTLA-4에 대한 antisense가 각각 100nt, 300nt 있을 경우(각각 AS100-IGS48P1P10-F.luci-서열번호 14, AS300-IGS48P1P10-F.luci-서열번호 15)에 라이보자임의 활성을 확인하였다. 이때, 음성 대조군으로서 CMV 프로모터만 가지고 있는 벡터(Vec)를 사용하고, 양성 대조군으로서 CMV 프로모터에 F.luciferase가 발현되는 벡터(CF)를 사용하였다.
그 결과 모두 표적 RNA가 존재할 경우 활성이 증가함을 확인할 수 있었고, in vitro에서는 antisense를 달아주지 않은 라이보자임이 가장 활성이 높았다. 또한 CTLA-4가 내재적 발현되는 Jurkat 세포주에서 확인하였을 때도 마찬가지로 모두 라이보자임의 활성을 확인할 수 있었으며, 그 중 antisense를 달아주지 않은 IGS48P1P10 라이보자임이 가장 활성이 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 4).
한편, 본 발명에서 AS100-IGS48P1P10-F.luci 및 AS300-IGS48P1P10-F.luci는 pcDNA3.1(+)(CMV 프로모터 포함 벡터)에 도입하여 활성을 확인하였다.
실시예 3 : 라이보자임 발현 레트로바이러스 벡터 제작 및 생산
3-1. 라이보자임 발현 레트로바이러스 벡터 제작
(주)바이로메드에서 받은 Tag72 항원 인지 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR, 서열번호 4)가 들어있는 레트로바이러스 벡터(pMT-CAR)에 라이보자임을 클로닝하였다. 특히 상기 실시예 2에서 확인한 바대로 라이보자임 효율이 가장 높고, leaky expression도 잘 일어나는 IGS48 라이보자임으로 레트로바이러스 벡터를 제작하여 라이보자임의 활성을 확인하였다.
구체적으로 PcDNA3.1(+)-IGS48 ribozyme-F.luciferase 플라스미드로부터 primer (IGS48 BamHI F, IGS48Rib BamHI R)를 이용하여 PCR한 후 DNA를 용리하여 insert를 얻었으며, IGS48 라이보자임의 3' exon으로 CAR를 발현시키기 위해 pMT-CAR 벡터를 BamHI으로 digestion하여 벡터를 준비하였다. 벡터와 insert를 16 ℃에서 라이게이션 반응시켰고, 클로닝된 것을 BamHI으로 선별하여 서열분석을 통해 #5, #11, #16의 3개 클론을 얻었다(pMT-Rib-CAR).
3-2. 레트로바이러스 생산
24시간 전에 293T를 60 mm cell culture dish에 1 X 106 세포씩 seeding하여 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 serum-free media 600 ㎕에 293T transfection reagent(Mirus)를 18 ㎕ 넣어 섞어주고 상온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음, 앞서 제작한 각각의 pMT-Rib-CAR 레트로바이러스 벡터와 함께 envelope DNA와 gag-pol DNA를 (2.4ug : 1.2ug : 2.4ug) 비율로 섞어서 튜브에 넣어주고 30분간 상온에서 반응시킨 후 세포에 천천히 뿌려주었다. 그로부터 4시간 뒤에 1X PBS로 2회 씻어낸 뒤, 알맞은 growth media를 넣어주고 48시간 뒤에 상층액을 걷어서 0.45um filter에 거른 후 -70 ℃에 분주하여 보관하였다. 이때, 레트로바이러스를 전달할 세포 특성에 따라 잘 감염할 수 있는 envelope DNA를 선택해야 하는데, 알려진 3가지의 envelope DNA 유형 중에서 1차 T 세포(primary T cell)에 전달효율이 제일 좋았던 RD114 envelope DNA를 이용하여 레트로바이러스를 생산하였다.
실시예 4 : 말초혈액 단핵세포 (Peripheral blood mononuclear cell) 분리 및 배양
4-1. 일차 말초혈액 단핵세포(PBMC) 분리
사람의 혈액을 채취한 후 원심분리를 이용하여 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하였다.
먼저 채취한 혈액에 1X PBS + 2% FBS 용액을 동량 섞었다. 그 다음, Ficoll-Paque PLUS(GE heathcare) 3 ㎖을 SepMate™-50(STEMCELL technologies)의 central hole을 통해 barrier 아래쪽에 넣고, 미리 섞어준 혈액 혼합물을 10 ㎖씩 Ficoll 위에 섞이지 않도록 천천히 올려준 후, 1200 x g 10분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 튜브는 gradient가 형성되므로 제일 위층의 플라즈마를 먼저 제거해준 다음, 뿌옇게 형성된 단핵세포(PBMC) 층을 파이펫을 이용해 새로운 튜브에 옮긴다. 이 때, 적혈구가 따라나올 수 있으니 너무 넓은 층을 무리해서 따지 않도록 주의한다. 새로운 튜브에 옮긴 PBMC를 1 X PBS + 2% FBS 용액 5 ㎖과 섞어서 300 x g 8분간 원심분리 한 후, pellet만 남기고 상층액은 모두 제거한 후 이 과정을 한번 더 반복한다. 마지막으로 얻어진 PBMC pellet을 primary T cell growth media에 재현탁하여 37 ℃ 5% CO2 인큐베이터에서 키운다.
4-2. 일차 T 세포 배양
상기 분리한 PBMC를 1 X 106 cells/ml로 준비하여 100 mm dish에 배양한 후 anti-CD3(eBioscience) 50 ng/ml을 첨가한다. 이때, T cell 생장배지(growth media)는 AIMV media(gibco)에 열불활성화(heat inactivation)시킨 인간 혈청을 5% 첨가한 배지를 사용하고, 새로운 배지로 갈아줄 때마다 human Interleukin-2(hIL-2)를 300 U/ml씩 섞어서 사용하였다. 그 후에 일차 T cell의 계대배양은 4일마다 한 번씩 T75 flask에서 배양하였으며, 항상 (0.7 X 105 ~ 2 X 106 cells/ml)의 농도를 유지해주었다.
실시예 5 : 일차 T 세포에 레트로바이러스 형질주입
일차 T 세포에 각각의 레트로바이러스를 4.8 X 1010 copies/1회로 하루에 1회씩, 총 2회 전달하였다. 구체적으로 레트로바이러스를 세포에 전달하기 전에 미리 사용할 배양접시의 바닥에 레트로넥틴(retronectin)을 20 ㎍/well씩 처리하여 상온에서 2시간 코팅해주었고, 2시간 후에 레트로넥틴을 제거한 다음 blocking reagent(PBS w/2.5% human albumin)을 2 ml/well씩 첨가하여 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 다음에 -70 ℃에 얼려두었던 레트로바이러스를 급속 해동하여 T cell 배양 배지와 함께 1 : 1로 섞어 레트로넥틴 코팅 배양접시(retronectin coated dish)에 넣은 후 2000g, 32 ℃, 2시간 동안 레트로바이러스(retrovirus)를 붙여주었다. 그동안에 일차 T 세포를 5 X 105 cells/ml로 세포 수를 세어 준비해두었고, 원심분리가 끝난 배양접시에 배지를 1 ml 정도만 남겨둔 후 준비한 세포를 4 ml/well로 넣어주고 1000g에서 15분간 원심분리 해주었다. 원심분리가 끝난 배양접시는 조심스럽게 가져와 37 ℃ 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양해주었다. 이와 같은 과정을 그 다음 날 1회 반복하였다.
실시예 6 : 레트로바이러스 형질주입 일차 T 세포에서 반정량 PCR(semi-quantitative PCR)을 통한 CTLA-4 발현량 측정
라이보자임을 발현하는 레트로바이러스를 전달한 일차 T 세포에서 얻은 RNA를 역전사(reverse transcription)시킨 후, 세포 내의 CTLA-4 수준을 확인하기 위해서 반정량 PCR(semi-quantitative PCR)을 수행하였다. 각각의 시료에 대해 실험을 triplet으로 진행하여 평균값을 구하였으며 melting point를 확인하고 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 확인하였다. 이때 SYBR Green을 이용하여 측정하였으며 반정량하게 시료들을 비교할 수 있도록 정량이 된 standard 대조군을 사용하였다. 보정을 위하여 CTLA-4 PCR한 것과 같은 RT 시료로 18S 반정량 PCR(semi-quantitative PCR)을 하여 나온 값으로 시료 간의 RT 효율 차이를 보정해주었다. 이때 primer는 5' primer(CTLA-4 real F), 3' primer(CTLA-4 real R)를 이용하였다.
상기 실시예 3에서 수득한 클론 중에서 clonal variation을 고려하여 가장 발현이 잘 되는 clone을 얻고자 각 clone을 비교하였다. 구체적으로 라이보자임이 발현되는 레트로바이러스를 각각 일차 T 세포에 전달한 후 T 세포 내의 CTLA-4 RNA 수준을 확인하였다. 이때, 대조군으로서 비아러스를 전달하지 않은 T 세포(mock-T)과 함께 CAR가 발현되는 레트로바이러스를 전달한 T 세포(CAR T)를 사용하였다. 그 결과, 라이보자임이 발현되는 레트로바이러스를 전달한 T cell(각각 Rib#5/11/16-CAR T) 내에서 CTLA-4 RNA의 감소를 확인할 수 있었으며, 3개의 clone 중 #11과 #16이 더 효율이 높은 것을 확인하였다(도 5).
실시예 7 : 웨스턴 블랏을 통한 측정
레트로바이러스를 전달한 일차 T 세포를 1X PBS로 washing한 뒤 1X RIPA buffer(sigma)와 0.1M PMSF(Fluka) mixture를 세포에 50 ㎕ 처리하여 스크랩퍼로 긁어낸 후 1.5 ml 튜브에 모두 옮겼다. Cell debris는 원심분리를 통해 제거하고 상층액만 새 튜브에 따로 담아 total whole extract를 얻었다. 얻은 total protein을 Bradford assay(sigma)를 이용해 단백질을 정량했으며 이때 BSA를 정량 standard로 사용해주었다.
정량한 단백질 20 ㎍과 4X sample buffer(Invitrogen)을 3:1로 섞은 후 95 ℃에서 5분동안 단백질 변성(protein denaturation)시킨 후에 얼음에서 인큐베이션한 상태로 준비하였다. SDS-PAGE 겔(NuPAGE 4-12% Bis-Tris minigel, Invitrogen)을 준비하여 running buffer(1X NuPAGE MES SDS Running buffer, Invitrogen)에 담가준 후에 겔의 각 레인에 단백질 시료를 천천히 로딩해주었다. 그 다음 200V로 35분간 running시키고, running이 완료된 겔은 PVDF membrane에 12V, 60분간 이동시켰다.
이동이 완료되면 membrane을 조심스럽게 떼어내어 TBS로 1회 씻어준 다음 1X TBST(1X TBS + 0.5% tween20)에 5% skim milk를 넣어 blocking solution을 만든 후 30분간 상온에서 shaking하면서 처리하였다. 그 다음 blocking solution을 모두 제거하고, 새로운 blocking solution에 1차 항체로 mouse anti-human CD247(BD)를 1:500으로 희석하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 shaking하면서 처리하였다. 1차 항체 처리가 끝나면 용액을 모두 제거한 후, 새로운 blocking solution에 2차 항체로 goat anti-mouse IgG HRP(Thermo)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리해주었다. 항체 처리가 모두 끝나면 1X TBST로 membrane을 15분씩 3회 washing한 뒤 luminol이 포함된 detection reagent(Santacruz)을 A:B=1:1 비율로 섞어 membrane에 전체적으로 뿌려준 후 1분간 암조건에서 반응시키고, Gel-doc(ImageQuant LAS4000, GE healthcare)에서 band를 확인하였다.
상기 실시예 3에서 수득한 클론 중에서 clonal variation을 고려하여 가장 발현이 잘 되는 clone을 얻고자 각 clone을 비교하였다. 구체적으로 웨스턴 블랏팅과 FACS로 CAR의 발현을 확인하여 비교하였다. 그 결과, 라이보자임이 발현되는 T 세포(각각 Rib#5/11/16-CAR T) 내에서 CAR의 발현을 확인할 수 있었다. 먼저, FACS 데이터는 라이보자임을 발현하는 레트로바이러스를 전달한 T 세포에서 모두 CAR의 발현을 확인할 수 있었으며, #16 클론에서 가장 높은 발현을 보였다(도 6).
또한, 웨스턴 블랏팅를 통해 확인한 결과 Rib#5/16-CAR T에서 CAR의 발현이 되는 것이 확인되었다. 다만, Rib#5/16-CAR에서는 CTLA-4 타겟팅 라이보자임을 이용하지 않은 CAR T에 비해 CAR를 발현량이 적은 것을 확인하였다. 한편, Rib#11-CAR T의 CAR의 발현량은 떨어지는 것으로 확인하였다(도 7).
상기 결과를 정리하면, CTLA-4 타겟팅 라이보자임을 발현하는 레트로바이러스가 전달된 T cell에서 표적 RNA의 감소와 CAR의 발현을 확인할 수 있었으며, 클론 16이 가장 효율이 높았다.
실시예 8 : Tag72를 발현하는 암세포에 대한 세포사 유도 효과 확인
상기 레트로바이러스 벡터에 라이보자임을 클로닝한 후 일차 T cell에 전달하고, Tag72 항원을 발현하는 세포주인 LS174T에 대해서 세포사멸능을 나타내는지 확인하였다. 세포사멸 실험은 레트로바이러스 벡터에 라이보자임-CAR을 클로닝한 것을 바이러스 (Ret-CTLA-4 Rib48-CAR, Rib#16-CAR T) 로 제작하여 일차 T cell에 전달하여 진행하였다.
구체적으로 LS174T 세포주를 target 세포로서 1 X 104 cells/50 ㎕로 준비한 뒤 CellTox green dye(Promega)를 준비한 50 ㎕ cell당 0.2 ㎕씩 첨가하여 섞어준 뒤 black 96-well plate에 50 ㎕/well으로 분주한다. 그 다음 레트로바이러스가 전달된 T cell(Effector cell)을 비율(target cell:effector cell +1:5, 1:10, 1:20, 1:30)에 따라 배양배지에 재현탁하여 준비 후 50 ㎕/well로 target cell과 섞어준다. 세포사멸 실험 (Cytotoxicity assay)의 background 대조군로 LS174T 또는 Effector cell만 넣고, 동량의 서로 다른 생장배지(growth media)를 넣어주어 배지에 의한 영향을 배제하였다. 이때 effector cell만 들어있는 well에는 CellTox green dye(Promaga)가 포함되어 있지 않으므로 dye를 위와 같은 비율로 섞은 target growth media를 넣어주었다. 또한 toxicity control(positive control)로 LS174T만 있는 well에 effector cell growth media를 동량 섞은 후 lysis solution을 4 ㎕ 첨가해주었으며, 음성대조군로 두 세포 배양배지만 섞은 well에도 dye를 같은 양 넣어주었다. 위와 같이 plate를 채워준 다음 빛을 차단한 환경을 만들어주고 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 24시간동안 반응시킨 후 Fluorescence reader(Ex 485nm/Em 520nm)로 값을 측정하였다.
실시예 9 : Jurkat 세포주 활성(stimulation)과 레트로바이러스 전달
Jurkat 세포주를 1x106 cells/well/2ml(RPMI1640)에 분주한 후, 24시간 후 레트로바이러스를 3 x 109 카피/well씩 total 3ml이 되도록 RPMI1640 배지와 함께 섞어서 각 well에 배지 교체를 해줬다. 이 때, polybrene(8ug/ml)을 1 ul/ml로 함께 넣어줬다. 그 다음 32℃ 2800 rpm 90분 동안 cell down시켜 레트로바이러스를 전달한 후, CO2 인큐베이터에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 뒤 배지 교체 시에 PMA(50ng/ml)+PHA(1ug/ml)을 섞은 RPMI1640 2ml을 넣어줬다. CO2 인큐베이터에서 72 시간 동안 인큐베이션한 후 세포를 걷어 RNA를 얻었다.
사용 프라이머
프라이머 서열 (5'-> 3')
RY-RT
(서열번호 18)		 ATGTGCTGCAAGGCGATT
RY-TS
(서열번호 19)		 TGTAAAACGACGGCCAGTG
CTLA4 5' UTR XhoI
(서열번호 20)		 CCGCTCGAGCTTCTGTGTGTGCACATG
IGS48P1P10 StuI
(서열번호 21)		 GAAGGCCTATCCTATGGATAGAAAAGTTATCAGGCAT
IGS111P1P10 StuI
(서열번호 22)		 GAAGGCCTATCCTTTGCCTTTAAAAGTTATCAGGCAT
IGS232P1P10 StuI
(서열번호 23)		 GAAGGCCTATCCTTTGACAGGAAAAGTTATCAGGCAT
5' F.luci ScaI P10 IGS48
(서열번호 24)		 AAAAGTACTCGTTAGGATGCCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATA
5' F.luci ScaI P10 IGS111
(서열번호 25)		 AAAAGTACTCGTAAGGATGCCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATA
5' F.luci ScaI P10 IGS232
(서열번호 26)		 AAAAGTACTGTAAGGATGCCCACCACGAAGACGCCAAAAACATA
IGS48 P1P10 HindIII
(서열번호 27)		 CCCAAGCTTATCCTATGGATAGAAAAGTTATCAGGCAT
IGS111 P1P10 HindIII
(서열번호 28)		 CCCAAGCTTATCCTTTGCCTTTAAAAGTTATCAGGCAT
IGS232 P1P10 HindIII
(서열번호 29)		 CCCAAGCTTATCCTTTGACAGGAAAAGTTATCAGGCAT
3' F.luci end XhoI
(서열번호 30)		 CCGCTCGAGTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTT
IGS48 AS100 kit F
(서열번호 31)		 CGTTTAAACTTAAGCTTAGCCATGGCTTTATGGGA
IGS48 AS300 kit F
(서열번호 32)		 CGTTTAAACTTAAGCTTACCTCAGTGGCTTTGCCT
IGS48 AS kit R
(서열번호 33)		 ATGGATCCGCGAAGCTTTGATTCTGTGTGGGTTCA
IGS48 BamHI F
(서열번호 34)		 CGCGGATCCATCCTATGGATAGAAAAG
IGS48Rib BamHI R
(서열번호 35)		 CGCGGATCCATCCTAACGAGTACTCCA
CTLA4 real F
(서열번호 36)		 CTACCTGGGCATAGGCAACG
CTLA4 real R
(서열번호 37)		 CCCCGAACTAACTGCTGCAA
실험의 양성 대조군으로서 라이보자임 없이 CAR를 발현하는 레트로바이러스(Ret-CAR)를 전달한 T cell (CAR T)과 함께 실험을 진행한 결과, mock T cell에 비해 약 5배의 세포 독성을 보였으며, 양성 대조군의 70% 정도의 효과를 보였다(도 8).
실시예 9 : 프로모터 추가 라이보자임 제작
한편, 상기 실시예 1-4에서 본 발명자들은 antisense 서열을 도입한 라이보자임을 제작하고 이의 트랜스-스플라이싱 효과를 확인한 결과 효율이 증진하지는 않았던 것을 확인하였다(도 4). 이에, 기본적인 CTLA4 Rib48-CAR 라이보자임(서열번호 8)에 라이보자임의 효과를 증진시키기 위하여 antisense 100 nt을 달아준 라이보자임 construct(서열번호 9 및 서열번호 11)와 강력한 프로모터인 CMV 프로모터를 달아준 라이보자임 construct(서열번호 10 및 서열번호 11)를 레트로바이러스 벡터에 클로닝한 것으로 일차 T cell에 전달하여 세포사멸 효과를 각각 비교, 확인하였다.
실시예 10 : 라이보자임의 특이성과 표적 효율을 높여 주기 위해 CMV 프로모터 및 안티센스를 붙여준 consturct의 개발 및 CAR 발현과 CTLA -4의 발현 감소 확인
상기 실시예를 통해서 가장 활성이 높게 나타난 것으로 확인된 IGS48 라이보자임으로 레트로바이러스 벡터를 제작한 후 그 중 가장 효율이 좋은 Rib#16(이하 Rib)으로 다음 실험을 진행하였다.
라이보자임의 CTLA-4 표적 특이성과 효율을 높여주기 위하여 레트로바이러스 프로모터 앞에 CMV 프로모터를 붙여주거나 또는 CTLA-4에 대한 안티센스 100nt를 붙여준 다음 그 효율을 비교하고자 실험을 진행하였다. 구체적으로, [CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-CTLA-5 Rib48-CAR(Rib-CAR T) construct, [antisense 100nt-CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-AS-CTLA-5 Rib48-CAR(AS-Rib-CAR T) construct, [CMV 프로모터-CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-CMV-CTLA-5 Rib48-CAR(CMV-Rib-CAR T) construct, 및 [CMV 프로모터-antisense 100nt-CTLA-4 Rib48-CAR]의 구조를 가지는 Ret-CMV-AS-CTLA-5 Rib48-CAR(CMV-AS-Rib-CAR T) construct를 제작하였으며, 이때, 레트로바이러스 벡터에 CMV 프로모터만 넣은 construct를 제작하여 CMV 프로모터를 붙여준 양성 대조군으로 사용하였다(도 9).
각각의 T cell에서 CAR의 발현을 확인하기 위해, PBMC에 각 레트로바이러스 벡터를 형질감염(transduction) 후 FACS를 수행하여 세포 밖 CAR의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이 라이보자임만 있는 Rib-CAR T에서 CAR의 발현율이 높게 나타났으며, 다른 construct를 형질감염한 T 세포에서는 CAR가 낮게 발현됨을 확인하였다. 또한 CMV 프로모터만을 넣어준 CMV-CAR T에서도 CAR의 발현이 낮음을 확인하였다.
또한 위 실험에서 사용한 레트로바이러스가 전달된 T cell 내의 CTLA-4 RNA level을 확인하였다. 라이보자임이 전달된 T cell 중 가장 CAR의 발현이 높게 나타난 Rib-CAR T와 그 다음으로 높게 나타난 CMV-AS-Rib-CAR T에서 CTLA-4 RNA 양을 확인하였으며 이때, 대조군으로서 바이러스를 전달하지 않은 T cell(mock T)과 함께 CAR가 발현되는 레트로바이러스를 전달한 T cell(CAR T)을 사용하였다.
그 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이 mock T와 비교하여 레트로바이러스가 전달된 대조군인 CAR T에서 CTLA-4 RNA 수준이 약 2배 높게 나타났다. 이를 통해 레트로바이러스를 전달한 경우 CTLA-4의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 라이보자임이 발현되는 레트로바이러스를 전달한 다른 T cell에서도 CTLA-4의 발현이 증가했을 것으로 생각되었다.
그 결과, Rib-CAR T와 CMV-AS-Rib-CAR T의 CTLA-4 RNA level이 mock T와 비슷하게 나타났으며, 레트로바이러스에 의해 높아진 CTLA-4의 양이 라이보자임에 의해서 감소되어 mock T와 비슷한 수준으로 나타난 것으로 해석될 여지가 있다.
실시예 11 : 레트로바이러스 전달에 따른 세포 내 CTLA -4 RNA 수준의 영향
상기와 같이 레트로바이러스에 감염된 세포 내에서 CTLA-4의 발현이 증가함을 확인해보기 위해서 Jurkat 세포주(인간 T lymphocyte; acute T cell leukemia)에서 실험을 진행하였다. 이때, 사용한 레트로바이러스로 양성 대조군으로 CAR만 발현되는 Ret-CAR을 사용하였고, Jurkat 세포를 활성화시켜 CTLA-4의 발현을 높여준다고 알려진 PMA/PHA chemical을 사용하여 CTLA-4 RNA 수준을 비교하였다.
그 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이 이전 실험과 동일하게 세포에 레트로바이러스 만을 전달하였을 때(II-2) CTLA-4 RNA 레벨이 약 2배 높아지는 것을 확인하였고, chemical만 처리한 경우 약 3배 높아졌으며, 레트로바이러스와 chemical을 동시 처리한 대조군의 경우 CTLA-4의 수준이 약 9배 가량 높아지는 것을 확인하였다.
즉, 상기 결과는 chemical을 통해 Jurkat 세포의 CTLA-4 수준을 높인 것과 같이, 레트로바이러스만을 전달하였을 때에도 CTLA-4의 발현량이 증가함을 보여주며 결과적으로 상기 실시예 10에서 레트로바이러스를 전달한 후 mock T 세포에 비해 높아진 CTLA-4 RNA 수준이 라이보자임에 의해 감소함을 확인하였다.
실시예 12 : 표적 암 세포에 대한 세포독성 어세이 ( cytotoxicity assay)
레트로바이러스 벡터에 라이보자임을 클로닝한 후 1차 T 세포에 전달하고 Tag72 항원을 발현하는 세포주인 LS174T에 대해서 세포독성 효과를 나타내는지 확인하였다.
상기 실시예에서 CTLA-4 RNA 수준을 감소시키고 CAR 발현이 가장 높게 나타난 Rib-CAR과 CMV-AS-Rib-CAR의 표적살상능을 확인하였다.
그 결과, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, Rib-CAR T에서 양성 대조군인 CAR T의 50 % 정도의 살상능 효과를 나타냈으며, CMV-AS-Rib-CAR보다 Rib-CAR에서 살상능이 더 좋은 것으로 확인되었다. 따라서, 이전 실험 결과와 일치하게 결과적으로 Rib-CAR이 CTLA-4 RNA를 가장 효과적으로 표적하며, CAR 발현효율이 우수한 것을 확인하였으며, 이를 통해 암세포 표적 살상능도 가증 우수한 construct임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> CTLA4 targeting transsplicing ribozyme for delivering chimeric antigen receptor and use thereof <130> KPA150050-KR-P1 <150> KR10-2015-0016152 <151> 2015-02-02 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4(IGS48) targeting ribozyme <400> 1 atcctatgga tagaaaagtt atcaggcatg cacctggtag ctagtcttta aaccaataga 60 ttgcatcggt ttaaaaggca agaccgtcaa attgcgggaa aggggtcaac agccgttcag 120 taccaagtct caggggaaac tttgagatgg ccttgcaaag ggtatggtaa taagctgacg 180 gacatggtcc taaccacgca gccaagtcct aagtcaacag atcttctgtt gatatggatg 240 cagttcacag actaaatgtc ggtcggggaa gatgtattct tctcataaga tatagtcgga 300 cctctcctta atgggagcta gcggatgaag tgatgcaaca ctggagccgc tgggaactaa 360 tttgtatgcg aaagtatatt gattagtttt ggagtactcg ttaggat 407 <210> 2 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4(IGS111) targeting ribozyme <400> 2 tttgccttta aaagttatca ggcatgcacc tggtagctag 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actgtaagga t 411 <210> 4 <211> 2364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag72-CAR <400> 4 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccagcttg tgcagtctgg ggctgaagtg aagaagcctg gggcttcagt gaaggtgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactgac catgcaattc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggacaacgcc ttgagtggat gggatatttt tctcctggca acgatgattt taaatactcc 240 cagaagttcc agggacgcgt gacaatcact gcggacaaat ccgcgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gcggtctatt actgtgcaag atcgtggatc 360 atgcagtact ggggccaagg gactctggtc actgtctctt caggtggagg cggttcaggc 420 ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac attgtgatga cccagtctcc agactccctg 480 gctgtgtctc tgggcgagag ggccaccatc aactgcaagt ccagccagag tgttttatac 540 agcagcaaca ataagaacta cttagcttgg taccagcaga aaccaggaca gcctcctaag 600 ctgctcattt actgggcatc tacccgggaa tccggggtcc ctgaccgatt cagtggcagc 660 gggtctggga cagatttcac tctcaccatc agcagcctgc aggctgaaga tgtggcagtt 720 tattactgtc agcaatatta ttcctatccg ttgacgttcg gccaagggac 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1620 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaattttgg 1680 gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1740 attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1800 actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1860 ttcgcagcct atcgctccgc cctgtacctg ctccggaggg accagaggct gccccccgat 1920 gcccacaagc cccctggggg aggcagtttc cggaccccca tccaagagga gcaggccgac 1980 gcccactcca ccctggccaa gatcagagtg aaattcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 2040 taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 2100 gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg 2160 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 2220 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 2280 ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2340 cgccatcatc accatcacca ttaa 2364 <210> 5 <211> 101 <212> DNA <213> CTLA4 specific antisense 100 <400> 5 agccatggct ttatgggagc ggtgttcagg tcttcaggaa gtagagcaaa acctttcagg 60 atcctgaagc tttgaaatgt gtttgaaccc acacagaatc a 101 <210> 6 <211> 301 <212> DNA <213> CTLA4 specific antisense 300 <400> 6 acctcagtgg ctttgcctgg agatgcatac tcacacacaa agctggcgat gcctcggctg 60 ctggccagta ccacagcagg ctgggccacg tgcattgctt tgcagaagac agggatgaag 120 agaagaaaaa acaggagagt gcagggccag gtcctggtag ccaggttcag ctgagccttg 180 tgccgctgaa atccaaggca agccatggct ttatgggagc ggtgttcagg tcttcaggaa 240 gtagagcaaa acctttcagg atcctgaagc tttgaaatgt gtttgaaccc acacagaatc 300 a 301 <210> 7 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promoter <400> 7 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 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cggttttaat gaatacgatt 960 ttgtaccaga gtcctttgat cgtgacaaaa caattgcact gataatgaat tcctctggat 1020 ctactgggtt acctaagggt gtggcccttc cgcatagaac tgcctgcgtc agattctcgc 1080 atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg 1140 ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc 1200 gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgttttt acgatccctt caggattaca 1260 aaattcaaag tgcgttgcta gtaccaaccc tattttcatt cttcgccaaa agcactctga 1320 ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tgggggcgca cctctttcga 1380 aagaagtcgg ggaagcggtt gcaaaacgct tccatcttcc agggatacga caaggatatg 1440 ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg 1500 cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa 1560 cgctgggcgt taatcagaga ggcgaattat gtgtcagagg acctatgatt atgtccggtt 1620 atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg ctacattctg 1680 gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat agttgaccgc ttgaagtctt 1740 taattaaata caaaggatat caggtggccc ccgctgaatt ggaatcgata ttgttacaac 1800 accccaacat cttcgacgcg ggcgtggcag gtcttcccga cgatgacgcc ggtgaacttc 1860 ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag atcgtggatt 1920 acgtggccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg tttgtggacg 1980 aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag atcctcataa 2040 aggccaagaa gggcggaaag tccaaattgt aataa 2075 <210> 14 <211> 3845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS100-IGS48P1P10-F.luci sequence <400> 14 agccatggct ttatgggagc ggtgttcagg tcttcaggaa gtagagcaaa acctttcagg 60 atcctgaagc tttgaaatgt gtttgaaccc acacagaatc aaagcttatc ctatggatag 120 aaaagttatc aggcatgcac ctggtagcta gtctttaaac caatagattg catcggttta 180 aaaggcaaga ccgtcaaatt gcgggaaagg ggtcaacagc cgttcagtac caagtctcag 240 gggaaacttt gagatggcct tgcaaagggt atggtaataa gctgacggac atggtcctaa 300 ccacgcagcc aagtcctaag tcaacagatc ttctgttgat atggatgcag ttcacagact 360 aaatgtcggt cggggaagat gtattcttct cataagatat agtcggacct ctccttaatg 420 ggagctagcg gatgaagtga tgcaacactg gagccgctgg gaactaattt gtatgcgaaa 480 gtatattgat tagttttgga gtactcgtta ggatgcccac catggaagac gccaaaaaca 540 taaagaaagg cccggcgcca ttctatcctc tagaggatgg aaccgctgga gagcaactgc 600 ataaggctat gaagagatac gccctggttc ctggaacaat tucrasgctt ttacagatgc 660 acatatcgag gtgaacatca cgtacgcgga atacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga 720 agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc 780 tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc 840 gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg aacatttcgc agcctaccgt 900 agtgtttgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa aattaccaat 960 aatccagaaa attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta 1020 cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg taccagagtc 1080 ctttgatcgt gacaaaacaa ttgcactgat aatgaattcc tctggatcta ctgggttacc 1140 taagggtgtg gcccttccgc atagaactgc ctgcgtcaga ttctcgcatg ccagagatcc 1200 tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca 1260 cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag 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gaacgtgcaa aaaaaattac 840 caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga tttcagtcga 900 tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat tttgtaccag 960 agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga tctactgggt 1020 tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg catgccagag 1080 atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt gttccattcc 1140 atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt cgagtcgtct 1200 taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac aaaattcaaa 1260 gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg attgacaaat 1320 acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg aaagaagtcg 1380 gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat gggctcactg 1440 agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc gcggtcggta 1500 aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa acgctgggcg 1560 ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt tatgtaaaca 1620 atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct ggagacatag 1680 cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct ttaattaaat 1740 acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa caccccaaca 1800 tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt cccgccgccg 1860 ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat tacgtggcca 1920 gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac gaagtaccga 1980 aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata aaggccaaga 2040 agggcggaaa gtccaaattg taataa 2066 <210> 17 <211> 2076 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS232P1P10-F.luci sequence <400> 17 agcttatcct ttgacaggaa aagttatcag gcatgcacct ggtagctagt ctttaaacca 60 atagattgca tcggtttaaa aggcaagacc gtcaaattgc gggaaagggg tcaacagccg 120 ttcagtacca agtctcaggg gaaactttga gatggccttg caaagggtat ggtaataagc 180 tgacggacat ggtcctaacc acgcagccaa gtcctaagtc aacagatctt ctgttgatat 240 ggatgcagtt cacagactaa atgtcggtcg gggaagatgt attcttctca taagatatag 300 tcggacctct ccttaatggg agctagcgga tgaagtgatg caacactgga 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aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taataa 2076 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RY-RT primer <400> 18 atgtgctgca aggcgatt 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RY-TS primer <400> 19 tgtaaaacga cggccagtg 19 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 5' UTR XhoI primer <400> 20 ccgctcgagc ttctgtgtgt gcacatg 27 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48P1P10 StuI primer <400> 21 gaaggcctat cctatggata gaaaagttat caggcat 37 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS111P1P10 StuI primer <400> 22 gaaggcctat cctttgcctt taaaagttat caggcat 37 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS232P1P10 StuI primer <400> 23 gaaggcctat cctttgacag gaaaagttat caggcat 37 <210> 24 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' F.luci ScaI P10 IGS48 primer <400> 24 aaaagtactc gttaggatgc ccaccatgga agacgccaaa aacata 46 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' F.luci ScaI P10 IGS111 primer <400> 25 aaaagtactc gtaaggatgc ccaccatgga agacgccaaa aacata 46 <210> 26 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' F.luci ScaI P10 IGS232 primer <400> 26 aaaagtactg taaggatgcc caccacgaag acgccaaaaa cata 44 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48 P1P10 HindIII primer <400> 27 cccaagctta tcctatggat agaaaagtta tcaggcat 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS111 P1P10 HindIII primer <400> 28 cccaagctta tcctttgcct ttaaaagtta tcaggcat 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS232 P1P10 HindIII primer <400> 29 cccaagctta tcctttgaca ggaaaagtta tcaggcat 38 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' F.luci end XhoI primer <400> 30 ccgctcgagt tacaatttgg actttccgcc ctt 33 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48 AS100 kit F primer <400> 31 cgtttaaact taagcttagc catggcttta tggga 35 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48 AS300 kit F primer <400> 32 cgtttaaact taagcttacc tcagtggctt tgcct 35 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48 AS kit R primer <400> 33 atggatccgc gaagctttga ttctgtgtgg gttca 35 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48 BamHI F primer <400> 34 cgcggatcca tcctatggat agaaaag 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS48Rib BamHI R primer <400> 35 cgcggatcca tcctaacgag tactcca 27 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 real F primer <400> 36 ctacctgggc ataggcaacg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 real R primer <400> 37 ccccgaacta actgctgcaa 20 <210> 38 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 (IGS32) targeting ribozyme <400> 38 ggatataaaa gttatcaggc atgcacctgg tagctagtct ttaaaccaat agattgcatc 60 ggtttaaaag gcaagaccgt caaattgcgg gaaaggggtc aacagccgtt cagtaccaag 120 tctcagggga aactttgaga tggccttgca aagggtatgg taataagctg acggacatgg 180 tcctaaccac gcagccaagt cctaagtcaa cagatcttct gttgatatgg atgcagttca 240 cagactaaat gtcggtcggg gaagatgtat tcttctcata agatatagtc ggacctctcc 300 ttaatgggag ctagcggatg aagtgatgca acactggagc cgctgggaac taatttgtat 360 gcgaaagtat attgattagt tttggagtac tcgtaaggta gccaa 405

Claims (16)

  1. (i) CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4)를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임;
    (ii) 상기 라이보자임의 3' 엑손에 연결된 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 항원 수용체 전달용 CTLA-4 타겟팅 트랜스-스플라이싱 라이보자임 발현 카세트를 포함하고,
    상기 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 CTLA-4의 RNA 상에서 내부 가이드 서열(Internal Guide Sequence, IGS)인 서열번호 38의 IGS32, 서열번호 1의 IGS48, 서열번호 2의 IGS111, 및 서열번호 3의 IGS232로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CTLA-4를 표적으로 하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임은 서열번호 1의IGS48을 표적으로 하는 것인, 재조합 벡터.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 항원 수용체는 암세포 특이적 항원을 인식하는 것인, 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 암세포 특이적 항원은 EGP2(Epithelial glycoprotein 2), EGP40(Epithelial glycoprotein 40), TAG72(Tumor associated glycoprotein 72), IL13Rα2(Interleukin 13 receptor alpha-2 subunit), CA IX(Carbonic anhydrase IX), CD19, CD52, CD33, CD20, TSLPR, CD22, CD30, GD3, CD171, ALK(Anaplastic lymphoma kinas), CD47, EGFRvIII, NCAM(Neural cell adhesion molecule), FBP(Folate binding protein), Le(Y)(Lewis-Y antigen), MUC1(Mucin 1), PSCA(Prostate stem cell antigen), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), FGFR4(Fibroblast growth factor receptor 4), FAR(Fetal acetylcholine receptor), CEA(Carcinoembryonic antigen), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), Mesothelin, CD44v6(Hyaluronate receptor variant 6), B7-H3, Glypican-3,5, ROR1, Survivin, FOLR1(folate receptor), WT1(Wilm's tumor antigen), CD70 및 VEGFR2(Vascular endothelial growth factor 2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 재조합 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터에 포함된 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어지는 것인, 재조합 벡터.
  7. 제1항에 있어서,
    (iii) 상기 라이보자임의 5' 말단에 CTLA-4의 라이보자임 인지 부위 뒤쪽의 염기서열 50 내지 400 뉴클레오티드에 대한 antisense 서열의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 antisense 서열은 서열번호 5 또는 6의 핵산 서열로 이루어지는 것인, 재조합 벡터.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 발현카세트는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 재조합 벡터.
  10. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된, 형질전환 세포.
  11. 삭제
  12. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터에서 발현된 라이보자임을 발현하는, 레트로바이러스.
  13. 제12항에 따른 레트로바이러스로 처리한 T 세포.
  14. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 폐암, 췌장암, 간암, 흑색종, 골암, 유방암, 대장암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 림프종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를, 암치료를 필요로 하는, 인간을 제외한 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230077650A (ko) 2021-11-22 2023-06-01 재단법인 아산사회복지재단 자연살해세포-특이적 키메릭항원수용체 및 이의 용도

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021172925A1 (ko) * 2020-02-28 2021-09-02 알지노믹스 주식회사 Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
KR102396200B1 (ko) * 2020-07-24 2022-05-12 알지노믹스 주식회사 로돕신 전사체에 특이적인 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140134142A1 (en) * 2012-05-25 2014-05-15 Cellectis Multi-Chain Chimeric Antigen Receptor and Uses Thereof
WO2014100385A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Anthrogenesis Corporation Chimeric antigen receptors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101034811B1 (ko) * 2008-08-25 2011-05-16 단국대학교 산학협력단 조직 특이적 프로모터와 암 특이 유전자를 타겟팅하는트랜스-스플라이싱 라이보자임을 포함하는 재조합아데노바이러스 및 이의 용도
PL3006459T3 (pl) * 2008-08-26 2022-01-17 City Of Hope Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu
KR101478869B1 (ko) * 2011-05-26 2015-01-06 단국대학교 산학협력단 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제
KR101293620B1 (ko) * 2011-08-19 2013-08-13 국립암센터 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 암치료 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140134142A1 (en) * 2012-05-25 2014-05-15 Cellectis Multi-Chain Chimeric Antigen Receptor and Uses Thereof
WO2014100385A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Anthrogenesis Corporation Chimeric antigen receptors

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230077650A (ko) 2021-11-22 2023-06-01 재단법인 아산사회복지재단 자연살해세포-특이적 키메릭항원수용체 및 이의 용도

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