KR20130001258A - Ｃｓｆ-１ｒ에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 CSF-1R에 고 친화도로 결합하는 인간 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 하기와 같은 다관능성에 의해 당업계에 공지된 항체보다 유의한 이점을 갖는다: 종양, 대식세포 및 단핵구을 포함하는 세포에서 CSF-1R의 신호전달의 억제, CSF-1R 분해의 내재화 및 유도 및 ADCC의 자극. 이들은 또한 단독으로 또는 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 또는 독소루비신과 조합되어 백혈병, 유방암, 자궁내막암 및 전립선암을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.

Description

ＣＳＦ-１Ｒ에 대한 항체 {ANTIBODIES AGAINST CSF-1R}
본 출원은 2010년 4월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 61/319,896을 우선권 주장한다.
본 발명은 면역학 및 암 치료의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 콜로니 자극 인자-1 수용체 (CSF-1R)에 결합하는 인간 항체에 관한 것이다.
c-fms 유전자에 의해 코딩되는 콜로니 자극 인자-1 수용체 (CSF-1R) (또한 M-CSFR 또는 CD-115로 공지됨) (인간 CSF-1R 변이체; 서열 15) (인간 CSF-1R; 서열 16; 유니프롯(Uniprot) 등록 #P07333)는 정상 개체의 대식세포 과립구 세포 계통 상에서 및 암의 종양 세포 상에서 선택적으로 발현되는 티로신 키나제 수용체이다. CSF-1R의 세포외 도메인에 결합하는 2가지 공지된 리간드, 콜로니 자극 인자-1 (CSF-1) (인간 CSF-1; 서열 17)(유니프롯 등록 #P09603) (또한, M-CSF 및 IL-34로 공지됨) (인간 IL-34; 서열 18)(유니프롯 등록 #Q6ZMJ4)이 존재한다. CSF-1 또는 IL-34 결합시에, CSF-1R이 이량체화되어, 수용체의 트랜스-인산화 및 하류 신호전달 분자, 예컨대 MAPK 및 Akt의 인산화 및 활성화로 이어진다. CSF-1R의 인산화는 하기로 이어진다: (1) 조혈 줄기 간세포로부터 대식세포의 증식 및 분화 및 (2) 대식세포의 생존 및 그의 신체 내의 다양한 기관 및 조직, 특히 종양 기질로의 이동. CSF-1R은 또한 종양 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다.
뮤린 CSF-1R에 대한 항체는 인간에서 교차-반응성이 아니며, 따라서 인간에서 암을 치료하는데 비효과적인 치료제일 것이다.
CSF-1R에 대한 인간 항체는 PCT 공보 WO2009/026303 (Brasel, et al.)에 개시되어 있다. 이러한 항체는 항체에 의해 결합된 세포에 대한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 유도하지 않다. 항체가 항원을 발현하는 세포 (표적 세포)에 결합하였을 때 ADCC가 일어나 자연 킬러 세포, 단핵구, 호중구 및 수지상 세포 (이펙터 세포) 상에서 Fc 수용체에 대한 결합에 이용가능한 항체의 Fc 영역을 만든다. 브라셀(Brasel)에 개시된 항체는 표적 세포의 사멸을 시작하기 위해 표적 세포 및 이펙터 세포를 함께 가져올 수 없다.
리간드에 대한 항체는 교차 반응성이 아니다. 따라서, CSF-1에 대한 항체는 CSF-1R에 대한 IL-34 결합을 억제하지 않고, IL-34에 대한 항체는 CSF-1R에 대한 CSF-1 결합을 억제하지 않는다. 수용체에 대한 리간드 결합은 암 성장에 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 리간드에 대한 항체는 내재화되지 않으며, 이들은 CSF-1R 분해를 유도하지도 않고 세포에 대한 ADCC 활성을 자극하지도 않는다.
CSF-1R에 대한 리간드의 결합을 차단하고, 또한 항체에 의해 결합된 세포에 대한 ADCC 활성을 유도하는 다관능성 항체에 대한 필요가 존재한다.
본 발명의 항체는 다수의 기능을 갖기 때문에 공지된 항체보다 유리하다. 본 발명의 항체는 대식세포 유도된 종양 성장을 방지하는데 중요한 기능을 하는 수용체에 대한 CSF-1 및 IL-34 결합을 차단하여, 수용체의 이량체화 및 이로 인한 세포내 티로신 잔기의 인산화를 방지한다. 본 발명의 항체는 내재화되고, CSF-1R 분해를 유도한다. 중요하게는, 본 발명의 항체가 리간드 결합 차단 뿐만 아니라, 종양 세포 및 종양-관련 대식세포 및 단핵구의 사멸을 자극시킴으로써 ADCC 활성을 증신시킨다. 본 발명의 항체는 또한 대식세포 활성에 동시에 영향을 미치며, 이 활성은 종양 진행에서 주요 역할을 수행한다. 본 발명의 항체는 이들이 갖는 다수의 치료 기능 때문에 당업계에 공지된 항체보다 유의한 이점을 갖는다.
<발명의 개요>
본 발명의 한 측면은 서열 SYGMH (서열 1)를 포함하는 CDRH1, 서열 VIWYDGSNKYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 CDRH2, 서열 GDYEVDYGMDV (서열 3)를 포함하는 CDRH3, 서열 RASQGISNALA (서열 4)를 포함하는 CDRL1, 서열 DASSLES (서열 5)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQFNSYPWT (서열 6)를 포함하는 CDRL3을 포함하는, 인간 CSF-1R 변이체 (서열 15)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 또 다른 측면은 서열 SYGMH (서열 1)를 포함하는 CDRH1, 서열 VIWYDGSNKYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 CDRH2, 서열 GDYEVDYGMDV (서열 3)를 포함하는 CDRH3, 서열 RASQGISNALA (서열 4)를 포함하는 CDRL1, 서열 DASSLES (서열 5)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQFNSYPWT (서열 6)를 포함하는 CDRL3을 포함하는, 인간 CSF-1R (서열 16)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 한 측면은 서열 SYGMH (서열 1)를 포함하는 CDRH1, 서열 VIWYDGSNKYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 CDRH2, 서열 GDYEVDYGMDV (서열 3)를 포함하는 CDRH3, 서열 RASQGISNALA (서열 4)를 포함하는 CDRL1, 서열 DASSLES (서열 5)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQFNSYPWT (서열 6)를 포함하는 CDRL3을 포함하는, 인간 CSF-1R (서열 15)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 항체는 상기 CDR 서열 중 하나 내에 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 언급된 CDR은 CDR 서열 중 하나에 아미노산 치환을 갖지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 CSF-1R에 결합하고, 아미노산 서열:
QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS (서열 7)를 포함하는 VH,
또는 아미노산 서열:
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPWTFGQGTKVEIK (서열 8)를 포함하는 VL
을 포함하는 항체 또는 그의 단편이다.
본 발명의 또 다른 측면은 CSF-1R에 결합하고, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체는 각각 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 및 각각 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다.
이러한 항체의 CSF-1R-결합 단편은 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체 또는 그의 단편를 코딩하는 단리된 DNA 및 폴리뉴클레오티드/폴리핵산, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로 항체 또는 그의 단편을 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명은 유효량의 항체를 투여함으로써, 포유동물에서, 암 세포의 성장을 억제하는 방법 및 백혈병, 유방 및 전립선 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 유효량의 항체를 투여함으로써, 포유동물에서, 암 세포의 성장을 억제하는 방법 및 백혈병, 자궁내막, 유방 및 전립선 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 암 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 백혈병, 자궁내막, 유방 및 전립선 암종 뿐만 아니라 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 다발성 골수종 및 호지킨 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 신생물성 질환 (고형 종양 포함)의 치료, 및 유방 및 전립선 암종의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 신생물성 질환 (고형 종양 포함)의 치료, 및 유방, 자궁내막 및 전립선 암종의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 신생물성 질환 (고형 종양 포함)의 치료, 및 유방, 자궁내막, 전립선, 난소, 결장직장, 간세포 및 신장 암종의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 요법에 사용하기 위한, 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 의약으로 사용하기 위한 항체 또는 그의 단편이다. 또 다른 측면에서, 이전에 기재된 항체 또는 그의 단편은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명은 백혈병, 유방암 및 전립선암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 백혈병, 유방암, 자궁내막암 및 전립선암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 다발성 골수종 및 호지킨 림프종을 포함하나 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 또 다른 항암 치료제의 제공 또는 투여를 포함하는 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하며, 여기서 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제 또는 항신생물제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 항신생물제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴(Herceptin)? 및 독소루비신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 항체 또는 단편 뿐만 아니라 항암 치료제가 환자에게 투여된다. 항체 또는 그의 단편은 다른 항암 치료제 또는 또 다른 항신생물제를 사용하는 요법의 시작 전에, 그 동안, 실질적으로 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다.
본 발명은 또한 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 한 측면에서 암은 백혈병, 유방암 또는 전립선암이다. 한 측면에서 암은 백혈병, 유방암, 자궁내막암 또는 전립선암이다. 본 발명의 또 다른 측면에서 암은 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 다발성 골수종 또는 호지킨 림프종이다. 항체의 사용은 유효량의 또 다른 항암 치료제의 제공 또는 투여를 포함하며, 여기서 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제 또는 항신생물제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 항신생물제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 및 독소루비신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 항체 또는 단편 뿐만 아니라 항암 치료제가 환자에게 투여된다. 항체 또는 그의 단편은 다른 항암 치료제 또는 또 다른 항신생물제를 사용하는 요법의 시작 전에, 그 동안, 실질적으로 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다.
본 발명은 추가로 암의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암은 백혈병, 유방암, 자궁내막암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 측면에서, 암은 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 췌장암, 다발성 골수종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로, 방법은 또 다른 항암 치료제를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항신생물제는 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 및 독소루비신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 그를 필요로 하는 포유동물의 치료, 예를 들어 혈관신생 또는 골 전이의 억제, 또는 종양 또는 과다증식성 성장의 억제, 또는 염증성 질환의 치료를 위해 항체 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 그를 필요로 하는 포유동물의 치료, 예를 들어 혈관신생 또는 골 전이의 억제, 또는 종양 또는 과다증식성 성장의 억제, 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항체 또는 그의 단편을 함유하는 생성물 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 생성물 또는 제약 조성물은 요법에서 본원에 개시된 항체와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 조합되는 추가의 제약 작용제, 항신생물제 또는 항암제 또는 치료제 (도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 또는 독소루비신을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 포함할 수도 있다.
본 발명은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포의 샘플에서의 CSF-1 수준을 암이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현되는 CSF-1R을 갖는 경우에 환자에서 본 발명의 CSF-1R 항체 또는 그의 단편으로의 성공적인 치료의 인디케이터로 사용하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 CSF-1의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) CSF-1 수준이 대조 집단에서 발견된 CSF-1 수준보다 높은 경우에 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포의 샘플에서의 IL-34 수준을 환자에서 본 발명의 CSF-1R 항체 또는 그의 단편으로의 성공적인 치료의 인디케이터로 사용하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 IL-34의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) IL-34 수준이 대조 집단에서 발견된 IL-34 수준보다 높은 경우에 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 (1) 암을 갖는 대상체의 샘플에서 CSF-1의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; (2) 암에 걸리지 않은 개체에서의 CSF-1의 수준과 비교하여 CSF-1의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (1) 암을 갖는 대상체의 샘플에서 IL-34의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; (2) 암에 걸리지 않은 개체에서의 IL-34의 수준과 비교하여 IL-34의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법이다.
본 발명은 또한 CSF-1R에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 (a) CSF-1R에 대한 CSF-1 또는 IL-34의 결합 억제; (b) CSF-1R의 활성화 억제; (c) CSF-1R의 인산화 감소; (d) MAPK의 활성화 감소; (e) Akt의 활성화 감소; (f) CSF-1R 양의 감소; 및 (g) ADCC 유도로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 특성 (a) 내지 (g)를 보유한다.
본 발명의 한 측면은 인간 CSF-1R 변이체 (서열 15) 또는 인간 CSF-1R (서열 16)에 특이적으로 결합하고, CSF-1R의 신호전달을 억제하고, CSF-1R 분해를 내재화 및 유도하고, 종양, 대식세포 및 단핵구를 포함하여 다양한 세포에 대한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성을 자극하는 항체 또는 그의 단편이다. 서열 15 및 서열 16은 결합 영역 외부에 있는 위치 54에서 하나의 아미노산이 상이하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)의 4개 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 개별 쇄는 크기 (110-125개 아미노산) 및 구조는 유사하지만 기능은 상이한 도메인으로 폴딩될 수 있다.
경쇄는 1개의 가변 도메인 (본원에서는 VL로 약칭함) 및/또는 1개의 불변 도메인 (본원에서는 CL로 약칭함)을 포함할 수 있다. 인간 항체 (이뮤노글로불린)의 경쇄는 카파 (K) 경쇄 또는 람다 (λ) 경쇄이다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 VL은 카파-유형 경쇄 (VK)의 가변 영역 및 람다-유형 경쇄 (Vλ)의 가변 영역 둘 다를 포함한다. 또한, 중쇄는 1개의 가변 도메인 (본원에서는 VH로 약칭함) 및/또는 항체의 클래스 또는 이소형에 따라 3 또는 4개의 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4) (본원에서는 통칭하여 CH로 약칭함)를 포함할 수 있다. 인간에서, 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이고, IgA 및 IgG는 서브클래스 또는 하위유형 (IgA1-2 및 IgG1-4)으로 추가로 세분된다. 본 발명은 임의의 상기 언급된 클래스 또는 서브클래스의 항체를 포함한다. 인간 IgG1이 본 발명의 항체로 바람직한 이소형이다.
초가변 또는 상보성-결정 영역 (CDR)으로 불리는 3개의 영역이 각각의 VL 및 VH에서 발견되고, 이는 프레임워크 (본원에서는 FR로 약칭함)로 불리는 덜 가변적인 영역에 의해 지지된다. 아미노산은 카바트(Kabat) 관례 (문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991).)에 따라 특정한 CDR 영역 또는 도메인에 배정된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. VL 및 VH 도메인으로 이루어진 항체의 일부는 Fv (가변 단편)로 명명되고, 항원-결합 부위를 구성한다. 단일 쇄 Fv (scFv)는 하나의 폴리펩티드 쇄 상에 VL 도메인 및 VH 도메인을 함유하는 항체 단편이고, 여기서 하나의 도메인의 N 말단 및 다른 도메인의 C 말단은 가용성 링커에 의해 연결된다.
"단리된 항체"는 (1) 성분들의 혼합물로부터 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 정제된 항체, (2) 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체, (3) 모노클로날 항체, (4) 동일 종으로부터의 다른 단백질을 함유하지 않는 항체, (5) 상이한 종의 세포에 의해 발현된 항체, 또는 (6) 자연계에서는 발생되지 않는 항체이다. 성분은, 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 항체를 제외한다. 항체의 천연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 항체의 예는 친화도 정제된 항체, 시험관내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 제조된 항체, 및 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 인간 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 예를 들어 집단을 구성하는 개별 항체들은 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이 또는 소수의 번역후 변이를 제외하고는 실질적으로 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위 (또한, 결정자 또는 에피토프로 공지됨)에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정자에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단결정자에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특성을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의해 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다 (문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같음). 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR에서 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되거나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 적어도 1개의 위치에서 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들어 활성 증진 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체는 포함하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "인간 항체"을 생산하는 방법은 인간에서 생산된 항체를 포함하지 않는다.
어구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체, 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다.
Fc (단편, 결정화가능 영역)는 쌍을 이루는 중쇄 불변 도메인으로 구성된 항체의 일부 또는 단편에 대한 명칭이다. 예를 들어 IgG 항체에서, Fc는 중쇄 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진다. IgA 또는 IgM 항체의 Fc는 CH4 도메인을 추가로 포함한다. Fc는 Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 세포 매개 세포독성 (CMC)의 활성화와 관련이 있다. 다수의 IgG 유사 단백질 복합체인 항체, 예컨대 IgA 및 IgM의 경우에 복합체 형성에는 Fc 불변 도메인이 필요하다.
따라서, 본 발명의 항체는 단리된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 재조합 인간 항체, 모노클로날 항체, 소화 단편, 특정 부분 및 그의 변이체 (항체 모방체를 포함하거나, 또는 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 일부를 포함함; 각각 적어도 1개의 CDR을 함유함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기능적 단편은 CSF-1R 항원에 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, CSF-1R 또는 그의 부분에 결합할 수 있고 본 발명에 포함되는 항체 단편은 2가 단편, 예컨대 무손상의 쇄간 디술피드 결합을 갖는 (Fab') 2, 1가 단편, 예컨대 VL-CL 및 VL-CH1 도메인으로 이루어지고 중쇄 힌지 영역을 보유하지 않는 (예를 들어, 파파인 소화에 의함) 항체의 단편을 지칭하는 Fab (단편, 항원 결합), 중쇄 힌지 영역을 보유하는 Fab, Facb (예를 들어, 플라스민 소화에 의함), F(ab') 2, 디술피드 결합이 결여된 Fab', pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 소화에 의함), Fd (예를 들어, 펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의함), 및 Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자 생물학 기술에 의함)를 포함한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 도메인 결실 항체, 선형 항체, 단일 쇄 항체, scFv, 단일 도메인 항체, 다가 단일 쇄 항체, 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체, 예컨대 디아바디, 트리아바디 등을 포함한다.
힌지 영역은 항체의 Fab 부분과 Fc 부분을 분리하여 Fab의 서로에 대한 이동성 및 Fab의 Fc에 대한 이동성을 제공할 뿐만이 아니라 2개 중쇄의 공유 연결을 위한 다수의 디술피드 결합을 포함한다.
결합 특이성을 보유하지만, 예를 들어 이중특이성, 다가성 (2개 초과의 결합 부위) 및 소형화된 크기 (예를 들어, 결합 도메인 단독)를 포함하는, 바람직할 수 있는 다른 특성도 갖는 항체 포맷이 개발되어 왔다. 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적이다. 항체 특이성은 항원의 특정한 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인식을 지칭한다. 본 발명의 항체는 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 항체 (BsAb)는 2개의 상이한 항원-결합 특이성 또는 부위를 갖는 항체이다. 항체가 하나 초과의 특이성을 갖는 경우에 인식되는 에피토프는 단일 항원 또는 하나 초과의 항원과 관련이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 CSF-1R에 대한 적어도 하나의 특이성을 갖는, 2종의 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 항체는 그의 임의의 단편을 포함한다.
CSF-1R에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 특이성은 친화도 및/또는 결합력을 기반으로 하여 결정될 수 있다. 친화도는 항체와 항원의 해리에 대한 평형 상수 (KD)로 표시되며, 항원 결정기와 항체-결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 세포외 도메인 절편 (이하 "도메인" 또는 "ECD"로 간단하게 지칭됨) 상에 위치한 CSF-1R의 에피토프에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 본 발명의 항체에 의해 인식되는, 항원 상의 불연속적 3차원 부위를 지칭한다. 에피토프는 복합 항원의 면역학적 활성 영역으로, 실제로 B-세포 수용체에 결합하고 B 세포에 의해 생산된 항체 분자에 의해 실제로 결합하는 영역이다. 일반적으로, 항원은 적어도 1개의 에피토프, 통상적으로는 1개 초과의 에피토프를 함유한다. 단백질 항원 상의 에피토프는 선형일 수도 있고 비-선형일 수도 있다. 선형 에피토프는 단백질 아미노산 서열의 인접 아미노산 잔기로 구성된 에피토프이다. 선형 에피토프에는, 천연 3차원 구조를 형성하고 항원에 결합 특이성을 갖는 항체를 생산하는 면역 반응을 도출하기 위해 형태적 폴딩이 요구될 수도 있고 요구되지 않을 수도 있다. 비-선형 에피토프는 비-인접 아미노산 잔기로 구성된다. 따라서, 비-선형 에피토프에는, 천연 3차원 구조를 형성하고 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 생선하는 면역 반응을 도출하기 위해 필요한 아미노산 잔기들을 서로 근접하게 하는 어느 정도의 단백질 폴딩이 항상 요구된다.
본 발명의 항체는 또한 직접적인 돌연변이, 친화도 성숙, 파지 디스플레이 또는 쇄 셔플링의 방법에 의해 결합 특성이 개선된 것을 포함한다. CDR 및/또는 FW 잔기를 돌연변이시키고, 바람직한 특성을 갖는 항원 결합 부위에 대해 스크리닝함으로써 친화도 및 특이성이 변형 또는 개선될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403(1995)] 참조). CDR은 다양한 방법으로 돌연변이된다. 한 가지 방법은 다른 동일한 항원 결합 부위의 집단 내에서 2 내지 20개 아미노산의 서브세트가 특정한 위치에서 발견되도록 개별 잔기 또는 잔기들의 조합을 무작위화하는 것이다. 대안적으로, 오류 유발 PCR 방법에 의해 돌연변이가 소정 범위의 잔기에 걸쳐 유도될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-96 (1992)] 참조). 또 다른 예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터가 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이유발 균주에서 증식될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-68 (1996)] 참조). 이러한 돌연변이유발 방법은 당업자에게 공지된 많은 방법의 예이다.
치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 CDR 영역 부위를 돌연변이시켜서 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이와 같이 생성된 항체 변이체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 1가 방식으로 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도(KD), 특이성, EC50)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 CDR 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 CDR 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CDR이 가변 영역에 작동가능하게 연결되어 있는지 또는 CDR이 다른 가변 영역 서열과 독립적인지에 관계없이 1개 이상의 CDR 서열의 1개 이상의 잔기 위치에서 무작위 돌연변이유발을 수행할 수 있고, 이어서 변경된 CDR을 재조합 DNA 기술을 이용하여 가변 영역으로 복귀시킨다. 일단 이러한 변이체 항체가 생성되고 발현되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특징을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
본원에 구체적으로 기재된 항체 뿐만 아니라, 다른 "실질적으로 상동성"인 변형된 항체가 당업자에게 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 용이하게 설계 및 제작될 수 있다. 예를 들어, 프레임워크 영역은 몇몇 아미노산 치환, 말단 및 중간체 부가 및 결실 등에 의해 1차 구조 수준에서 천연 서열과 달라질 수 있다. 또한, 다양한 상이한 인간 프레임워크 영역이 단독으로 또는 조합되어 본 발명의 인간화 이뮤노글로불린에 대한 기반으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 다양한 주지의 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명은 VH 영역 또는 그의 부분 중 어느 하나, 또는 VH CDR 중 어느 하나, 예컨대 그의 임의의 변이체를 포함하는 항-CSF-1R 항체 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명은 또한 VL 영역 또는 그의 부분 중 어느 하나 또는 VL CDR 중 어느 하나, 예컨대 그의 임의의 변이체를 포함하는 항-CSF-1R 항체 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 또한 각각 중쇄 및 경쇄에 대한 항체 1의 핵산 서열, 서열 13 및 14를 포함한다. 본 발명의 항체는 항체 1의 동일한 CDR 영역, 및/또는 항체 1의 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이들 방법은 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon et al. eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam) in Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell ed., 1984)]에 기재된 면역학적 방법 뿐만 아니라 문헌 [Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)]에 기재된 재조합 DNA 방법을 포함한다. 항체는 또한 scFv 또는 Fab 형태로 VH 및 VL 도메인의 조합물을 보유하는 라이브러리로부터 수득될 수도 있다. VH 및 VL 도메인은 합성, 부분 합성 또는 천연 유래의 뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명은 인간 항체 단편을 보유하는 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 만들어질 수 있다. 인간 항체의 다른 공급원은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하도록 유전자조작된 트랜스제닉 마우스이다.
항체의 제조를 위한 한 실시양태는 삽입된 인간 항체 생성 게놈의 실질적인 일부를 갖고 내인성 항체의 생산이 결여되도록 만든 트랜스제닉 동물에서 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산를 발현시키는 것이다. 트랜스제닉 동물은 마우스, 염소 및 토끼를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 트랜스제닉 마우스로 만들어진다. 본 발명의 추가의 한 실시양태는, 예를 들어 수유 중에 폴리펩티드가 분비되도록 동물의 유선에서 항체-코딩 유전자를 발현시키는 것을 포함한다.
"인간화" 항체를 생성하기 위한 통상의 방법은 MAb (설치류 숙주를 면역화시켜 생성됨)로부터의 CDR 서열을 인간 Ig 백본으로 이식하는 것, 및 키메라 유전자를 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로 형질감염시키는 것 (이는 다시 CHO 세포에 의해 분비된 기능적 항체를 생산함)이다.
단일 도메인 항체의 결합의 1차 결정자인 아미노산 잔기가 카바트 또는 코티아 정의된 CDR 내에 존재할 수 있지만, 예를 들어 VH-VL 이종이량체의 VH-VL 인터페이스에 다른 방식으로 매립되는 잔기와 같은 다른 잔기도 포함될 수 있음이 이해된다.
본 발명의 CSF-1R 결합 항체를 확인하는데 사용되는 단백질은 바람직하게는 CSF-1R이고, 보다 바람직하게는 CSF-1R의 세포외 도메인이다. CSF-1R 세포외 도메인은 또 다른 분자를 함유하지 않을 수 있거나 또는 또 다른 분자에 접합될 수도 있다. 본 발명의 항체는 추가의 아미노산 잔기에 융합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 단리를 용이하게 하기 위한 것일 수 있는 펩티드 태그 또는 이량체와를 최적화시키기 위한 IgG FC 부분일 수 있다. 항체를 특정 기관 또는 조직에 귀소시키기 위한 다른 아미노산 잔기도 고려된다.
항체 단편은 온전한 항체를 절단하거나 단편을 코딩하는 DNA를 발현시켜 생산될 수 있다. 항체의 단편은 문헌 [Lamoyi et al., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) 및 Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편 중 하나 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 단편은 단일-쇄 단편 가변 영역 항체, 즉 scFv, 디아바디, 또는 다른 항체 단편을 함유할 수도 있다. 이러한 기능적 등가물을 생산하는 방법은 유럽 특허 출원 공보 번호 EP 239,400 (Winter); PCT 공보 WO 89/09622 (Hann, et al.); 유럽 특허 출원 공보 번호 EP 338,745 (Owens, et al.); 및 유럽 특허 출원 공보 번호 EP 332,424 (Beldler, et al.)에 개시된다. 본 명세서 전체에 걸쳐서, 용어 본 발명의 "항체"'는 구체적으로 언급되는지 언급되지 않는지에 관계없이 그의 임의의 단편을 포함한다.
본 발명의 벡터의 형질전환 및 본 발명의 항체의 발현에 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 NS0 세포 (비-분비 (0) 마우스 골수종 세포), 293, SP20 및 CHO 세포, 및 림프종, 골수종 또는 하이브리도마 세포와 같은 림프양 기원의 다른 세포주이다. 다른 진핵 숙주, 예컨대 효모가 대안적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 황산암모늄 또는 황산나트륨에 의한 침전에 이어 염수에 대한 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 또는 면역-친화성 크로마토그래피 뿐만 아니라 겔 여과 또는 구역 전기영동에 의해 단리 또는 정제될 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 정제 방법은 단백질-A 친화성 크로마토그래피이다.
인간 항체를 코딩하는 DNA는 실질적으로 또는 오직 상응하는 인간 항체 영역으로부터 유래된, CDR 이외의 인간 불변 영역 및 가변 영역을 코딩하는 DNA와 인간으로부터 유래된 CDR을 코딩하는 DNA를 재조합하여 제조될 수 있다.
항체의 단편을 코딩하는 DNA의 적합한 공급원은 전장 항체를 발현하는 하이브리도마 및 비장 세포와 같은 임의의 세포를 포함한다. 상기한 바와 같이, 단편은 그 자체가 항체 균등물로 사용될 수도 있고, 또는 균등물로 재조합될 수도 있다. 본원에 기재된 DNA 재조합 및 다른 기술은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다. DNA의 또 다른 공급원은 당업계에 공지된 바와 같은 항체의 파지 디스플레이 라이브러리이다.
추가로, 본 발명은 대조 서열, 예컨대 발현 서열, 프로모터 및/또는 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된, 이전에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 원핵 시스템, 예컨대 박테리아, 및 진핵 시스템 (효모 및 포유동물 세포 배양 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않음) 내에서 항체 폴리펩티드를 효율적으로 합성하기 위한 다양한 발현 벡터가 개발되었다. 본 발명의 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 절편을 포함할 수 있다.
임의의 적합한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 원핵 클로닝 벡터는 이. 콜라이로부터의 플라스미드, 예컨대 colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM 및 RP4를 포함한다. 원핵 벡터는 또한 파지 DNA, 예컨대 M13 및 다른 필라멘트형 단일-가닥 DNA 파지의 유도체도 포함한다. 효모에서 유용한 벡터의 예는 2μ 플라스미드이다. 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 SV-40, CMV, 아데노바이러스, 레트로바이러스-유래의 DNA 서열의 주지된 유도체, 및 상기한 것과 같은 기능적 포유동물 벡터 및 기능적 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 셔틀 벡터를 포함한다. 추가의 진핵 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); Kaufmann and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21 (1982); Scahill et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 4654-59 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216-20) (1980)]).
본 발명에 유용한 발현 벡터는 발현시킬 DNA 서열 또는 단편에 작동가능하게 연결된 적어도 1개의 발현 제어 서열을 함유한다. 제어 서열은 클로닝된 DNA 서열의 발현을 제어하고 조절하기 위해 벡터로 삽입된다. 유용한 발현 제어 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 제어 영역, 효모의 글리콜분해 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-접합 인자의 프로모터, 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 원숭이 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들어 초기 및 후기 프로모터 또는 SV40, 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 및 이들의 바이러스의 유전자 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열 또는 그의 조합이다.
효모에서 유전자 구축물을 발현하는 것이 바람직한 경우에, 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076에 대한 선택 마커를 제공한다. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재 하에 성장시켜 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
본 발명은 또한 이전에 기재된 재조합 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 항체는 하이브리도마 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 적합한 포유동물 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다.
특히 바람직한 세포주는 높은 수준의 발현, 관심 단백질의 구성적 발현, 및 숙주 단백질로부터의 최소의 오염을 기반으로 선택된다. 발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 주지되어 있고, 많은 불멸화 세포주, 예컨대 (이에 제한되지 않음) COS-7 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 및 림프종, 골수종 또는 하이브리도마 세포와 같은 림프양 기원의 세포주를 포함하는 많은 다른 세포주를 포함한다. 적합한 추가의 진핵 세포는 효모 및 다른 진균을 포함한다. 유용한 원핵 숙주는 예를 들어 이. 콜라이, 예컨대 이. 콜라이 SG-936, 이. 콜라이 HB 101, 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 X1776, 이. 콜라이 X2282, 이. 콜라이 DHI, 및 이. 콜라이 MRCl, 슈도모나스(Pseudomonas), 바실루스(Bacillus), 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다.
이러한 재조합 숙주 세포는, 상기 세포를 항체 또는 그의 단편의 발현을 허용하는 조건하에 배양하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포 주위의 배지로부터 항체 또는 그의 단편을 정제함으로써 항체 또는 그의 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 재조합 숙주 세포에서 분비를 위한 발현된 항체 또는 단편의 표적화는 관심 항체-코딩 유전자의 5' 말단에 신호 또는 분비 리더 펩티드-코딩 서열을 삽입함으로써 용이해질 수 있다. 이러한 분비 리더 펩티드 요소는 원핵 또는 진핵 서열로부터 유래될 수 있다. 따라서, 숙주 세포 시토졸 외부로 폴리펩티드가 직접 이동하고 배지로 분비되도록 지시하는, 폴리펩티드의 N-말단부에 연결된 아미노산인 적합한 분비 리더 펩티드가 사용된다.
형질전환된 숙주 세포를 당업계에 공지된 방법에 따라 탄소 (탄수화물, 예컨대 글루코스 또는 락토스), 질소 (아미노산, 펩티드, 단백질 또는 이들의 분해 산물, 예컨대 펩톤, 암모늄 염 등) 및 무기 염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 술페이트, 포스페이트 및/또는 카르보네이트)의 동화가능한 공급원을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 배지는 예를 들어 성장-촉진 물질, 예컨대 미량 원소, 예를 들어 철, 아연, 망가니즈 등을 추가로 함유한다.
본 발명은 또한 포유동물에게 유효량의 항체를 투여함으로써 포유동물에서 종양 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료할 적합한 상태는 바람직하게는 CSF-1R을 발현하는 세포를 수반한다. 임의의 특정한 메카니즘과 연관시키려는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 예를 들어 신생물성 성장을 포함하는 암 세포의 성장, 골 전이, 기관 이식 거부 또는 CSF-1R에 의해 자극되는 자가면역 질환과 같은 면역 장애의 치료를 제공한다.
본 발명의 문맥에서, "치료" 또는 "치료하다"는 질환 또는 장애와 관련이 있는 근본적인 상태 또는 원치않는 생리학적 변화의 진행의 억제, 감속, 감소 또는 역전, 상태의 임상적 증상의 완화 또는 상태의 임상적 증상의 발현 예방을 포함하는 치유적 치료를 지칭한다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능한지 검출가능하지 않은지에 관계없이 증상의 경감, 질환 또는 장애 정도의 감소, 질환 또는 장애의 안정화 (즉, 질환 또는 장애가 악화되지 않음), 질환 또는 장애 진행의 지연 또는 감속, 질환 또는 장애의 완화 또는 개선, 및 질환 또는 장애의 차도 (부분적인지 또는 전체적인지에 관계없음)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 자는 이미 질환이 있는 자를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 치료 유효량의 본 발명의 항체는 그를 필요로 하는 포유동물 또는 환자에게 투여된다. 추가로, 본 발명의 제약 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 항-CSF-1R 항체를 포함할 수 있다. "치료 유효량" 또는 "유효 용량"은 바람직한 치료 결과 달성에 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료 유효량은 예를 들어 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유발하는 항체 또는 항체의 부분의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 다른 요인은 투여, 표적 부위, 환자 (환자가 인간인지 또는 동물인지 여부에 상관없음)의 생리학적 상태, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간으로의 투여에 특히 유용하지만, 다른 포유동물에게 투여될 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 포유동물은 인간, 실험 동물, 가정용 애완 동물 및 가축 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 치료 유효량은 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학상 유익한 효과가 더 큰 양이다.
투여 요법은 바람직한 최적의 반응 (예를 들어, 치료 또는 예방 반응)이 제공되도록 조정될 수 있다. 치료 투여량은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정될 수 있다. 전형적으로, 투여 스케쥴은 단일 볼루스 투여 또는 연속 주입 내지 1일 당 수회의 투여 (예를 들어, 4-6시간마다) 범위이거나, 또는 치료 전문의 및 환자의 상태에 따라 지시되는 바와 같을 것이다. 본 발명의 항체의 치료 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 0.1-50 mg/kg, 보다 바람직하게는 3-35 mg/kg, 보다 바람직하게는 5-20 mg/kg이다. 투여량 및 투여 빈도는 환자를 치료하는 의사가 결정할 것이고, 매일, 1주일에 3회, 매주, 2주일에 1회 또는 이보다 적은 빈도로 제공되는 1 mg/kg 미만으로부터 100 mg/kg 초과까지의 용량을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정한 용량으로 제한되지 않는다는 것에 주목해야 한다.
항-CSF-1R 항체는 항혈관신생제, 화학요법제 및 항신생물제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 항암 치료와 조합되어 투여될 수 있다. 임의의 적합한 항암제, 예컨대 화학요법제, 방사선, 항체 또는 그의 조합이 사용될 수 있다.
항암제는 항신생물제, 항체, 아주반트 및 전구약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 현재 당업계에 공지되거나 평가된 항신생물제는 다양한 클래스, 예를 들어 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사물, 인터칼레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 항생존 작용제, 생물학적 반응 조절제, 항호르몬제 및 항혈관신생제로 분류될 수 있다. 알킬화제의 예는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜팔란 및 다카르바진을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항대사물의 예는 독소루비신, 다우노루비신, 파클리탁셀, 겜시타빈, 알림타(ALIMTA)? 및 토포이소머라제 억제제 이리노테칸 (CPT-11), 아미노캄프토테신, 캄프토테신, DX-8951f, 토포테칸 (토포이소머라제 I), 에토포시드 (VP-16) 및 테니포시드 (VM-26) (토포이소머라제 II)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항신생물제가 방사선인 경우, 방사선의 공급원은 치료할 환자에 대해 외부 (외부 빔 방사선 요법 - EBRT) 또는 내부 (근접요법 - BT)일 수 있다. 투여되는 항신생물제의 용량은 예를 들어 작용제의 유형, 치료할 종양의 유형 및 중증도 및 작용제의 투여 경로를 포함하는 수많은 요인에 따라 달라진다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정한 용량으로 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 한 측면에서, 도세탁셀은 본 발명의 바람직한 항신생물제이다. 본 발명의 다른 측면에서, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 및 독소루비신이 바람직한 항신생물제이다.
본 발명의 항-CSF-1R 항체는 종양 성장 또는 혈관신생에 관련된 다른 수용체를 중화시키는 항체와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-CSF-1R 항체는 Her2에 특이적으로 결합하는 수용체 길항제와 조합되어 사용된다. 이러한 수용체의 또 다른 예는 VEGFR이다. 항-CSF-1R 항체는 VEGFR 길항제와 조합되어 사용될 수 있다. CSF-1R 항체는 하나 이상의 적합한 아주반트, 예컨대 예를 들어 시토카인 (예를 들어, IL-10, IL-4 및 IL-13) 또는 다른 면역 자극물질, 예컨대 (이에 제한되지 않음) 케모카인, 종양-관련 항원 및 펩티드와 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 항-CSF-1R 항체를 투여하고, 임의로는 항신생물제 및/또는 다른 수용체의 길항제를 공동 투여하기 위해 임의의 적합한 방법 또는 경로가 이용될 수 있다. 본 발명의 조합 요법에서, 항-CSF-1R 항체는 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 또는 독소루비신 뿐만 아니라 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않은 또 다른 작용제를 사용하는 요법의 시작 전에, 그 동안, 그와 실질적으로 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 항신생물제 요법은 환자의 신생물성 상태 치료에 최적으로 적합하다고 여겨지는 임의의 요법을 포함한다. 여러 악성종양은 환자에 따라 달리 결정될 특이적 항종양 항체 및 특이적 항신생물제의 사용을 필요로 수 있다. 투여 경로는 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 길항제의 용량은 예를 들어 길항제의 유형, 치료할 종양의 유형 및 중증도 및 길항제의 투여 경로를 포함하는 수많은 요인에 따라 달라진다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정한 방법 또는 투여 경로로 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다.
본 발명의 항-CSF-1R 항체는 예방 또는 치료의 목적을 위해 포유동물에서 사용되는 경우에 바람직하게는 제약 조성물로 제제화된다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remenigton: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A., et al., eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 항암제, 항신생물제 또는 항혈관신생제 또는 검출가능한 신호-생성제와 함께 투여되거나 또는 이에 화학적으로 또는 생합성적으로 연결될 수 있다. 항체에 연결된 항종양제는 항체가 결합되는 신생맥관구조 또는 종양 또는 대식세포 또는 항체가 결합되는 세포의 환경을 파괴 또는 손상시키는 임의의 작용제를 포함한다. 본 발명은 수용체에 특이적으로 결합하고, 리간드-독소 내재화에 따라 독소를 전달하는 면역접합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 접합체로서 투여되는 항-CSF-1R 항체일 수 있다. 항체-작용제 접합체는 직접적으로 서로에게 또는 링커, 펩티드 또는 비-펩티드를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 항종양제 또는 항-대식세포 작용제는 독성 작용제, 예컨대 항신생물제 또는 방사성동위원소이다. 화학요법제를 포함하는 적합한 항신생물제는 당업자에게 공지되어 있고, 하기 논의된다. 본 발명은 추가로 검출가능한 신호-생성제가 항체에 접합되는 진단 시스템에서 단지 예를 들어 항신생물제, 다른 항체 또는 리포터, 예컨대 방사성표지된 동위원소를 포함하는 표적 또는 리포터 모이어티에 연결된 항-CSF-1R 항체를 고려한다.
본 발명에 따르면, 혈관신생을 억제하는 방법은 소정의 시간 동안 및 혈관신생을 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물에게 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 항체 및 항체 단편은 소정의 시간 동안 전이를 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물에게 본 발명의 항체를 함유하는 조성물을 투여함으로써 포유동물에서 종양 전이를 억제하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양 기질로의 대식세포 침윤을 억제하고, 종양 성장을 자극하는 방법은 소정의 시간 동안 및 종양 성장에 대한 대식세포의 효과를 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물에게 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 유사하게, 항체 및 항체 단편은 소정의 시간 동안 골 부식을 억제하는데 효과적인 양으로 포유동물에게 본 발명의 항체를 함유하는 조성물을 투여함으로써 포유동물에서 종양 전이 주위의 골 부식을 완화시키는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 또는 순환 종양 세포에서 암이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현되는 CSF-1R을 갖는 경우에 치료에 반응하는 암 환자의 바이오마커로서 CSF-1R 리간드 (CSF-1 또는 IL-34)를 사용하는 것을 고려한다. 본 발명은 추가로 혈청, 혈장, 종양 세포 또는 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플에서 혈중 CSF-1 수준을 측정함으로써 본 발명의 항체 또는 단편으로의 환자의 성공적인 치료를 예측하는 방법을 고려한다. 본 발명의 또 다른 측면은 (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 CSF-1의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) CSF-1 수준이 대조 집단에서 발견된 CSF-1 수준보다 높은 경우에 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다. 본 발명은 추가로 혈청, 혈장, 종양 세포 또는 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플에서 혈중 IL-34 수준을 측정함으로써 본 발명의 항체 또는 단편으로의 환자의 성공적인 치료를 예측하는 방법을 고려한다. 본 발명의 또 다른 측면은 (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 IL-34의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) IL-34 수준이 대조 집단에서 발견된 IL-34 수준보다 높은 경우에 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이다.
본 발명은 또한 (1) 암을 갖는 대상체의 샘플에서 CSF-1의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; (2) 암에 걸리지 않은 개체에서의 CSF-1의 수준과 비교하여 CSF-1의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법을 고려한다.
본 발명은 또한 (1) 암을 갖는 대상체의 샘플에서 IL-34의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; (2) 암에 걸리지 않은 개체에서의 IL-34의 수준과 비교하여 IL-34의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법을 고려한다.
본 발명은 또한 (1) 암을 갖는 대상체의 샘플에서 CSF-1 또는 IL-34 또는 둘 다의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; (2) 암에 걸리지 않은 개체에서의 CSF-1 또는 IL-34 또는 둘 다의 수준과 비교하여 CSF-1 또는 IL-34 또는 둘 다의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법을 고려한다.
CSF-1 또는 IL-34 수준은 상업적으로 입수가능한 키트 (CSF-1의 경우 알앤디 시스템즈(R&D Systems) 및 IL-34의 경우 USCN 라이프 사이언시즈, 인크.(USCN Life Sciences, Inc.))를 포함하여 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 한 이러한 기술에서, CSF-1 또는 IL-34 표준물 또는 샘플은 인간 CSF-1 또는 IL-34에 대한 항체로 미리 코팅된 플레이트에 첨가되어 항체에 대한 CSF-1 또는 IL-34의 결합을 허용한다. 미결합 CSF-1 또는 IL-34 및 다른 단백질을 세척한 후에, 각각 항-CSF-1 또는 IL-34 항체를 인식하는 2차 항체가 첨가된다. 2차 항체는 기질에 웰에 첨가되었을 때 청색빛 색을 방출하는 양고추냉이 퍼옥시다제에 커플링된다. 색의 강도는 플레이트에서 발견되는 CSF-1 또는 IL-34의 양과 관련된다.
CSF-1 및 IL-34가 건강한 인간 신체에서 자연적으로 발생하므로, CSF-1 및 IL-34 기준선은 대조 집단에서 결정될 필요가 있을 것이다. 대조 집단은 암성 상태 또는 감염의 징후를 갖는 것으로서 진단되지 않은 개체의 군을 포함할 수 있다. 따라서, 대조 집단은 건겅한 개체에 대해 정상이거나 또는 기준선인 CSF-1 및 IL-34 수준의 범위를 확립할 것이다. 예를 들어, CSF-1 수준은 대조군의 혈청에서보다 각각 유방암 또는 결장직장암 환자 혈청에서 68% 또는 77% 더 높다 (문헌 [Lawicki et al., Clin. Chim. Acta 317: 112-116 (2006); Mroczho et al., Clin. Chim. Acta 380: 208-212 (2007)]). 본 발명의 한 측면에서, CSF-1R 리간드 수준은 대조 집단으로부터 샘플에서보다 암 환자 샘플에서 적어도 50% 더 높다. 대조 집단에서 CSF-1 및/또는 IL-34 수준의 범위는 환자의 CSF-1 및/또는 IL-34 수준이 대조 집단의 기준선 범위보다 높은지 결정하기 위해 환자의 샘플 또는 샘플들로부터 확인된 CSF-1 및/또는 IL-34 수준과 비교될 것이다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 암 세포가 리간드 분비성인 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 암 세포가 CSF-1 분비성인 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 암 세포가 IL-34 분비성인 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 인간 항-CSF-1R 항체를 포함하는, 종양 성장 및/또는 혈관신생을 억제하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 항체 또는 그의 단편, 및 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 또는 독소루비신을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 항암제, 항신생물제 또는 치료를 유도하는 추가의 작용제를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 키트는 예를 들어 하기 논의되는 종양형성 또는 혈관신생에 관련된 또 다른 성장 인자 수용체의 임의의 적합한 길항제를 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 아주반트를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 수용체 항체는 조사, 진단, 예방 또는 치료 방법을 위해 생체내 및 시험관내 사용될 수 있고, 이는 당업계에 주지되어 있다. 당업자는 본원에 개시된 발명의 원리에 변동을 가할 수 있고, 이러한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
당업자는 본원에 개시된 발명의 원리에 변동을 가할 수 있고, 이러한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것을 이해하고 예상해야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 이러한 실시예가 본 발명의 광범위한 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 벡터 및 플라스미드의 구축, 이러한 벡터 및 플라스미드로의 폴리펩티드 코딩 유전자 삽입, 숙주 세포로의 플라스미드 도입, 및 상기 유전자 및 유전자 산물의 발현 및 그의 결정에 이용되는 것과 같은 통상적인 방법에 대한 상세한 설명은 수많은 간행물, 예를 들어 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 및 Coligan, J. et al. Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated (2007)]에서 찾아볼 수 있다.
인간 항-CSF-1R 항체의 발현 및 정제
각각의 항체에 대해, PCR 클로닝과 같은 적합한 방법에 의해 적합한 중쇄 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 항체 1에 대한 서열 13을 적합한 발현 플라스미드, 예를 들어 pGSHC 내로 조작하고, 적합한 경쇄 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 항체 1에 대한 서열 14를 적합한 발현 플라스미드, 예컨대 pGSLC 내로 조작하였다. 안정한 세포주를 확립하기 위해서, 적합한 숙주 세포주, 예컨대 NSO 또는 CHO 세포를 선형 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 전기천공에 의해 공동-형질감염시키고, 적합한 배지, 예컨대 투석된 소 태아 혈청 및 글루타민 신테타제 보충물을 함유하는, 글루타민-무함유 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 중에서 배양하였다. 클론을 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 항체 발현에 대해 스크리닝하고, 스피너 플라스크에서의 배양에 가장 우수한 생성주를 선택하였다. 항체를 적합한 방법, 예컨대 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
표 1은 본 발명의 항체 1의 다양한 CDR의 아미노산 서열 및 서열 번호를 제공한다. 모든 CDR 서열은 카바트 관례를 이용하여 결정된다. 표 2는 본 발명과 관련된 다양한 서열의 서열 번호를 제공한다. 하기 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리핵산 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 결합 검정
CSF-1R 결합 검정을 위해, 96-웰 플레이트를 가용성 재조합 인간-CSF-1R-Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈) (1 μg/mL x 100 μL)로 코팅하고, 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 0.2% 트윈-20?을 함유하는 PBS (포스페이트 완충 염수) (PBS/T)로 3회 세척한 후에, 웰을 1시간 동안 실온 (20-25℃) (RT)에서 3% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS로 차단시켰다. BSA-PBS 혼합물을 흡인하고, 플레이트를 PBS/T로 3회 세척하였다. 항체 1 또는 대조군 IgG의 일련의 희석액을 만들고 (3 μg/mL에서 시작 및 3배 희석), 100 μL를 웰에 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 웰을 PBS/T로 3회 세척하였다. 세척 후에, 플레이트를 PBS 중 항-인간 F(ab')2 단편 특이적-HRP 접합체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)) (1:5000 희석액) 100 μL와 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/T로 5회 세척한 후에 TMB 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (KPL)의 1:1 제조물 100 μL와 RT에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 0.1 M H2SO4를 첨가하여 비색 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 데이터를 수집하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어로 흡광도 데이터를 분석하여 ED50을 계산하였다. ED50 또는 절반 최대 유효 용량은 50% 최대 결합을 달성하기 위해 필요한 용량이다.
인간 CSF-1R에 대한 항체 1의 ED50은 8.7x10-11M (0.09 nM으로 기록됨)이다. 항체 1은 CSF-1R에 대한 강한 결합을 나타낸다.
효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 차단 검정
항체가 CSF-1/CSF-1R 상호작용을 차단한다는 것을 보여주기 위한 ELISA
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 (0.5 μg/mL x 100 μL) CSF-1 (알앤디 시스템즈)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 PBS/T로 3회 세척한 후에, 100 μL 3% BSA/PBS로 1시간 동안 RT에서 차단시켰다. 다시 PBS/T로 3회 세척하였다. 가용성 인간 rh-CSF-1R-Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)을 PBS에서 0.250 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 동시에, 항체 1을 PBS에서 200 nM의 최종 농도로 희석하였다. 항체 1을 초기 200 nM으로부터 3x10-12 M까지 아래로 1:3 증분으로 연속적으로 희석하였다. 100 μL의 rh-CSF-1R-Fc를 100 μL의 항체 1의 각 희석액과 30분 동안 RT에서 합하였다. 100 μL의 항체 1:CSF-1R-Fc 혼합물을 CSF-1-코팅된 웰 중에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. RT에서의 1시간의 인큐베이션 후에, PBS/T로 3회 세척하고, 항-인간 IgG-Fc-HRP 접합된 항체의 1:5000 희석액을 플레이트에 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 플레이트를 PBS/T로 5회 세척한 후에, TMB 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (KPL)의 1:1 제조물 100 μL와 15분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 100 μL의 0.1 M H2SO4를 첨가하여 비색 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 설정된 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 데이터를 수집하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어로 흡광도 데이터를 분석하여 IC50을 계산하였다. IC50 또는 절반 최대 억제 농도는 수용체에 대한 리간드 결합의 50% 억제를 유발하는 항체의 농도이다.
인간 CSF-1R에 대한 항체 1 결합의 IC50은 8.1x10-10 M (0.81 nM으로 기록됨)이다. 항체 1은 CSF-1R에 대한 CSF-1 결합을 억제하여, CSF-1 리간드에 의한 CSF-1R 활성화를 방지한다.
항체가 IL-34/CSF-1R 상호작용을 차단한다는 것을 보여주기 위한 ELISA
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 (0.5 μg/mL x 100 μL) IL-34 (알앤디 시스템즈)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 PBS/T로 3회 세척한 후에, 100 μL 3% BSA/PBS로 1시간 동안 RT에서 차단시켰다. 다시 PBS/T로 3회 세척하였다. 가용성 인간 rh-CSF-1R-Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)을 PBS에서 0.250 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 동시에, 항체 1을 PBS에서 200 nM의 최종 농도로 희석하였다. 항체 1을 초기 200 nM으로부터 3x10-12 M까지 아래로 1:3 증분으로 연속적으로 희석하였다. 100 μL의 rh-CSF-1R-Fc를 100 μL의 항체 1의 각 희석액과 30분 동안 RT에서 합하였다. 100 μL의 항체 1-CSF-1R-Fc 혼합물을 IL-34-코팅된 웰에서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. RT에서의 1시간의 인큐베이션 후에, PBS/T로 3회 세척하고, 항-인간 IgG-Fc-HRP 접합된 항체의 1:5000 희석액을 플레이트에 1시간 동안 RT에서 첨가하였다. 플레이트를 PBS/T로 5회 세척한 후에, TMB 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (KPL)의 1:1 제조물 100 μL와 15분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 100 μL의 0.1 M H2SO4를 첨가하여 비색 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 설정된 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 데이터를 수집하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어로 흡광도 데이터를 분석하여 IC50을 계산하였다. IC50 또는 절반 최대 억제 농도는 수용체에 대한 리간드 결합의 50% 억제를 유발하는 항체의 농도이다.
인간 CSF-1R에 대한 항체 1 결합의 IC50은 7.0x10-10M (0.71 nM으로 기록됨)이다. 항체 1은 CSF-1R에 대한 IL-34 결합을 억제하여, IL-34 리간드에 의한 CSF-1R 활성화를 방지한다.
표면 플라즈몬 공명/비아코어(Biacore)? 분석에 의한 결합 동역학 분석
CSF-1R-Fc에 대한 항체 1의 결합 동역학을 25℃에서 비아코어? 2000 SPR 바이오센서(Biosensor) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에서 측정하였다. 가용성 CSF-1R-Fc 융합 단백질 (10 μg/mL의 농도 및 pH 5) (395 내지 1200 반응 단위 범위)을 CM5 칩 상에 표준 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 고정시켰다. HBS-EP (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 mM NaCl, 및 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)를 결합 친화도 측정 동안 러닝 완충제로 사용하였다. 용액 중 항체를 CM5 센서 칩의 준비된 표면 상에서 1.5-100 nM 범위의 농도로 주사하여 상호작용 분석을 수행하였다. 항체를 결합을 위해 3분에 걸쳐 주사하고, 15분 동안 해리시켰다. 20 mM HCL의 10 μL/분 주사에 의해 고정된 단백질의 재생을 수행하였다. BIA평가 버전 4.1 소프트웨어를 사용하여, 데이터의 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 대한 동시 글로벌 핏팅에 의해 복합체 형성의 Ka (kon) 및 Kd (koff)를 결정하였다. 1/KD (몰 (1/M)로 측정됨)의 비로부터 평형 회합 상수 (KA)를 계산하였다. 속도 상수 Kd/Ka (몰 (M)로 측정됨)의 비로부터 평형 해리 상수 (KD)를 계산하였다.
인간 CSF-1R을 갖는 항체 1에 대한 다중 비아코어? 분석에 대한 평균 Ka, Kd 및 KD 값을 표 3에 요약하였다.
Figure pct00003
항체 1은 CSF-1R에 높은 결합 친화도를 나타낸다.
웨스턴 블롯에 의해 검출된 CSF-1R의 인산화
CSF-1R 세포로 안정하게 형질감염된 NIH3T3 세포를 5x105개 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에서 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 mg/mL 게네티신을 함유하는 1 mL 웰의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중에 5시간 동안 시딩하였다. 단일층을 PBS에서 2회 세척하고, 0.9 mL/웰 DMEM 중에서 1% FBS와 밤새 배양하였다. DMEM 중 항체 1의 일련의 희석액을 만들고 (1 μg/mL에서 시작 및 3-배 희석), 100 μL를 웰에 2시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 세포를 100 ng/mL CSF-1 또는 IL-34 리간드로 10분 동안 자극한 후에, 얼음 상에 놓고, 빙냉 PBS로 세척하였다. 세포를 100 μL의 얼음 상의 50 mM Hepes (pH 7.5 150 mM NaCl, 0.5% 트리톤X-100, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaPPi, 50 mM NaF) 및 프로테아제 억제제의 정제 (로슈(Roche))에서 10분 동안 용해시켰다. 용해된 세포를 원심분리에 의해 4℃에서 정화하였다. 20 μL 용해물을 변성 전기영동 겔 상에 로딩하고, 니트로셀룰로스 막 상에 블롯팅하였다. 블롯 상에서 티로신-인산화 CSF-1R을 1 μg/mL의 항-포스포CSF-1R 항체 (셀 시그널링(Cell Signaling))의 사용에 의해 검출하였다. 블롯을 항-포스포-MAPK (1:500 희석) 또는 항-포스포-Akt (1:1000) (셀 시그널링)로 프로빙하여 CSF-1R 신호전달을 결정하였다. 레인의 동일한 로딩을 보장하기 위해, 프로브를 항-CSF-1R 항체 (1 μg/mL; 알앤디 시스템즈) 또는 항-액틴 항체 (1:2000; 시그마(Sigma))로 블롯팅하였다. 모든 1차 항체를 흔들면서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션한 후에, HRP와 접합된 상응하는 2차 항체를 또한 흔들면서 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 밴드를 화학발광 시약 (지이 헬쓰케어)으로 시각화하였다.
CSF-1R로 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포는 CSF-1 또는 IL-34로 자극시켰을 때 CSF-1R의 빠른 인산화를 나타내었다. 항체 1의 존재는 심지어 항체의 수준이 1 nM일 때에도 CSF-1R 인산화를 억제하였으며, 이는 CSF-1R에 대한 항체 1의 결합이 CSF-1 또는 IL-34에 의한 수용체의 활성화를 방지한다는 것을 나타낸다. CSF-1R 인산화의 억제는 또한 CSF-1 또는 IL-34 경로에 의해 사용되는 신호전달 분자의 인산화의 감소로 이어졌다. CSF1-R의 하류에 있는 Akt 및 MAPK는 둘 다 세포를 100 nM 내지 1 nM의 항체 1과 인큐베이션하였을 때 인산화를 감소시켰다. 따라서, 항체 1은 CSF-1R 활성화 및 CSF-1R 자극 이후의 키나제 캐스케이드의 활성화를 방지한다. 레인 사이에 액틴 및 CSF-1R의 단백질 수준은 차이가 없었으며, 이는 블롯을 이들 분자에 대한 항체로 프로빙하였을 때 각 레인에서의 동일한 화학발광 신호로 증명된다. 따라서, CSF-1R 인산화의 억제는 단백질 샘플이 불균일하게 로딩되는 기술적 어려움 때문이 아니라 실제로 감소된 신호전달을 나타내는 것이다.
내재화 및 분해 검정
항체 1은 CSF-1R 수용체의 내재화를 유도함
NIH-3T3-CSF-1R 세포를 8-웰 챔버 슬라이드 (눈크(Nunc))에 플레이팅하고, 37℃에서 세포가 웰의 표면적의 50%를 덮을 때까지 인큐베이션하였다. 슬라이드를 4℃로 냉각시킨 후에 물:얼음 슬러리 혼합물 중에서 실험을 시작하였다. 세포를 5 μg/mL 항체 1과 인큐베이션하고, 즉시 37℃로 15분 내지 4시간 동안 옮겨 내재화가 일어나도록 하였다. 별도의 세트의 슬라이드를 물:얼음 슬러리 혼합물 중에서 15분 내지 4시간 동안 대조군으로서의 5 μg/mL 항체 1과 계속 인큐베이션하였다. 4℃ 인큐베이션은 CSF-1 수용체의 내재화를 방지하며, 따라서 세포 내에서 나타난 임의의 신호는 인공물이다. 인큐베이션 후에, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 이어서 세포를 빙냉 1% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시켰다. 차가운 PBS로 3회 세척한 후에, 세포를 0.5% 사포닌 및 1% BSA를 함유하는 PBS 중에 5분 동안 투과시키고, 이어서 다시 1% BSA를 함유하는 PBS에서 세척하였다. 염소 Cy3 항-인간 IgG (1:5000 희석액)로 1시간 동안 표지하여 항체 1을 형광 표지하였다. 마지막으로 PBS로 3회 세척을 수행한 후에 겔마운트(GelMount) (바이오메다(Biomeda))에 마운팅하고, 슬라이드를 커버글라스로 덮었다. 형광 표지된 항체 1은 현미경으로 시각화되어 상기 기재된 다양한 조건 하에 세포 위치를 결정할 수 있다.
현미경 검사시에, 항체 1은 실험을 시작하기 전에 4℃에서 세포의 주변부 상에서 관찰되었다. 세포를 37℃로 스위칭하여 항체 1/CSF-1R 복합체의 빠른 내재화를 허용하였으며, 이는 일반적으로 15분 내에 관찰된다. 항체 1과의 1 또는 2시간의 인큐베이션 후에, 모든 항체/CSF-1R 복합체는 원형질 막 상에서는 매우 적게 시각화되면서 핵주변에 있었고, 이는 CSF-1R에 대한 항체 1의 결합이 수용체의 빠른 내재화 및 세포 내부에서의 잔류를 유도한다는 것을 나타낸다. 4℃에서 2시간까지 동안 유지시킨 세포는 항체 1의 내재화 없이 오직 세포의 주변부 염색을 나타내었다. 따라서, 항체/CSF-1R의 내재화는 세포에 항체를 첨가하고 15분 내에 일어나는 ATP-의존성 과정이다.
항체 1은 CSF-1R 수용체의 분해를 유도함
NIH-3T3-CSF-1R 세포를 5x105개 세포/웰로 12웰 플레이트에서 10% FBS 및 1 mg/mL 게니티신을 함유하는 1 mL DMEM 배지 중에 시딩하였다. 세포를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후에, 100 ng/mL CSF-1 또는 15 μg/mL 항체 1을 플레이트에 첨가하였다. CSF-1은 CSF-1R의 내재화 및 분해를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이에 의해 실험에서 양성 대조군으로 작용한다. CSF-1을 세포 상에 1 및 5시간 동안 놓아 둔 후에 세포를 수집하였다. 다른 웰에서, 24 및 48시간 동안 항체 1과 인큐베이션한 후에 세포를 수집하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 용해시키고, 정화된 용해물을 겔 상에 러닝시켰다 (상기 기재된 바와 같음). 전달된 단백질을 항-CSF-1R 항체로 프로빙하여 각 조건에 대한 수용체의 양을 결정하였다. 동일한 블롯을 항-액틴 항체로 프로빙하여 단백질 수준을 정규화하였다. CSF-1R 및 액틴 수준을 멀티-게이지(Multi-Gauge) 프로그램을 이용하여 정량화하여 웨스턴 블롯 상에서의 밴드 밀도를 측정하였다. 상대적 총 CSF-1R 단백질 수준은 총 CSF-1R 밴드 밀도를 상응하는 액틴 밴드 밀도로 나누어 나타내었다.
NIH-3T3-CSF-1R 세포와의 CSF-1 인큐베이션은 처리 1시간 내에 CSF-1R의 분해로 이어지고, CSF-1R 수준은 5시간만에 반감된다. 항체 1과 인큐베이션하였을 때 CSF-1R의 분해는 명백하지 않았으나, 항체 1은 CSF-1R 수준을 1/4로 감소시켰다. 48시간 후에, 분해 수준은 동일하게 유지되었고, 이는 분해 속도가 일정하게 유지된다는 것을 나타낸다. 따라서, CSF-1R에 대한 항체 1 결합은 세포에서 수용체의 분해로 이어진다.
항체 1에 의한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)
항체 1은 CSF-1R에 대한 CSF-1 결합의 억제 및 CSF-1R의 내재화 및 분해의 유도 이외에, 또한 ADCC 반응을 일으킴으로써 CSF-1R을 억제한다.
NKM-1 인간 백혈병 세포를 2x105개 세포/mL로 96 웰 플레이트에서 10% 울트라-로우(Ultra-Low) IgG FBS 및 3 ng/mL의 인간 IL-2를 함유하는 25 μL RPMI 배지 중에 시딩하였다. IgG1 또는 IgG2 백본 중에서 1 μg/mL 항체 1의 1:3 일련의 희석액을 만들고, 25 μL/웰을 첨가하였다. 15분 인큐베이션 후에, 25 μL의 3x106개 세포/mL 인간 NK 세포 (론자(Lonza))를 시딩하고, 추가의 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 아셀라-톡스(aCella-TOX) 키트 (셀 테크놀로지(Cell Technology))로부터 10 μL의 용해 완충제를 첨가하고, 15분 동안 RT가 되도록 하였다. 125 μL의 낮은 IgG FBS를 첨가하고, 플레이트를 1분 동안 750 xg에서 원심분리하였다. 옵티플레이트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에서, 아셀라-톡스 키트로부터 50 μL 효소 검정 희석제를 첨가하고, 50 μL의 세포 상청액을 옵티플레이트에 조심스럽게 옮겼다. 키트 설명서에 따라 효소 검정 시약 및 검출 시약을 준비하고, 옵티플레이트에 100 μL 효소 검정 시약을 첨가한 후에 바로 50 μL의 검출 시약을 첨가하였다. 시약을 첨가하고 20분 후에 플레이트를 발광측정기에서 판독하였다.
ADCC 활성을 항체 1 농도가 1 μg/mL에 도달하였을 때 사멸된 NKM-1 세포의 9%로 항체 1 용량-의존성 방식으로 증가시켰다. 대조적으로, 항체 1이 IgG2 백본에 클로닝되었을 때 증가하는 양의 항체 1로 ADCC 활성이 변화되지 않았다. 따라서, 항체 1, IgG1 분자는 결합하는 세포의 ADCC를 유도한다.
에피토프 맵핑
이전의 간행물은 CSF-1이 CSF-1R의 처음 3개의 Ig 도메인에 결합하는 것으로 결정하였다. 문헌 [Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 5348 (1993)]. 항체 1은 CSF-1R에 결합하고, 인간 CSF-1R에 대한 CSF-1 결합을 억제하며, 이에 따라 이는 CSF-1R의 처음 3개의 Ig 도메인 상에 또는 그 근처에 결합해야 한다. 에피토프 항체 1이 CSF-1R 분자 상에 결합하는지 결정하기 위해, 마우스 및 인간의 처음 3개의 Ig 도메인을 교환하였다 (표 4 참조). 항체 1은 마우스 CSF-1R을 인식하지 않았고, 이에 따라 마우스 Ig 도메인이 인간 CSF-1R의 중요한 결합 영역에 삽입된다면, 항체의 결합은 일어나지 않을 것이다.
처음 3개의 Ig 도메인의 변형을 세포외 도메인의 나머지 2개의 가장 C-말단의 Ig 도메인을 함유하는 인간 CSF-1R 백본에 삽입하였다. 이들 구축물을 단백질 생성의 용이함 및 분자의 안정성을 위해 IgG 분자의 Fc 부분에 융합시켰다.
Figure pct00004
따라서, 키메라 1은 마우스 Ig 도메인 1, 인간 Ig 도메인 2 및 인간 Ig 도메인 3 (m,h,h), 인간 Ig 도메인 4 및 5 (Fc 태그에 융합됨)를 함유한다. 키메라 2 내지 키메라 7은 다음과 같다: m,m,h (키메라 2), m,m,m (키메라 3), h,m,h (키메라 4), h,m,m (키메라 5), h,h,m (키메라 6) 및 m,h,m (키메라 7) (인간 CSF-1R의 마지막 2개의 Ig 도메인에 이어 Fc 태그에 융합됨).
키메라 CSF-1R 단백질에 대한 항체 1 결합을 상기 기재된 바와 같이 결합 ELISA 및 비아코어?에 의해 결정하였다. 간략하게, 플레이트를 100 μL의 200 ng/mL 인간, 마우스 또는 키메라 1-7 단백질로 밤새 코팅하였다. 플레이트의 세척 및 차단 후에, 항체 1을 반복하여 100 nM 농도로 첨가하였다. HRP에 접합된 항-인간 Fab 2차 항체를 1:10,000의 농도로 첨가하여 CSF-1R 분자에 대한 항체 1 결합을 검출하였다.
예상한 바와 같이, 항체 1은 ELISA 결합 검정에서 인간 CSF-1R에 결합하나 마우스 CSF-1R에 결합하지 않았다. 항체 1은 제1 또는 제2 인간 Ig 도메인을 함유하는 키메라에 약하게 결합하였으나, 제1 또는 제2 마우스 Ig 도메인을 함유하는 것에는 그렇지 않았다. 항체 1은 인간 CSF-1R의 제1 및 제2 Ig 도메인을 둘 다 함유하는 키메라에 강하게 결합하였다. 다른 모든 구축물은 항체 1에 결합하지 않았다. 따라서, 항체 1은 Ig 도메인 1 및 2에 결합하나, 결합 검정에서 평가하였을 때 인간 CSF-1R에 대한 강한 항체 결합을 위해 상기 도메인 둘 다가 필요하다. 비아코어? 데이터는 ELISA 데이터를 요약한다. 인간 제2 Ig 도메인을 함유하지 않는 임의의 키메라 구축물은 심지어 항체 수준이 1 μM일 때에도 항체 1에 결합하지 않았으며, 이는 제2 Ig 도메인이 항체 1 결합에 필요하다는 것을 나타낸다. 항체 1 결합은 또한 제1 Ig 도메인이 또한 인간 기원일 때 추가로 증진되었다. 따라서, 항체 1은 주로 CSF-1R의 제2 Ig 도메인에 결합하지만, 제1 Ig 도메인이 일부 유익한 접촉을 갖는다.
분화 및 증식 검정
CSF-1에 의한 대식세포 분화
단핵구 (론자)를 4x105개 세포/mL의 밀도로 8-챔버 슬라이드의 각각의 챔버에서 10% FBS 및 100 ng/mL hCSF-1을 함유하는 900 μL 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) (RPMI) 1640 배지 중에 시딩하였다. RPMI 중에서 항체 1의 일련의 희석액을 만들고 (1 μg/mL에서 시작 및 3-배 희석), 100 μL를 웰에 첨가하였다. 단핵구가 플레이트에 부착되어 신장하는 것으로 명백하게 나타날 때까지 (대식세포 분화의 특성임) 3일마다 배지를 바꾸면서 37℃에서 인큐베이션하였다.
CSF-1의 존재 하에 2 nM 이상의 농도의 항체 1로 처리된 단핵구는 대식세포로의 분화에 실패하였고, 이들의 단핵구의 원형 형태 특성을 유지하였다. 단핵구의 대식세포 분화로의 CSF-1 유도는 항체 1에 의해 0.25 nM의 IC50으로 억제될 수 있다. 또한, 처리 동안 다수가 사멸하였고, CSF-1로의 계속적인 자극없이 생존할 수 없었다.
IL-34에 의한 대식세포 분화
단핵구 (론자)를 4x105개 세포/mL의 밀도로 8-챔버 슬라이드의 각각의 챔버에서 10% FBS 및 100 ng/mL hIL-34를 함유하는 900 μL 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 1640 배지 중에 시딩하였다. RPMI 중에서 항체 1의 일련의 희석액을 만들고 (1 μg/mL에서 시작 및 3-배 희석), 100 μL를 웰에 첨가하였다. 단핵구가 플레이트에 부착되어 신장하는 것으로 명백하게 나타날 때까지 (대식세포 분화의 특성임) 3일마다 배지를 바꾸면서 37℃에서 인큐베이션하였다.
IL-34의 존재 하에 2 nM 이상의 농도의 항체 1로 처리된 단핵구는 대식세포로의 분화에 실패하였고, 이들의 단핵구의 원형 형태 특성을 유지하였다. 단핵구의 대식세포 분화로의 IL-34 유도는 항체 1에 의해 0.3 nM의 IC50으로 억제될 수 있다. 또한, 처리 동안 다수가 사멸하였고, CSF-1로의 계속적인 자극없이 생존할 수 없었다.
CSF-1에 의한 단핵구 증식
단핵구 (론자)를 3000개 세포/웰의 밀도로 10% FBS 및 100 ng/mL CSF-1을 함유하는 RPMI 1640 배지의 존재 하에 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 배지를 교체하고, 20 nM으로부터 0.01 nM으로 연속적으로 희석된 항체 1 (1:3배 희석액)을 첨가하였다. 3일 후에 배지를 10% FBS, 100 ng/mL CSF-1 및 항체를 함유하는 새로운 배지로 교체하고, 세포를 추가의 5일 동안 성장시켰다. 100 μL의 셀타이터 글로(CellTiter Glo) 발광 완충제 및 기질 (프로메가(Promega))의 첨가 시에, 세포를 10분 동안 진탕시키고, 생존력의 인디케이터로서 발광을 판독하였다.
단핵구 성장의 50%를 억제하는 항체 1의 IC50은 1.4x10-10M (0.1 nM으로 기록됨)이다. 항체 1의 존재 하에 단핵구 성장의 CSF-1 유도에 대한 IC50은 항체 1이 배양물에서 단핵구의 증식을 억제한다는 것을 나타낸다.
IL-34에 의한 단핵구 증식
단핵구 (론자)를 3000개 세포/웰의 밀도로 10% FBS 및 100 ng/mL IL-34를 함유하는 RPMI 1640 배지의 존재 하에 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 배지를 교체하고, 20 nM으로부터 0.01 nM으로 연속적으로 희석된 항체 1 (1:3배 희석액)을 첨가하였다. 3일 후에 배지를 10% FBS, 100 ng/mL IL-34 및 항체를 함유하는 새로운 배지로 교체하고, 세포를 추가의 5일 동안 성장시켰다. 100 μL의 셀타이터 글로 발광 완충제 및 기질 (프로메가)의 첨가 시에, 세포를 10분 동안 진탕시키고, 생존력의 인디케이터로서 발광을 판독하였다.
단핵구 성장의 50%를 억제하는 항체 1의 IC50은 0.5 nM이다. 항체 1의 존재 하에 단핵구 성장의 IL-34 유도에 대한 IC50은 항체 1이 배양물에서 단핵구의 증식을 억제한다는 것을 나타낸다.
CSF-1을 갖는 종양 세포주에 대한 증식 검정
NKM-1 백혈병 세포를 1x104개 세포/mL로 96 웰 플레이트에서 1% FBS를 함유하는 100 μL RPMI 1640 배지 중에 밤새 시딩하였다. 1% FBS 및 20 nM으로부터 0.01 nM으로 연속적으로 희석된 항체 1 (1:3배 희석액)을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 세포에 20 ng/mL의 CSF-1을 첨가하였다. 추가의 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 100 μL의 셀타이터 글로 발광 완충제 및 기질 (프로메가)의 첨가 시에, 세포를 10분 동안 진탕시킨 후에 발광 (생존력의 인디케이터로서)을 판독하였다.
항체 1의 존재 하에 NKM-1 성장에 대한 IC50은 7.6x10-11 M (0.07 nM으로 기록됨)이다. 이는 항체 1이 배양물에서 NKM-1 세포의 증식을 억제한다는 것을 나타낸다.
CSF-1R이 종양의 표면 상에서 발현되는 생체내 종양 모델
항체 1로 처리된 NKM-1 인간 백혈병-보유 마우스의 생존 연장
Nu/nu 마우스에게 거의 치사량에 가깝게 200 rad/마우스로 24시간 방사선 조사한 후에 2.5x106개 NKM-1 백혈병 세포를 정맥내 주사하였다. 추가의 24시간 후에, 마우스를 매주 2회 60 mg/kg 인간 IgG, 60 mg/kg, 20 mg/kg 또는 5 mg/kg 항체 1을 투여하는 4개의 군으로 무작위로 분류하였다. 마우스의 생존을 매일 모니터링하였다. 로그 랭크 맨틀 콕스(Mantel Cox) 시험에 의해 P 값을 결정하였다.
Figure pct00005
종양 부피를 식: 부피 = [(Pi/6) l x w2] (여기서, Pi는 3.14이고, w는 너비를 나타내고, l은 길이를 나타냄)에 의해 계산하였다. 대조군의 퍼센트 또는 %T/C = 100* (처리 부피) / (대조 부피). p-값이 0.05 이하이면 통계적 유의성이 있는 것으로 한다.
항체 1은 표 5에 나타난 바와 같이 NKM-1 백혈병 세포를 보유하는 마우스의 생존을 증가시킨다.
CSF-1R이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현되는 생체내 종양 모델
항-CSF-1R 항체 1은 CSF-1R의 인간 형태는 인식하지만 수용체의 뮤린 형태는 인식하지 않는 완전 인간 항체이다. 따라서, 항-마우스 항체가 CSF-1R이 대식세포 상에서 발현되는 생체내 연구에서 개념의 증거 이행에 필요하다. 이들 연구는 마우스 이종이식 모델에서 인간 종양의 성장에 대한 마우스 대식세포의 역할을 다룬다. 항-마우스 항체는 마우스 대식세포에 영향을 미치나 종양에는 영향을 미치지 않을 것이며, 이는 종양 성장에 대한 기질 대식세포의 효과를 계측하는 능력을 허용한다. 하기 실험은 항체 2, 래트-항-마우스 CSF-1R 항체로 수행하였다.
인간 자궁내막 암종의 AN3CA 이종이식 모델에서의 항-마우스 CSF-1R mAb의 효능
Nu/nu 마우스 (암컷, 7-8주령)의 왼쪽 옆구리에 5x106개 AN3CA 세포/마우스를 피하 주사하였다. 종양이 대략 200 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 12마리 마우스/처리 군으로 무작위로 분류하였다.
항체 2 및 래트 IgG를 염수 중에서 6 mg/mL의 농도로 준비하고, 40 mg/kg으로 1주일에 3회 피하 투여하였다. 제15일에 종양 부피를 기록하고, %T/C를 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다. 항체 2로의 처리군 대 래트 IgG 대조군에 대해 66%의 T/C%가 계산되었다. 이들 결과는 항체 2로 처리된 동물에서 유의한 종양 억제를 보여준다 (p=0.045).
인간 유방 암종의 HCC1954 이종이식 모델에서의 항-마우스 CSF-1R mAb의 효능
Nu/nu (암컷, 7-8주; 찰스 리버 래보러토리(Charles River Laboratories)) 마우스에게 1x107개 HCC1954 세포/마우스를 피하 주사하였다. 종양의 크기가 300 mm3에 도달하였을 때, 각 처리군에 12마리의 동물을 할당하면서 마우스를 종양 크기에 의해 무작위로 분류하였다. 래트 IgG 및 항체 2를 염수 중에서 6 mg/mL의 농도로 준비하고, 1주일에 3회 피하 투여하였다. 래트 IgG를 동물에게 40 mg/kg으로 투여하고, 항체 2를 동물에게 각 주사 시에 40 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여하였다. 종양 측정값을 매주 2회 기록하고, 제1 주사 37일 후에 T/C%를 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
표 6에 나타난 바와 같이, 제37일에 상대적 종양 부피 대 염수 대조군의 비로서 10 mg/kg을 투여한 처리군의 경우 77%의 T/C% 및 40 mg/kg을 투여한 처리군의 경우 56%의 T/C%가 계산되었다. 결과는 40 mg/kg 항체 2로 처리된 동물에서 유의한 종양 억제를 보여준다 (p=0.0014).
DU145 인간 전립선 이종이식 모델에서의 항-마우스 CSF-1R mAb의 항종양 효과
Nu/nu 마우스 (수컷, 7-8주령)의 왼쪽 옆구리에 15x106개 DU145 세포/마우스를 피하 주사하였다. 종양이 대략 250 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 12마리 마우스/처리 군으로 무작위로 분류하였다.
항체 2 및 래트 IgG를 염수 중에서 6 mg/mL의 농도로 준비하고, 40 및 10 mg/kg으로 1주일에 3회 피하 투여하였다. 제21일에 종양 부피를 기록하고, 10 mg/kg 및 40 mg/kg에 대해 % T/C를 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
표 6에 나타난 바와 같이, 각각 처리군 10 mg/kg 및 40 mg/kg 대 래트 IgG 대조군에서 50 및 43의 T/C%가 계산되었다. 이들 결과는 항체 2로 처리된 동물에서 유의한 종양 억제를 보여준다 (두 농도에 대해 p=<0.0001).
Figure pct00006
항-마우스 CSF-1R mAb로 처리된 HCC1954 유방 및 DU145 전립선 종양에서의 대식세포 침윤의 감소
상기 기재된 HCC1954 (유방) 및 DU145 (전립선) 동물 연구에서 동물로부터 종양을 제거하였다. 종양을 최장축을 따라 절단하고, 10% 포르말린 중에서 흔들면서 밤새 4℃에 두었다. 24시간 후에, PBS에서 20분에 걸쳐 2회 세척한 후에, 종양이 100% 에탄올 중에 있을 때까지 점차적으로 더 높은 농도의 에탄올 용액을 첨가하였다. 100% 크실렌 중에서 여러 번 인큐베이션하여 에탄올을 크실렌으로 교체하고, 종양을 파라핀에 포매시켰다. 파라핀 블록을 4 μm에서 절단하고, 유리 슬라이드 상에 놓았다. 크실렌에 이어 증가하는 농도의 에탄올 중 물에서의 점진적인 인큐베이션에 의해 조직을 탈파라핀화 및 재수화시켰다. 종양 슬라이드를 표적 복구 용액 (다코(Dako)) 중에서 3분 동안 마이크로웨이브로 가열한 후에 내인성 퍼옥시다제를 3% H2O2로 10분 동안 RT에서 차단시켰다. 비-특이적 단백질 결합을 단백질 블록 (다코)으로 10분 동안 차단시킨 후에 비오틴에 접합된 래트 항-마우스 대식세포-특이적 항체, F4/80 (2 μg/mL; 세로텍(Serotec))을 첨가하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. HRP-스트렙타비딘 (1:1000 희석액; 잭슨 이뮤노리서치) 중에서 45분 동안 RT에서 인큐베이션하고, 3회 세척하였다. 키트 설명서에 따라 DAB (다코) 중에서 발색시키고, 물에서 2회 세척하면서 반응을 중지시켰다. 간략하게 메이어(Mayer) 헤마톡실린으로 대비염색하고 (10분; 다코), 이어서 물로 세척하고, 산 알코올에 침지시키고, 물로 2차 세척하고, 암모니아수를 사용하여 블루잉시켰다. 탈수화시키고, 세정하고, 영구 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 덮었다. 각 처리군에 대해 3마리의 동물로부터의 5개의 영상을 분석하였다. 이미지프로(ImagePro) 소프트웨어를 사용하여, 각 처리군에 대해 대식세포의 수/면적을 결정하였다.
Figure pct00007
표 7에 나타난 바와 같이, 대식세포 수는 종양 모델 둘 다에서, 특히 주변부를 따라 감소하였다. 따라서, 항체 2 처리는 종양의 대식세포 침윤의 감소로 이어지며, 이는 항-마우스 CSF-1R 항체가 이들 종양에서 대식세포 집단의 고갈을 담당한다는 것을 나타낸다.
종양 진행에 대한 대식세포 및 CSF-1 수준의 유의성
유방 및 전립선 이외에, 종양 성장의 억제 뿐만 아니라 다수의 암의 치료는 항체 1의 투여에 의해 유익한 영향을 받을 수 있다. 일부 종양 유형, 예컨대 신암은 그의 세포 표면 상에서 CSF-1R을 발현하고, 항체 1 처리로 성장이 직접 억제될 수 있다 (문헌 [Soares, et al., Modern Pathol. 22: 744-752 (2009)]). 큰 종양-관련 대식세포 집단을 갖는 다른 종양 유형, 예컨대 호지킨 림프종 및 다발성 골수종은 항체 1 처리가 유익할 수 있고, 여기서 항체 1은 종양 성장을 유도하는 대식세포를 제거할 수 있다 (문헌 [Steidl, et al. New Engl. J. Med. 362: 875-885 (2010); Zheng, et al., Blood 114: 3625-3628 (2009)]). 추가로, CSF-1을 분비하는 종양, 예컨대 결장직장암은 항-CSF-1 또는 CSF-1R 처리에 감수성이고 (문헌 [Aharinejad, et al., Cancer Res. 62: 5317-5324 (2002)]), 항체 1 처리에 적절할 것이다. 또한, 그의 높은 CSF-1 발현이 불량한 예후와 관련된 난소암, 간세포 암종 및 신세포 암종은 모두 항체 1 처리를 위한 후보가 될 것이다 (문헌 [Toy, et al., Gyn. Oncol. 80: 194-200 (2001); Zhang, et al., Gyn. Oncol. 107: 526-531 (2007); Zhu, et al., J. Clin. Oncol. 26: 2707-2716 (2008); Gerharz, et al., Urol. 58: 821-827 (2001)]).
종양-관련 대식세포를 보유하는 비-CSF-1R 발현 종양은 오직 CSF-1 분비성인 경우에 항-CSF-1R 항체에 의해 성장 억제됨
종양 세포주 HCC1954 (유방), DU145 (전립선) 및 Pc3 (전립선)를 5x105개 세포/mL로 48시간 동안 1% FBS를 함유하는 성장 배지 중에 시딩하였다. 알앤디 퀀티킨(R&D Quantikine) 인간 M-CSF 검정 키트 (알앤디 시스템즈)를 이용하여 배지를 수집하고, 정화하고, 분석하였다. CSF-1 수준을 제0 및 48시간에 pg/mL로 결정하였다.
제0시간에, 예상한 바와 같이 배지 중에 분별가능한 CSF-1이 존재하지 않았다. 그러나, 48시간 내에, HCC1954 세포는 3613 pg/mL의 CSF-1을 분비한 한편, DU145 세포는 4019 pg/mL를 생성하였다. 대조적으로, Pc3 세포 배지는 오직 39 pg/mL의 CSF-1을 함유하였다.
전립선 세포주 Pc3을 마우스에서 성장시켜 CSF-1 발현의 부족이 항-CSF-1R 처리에 대한 내성과 상관관계가 있는지 확인함
5x106개 Pc3 전립선 세포를 누드 마우스 (수컷, 7-8주령)에 피하 주사하고, 종양이 300 mm3에 도달하도록 한 후에 각각 12 마리 마우스의 처리군으로 세분하였다. 동물에게 대조군 종양이 2000 mm3에 도달할 때까지 40 mg/kg의 래트 IgG, 40 mg/kg 항체 2 또는 10 mg/kg 항체 2를 1주일에 3회 투여하였다. 종양 부피를 측정하고, 제18일에 각 처리군에 대한 T/C%를 상대적 종양 부피 대 래트 IgG 대조군의 비로 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
Figure pct00008
래트 IgG 처리된 대조군 대 항체 2 처리군 사이에 성장은 차이가 없었고, 이는 상승된 CSF-1 수준이 항-CSF-1R 항체로의 처리에 대한 바이오마커일 수 있다는 것을 나타낸다.
CSF-1 분비는 CSF-1R이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현되었을 때 항-CSF-1R 처리의 감수성과 상관관계가 있음
세포 (하기 표 9 및 10에 상술됨)를 누드 마우스에 피하 주사하고, 종양이 300 mm3에 도달하도록 한 후에 각각 12마리 마우스의 처리군으로 세분하였다. 동물에게 대조군 종양이 2000 mm3에 도달할 때까지 1주일에 3회 하기 표 9 및 10에 상술된 치료 요법에 따라 투여하였다. 종양 부피를 측정하고, 각 처리군에 대한 T/C%를 상대적 종양 부피 대 래트 IgG 대조군의 비로 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
CSF-1 분비 종양 (표 9)은 모두 항체 2와의 항-CSF-1R 처리에 반응하지만, CSF-1을 분비하지 않는 종양 (표 10)은 항-CSF-1R 항체 2에 반응하지 않거나 오직 양호하지 않게 반응한다. CSF-1 분비는 CSF-1R이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현되는 종양 모델에서 항-CSF-1R 처리의 감수성과 관련된다. 따라서, 상승된 CSF-1 수준은 CSF-1R이 종양-관련 대식세포의 표면 상에서 발현될 때 잠재적인 감수성 인디케이터 또는 바이오마커로서 기능한다.
CSF-1R은 또한 종양 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. CSF-1 분비는 CSF-1R 종양 세포 표면 발현에 대한 항-CSF-1R 처리의 감수성과 관련되지 않는다.
종양 및 환자 혈청 샘플에서의 IL-34 수준
CSF-1 뿐만 아니라, IL-34가 또한 CSF-1R에 결합하고, 수용체의 인산화를 유도하고, 하류 신호전달 분자를 활성화시키며, 이는 대식세포 분화 및 생존으로 이어진다. CSF-1 및 IL-34는 둘 다 CSF-1R의 세포외 영역에서 IgG 도메인에 결합하고 (문헌 [Lin, et al., Science, 320: 807-11 (2008)]), 리간드는 둘 다 항체 1에 의한 CSF-1R로의 결합으로부터 억제될 수 있다 (각각 상기 문헌에서 논의된 바와 같이, 항체 1에 의한 CSF-1 및 IL-34 결합의 억제에 대해 IC50= 0.81 nM 및 IC50=0.71 nM). CSF-1R로 안정하게 형질감염된 NIH-3T3 세포를 항체 1로 처리하면 IL-34에 의한 CSF-1R의 인산화를 억제한다 (상기 문헌에 논의된 바와 같음). 또한, 단핵구의 대식세포 분화 및 대식세포 증식으로의 IL-34 유도는 항체 1에 의해 각각 0.3 nM 및 0.5 nM의 IC50으로 억제되고 (상기 문헌에 논의된 바와 같음), 이는 CSF-1에 의해 나타난 결과와 대등하다. 따라서, IL-34 활성 및 항체 1에 의한 그의 억제는 CSF-1에 의해 나타난 것과 유사하다.
IL-34 수준은 유방, 전립선 및 자궁내막 종양 세포주를 포함하여 많은 종양 세포에서 상승된다. 추가로, 전립선 및 유방 환자의 하위집단은 그의 혈청에서 높은 IL-34 단백질 수준을 갖는다. 따라서, IL-34가 CSF-1과 거의 동등하게 기능하고 CSF-1 분비가 항-CSF-1R 처리의 감수성과 관련되기 때문에, 상승된 IL-34 수준은 또한 감수성 인디케이터 또는 바이오마커로 기능한다.
유방 종양 조합 연구
Nu/nu 마우스 (암컷, 7-8주령)에게 1x107개 HCC-1954 유방 세포/마우스를 피하 주사하고, 처리 전에 종양이 300 mm3에 도달하도록 하였다. 마우스를 12개의 군으로 무작위로 분류하고, 다음과 같이 처리하였다:
Figure pct00011
종양 부피를 측정하고, 상대적 종양 부피 대 대조군의 비로서 각각의 처리군에 대한 T/C%를 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
표 11에 제시된 모든 연구에서, 항체 2, 헤르셉틴?, 독소루비신 및 파클리탁셀은 단일 작용제로서 종양 성장을 억제하였다. 그러나, 항체 2를 종양-표적화 작용제와 조합하는 것은 항-CSF-1R 항체의 화학요법제 또는 종양에 영향을 미치는 다른 작용제와의 조합이 이들 시약 단독보다 높은 효능이 있을 것임을 나타내는 부가 효과를 갖는다.
전립선 종양 조합 연구
Nu/nu 마우스 (수컷, 7-8주령)에게 1.5x107개 DU145 전립선 세포/마우스를 피하 주사하고, 처리 전에 종양이 300 mm3에 도달하도록 하였다. 마우스를 10개의 군으로 무작위로 분류하고, 다음과 같이 처리하였다:
Figure pct00012
종양 부피를 측정하고, 상대적 종양 부피 대 대조군의 비로서 각각의 처리군에 대한 T/C%를 계산하였다. RM ANOVA를 이용하여 종양 부피를 분석하였다.
항체 2와 도세탁셀을 조합하는 것은 전립선암에서 화학요법제와의 조합이 화학요법제 시약 단독보다 높은 효능이 있을 것임을 나타내는 부가 효과를 갖는다.
추가의 서열
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
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Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTIBODIES AGAINST CSF-1R <130> X18903 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 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His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln 130 135 140 Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160 Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175 Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190 Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205 Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220 Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro 225 230 235 240 Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255 Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270 Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285 Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300 Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly 305 310 315 320 Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu 325 330 335 Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365 Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro 370 375 380 Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 385 390 395 400 Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro 405 410 415 Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 420 425 430 Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 435 440 445 Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460 Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 465 470 475 480 His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser 485 490 495 Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val 500 505 510 Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro 515 520 525 Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540 Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val 545 550 <210> 18 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly Ile Phe Leu Gly 1 5 10 15 Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gln Asn 20 25 30 Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gln Tyr Arg 35 40 45 Ser Arg Leu Gln Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro Ile Asn Tyr Lys Ile 50 55 60 Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ile Ala Asn Val Thr Arg Leu 65 70 75 80 Gln Arg Ala Gln Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu 85 90 95 Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gln Asp Val Leu Leu Glu Gly 100 105 110 His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gln Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn 115 120 125 Val Gln Gln Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser 130 135 140 Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr 165 170 175 Cys Ser Cys Cys Lys Gln Ser Ser Val Leu Asn Trp Gln Asp Cys Glu 180 185 190 Val Pro Ser Pro Gln Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gln Tyr Ala 195 200 205 Ala Thr Gln Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro 210 215 220 His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gln Gly Glu Gly Leu 225 230 235 240 Leu Pro

Claims (24)

  1. 서열 SYGMH (서열 1)를 포함하는 CDRH1, 서열 VIWYDGSNKYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 CDRH2, 서열 GDYEVDYGMDV (서열 3)를 포함하는 CDRH3, 서열 RASQGISNALA (서열 4)를 포함하는 CDRL1, 서열 DASSLES (서열 5)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQFNSYPWT (서열 6)를 포함하는 CDRL3을 포함하는, 인간 CSF-1R 변이체 (서열 15)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
  2. 서열 SYGMH (서열 1)를 포함하는 CDRH1, 서열 VIWYDGSNKYYADSVKG (서열 2)를 포함하는 CDRH2, 서열 GDYEVDYGMDV (서열 3)를 포함하는 CDRH3, 서열 RASQGISNALA (서열 4)를 포함하는 CDRL1, 서열 DASSLES (서열 5)를 포함하는 CDRL2, 및 서열 QQFNSYPWT (서열 6)를 포함하는 CDRL3을 포함하는, 인간 CSF-1R (서열 16)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열:
    AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPWTFGQGTKVEIK (서열 8)를 포함하는 VL,
    및 아미노산 서열:
    QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS (서열 7)를 포함하는 VH
    를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄 및 각각 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 추가의 제약 작용제를 더 포함하는 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 단편.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 그의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 다발성 골수종 또는 호지킨 림프종인 항체 또는 그의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암, 자궁내막암 또는 전립선암인 항체 또는 그의 단편.
  12. 제11항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암 또는 전립선암인 항체 또는 그의 단편.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 또 다른 항암 치료제를 사용하는 요법의 시작 전에, 그 동안, 실질적으로 그와 동시에 또는 그 후에 투여되는 항체 또는 그의 단편.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항암 치료제가 항혈관신생제, 화학요법제 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항신생물제가 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴(Herceptin)? 및 독소루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 단편.
  16. 암의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암은 백혈병, 유방암, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 간세포암, 신암, 다발성 골수종 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포유동물에서 암을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암, 자궁내막암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 포유동물에게 또 다른 항암 치료제를 투여하는 것을 더 포함하며, 여기서 상기 항암 치료제는 항혈관신생제, 화학요법제 및 항신생물제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항신생물제가 도세탁셀, 파클리탁셀, 헤르셉틴? 및 독소루비신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 CSF-1의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) CSF-1 수준이 대조 집단에서 발견된 CSF-1 수준보다 높은 경우에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  22. (1) 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 환자로부터 얻은 샘플에서 IL-34의 수준을 측정하는 단계, 및 (2) IL-34 수준이 대조 집단에서 발견된 IL-34 수준보다 높은 경우에 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  23. 암을 갖는 대상체의 샘플에서 CSF-1의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서 암에 걸리지 않은 개체에서의 CSF-1의 수준과 비교하여 CSF-1의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며,
    여기서 상기 항체는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법.
  24. 암을 갖는 대상체의 샘플에서 IL-34의 수준을 생체외 또는 시험관내에서 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 종양 세포 및 순환 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서 암에 걸리지 않은 개체에서의 IL-34의 수준과 비교하여 IL-34의 수준의 증가는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보임을 나타내며,
    여기서 상기 항체는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체인, 암을 갖는 대상체가 항-CSF-1R 항체-기반 암 치료 요법을 위한 후보인지 여부를 결정하는 방법.
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