CN107325184A - 一种靶向egfr和her2的双特异性抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其应用。其抗原结合区是由人源化西妥昔单抗和赫赛汀单抗组成。本发明利用生物工程技术构建出可以同时靶向结合EGFR和HER2抗原的双特异性抗体。文中提供了该抗体的两条重链和两条轻链的DNA序列及其表达宿主细胞。本发明还保护了该双特异性抗体在制备用于非小细胞肺癌药物中的应用。对于非小细胞肺癌的治疗具有重要的应用价值。

Description

一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明主要涉及一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其应用。

背景技术

癌症严重危害人类身体健康，尤其是恶性肿瘤患者病情发展迅速，易发生转移，且死亡率高。目前在各种疾病所致死亡统计中高居第二位。近年来随着环境污染加剧等因素造成肿瘤的发病率显著上升。而临床采用的常规疗法如放疗、化疗和手术治疗在一定程度上缓解了病情，提高了生存时间，但也存在很多的弊端，如副作用大、易复发等。治疗效果难以进一步得到提高。

在各种癌症中，肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤。其中80％-85％属于非小细胞肺癌(NSCLC)。肺癌在男性患者中死亡率和发病率占第一位，而在女性中也占第二位。对肺癌的发病机制和治疗手段的研究和开发一直在进行。研究发现EGFR是一类在肺癌等癌症中高表达的细胞表面抗原，其属于HER家族(包括EGFR/HER1、HER2、HER3和HER4)，该家族成员通过配体(如EGF)激活后形成同源或异源二聚体后激活下游PI3K-Akt信号通路来介导细胞的增殖、生长和分化等，是非小细胞肺癌依赖的重要受体和通路。通过靶向抑制EGFR可以达到良好的临床效果。靶向抑制EGFR的药物主要有两大类：EGFR-TKI和单克隆抗体。目前EGFR-TKI小分子药物(如吉非替尼)可以很好地靶向治疗肺癌；德国Merck公司研制的人/鼠嵌合单克隆抗体——西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)也主要应用于EGFR高表达的癌症治疗当中。然而肺癌具有高度的突变潜力，往往通过发生二次突变(如T790M、L858R)等对EGFR-TKI和抗体产生耐受。因此，进一步了解耐受机制，挖掘新的作用靶点成为研究热点。

大量研究表明EGFR和同家族成员HER2之间的异源二聚体对下游信号通路的作用在HER家族中是最强的，而且HER2的扩增和激活成为肺癌细胞产生耐受的重要机制。20％的非小细胞肺癌患者中被检测出HER2的过表达，同时EGFR和HER2的共表达达到10％-50％。在20％-30％的乳腺癌患者中也存在HER2过表达。1998年美国Genentech公司研制的针对HER2受体的人源化单抗——曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)获得了美国FDA批准用于HER2高表达转移性乳腺癌治疗。因此，同时靶向EGFR和HER2成为重要的治疗策略。同时靶向EGFR和HER2的拉帕替尼(Lapatinib，商品名Tykerb)在临床治疗非小细胞肺癌时也表现出良好的潜力。但小分子抑制剂药物容易引起耐受，无法长期发挥治疗效果。而近年来双特异性抗体的出现带来了新的希望，双特异性抗体可以同时靶向两种不同的抗原，从而发挥双重或协同效应，用量少而且特异性强。具有十分突出的治疗优势。

发明内容

为克服非小细胞肺癌耐药问题，本发明的发明人结合EGFR和HER2的关联和工作积累，利用基因工程技术构建了一种同时靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，这种抗体同时含有人源化西妥昔单抗和赫赛汀单抗的抗原表位结合区。

本发明的技术方案如下：

一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，包含了人源化cetuximab和商业Herceptin的抗原结合区的全长IgG1型抗体蛋白。具有人源化cetuximab和商业Herceptin的重链和轻链各一条，所述的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2和NO:6；所述的轻链氨基酸序列为SEQ IDNO:4和NO:8。

本发明还保护编码上述靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的基因，其特征在于，编码所述重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和NO:5；编码所述轻链的核苷酸序列为SEQ IDNO:3和NO:7。

本发明还保护涉及包含本发明核酸分子的载体和包含所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列的载体，具体表达载体可为pZJC或pcDNA3.1。

本发明涉及一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

a)将人源化cetuximab的重链恒定区和赫赛汀抗体的重链恒定区相应位置碱基进行突变，从而构成隆突-入-穴结构，形成异源重链结合，并交换人源化cetuximab的重链CH1和轻链CL区域，最终形成靶向HER2与EGFR的双特异性抗体的重轻链基因；

b)将靶向HER2与EGFR的双特异性抗体的重轻链基因分别克隆到真核表达载体pZJC或pcDNA3.1载体上，转染宿主细胞，进行瞬时转染；

c)在摇瓶培养条件下，培养并收集上清；

d)纯化所述的双特异性抗体。

所述的宿主细胞用于载体转染表达，为哺乳动物细胞，具体可为HEK293F细胞。

本发明还保护一种组合物，该组合物含有靶向EGFR和HER2的双特异性抗体和药学上可接受的载体。

本发明还保护一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其组合物在制备抗非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞的药物中的应用。

所述的非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞分别为高表达EGFR和过表达HER2的非小细胞肺癌细胞，具体可为PC-9和PC-9/GR细胞。

本发明还保护一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体及其组合物和其他的抗肿瘤药物联合使用。

本发明的优点：该双特异性抗体可以同时靶向EGFR和HER2，保留了两个亲本抗体与EGFR和HER2的亲和力，同时提高了抗体的靶向特异性，减少了抗体用量，而且对非小细胞肺癌PC-9/GR(Gefitinib-resistance)细胞的杀伤作用十分显著，效果优于两个亲本抗体的组合，与其他药物联用的效果也十分显著。为临床治疗非小细胞肺癌及其耐受提供了重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例3中的抗体鉴定图。

图2为实施例5流式检测抗体与非小细胞肺癌的亲和力图。其中PBS：磷酸盐缓冲液；hErb：人源化cetuximab抗体；Her：赫赛汀抗体；HE_crossMab：靶向EGFR和HER2的双特异性抗体。

图3为实施例6中PC-9和PC-9/GR细胞生长抑制功能检测图。图中A为PC-9细胞生长抑制功能检测图；B为PC-9/GR细胞生长抑制功能检测图。其中NC：阴性对照；hErb：人源化cetuximab抗体；Her：赫赛汀抗体；HE_crossMab：靶向EGFR和HER2的双特异性抗体；EGF：表皮生长因子；PC-9：人非小细胞肺癌PC-9细胞；PC-9/GR：人非小细胞肺癌PC-9/GR细胞。

图4为实施例6中PC-9和PC-9/GR细胞中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图。图中A为PC-9细胞中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图；B为PC-9/GR中增加吉非替尼进行处理所得生长抑制功能检测图。其中EGF：表皮生长因子；hErb：人源化cetuximab抗体；Her：赫赛汀抗体；HE_crossMab：靶向EGFR和HER2的双特异性抗体；PC-9：人非小细胞肺癌PC-9细胞；PC-9/GR：人非小细胞肺癌PC-9/GR细胞；Gef：吉非替尼。

图5为实施例7中流式检测细胞凋亡图。

图6为实施例8中信号通路检测图，图中NC：阴性对照；hErb：人源化cetuximab抗体；Her：赫赛汀抗体；HE_crossMab：靶向EGFR和HER2的双特异性抗体；EGF：表皮生长因子；p-Akt：磷酸化蛋白激酶B；Akt:蛋白激酶B；AEG-1：星形胶质细胞上调基因-1；c-myc和c-fos：为两种原癌基因；GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶，作为内参蛋白。

序列说明

SEQ ID NO:1：Herceptin的重链核苷酸序列。

SEQ ID NO:2：Herceptin的重链氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：Herceptin的轻链核苷酸序列。

SEQ ID NO:4：Herceptin的轻链氨基酸序列。

SEQ ID NO:5：人源化cetuximab的重链核苷酸序列。

SEQ ID NO:6：人源化cetuximab的重链氨基酸序列。

SEQ ID NO:7：人源化cetuximab的轻链核苷酸序列。

SEQ ID NO:8：人源化cetuximab的轻链氨基酸序列。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明内容。其中涉及到的实验方法均为常规方法，特殊的进行说明。所用试验材料均采购自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果以平均值进行表示。

本发明的发明人结合EGFR和HER2的关联和工作积累，利用基因工程技术构建了一种同时靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，这种抗体同时含有人源化西妥昔单抗(CN102153647B)和赫赛汀单抗的抗原表位结合区，具有人源化cetuximab和商业Herceptin的重链和轻链各一条，其中重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2和NO:6；轻链氨基酸序列为SEQID NO:4和NO:8。

实施例1、重组质粒构建

质粒构建中的所有实验操作均参考于《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社)。将序列表的序列1、3、5、7所示的DNA分子分别插入到pZJC载体上，得到4种重组质粒。分别以人源化cetuximab抗体和赫赛汀单抗的重轻链为模板，引入相应的位点突变和片段互换，设计引物进行扩增。相应的引物如下表1所示：

表1合成Crossmab结构基因引物序列

实施例2、制备双特异性抗体

(1)、培养生长良好的HEK293F细胞至125ml摇瓶中培养，转染前一天调整细胞数为5×10⁵/ml，活力达到90％以上，培养基为30ml。37℃、125rpm培养。

(2)、转染当天测定细胞数目及活力，活力应大于95％。离心后更换新鲜Freestyle293F培养基。取30μg组合质粒DNA于Opti-MEM培养基中，总体积为1ml。

(3)、取60μl 293F脂质体加入Opti-MEM培养基中，总体积为1ml。

(4)、室温孵育5min，将DNA缓慢加入稀释好的脂质体中，用枪头轻轻吹吸混匀，并室温静置20-30min，孵育结束后将2ml脂质体和质粒的混合液加入细胞悬液中。

(5)、继续放入摇床中37℃、125rpm培养。12-14天后收集培养上清。

(6)、将收集到的培养上清进行12000rpm离心10min，然后用0.22μm滤膜进行过滤。

(7)、用真空泵过滤结合缓冲液和洗脱缓冲液。

(8)、打开蛋白纯化仪(Bio-rad，BioLogic DuoFlow)进行rProtein A亲和层析，大体过程如下：开启仪器，润洗泵，先用5个柱体积的超纯水(约10ml)将柱子中的乙醇洗净，然后用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液(约20ml)平衡柱子。再用5个柱体积的柠檬酸洗脱缓冲液清洗柱子，洗去残余蛋白；最后再用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液平衡柱子至电导、pH均稳定且将OD₂₈₀值归零。

将过滤后的细胞收集液进行上样，缓慢流过柱子。上样后用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液再次平衡柱子同时洗去未结合的杂蛋白。

洗脱：用5个柱体积的pH＝3.0的柠檬酸洗脱缓冲液将结合在柱子上的目的蛋白洗脱下来，在出现蛋白峰时用收集管进行收集，收集管中事先加入200μl的Tris-HCl(pH＝9.0)防止pH过低导致收集到的抗体变性。

洗脱结束后再次用10个柱体积的柠檬酸结合缓冲液平衡柱子，最后用超纯水清洗柱子，用乙醇封柱，柱子保存在4℃。将收集管中洗脱的液体合并后用超滤管进行浓缩并置换Buffer为PBS，抗体经过BCA和ELISA方法定量后分装在小管中保存在-20℃。

实施例3、SDS-PAGE检测

(1)样品处理：三倍体积的样品加入一倍体积的4×Loading Buffer(LoadingBuffer分变性还原和变性非还原两种)，混匀后煮沸10min，12000rpm离心10min，备用。

(2)配胶：先配分离胶，，在分离胶上方加入异丙醇，室温静置30min左右至胶凝固后倒掉异丙醇。再配制浓缩胶，加入浓缩胶后迅速插入梳子模具，室温静置30min至胶凝固，拔掉梳子模具。

(3)上样：用小枪头吸取样品上样，Marker上样5μl，最两侧胶孔用1×LoadingBuffer补充。

(4)电泳：蛋白电泳缓冲液没过胶孔，先用80V电压将溴酚蓝指示带电泳至浓缩胶和分离胶分界线处，再将电压调至120V至电泳结束。

(5)电泳结束后如需进行考马斯亮蓝染色则撬开配胶板，取出蛋白胶，用考马斯亮蓝染色液染色30min，再用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。

结果见图1，表明抗体组装完整，纯度较高。

实施例4、ELISA检测亲和力

(1)将合成的EGFR和HER2抗原(委托由北京义翘神州生物技术有限公司合成，EGFR抗原：10004-HCCH，HER2抗原：10001-H02H-50)分别包被96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被过夜。

(2)清洗：倒掉包被液，在纱布上扣干液体，每孔加入175μl 1×PBST，润洗后甩干液体。再每孔加入350μl 1×PBST，静置3min，倒掉液体并在纱布上扣干液体，再次用同样的方法用PBST洗两遍。

(3)封闭：用10％的小牛血清(PBS配制)进行封闭，每孔加入200μl，37℃封闭2h。

(4)清洗、加样：每孔加入175μl 1×PBST，润洗后甩干液体。将阳性对照曲妥珠单抗与待测样品(纯化的抗HER2人源化抗体)一起进行一定浓度的稀释，然后加入酶标板的对应孔中，每孔100μl样品，每个样品做3个复孔，37℃孵育1.5h。

(5)清洗加二抗：清洗步骤同(2)中的清洗步骤。清洗后每孔加入100μl二抗，即HRP-羊抗人IgG(1:2000稀释，用10％小牛血清稀释)，37℃孵育1.5h。

(6)显色：弃二抗，同(2)中的清洗步骤进行清洗。清洗后每孔加入100μl TMB底物溶液，37℃孵育14min进行显色。

(7)终止并检测：显色后直接每孔加入50μl终止液(2M H₂SO₄)终止反应，在酶标仪上读取450nm波长处的光吸收值。

(8)根据吸光值的高低比较待测样品与抗原结合的亲和力的大小。

最终，测定双特异性抗体HE_crossMab与EGFR和HER2的亲和力(Kd)如下表2所示。从结果中可以看出来HE_crossMab保留了亲本抗体与EGFR和HER2的亲和力。

表2亲和力常数(nM)

实施例5、流式细胞术检测抗体与非小细胞肺癌细胞的亲和力

(1)取对数期生长的PC-9或PC-9/GR细胞(细胞表面同时表达EGFR和HER2)，调整细胞浓度为5×10⁵-1.0×10⁶/ml，加入EP管中，每管1ml细胞悬液，每管对应一个样品。

(2)2000rpm、4℃离心5min，弃上清。

(3)加入1ml含1％FBS的PBS洗涤细胞一次，2000rpm、4℃离心5min，弃上清。

(4)加入稀释好的相应浓度的抗体样品(HE_crossMab)以及阳性对照样品(hErbitux、Herceptin以及hErbitux+Herceptin)于EP管中，200μl每管，另外可设置加入200μl PBS的样品为阴性对照组，冰浴60min。待测抗体可加入不同梯度的浓度，例如：1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。

(5)抗体孵育结束后离心弃上清，用500μl含1％FBS的PBS洗涤一次。

(6)每管样品中加入FITC标记的羊抗人IgG 100μl(用含1％FBS的PBS进行1：64稀释)，避光冰浴45min(此时可打开流式细胞仪提前预热机器)。

(7)二抗孵育结束后再次离心弃上清，用500μl含1％FBS的PBS洗涤一次。

(8)细胞沉淀重悬于350μl含1％FBS的PBS中并转移至流式管中进行流式上机检测。根据检测到的FITC荧光值的大小来判断抗体亲和力的强弱。

结果见图2。从结果中可以看出同两个亲本抗体的组合相比，HE_crossMab与两个亲本抗体同PC-9和PC-9/GR细胞之间的亲和力相当。

实施例6、MTT检测细胞毒性实验

(1)铺板：分别收集对数期PC-9和PC-9/GR细胞，调整细胞浓度至2.5×10⁴/ml，铺板在96孔板上，每孔加入200μl细胞悬液即每孔5000个细胞，无菌PBS填充边缘，铺2块96孔板，用于72h后的检测。37℃、5％CO₂培养24h。

(2)加药：待铺板细胞贴壁后，用培养基稀释不同浓度的抗体，吸去96孔板中的培养基，每孔加入200μl含相应浓度抗体的培养基，每个样品浓度设置3个复孔。2小时后相应孔中加入表皮生长因子(EGF，10nmol/L)，同时设置不加药的空白对照组。2块96孔板同时加药，72h后检测。加药后继续37℃、5％CO₂培养。

(3)检测：加相应抗体处理72h后分别进行检测。处理时间结束后，保留培养基，直接每孔加入20μl MTT(MTT溶液浓度为5mg/ml)，在37℃继续培养。4h后吸去各孔中的液体，每孔加入150μl DMSO，摇床上快速振荡15min充分溶解结晶，然后立即在酶标仪上检测490nm波长处的吸光值。

(4)细胞存活率＝(加药孔OD490/空白对照孔OD490)×100％；抑制率＝100％–存活率。

最终结果见图3和图4。可以明显看出：HE_crossMab能够很好地杀伤PC-9和PC-9/GR细胞，而且在EGF刺激下的PC-9/GR细胞中作用更加显著。同时还能够增强PC-9/GR对吉非替尼(Gefitinib)的敏感性，其中Gef(10nM)和Gef(500nM)分别表示吉非替尼在PC-9和PC-9/GR细胞中的终浓度。

实施例7、流式细胞术检测细胞凋亡

(1)第一天进行细胞铺板(PC-9/GR细胞)，调整细胞至5×10⁵/ml的密度，6孔板每孔加入1.5ml细胞悬液。铺板后继续37℃、5％CO₂培养24h。

(2)待细胞贴壁后，用培养基配制10μg/ml浓度的不同抗体，将6孔板中培养基吸出换成含抗体的培养基进行加药处理，同时设置不加抗体的阴性对照组。

(3)加药处理72h后收集细胞，用预冷PBS清洗细胞2次。加入300μl的1×BindingBuffer重悬细胞，加入5μl FITC-Annexin V避光染色15min，上机检测前再加入5μl PI避光染色5min，补加200μl 1×binding Buffer后进行流式上机检测。染色处理时FITC-AnnexinV单染和PI单染的对照各设置一组。

(4)流式细胞术检测凋亡比例并统计结果。

结果见图5。可以看出：无论是否存在EGF刺激下，HE_crossMab能够介导更多的细胞凋亡，而且效果显著强于两个亲本抗体的组合。

实施例8、EGFR下游信号通路检测

(1)同实施例7中处理一样，收集细胞进行蛋白收集，将待检测蛋白样品进行SDS-PAGE。

(2)在SDS-PAGE蛋白电泳结束前30min将两张转膜滤纸用转膜缓冲液进行浸泡，PVDF膜用甲醇浸泡30s后放入转膜滤纸上。

(3)转膜：电泳结束后撬开配胶板取出蛋白胶，将蛋白胶置于PVDF膜上，将蛋白胶、PVDF膜、一张滤纸三者一起转移至半干转膜仪的电极板上，最后在蛋白胶的上面再覆盖一张滤纸，用玻璃棒均匀地赶出气泡，吸走多余的转膜缓冲液。盖上转膜仪盖子，18V转膜1h。

(4)封闭：转膜结束后将PVDF膜转移至5％的脱脂奶粉封闭液(用1×TBST配制，现配现用)中，室温封闭1h。

(5)孵育一抗：封闭结束后将PVDF膜用保鲜膜包裹后进行裁膜，根据预染Marker的条带大小将目的条带和内参条带处裁开分成两部分。孵育相应抗体，4℃过夜。

(6)次日用1×TBST清洗PVDF膜3次，每次在摇床上清洗10min。

(7)清洗后孵育二抗，目的条带孵育HRP-山羊抗鼠抗体(1:1500稀释)，内参条带孵育HRP-山羊抗兔抗体(1:5000稀释)，室温孵育1h。

(8)二抗孵育结束后按照(6)中的步骤清洗PVDF膜。

(9)在暗室中进行显影，将PVDF膜放在暗盒中的保鲜膜上，均匀涂抹ECL化学发光剂，然后用X胶片进行压片，经过显影、定影后获得Western结果。

结果见图6。可以看出：HE_crossMab能够显著抑制Akt的磷酸化水平，以及下游效应分子c-fos、c-jun和AEG-1的表达水平。

综上所述，HE_crossMab具有良好的抗PC-9及PC-9/GR细胞(同时表达EGFR和HER2)的生长作用，有望成为一种用于临床治疗非小细胞肺癌以及Gefitinib获得性耐受的抗体药物。

<110> 安徽大学

<120> 一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag ctccaggtgc tcactccgag 60

gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 120

tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgcg tcaggccccg 180

ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt tatcctacga atggttatac tagatatgcc 240

gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctacctg 300

cagatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt attgttctag atggggaggg 360

gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaaccc tggtcaccgt ctcctcggct 420

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctctccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ctccatgccg ggatgagctg 1140

accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410

<210> 2

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys***

465

<210> 3

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagacac ccgcccagct gctgttcctg ctgctgctgt ggctgcccga caccaccggc 60

gacatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggttacc 120

atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180

ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 240

cgcttctctg gctccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 300

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 360

ggtaccaagg tggagatcaa gcggcggacc gtggcggcgc catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggtacc gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708

<210> 4

<211> 235

<212>PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys***

225 230 235

<210> 5

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag ctccaggtgc tcactcccag 60

gtgaagctgc tggagcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 120

tcctgcaagg catctggatt cagcctgact aactacggcg tccactgggt gcgacaggcc 180

cctggacaaa gacttgagtg gatgggagtg atctggagtg gtggtaacac tgactacaac 240

acccccttca ctagcagagt caccatcacc agggacacgt ccgctactac agcctacatg 300

ggcctgtcta gcctgagacc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgag agccctgact 360

tattacgact acgagttcgc ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 420

agcgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 480

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 540

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 600

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 660

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 720

ttcaacaggg gagagtgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctctccg tcctgcacca ggactggctg 1020

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtgcaccct gcctccatct 1140

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgagctgcg ccgtcaaagg cttctatccc 1200

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtga gcaagctcac cgtggacaag 1320

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422

<210> 6

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Lys Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser

35 40 45

Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg

50 55 60

Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Thr Pro Phe Thr Ser Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala

130 135 140

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

165 170 175

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

180 185 190

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

210 215 220

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

225 230 235 240

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Ser Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys***

465 470

<210> 7

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggagacac ccgcccagct gctgttcctg ctgctgctgt ggctgcccga caccaccggc 60

gaactcgtca tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcaac 120

attgcctgcc gggcaagtca gagcattggc actaacatcc actggtatca gcagaaacca 180

gggaaagccc ctagactcct gatcaaatat gcctccgaaa gcatcagtgg ggtcccatca 240

agattcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300

gaagattttg caatctatta ctgtcagcaa aataacaatt ggcctactac gttcggcgga 360

gggaccaagg tggaaatcaa acgacggacc gtggcggcgc catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggtacc gctagcgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708

<210> 8

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

100 105 110

Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys***

225 230 235

合成Crossmab结构基因引物序列

引物名称序列 （5’- 3’）

KnobHER2-H-R1:GCTGACCTACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATCCCGGCATGGAGGCAGGGTG TACACCTG

KnobHER2-H-F1:GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT

KnobHER2-H-R2:GGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGA

Crossmab-EGFR-L-R1:TGCTAGCTGAGGATCGTTTGATTTCCACCTTGGT

Crossmab-EGFR-L-F1:TGGAAATCAAACGATCCTCAGCTAGCACCAAGGGC

Crossmab-EGFR-L-R2:GGATCCCTAACAAGATTTGGGCTCAACTTT

Claims (9)

1.一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体，包含了人源化cetuximab抗体和商业Herceptin抗体的抗原结合区的全长IgG1型抗体蛋白，具有人源化cetuximab和商业Herceptin的重链和轻链各一条，所述的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2和NO:6；所述的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:4和NO:8。

2.编码权利要求1所述靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的基因，其特征在于，编码所述重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和NO:5；编码所述轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和NO:7。

3.一种靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求2所述的核苷酸序列或与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，具体可为pZJC或pcDNA3.1。

4.一种制备靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a) 将人源化cetuximab的重链恒定区和赫赛汀抗体的重链恒定区相应位置碱基进行突变，从而构成隆突-入-穴结构，形成异源重链结合，并交换人源化cetuximab的重链CH1和轻链CL区域，最终形成所述双特异性抗体的重轻链基因；

b) 将制得的双特异性抗体的重轻链基因分别克隆到权利要求3所述的表达载体上，转染宿主细胞，进行瞬时转染；

c) 在摇瓶培养条件下，培养并收集上清；

d) 纯化得到所述的双特异性抗体。

5.如权利要求4所述的一种制备靶向EGFR和HER2的双特异性抗体的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，具体可为HEK293F细胞。

6.一种组合物，含有权利要求1所述的双特异抗体和药学上可接受的载体。

7.如权利要求1所述的双特异性抗体或如权利要求6所述的一种组合物在制备抗非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的非小细胞肺癌及其获得性耐受细胞分别为高表达EGFR和过表达HER2的非小细胞肺癌细胞，具体可为PC-9和PC-9/GR细胞。

9.如权利要求7所述的应用，还包括和其他的抗肿瘤药物联合应用。