MX2014013213A - Composiciones de anticuerpos pan-receptor del factor de crecimiento epidermico humano (pan-her) humanizados. - Google Patents

Composiciones de anticuerpos pan-receptor del factor de crecimiento epidermico humano (pan-her) humanizados.

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Magnus Strandh
Klaus Koefoed
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Mikkel Wandahl Pedersen
Helle Jacobsen
Michael Kragh
Ida Kjaer
Thomas Tuxen Poulsen
Peter Sejer Andersen
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Symphogen As
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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos recombinantes humanizados que tienen como diana los receptores EGFR, HER2 y HER3 de la familia de EGFR, a composiciones que comprenden al menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado, al menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado y al menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado, y el uso de las composiciones de anticuerpos para el tratamiento de cáncer. La invención también se refiere al uso de anticuerpos que tienen como diana múltiples receptores de la familia de EGFR para tratar cáncer (por ejemplo, cáncer pancreático) y cáncer que tiene resistencia adquirida a terapias previas.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPOS PAN-RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO HUMANO (PAN-HER) HUMANIZADOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos recombinantes humanizados que tienen como diana a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) y a composiciones que comprenden dos o más de estos anticuerpos para el uso en terapia de cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (familia EGFR o ErbB/HER) es un subgrupo de las tirosina-cinasas receptoras (RTK, por sus siglas en inglés) e incluye cuatro miembros: EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 y HER4/ErbB4. Los miembros de la familia de EGFR son glicoproteínas modulares, de cadena individual, cercanamente relacionadas con una región extracelular de unión a ligado, un dominio transmembrana individual y un dominio de tirosina-cinasa intracelular. En escenarios fisiológicos normales, la familia de ErbB regula eventos clave en la coordinación del crecimiento, diferenciación y migración celular. Se cree que EGFR, HER2 y HER3 se juegan papeles cruciales en la transformación maligna de células normales y en el crecimiento continuo de células de cáncer. Se ha encontrado Ref . 252110 que EGFR y HER2 se sobreexpresan por muchos cánceres epiteliales. Adicionalmente, la sobreexpresión de EGFR y HER2 se ha enlazado al progreso de enfermedad, a supervivencia reducida, a pobre respuesta y a resistencia a quimioterapia en varios cánceres epiteliales humanos. El papel de HER4 en la transformación maligna y progreso de cáncer es controversial y no se analizará adicionalmente en la presente.
EGFR y HER2 son dianas validadas de cáncer y se han aprobado tanto anticuerpos monoclonales como inhibidores de molécula pequeña de su tirosina-cinasa, para el tratamiento de varios cánceres. Actualmente se está explorando HER3 como una diana terapéutica potencial. Sin embargo, los pacientes quienes inicialmente responden a estas terapias frecuentemente recaen debido a la evolución de la resistencia adquirida. La investigación pre-clínica apunta a la implicación de uno o ambos de los receptores no seleccionados como diana en el desarrollo de la resistencia. De esta manera, parece que los receptores ErbB tienen la capacidad de reemplazarse entre sí a fin de mantener la señalización estimulatoria de crecimiento y un fenotipo maligno. Por lo tanto, la selección simultánea como diana de dos o tres de estos receptores puede ser una manera más eficiente de inhibir las células de cáncer con dependencia a la familia de ErbB.
EGFR es una glicoproteína de superficie celular de 170kDa que consiste de una cadena individual de polipéptido de 1186 residuos de aminoácido como se determinó y describió originalmente mediante la clonación y secuenciación de ADNc humanos de una línea de células de carcinoma vulvar humano. EGFR contiene tres dominios principales: un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que contiene la tirosina-cinasa. La actividad catalítica de EGFR reside en el dominio de tirosina-cinasa (residuos 685-953) y se activa en la unión a ligando.
El EGFR existe en dos diferentes conformaciones, específicamente una conformación sujeta (cerrada) y una conformación extendida (abierta). El receptor se cambia entre las dos conformaciones. En la conformación sujeta, interactúan los dominios II y IV de la región extracelular de EGFR, dejando al receptor en un estado autoinhibido . Adicionalmente, el dominio III se mantiene a una distancia significativa del dominio I, por lo que la unión de EGF a ambos dominios es simultáneamente imposible. En la conformación extendida de EGFR, los dominios I, II y III están estéricamente arreglados en una forma de C, dando espacio para la unión de EGF. Adicionalmente, los cambios conformacionales induce la exposición de una b-horquilla que consiste de una región de 20 residuos en el dominio II, también conocida como el "brazo de dimerización". El brazo de dimerización que se extiende desde el dominio II de la EGFR hace contactos extensivos con el dominio II de otro EGFR, formando de este modo un homodímero de EGFR.
La dimerización pone a los dominios citoplásmicos activos de tirosina-cinasa, de los receptores, suficientemente cerca para la fosforilación de los residuos de tirosina en las regiones reguladoras de los receptores. Adicionalmente, las regiones de juxtamembrana de los dos receptores forman un dímero antiparalelo que se ha encontrado que es importante en la estabilización del dímero de tirosina-cinasa. El mecanismo de dimerización "mediado por el receptor" es único para la familia de ErbB en comparación a otros receptores de tirosina-cinasa donde la dimerización "mediada por ligando" es el tema más común.
Se han sugerido varios modos de activación del dominio intracelular de tirosina-cinasa de EGFR. Diferente de otras tirosina-cinasas receptoras, el dominio de tirosina-cinasa de EGFR adopta por defecto una conformación normalmente observada sólo en las cinasas fosforiladas y activadas. Esto indica que el dominio de cinasa de EGFR es constitutivamente activo. La regularización de una tirosina-cinasa constitutiva de esta manera se presentará a través de la distribución de una región reguladora C-terminal del compañero de dimerización, para la trans-fosforilación. Otra posibilidad es que la activación del dominio de tirosina- cinasa comprende el desplazamiento de interacciones inhibitorias que no se han visualizado en estudios cristalográficos. Sin embargo, los análisis de las estructuras cristalinas de la juxtamembrana y de la tirosina-cinasa de EGFR han revelado que un dímero asimétrico de tirosina-cinasas formado en la dimerización de dos EGFR es importante para la regularización de la actividad de la tirosina-cinasa. En este homodímero asimétrico, una de las tirosina-cinasas juega el papel del receptor en tanto que la otra tirosina-cinasa juega el papel del donador. Sólo el dominio del receptor-cinasa tiene actividad catalítica y prosigue a la fosforilación de los residuos de tirosina en el extremo C-terminal del receptor (ya sea en cis o trans, o en ambos se desconoce).
La endocitosis mediada por clatrina es el mecanismo más importante de reducción de la expresión de EGFR. El destino del EGFR depende de la estabilidad del complejo de ligando-receptor. En la unión de EGF al EGFR el homodímero de EGFR se dirige rápidamente hacia hoyuelos revestidos con clatrina y se internaliza a través de la endocitosis inducida por ligando. De manera simultánea el EGFR es bastante obicuo por la unión tanto de monoubiquitina y poliubiquitina. La ubiquitina-ligasa Cbl es responsable de la ubiquitinación de EGFR. Cbl se une ya sea directamente o de forma indirecta a través de una proteína adaptadora tal como Grb2 a residuos fosforilados de tirosina en la región reguladora de EGFR. La unión de Cbl a EGFR mediante Grb2 es necesaria para la internalización del receptor. Espl5 también juga un papel en la internalización de EGFR. Aún es sin embargo controversial el papel de Espl5. La ubiquitinación está comprendida en la reducción endocitótica de la expresión de EGFR y en la clasificación endosómica de EGFR a lisosomas. Las cadenas de ubiquitina se reconocen por el complejo de clasificación endosómica requerido para el transporte (ESCRT, por sus siglas en inglés) y el Hrs/STAM, que retiene las proteínas ubiquitinadas en la membrana de endosomas tempranos, impidiendo de este modo el recielado del EGFR. Subsiguientemente, el EGFR se clasifica en vesículas intraluminales (ILV, por sus siglas en inglés), lo que conduce a la distribución de EGFR al endosoma tardío y finalmente a la degradación en los lisosomas.
En contraste a la degradación de EGFR cuando se une a EGF, la unión de TGF-a permite el reciclado del receptor. El ligando TGF-a se disocia rápidamente de EGFR en el endosoma temprano debido al ambiente ácido, conduciendo a la desforforilación del receptor, a la des-ubiquitinación y de este modo al reciclaje del receptor de regreso a la superficie celular.
El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2, ErbB2 o Neu) se describió primero en 1984 por Schechter et al. HER2 consiste de 1234 aminoácidos y estructuralmente similar a EGFR con un dominio extracelular que consiste de cuatro subdominios I-IV, un dominio transmembrana, un dominio juxtamembrana, una tirosina-cinasa citoplásmica intracelular y un dominio C-terminal regulatorio.
El contacto de los dominios II-IV que restringe el arreglo de dominios en el eje EGFR sujeto, está ausente en HER2. Tres de los siete residuos conservados, importantes para la estabilización de la sujeción en el EGFR in activados son diferentes en el HER2. De esta manera, HER2 se asemeja a EGFR en su forma extendida (abierta) con el brazo de dimerización expuesto y aparentemente suspendido para activar las interacciones receptor-receptor. La ausencia de una conformación de HER2 sujeto indica que el receptor carece de autoinhibición como se ve para los otros miembros de la familia de ErbB. Una interfase estable del subdominio I-III parece mantener a HER2 en la configuración extendida similar a la configuración extendida del complejo de EGFR-EGF. La interacción entre los dominios I y III comprende regiones que corresponden a sitios de unión a ligando en los dominios I y III de EGFR, no dejando espacio e histéricamente para ligandos, volviendo a HER2 incapaz de la unión a ligandos. Los dominios II y IV forman dos interfaces distintas que estabilizan la formación del heterodímero de HER2 y otro miembro de la familia de ErbB.
Los estudios biofísicos han fallado en detectar la homodimerización significativa de HER2 en solución o en cristales. Son similares los residuos del dominio II de EGFR y HER2. Sin embargo, Arg285 en la interfaz de dímero no está conservada entre EGFR y HER2. En HER2 el residuo 285 es Leu. Los estudios de mutación indican que Leu en esta posición es parcialmente responsable de la ausencia de homodímeros de HER2 en solución. La dimerización de HER2 intacto in vivo puede requerir interacciones adicionales de sitios en el dominio transmembrana de HER2.
HER2 es el único miembro de la familia de ErbB que no se une a ligandos conocidos. En cambio HER2 se activa mediante la formación de complejos heteromericos con otros miembros de la familia de ErbB y de este modo se regula indirectamente por los ligandos de EFGR y HER3. HER2 es el compañero preferido de heterodimerización de los otros tres receptores ErbB. HER2 mejora la afinidad de los otros receptores de ErbB para sus ligandos al desacelerar la velocidad de disociación del complejo de 1igando-receptor, por lo que HER2 mejora prolonga la señalización. La capacidad de HER2 para mejorar la afinidad a ligandos de otros receptores de ErbB puede reflejar el comportamiento promiscuo de HER2 como un compañero de heterodimerización. La heterodimerización de HER2 y otro receptor unido a ligando de la familia de ErbB induce la fosforilación cruzada, conduciendo a fosforilación de los residuos de tirosina C-terminales. El heterodímero de HER2 más activo es el complejo de HER2-HER3. HER2 complementa el HER3 deficiente de cinasa al proporcionar una cinasa activa.
En contraste a EGFR, el HER2 es resistente a la internalización cuando se sobreexpresa. Adicionalmente se ha reportado que la sobreexpresión de HER2 inhibe la endocitosis de los otros miembros de la familia de ErbB. Se han sugerido dos mecanismos por los cuales HER2 escapa la degradación lisosómica y permanece de este modo en la membrana de plasma. Ya sea HER2 evita la internalización o se lleva a recielar de manera eficiente de los endosomas de regreso a la membrana de plasma. Los estudios usando anticuerpos marcados han mostrado que HER2 se internaliza y recicla de forma constante. Otros estudios en contraste fallaron en identificar HER2 intracelular en células tratadas con compuestos que se conoce que inhiben el reciclado.
Se ha propuesto que el término carboxilo de HER2 no posee todas las señales requeridas para la internalización o que contiene una señal inhibitoria esencial para la endocitosis mediada por clatrina. Adicionalmente, los estudios han mostrado que los heterodímeros de HER2 no se distribuyen a los endosomas. El sitio de acoplamiento de Cbl igual que el encontrado en EGFR también se ha identificado en HER2 (Y1112). De este modo Cbl se puede reclutar a HER2, conduciendo a la ubiquitinación de HER2, pero mezclará la eficiencia real de unión de Cbl. Se ha propuesto que HER2 es resistente a la internalización debido a su asociación con salientes de membrana. Finalmente, otros estudios han mostrado que la resistencia a la endocitosis de los heterodímeros de HER2-EGFR se asocia con formación ineficiente inducida por EGF de hoyuelos revestidos con clatrina.
El tercer miembro de la familia de ErbB, conocido como el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER3, ErbB3) se identificó en 1989 por Kraus M. H. et al. El gen HER3 codifica para una proteína de 1342 aminoácidos con notables similitudes estructurales a EGFR Y HER2. Las características tal como tamaño total, cuatro subdominios extracelulares (I-IV) con dos agrupaciones de cisteína (dominios II y IV), y un domino de tirosina-cinasa muestran similitudes estructurales a EGFR y HER2. El dominio de tirosina-cinasa de HER3 muestra 59% de homología de secuencia al dominio de tirosina-cinasa de EGFR.
Tal como EGFR, HER3 existe en una conformación sujeta y en una conformación extendida. En la conformación sujeta, el brazo de dimerización está enterrado por interacciones con el dominio IV, dejando a los dominios I y III demasiados separados para la eficiente unión a ligando. La unión a ligando a los dominios I y III extracelulares se presenta en la conformación extendida de HER3 que conduce a la heterodimerización con otros miembros de la familia de ErbB. No se forman homodímeros de HER3 en la unión a ligando. La molécula de HER3 extendida y unida a ligando se heterodimeriza preferencialmente con HER2.
En contraste a EGFR y HER2, la tirosina-cinasa de HER3 tiene actividad catalítica deteriorada, insuficiente para cualquier respuesta biológica detectable. Los dos residuos de aminoácido que están altamente conservados en los dominios catalíticos de proteína-cinasas están alterados en el dominio catalítico de HER3. Estos son la sustitución de asparagina por ácido aspártico en el residuo 815 y la sustitución de histadina por glutamato en el residuo 740. Las dos sustituciones de aminoácido pueden ser la razón por la que HER3 carece de actividad catalítica de su dominio de tirosina-cinasa. Debido a la actividad de cinasa intrínseca deteriorada de HER3, el receptor necesita heterodimerizarse con otro miembro de la familia de ErbB a fin de responder a su propia unió a ligando.
Poco se conoce a cerca de la endocitosis de HER3. Adicionalmente, diferentes estudios han sugerido que HER3 está deteriorado en la endocitosis al mismo grado como HER2. De acuerdo con esto, se encontró que el complejo de HER3-NRG1 se internaliza de manera menos eficiente y más lento que el complejo de EGFR-EGF, soportando la visión que HER3 no se endocitosa tan eficientemente como EGFR. Sin embargo, cuando la extremidad C-terminal de EGFR se reemplaza con la extremidad C-terminal de HER3, el EGFR se llega a deteriorar en la endocitosis, sugiriendo que una región en el C-término de HER3 protege al receptor contra la internalización . También se ha sugerido que NRG1 no tiene como diana de forma eficiente a HER3 para la degradación debido a la disociación de los complejos de ligando-receptor en los endosomas como se observa cuando EGF se activa por TGFa.
Se ha perseguido intensamente la selección como diana de la familia de ErbB en la última década como una estrategia de tratamiento contra el cáncer. Se han explorado diferentes modalidades de tratamiento, tal como inhibidores de tirosina-cinasa (TKI, por sus siglas en inglés), anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) y trampas de ligando. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales para tratamiento de cáncer es la especificidad de la diana, asegurando una baja toxicidad en comparación a la quimioterapia citotóxica convencional contra cáncer. Se han aprobado anticuerpos monoclonales para el tratamiento de tumores sólidos con niveles anormalmente altos de EGFR o HER2, y numerosos mAb que tienen como diana a EGFR o HER2 están en ensayos clínicos. Los TKI inhiben la señalización del receptor mediante la unión al sitio de unión a ATP en el dominio de tirosina-cinasa de EGFR y HER2. Erlotinib/TarcevaMR inhibe las tirosina-cinasas de EGFR en tanto que lapatinib/TykerbMR inhibe las tirosina-cinasas tanto de EGFR como HER2. Tanto erlotinib como laptinib son TKI aprobados por la FDA para el uso en el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer metastático de mama que sobreexpresa HER2, respectivamente.
Sin embargo, a pesar de la utilidad clínica de la terapia de anticuerpos monoclonales y TKI, es una cuestión creciente al desarrollo de resistencia requerida al tratamiento. La terapia de combinación de los mAb y quimioterapia citotóxica convencional es uno de los planteamientos que se lleva a cavo a fin de incrementar la eficiencia del tratamiento. Adicionalmente, se están explorando varias estrategias para incrementar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales, incluyendo mejora de las funciones efectoras, y el armado directo e indirecto de los anticuerpos con radionúclidos o toxinas.
De esta manera, existe la necesidad de fármacos adicionales para tratar enfermedades relacionadas a la familia de EGFR en pacientes, incluyendo pacientes quienes han desarrollado resistencia a los tratamientos existentes.
Estos fármacos adicionales también tienen un bajo riesgo de provocar una respuesta inmunitaria indeseable cuando se usan para tratar pacientes humanos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha descubierto que la selección simultánea como diana de dos o más miembros de la familia de EGFR (por ejemplo, EGFR, HER2, y HER3) para anticuerpos humanizados conduce a la inhibición efectiva de crecimiento de cáncer. También se ha descubierto que se pueden usar composiciones que tienen como diana múltiples miembros de la familia de EGFR para tratar cáncer, tal como cáncer pancreático, óseo, colónico, endometrial o del tracto urinario, incluyendo cáncer que tiene resistencia adquirida a terapias con fármaco que tienen como diana solo un miembro de la familia de EGFR.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a anticuerpos humanizados dirigidos contra EGFR, HER2 y HER3, así como composiciones que comprenden dos o más anticuerpos humanizados dirigidos contra dos o más de estas dianas. La invención se refiere adicionalmente al uso de los anticuerpos y composiciones para terapia de cáncer humano.
Un aspecto de la invención se refiere a una composición de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y al menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado o un fragmento de un antígeno del mismo, al menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo anti-EGFR humanizado de la invención se puede seleccionar de un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:1 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:2, y un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:5. En una modalidad, el anticuerpo anti-EGFR puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:1) que comprende Arg44 y Val83, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:2) que comprende Alal9 y Phe92; una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID N0:1) que comprende Arg44, Val83 y Ilel04, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:3) que comprende Tyr41, Leu51 y Phe92; o una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID N0:1) que comprende Arg44, Val83 y Ilel04, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:3) que comprende Leu34, Tyr41, Leu51 y Phe92. En otra modalidad, el anticuerpo anti-EGFR puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:4) que comprende Leu20, Ile48 y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:5) que comprende Val75 y Phe87; o una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:) que comprende Leu20, Ile48, Leu56, y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:5) que comprende Val75 y Phe87.
En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo anti-EGFR humanizado cuyas secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera comprenden SEQ ID NOs:43 y 44, respectivamente, SEQ ID NOs:38 y 39, respectivamente, SEQ ID N0s:41 y 42, respectivamente, SEQ ID NOs:45 y 46, respectivamente, o SEQ ID N0s:47 y 48, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo anti-HER2 humanizado de la invención se puede seleccionar de un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:6 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:7, y un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEQ ID NO:8 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:9. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER2 puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:6) que comprende Ser55, Leu70, Val72, Lys74 y Ala79, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:7) que comprende Val44, Met48 y Tyr70; o una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:6) que comprende Ser55 y Val72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:7) que comprende Met48 y Tyr70. En otra modalidad, el anticuerpo anti-HER2 puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:8) que comprende Ala49, Ile74 y Ser77, y una secuencia de región variable de cadena ligera 30 (SEQ ID NO:9) que comprende Thr56, Tyr71, Ser85 y Leul04.
En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo anti-HER2 humanizado cuya secuencias de aminoácido de cadena pesada y ligera comprenden: SEQ ID NOs:51 y 52, respectivamente, SEQ ID NOs:49 y 50, respectivamente, o SEQ ID NOs:53 y 54, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo anti-HER3 humanizado de la invención se puede seleccionar de un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEQ ID NO:10 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11, y un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:12 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:13. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER3 puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:10) que comprende Met49, Ser55 y Ile68, o Asn44, Ser55 y Thr93, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID N0:11) que comprende Phe36, Val44, Phe49 y Ile85, o Phe36, Phe49 y Leu73. En otra modalidad, el anticuerpo anti-HER3 puede comprender una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:12) que comprende Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:13) que comprende Val21, Val44 y Phe87, y opcionalmente Thr29; o una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO:12) que comprende Phe41, Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO:13) que comprende Val21, Val44, Tyr71, Phe87 y Leul04.
En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo anti-HER3 humanizado cuyas secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera comprenden: SEQ ID NOs:55 y 56, respectivamente, SEQ ID 15 NOs:57 y 58, respectivamente, SEQ ID NOs:59 y 60, respectivamente, o SEQ ID NOs:61 y 62, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
La invención también abarca composiciones de anticuerpos que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o seis de los anticuerpos descritos anteriormente. En alguna modalidades, la composición de anticuerpos puede comprender (i) 11294 y/o 11302; (ii) 11249 y/o 11145; y (iii) 10738 y/o 11052. En una modalidad, la composición comprende los seis anticuerpos.
La composición de anticuerpos puede comprender (a) anticuerpo anti-EGFR 10292, 10460, o 11294; (b) anticuerpo anti-EGFR 10560 o 11302; (c) anticuerpo anti-HER2 10704 o 11249; (d) anticuerpo anti-HER2 11145; (e) anticuerpo anti- HER3 10738 o 10810; y (f) anticuerpo anti-HER311006 o 11052. En una modalidad preferida, la composición de anticuerpos comprende los anticuerpos anti-EGFR 11294 y 11302, los anticuerpos anti-HER211249 y 11145, y los anticuerpos anti-HER3 10738 y 11052. El anticuerpo 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006, o 11052 puede comprender al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la Tabla 4.
En una modalidad, la composición de anticuerpos puede comprender (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:44; (b) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada SEQ ID NO:47 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:48; (c) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:51 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:52; (d) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:54; (e) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:55 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:56; y (f) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:61 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:62.
Los aspectos adicionales de la invención se refieren a un método para producir anticuerpos y composiciones de anticuerpos de la invención; una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una composición de anticuerpos de la invención y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable; un método para tratar cáncer en un humano u otro mamífero que comprende administrar a un sujeto en necesidad de lo mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de anticuerpos recombinantes o composición farmacéutica de la invención; el uso de una composición de anticuerpos recombinantes una composición farmacéutica de la invención para preparar un medicamento para el tratamiento de cáncer; y una composición de anticuerpos recombinantes o composición farmacéutica de la invención para el uso como un medicamento para tratamiento de cáncer. Para el tratamiento en humanos, los anticuerpos se dirigen diferentemente a miembros de la familia de HER de humano. En algunas modalidades, cada una de estas composiciones comprenden más de un anticuerpo monoclonal, cada uno que se une a un diferente epítopo en el HER seleccionado como diana. En algunas modalidades, al menos uno de los anticuerpos se conjuga a un agente-cáncer, por ejemplo, un agente citotóxico, una citocina, una toxina, o un radionúclido.
El cáncer tratable por los métodos de la invención incluye, sin limitación, cáncer pancreático (incluyendo cáncer pancreático facilitado por una mutación de KRAS), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de hueso, cáncer de colon (incluyendo cáncer colorectal), cáncer endometrial, cáncer de tracto urinario, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer ovárico, otro cáncer epidémico, y cánceres con una dependencia en uno o más de EGFR, HER2, y HER3.
El paciente puede haber sido tratado previamente para cáncer. Por ejemplo, el paciente puede haber sitio tratado con un fármaco que selecciona como diana un miembro individual de la familia de EGFR y ha adquirido resistencia al fármaco (por ejemplo, cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab).
La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de las regiones variables pesadas o ligeras o cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo descritas en la presente. La invención también se refiere a un vector de expresión que comprende estas moléculas de ácido nucleico y una célula hospedadora que comprende estos vectores o moléculas de ácido nucleico. La célula hospedadora que comprende estos vectores o moléculas de ácido nucleico. La célula hospedadora puede ser capaz de expresar cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Alineación de secuencias de aminoácido de cadena variables de los anticuerpos monoclonales humanizados 10292, 10460, y 11294 anti-EGFR con la secuencia diseñada in silico construida de CDR murinas originales injertadas en regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las posiciones diferentes se marcan con su abreviación de aminoácido de una letra. Las áreas sombreadas indican las CDR como se define por IMGT. Parte superior: cadenas pesadas variables de 10292 (SEQ ID NO:38), 10460 (SEQ ID N0:40), y 11294 (SEQ ID NO:42) alineadas con la secuencia injertada con CDR (1277_CDRinjertada-H; SEQ ID N0:62). Parte intermedia: Cadena ligera variable de 10292 (SEQ ID NO:39) alineada con la secuencia injertada de CDR (|277_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:63). Parte inferior: Cadenas ligera variables de 10460 (SEQ ID NO:41) y 11294 (SEQ ID NO:43) alineada con secuencia injertada de CDR (1277A_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:64).
Figura 2: Alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas variables de los anticuerpos monoclonales humanizados 10560 y 11302 anti-EGFR con la secuencia diseñada in silico constituida de la CDR murinas originales injertadas en las regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las posiciones diferentes se embarcan con su abreviación de aminoácido de una letra. Las áreas sombreadas indican la CDR como se define por IMGT. Parte superior: Cadenas pesadas variables 10560 (SEQ ID NO:44) y 11302 (SEQ ID NO:46) alineadas a la secuencia injertada de CDR (1565_CDRinjertada-H; SEQ ID 15 NO:65). Parte inferior: Cadenas ligeras variables de 10560 (SEQ ID NO:45) y 11302 (SEQ ID NO:47) alineadas a la secuencia injertada de CDR (1565_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:66).
Figura 3: Alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas variables de anticuerpos monoclonales humanizados 10704 y 11249 anti-HER2 con la secuencia diseñada in silico constituida de la CDR murinas originales injertadas en regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las posiciones diferentes se marcan con su abreviación de aminoácido de una letra. Las áreas sombreadas indican la CDR como se define por IMGT. Parte superior: Cadenas pesadas variables de 10704 (SEQ ID NO:48) y 11249 (SEQ ID NO:50) alineadas con la secuencia injertada de CDR (4384_CDRinjertada-H; SEQ ID NO:67). Parte inferior: Cadenas ligeras variables de 10704 (SEQ ID NO:49) y 11249 (SEQ ID NO:51) alineadas a la secuencia injertada de CDR (4384_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:68).
Figura 4: Alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas variables del anticuerpo monoclonal humanizado 11145 anti-HER2 con la secuencia diseñada in silico constituida de la CDR murinas originales injertadas en las regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las diferentes posiciones se marcan con su abreviación de aminoácido de una letra. Las áreas sombreadas indican CDR como se define por IMGT. Parte superior: Cadena pesada variable de 11145 (SEQ ID NO:52) alineada a la secuencia injertada de CDR (4517_CDRinjertada-H; SEQ ID NO:69). Parte inferior: Cadena ligera variable de 11145 (SEQ ID NO:53) alineada a la secuencia injertada de CDR (4517_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:70).
Figura 5: Alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas variables de secuencias de aminoácidos de cadenas variables de los anticuerpos monoclonales humanizados 10738 y 10810 anti-HER3 con la secuencia diseñada in silico constituida de la CDR murinas originales injertadas en regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las posiciones diferentes se marcan con su abreviación de aminoácidos en una letra. Las áreas sombreadas indican CDR como se define por IMGT. Parte superior: Cadenas pesadas variables 10738 (SEQ ID NO:54) y 10810 (SEQ ID NO:56) alineadas a la secuencia injertada de CDR (5038_CDRinjertada-H; SEQ ID N0:71). Parte inferior: Cadenas ligeras variables de 10738 (SEQ ID NO:55) y 10810 (SEQ ID NO:57) alineadas a la secuencia injertada de CDR (5038_CDRinjertada-L; SEQ ID NO:72).
Figura 6: Alineación de secuencias de aminoácidos de cadenas variables de los anticuerpos monoclonales humanizados 11006 y 11052 anti-HER3 con la secuencia diseñada in silico constituida de la CDR murinas originales injertadas en regiones menos variables completamente humanas. Los puntos denotan identidad, en tanto que las posiciones diferentes se marcan con su abreviación de aminoácidos en una letra. Las áreas sombreadas indican CDR como es define por IMGT. Parte superior: Cadenas pesadas variables de 11006 (SEQ ID NO:58) y/o 11052 (SEQ ID N0:60) alineadas a la secuencia injertada de CDR(5082_CDRinjertada-H; SEQ ID NO:73). Parte inferior: Cadenas ligeras variables de 11006 (SEQ ID NO:59) y 11052 (SEQ ID NO:61) alineadas a la secuencia injertada a CDR (5082_CDRinjertada-L; SEQ ID N0:74).
Figura 7: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10292 humanizado anti-EGFR en combinación con su anticuerpo compañero anti-EGFR quimérico. Se trataron células A431NS (panel superior) y células H358 (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpos durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 8: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10460 anti-EGFR humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-EGFR quimérico. Se trataron células A431NS (panel superior) y células H358 (penal de parte inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpos durante 96 horas. Los datos se presentan como media + SEM.
Figura 9: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10560 anti-EGFR humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-EGF quimérico. Se trataron células A431NS (panel superior) y células H358 (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media + SEM.
Figura 10: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10704 anti-HER2 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-HER2 quimérico. Se trataron células 0E19 (panel superior) y células BT474 (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 11: Actividad in vitro del anticuerpo variante 11145 anti-HER2 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-HER2 quimérico. Se trataron células OE19 (panel superior) y las células BT474 (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media + SEM.
Figura 12: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10738 anti-HER3 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-HER3 quimérico. Se trataron células MBA-MD-175 VII (panel superior) y las células MCF-7 (en la presencia de heregulina- beta 1 nM; panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 13: Actividad in vitro del anticuerpo variante 10810 anti-HER3 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero 10810 anti-HER3 quimérico. Se trataron las células MBA-MD-175 VII (panel superior) y células MCF-7 (en presencia de heregulina-beta 1 nM; panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 14: Actividad in vitro del anticuerpo variante 11006 anti-HER3 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero 11006 anti-HER3 quimérico. Se trataron las células MBA-MD-175 VII (panel superior) y células MCF-7 (en presencia de heregulina-beta 1 nM; panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 15: Actividad in vitro del anticuerpo variante 11052 anti-HER3 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero anti-HER3. Se trataron las células MBA-MD-175 VII (panel superior) y células MCF-7 (en presencia de heregulina-beta 1 nM; panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media 20 ± SEM.
Figura 16: Patrón de reactividad cruzada de anticuerpos quiméricos y humanizados con antígenos de la familia de HER, de humano, de cynomolgus y murinos. La señal OD del anticuerpo a 40 nM, medida a 450 nm usando un lector de ELISA, se clasificó de negativo (-; OD<0.1) a fuertemente positivo 25 (+++; OD>2.5).
Figura 17: Actividad in vitro del anticuerpo variante humanizado 11294 anti-EGFR en combinación con su anticuerpo compañero anti-EGFR quimérico. Se trataron las células A431NS (panel superior) y células FaDu (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media + SEM.
Figura 18: Actividad in vitro del anticuerpo variante 11302 humanizado anti-HER en combinación con su anticuerpo compañero anti-EGFR quimérico. Se trataron células A431NS (panel superior) y células FaDu (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media + SEM.
Figura 19: Actividad in vitro del anticuerpo variante 11249 anti-HER2 humanizado en combinación con su anticuerpo compañero 11145 anti-HER2 humanizado. Se trataron células 0E19 (panel superior) y células BT474 (panel inferior) con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpo durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
Figura 20: Actividad in vitro de una mezcla de anticuerpos humanizados (variantes 11294, 11302, 11249, 11145, 10738 y 11052; Pan-HER humanizado) y una mezcla de anticuerpos quiméricos (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082; Pan-HER quimérico) . Las líneas celulares indicadas se trataron con diferentes concentraciones de las mezclas indicadas de anticuerpos durante 96 horas. Los datos se presentan como media ± SEM.
La Figura 21A es una ilustración esquemática de la interacción de Pan-HER con sus proteínas diana EGFR (izquierda), HER2 (intermedio) y HER3 (derecha).
La Figura 2IB es una serie de gráficas que muestran los efectos del tratamiento con los anticuerpos de EGFR (izquierda), HER2 (intermedio) y HER3 (derecha) en la actividad metabólica de las líneas celulares A431NS, HCC202, y MDA-15 MB-175-VII, respectivamente. La lcyenda de las Figuras en el panel izquierdo lista de la parte superior a la parte inferior: control negativo, 1277, 1565, 1277+1565. La leyenda de la Figura en el panel de centro lista de la parte superior a la parte inferior: control negativo, 4384, 4517, 4384+4517. La leyenda de la Figura en el panel derecho lista de la parte superior a la parte inferior: Control negativo, 5038, 5082, 5038+5082.
La Figura 21C es una serie de imágenes de Western blot que muestra los niveles de EGFR (izquierda), HER2 (intermedio), y HER3 (derecha) en los lisados celulares totales de células de cáncer A431NS, HCC202 y MDA-MB-175-VII, respectivamente, que se han tratado con los anticuerpos indicados y las mezclas indicadas de anticuerpos.
La Figura 22 es una imagen que muestra los niveles de fosforilación del receptor de EGFR (izquierda), HER2 (intermedio), y HER3 (derecha) en 73 líneas de células de cáncer tratadas con Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082; Pan-HER quimérico).
La Figura 23 es una tabla que muestra la actividad metabólica máxima como un porcentaje de células de control no tratadas (sin Heregulina o EGF) (ajustado a 100%) después del tratamiento con la mezcla de Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082; Pan-HER quimérico), subcomponente de Pan-HER y un anticuerpo de control negativo.
La Figura 24 es una tabla que muestra la actividad metabólica máxima como un porcentaje de células de control no tratadas en la ausencia de ligando (ajustado a 100%) después del tratamiento con Pan-HER (1277, 1565, 4384, 354517, 5038 y 5082; Pan-HER quimérico), subcomponentes de Pan-HER y un anticuerpo de control negativo en la presencia de Heregulina 5 nM. Las células se expusieron al medio que contiene anticuerpos y ligandos durante 96 horas, (es decir, se adiciona simultáneamente el ligando y un anticuerpo a las células).
La Figura 25 es una tabla que muestra la actividad metabólica máxima como un porcentaje de células de control no tratadas en la ausencia de ligando (ajustado a 100%) después del tratamiento con Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 50812; Pan-HER quimérico), subcomponentes de Pan-HER y un anticuerpo de control negativo en la presencia de EGF 1 nM. La células se expusieron al medio que contiene anticuerpos y ligandos durante 96 horas. (es decir, se adicionó simultáneamente ligando y anticuerpo a las células).
La Figura 26 es una imagen que muestra el estado de mutación de genes listados a través de la parte superior de la imagen de siete líneas de células de cáncer pancreático (CAPAN-1, PK-1, CFPAC-1, BxPC3, ASPC1, CAPAN-2, Pan08.13, PANC-1, KP4, MiaPaca-2 y PSN1).
La Figura 27 es una serie de gráficas que muestran la dosis-respuesta de la línea de células CAPAN-1 al tratamiento con Pan-HER en la ausencia (izquierda) o presencia (intermedia) de Heregulina y ligandos de EGF (derecha). "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. La Figura 28 es una serie de gráficas que muestran los efectos de Pan-HER y anticuerpos de referencia en la actividad metabólica de líneas de células parentales (superior) y los correspondientes clones resistentes que tienen actividad adquirida a cetuximab, trastuzumab o pertuzumab (parte inferior). "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. La lcyenda de la Figura en el panel izquierdo superior lista de la parte superior a la parte inferior: Pan-HER, cetuximab, control negativo. La leyenda de la Figura en el panel central superior lista de la parte superior a la parte de parte inferior: Pan-HER, trastuzumab, control negativo. La leyenda de la Figura en el panel derecha superior lista de la parte superior a la parte inferior: Pan-HER, pertuzumab, control negativo.
La Figura 28 es una serie de gráficas que muestran los efectos de Pan-HER y los anticuerpos de referencia en la actividad metabólica de líneas de células parentales (superior) y los correspondientes clones resistes que tienen resistencia adquirida a cetuximab, trastuzumab o pertuzumab (inferior). "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. La lcyenda de la Figura en el panel izquierdo superior lista de la parte superior a la parte inferior: Pan-HER, cetuximab, control negativo. La leyenda de la Figura en el panel central superior lista de la parte superior a la parte inferior: Pan-HER, trastuzumab, control negativo. La leyenda de la Figura en el panel derecho superior lista de la parte superior a la parte inferior: Pan-HER, pertuzumab, control negativo.
La Figura 29 es una serie de imágenes de Western blot que muestran los niveles de EGFR, HER2 y HER3 en U sados celulares completos de líneas de células H292 (parte superior) y OVCAR-8 (parte inferior) después del tratamiento con anticuerpos. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 30 es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con Pan-HER o sus subcomponentes en el volumen tumoral en el modelo de xenoinjerto BxPC-3. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR+HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517.
"EGFR+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 31 es una serie de imágenes que muestran secciones de tumores inmunomarcados de EGFR y HER2, extirpados de xenoinjertos BxPC-3 tratados con vehículo y Pan-HER tres días después del retiro del tratamiento. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 32 es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con Pan-HER o sus subcomponentes en el volumen tumoral en el modelo de xenoinjerto Calu-3. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR+HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038 y 5082.
La Figura 33 (parte superior) es una serie de imágenes de Western blot que muestran los nivele de EGFR, HER2, HER3 y un control de carga de b-actina en U sados de tumores BxPC-3 después del tratamiento con los anticuerpos.
La cuantificación relativa de los niveles de EGFR, HER2, y HER3 en las intensidades de banda de la Western blot se muestra en una serie de gráficas en la Figura 30 (parte inferior). "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR+HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 34 es una serie de gráficas que muestran los efectos de Pan-HER en el volumen tumoral en modelos de xenoinjerto de tumor ST191, ST204, ST383, STS021, ST179, ST385, STS064, ST334, STS059, y STS058 derivados de paciente de cáncer pancreático mutado de KRAS. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 35 es una serie de gráficas que muestran los efectos de tratamiento con Pan-HER o su subcomponentes en el volumen tumoral en modelos de xenoinjerto de tumor ST179 y ST383 derivados de paciente de cáncer pancreático mutado de KRAS. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 354384, 4517, 5038, y 5082. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR+HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2+HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 14384, 4517, 5038, y 5082.
La Figura 36 es una vista esquemática que ilustra el desarrollo y clonación de clones HN5 con resistencia adquirida a cetuximab.
La Figura 37 es una gráfica que muestra los efectos de dosis-respuesta del tratamiento con cetuximab en células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14.
La Figura 38 es una gráfica que muestra la curva de unión de cetuximab a células HN5 parentales fijadas y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14.
La Figura 39 es una gráfica que muestra los niveles superficiales relativos de EGFR encontrados por citometría de flujo de fluorescencia en células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14.
La Figura 40 es una serie de imágenes de Western blot que muestra los niveles totales de EGFR, especies fosforiladas de EGFR, y un control de carga de b-actina en U sados celulares de células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14 que ya sea están sin tratar (izquierda) o se estimularon con EGF (derecha).
La Figura 41 es una serie de imágenes de Western blot que muestran los niveles totales de EGFR, AKT, pAKT (Ser473), ERK1/2, pERKl/2(Thr202/Tyr204), y un control de carga de b-actina en los U sados celulares de células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14 que ya sea están sin tratar (izquierda) o se estimularon con EGF (derecha).
La Figura 42 es una gráfica que muestra la viabilidad de células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2 y HN5 CR14 tratados con EGFR-LNA, cetuximab, mezcla EGFR-2 (anticuerpos 1277 y 1565) o controles.
La Figura 43 es una serie de imágenes de Western blot que muestran los niveles totales de EGFR en células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2 y HN5 CR14 tratados con EGFR-LNA, cetuximab, mezcla EGFR-2 (anticuerpos 1277 y 1565) o controles.
La Figura 44 es una gráfica que muestra la viabilidad de células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14 tratados con los anticuerpos indicados de EGFR. "Mezcla EGFR 2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "Mezcla Her32" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082.
Las Figuras 45A y 45B es una serie de gráficas que muestran la dosis-respuesta de células HN5 parentales (Figura 45A) y la viabilidad de los clones resistentes a cetuximab HN5 CR2 (Figura 45B) al tratamiento con anticuerpos indicados. "Mezcla EGFR 2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "Mezcla Her3 2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "Mezcla EGFR+HER34" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038 y 5082.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En tanto que algunos anticuerpos monoclonales (por ejemplo, cetuximab, trastuzumab, y pertuzumab) se han usado para tratar enfermedades relacionadas a la familia de EGFR, estos tratamientos no son efectivos para todos los pacientes. Adicionalmente, los pacientes desarrollan frecuentemente resistencia a estos fármacos después del uso inicial. Esta invención se basa en el descubrimiento de nuevos anticuerpos humanizados que tienen como diana a los miembros EGFR, HER2, y HER3 de la familia de EGFR y que las mezclas de estos anticuerpos humanizados (una composición de anticuerpos humanizados de pan-HER) pueden reducir de manera efectiva la expresión de las dianas e inhibir el crecimiento de una variedad de líneas de células de cáncer. También se ha descubierto que las mezclas de anticuerpo que tienen como dianas los miembros EGFR, HER2, y HER3 de la familia de EGFR suprimen de manera efectiva el crecimiento tumoral en múltiples modelos de xenoinjerto de cáncer humano, incluyendo modelos de cáncer pancreático derivados de pacientes, difíciles de tratar. También se ha mostrado que las mezclas de anticuerpos que tienen como diana más de un miembro de la familia de EGFR retienen su efecto inhibitorio en células que tienen resistencia adquirida a anticuerpos monoclonales terapéuticos tal como cetuximab, trastuzumab, y pertuzumab. Anticuerpos Humanizados Un aspecto de la invención se refiere a anticuerpos humanizados que se unen a los miembros EGFR, HER2, y HER3 de la familia de EGFR. El término "anticuerpo" o "molécula de anticuerpo" describe un componente funcional del suero y frecuentemente se refiere ya sea como una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulinas) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o la molécula de inmunoglobulina). Un anticuerpo es capaz de unirse a o reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico), que a su vez puede conducir a inducción de mecanismos efectores inmunológicos. Un anticuerpo individual usualmente se considera como monoespecífico, y una composición de anticuerpos puede ser monoclonal (es decir, que consiste de moléculas idénticas de anticuerpo) o policlonal (es decir, que consiste de dos o más anticuerpos diferentes que reaccionan con los mismos o diferentes epítopos en el mismo antígeno o aún en distintos antígenos diferente). Cada anticuerpo tiene una estructura única que le permite unirse de manera específica a su correspondiente antígeno, y todos los anticuerpos naturales tienen la misma estructura básica total de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulinas.
A menos que se indique de otro modo, los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usan en la presente se propone que incluyan anticuerpos de cadena individual así como fragmentos de unión de anticuerpos, tal como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o fragmentos Fv de cadena individual (scFv), y formas multiméricas tal como moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalente. En la presente descripción y en las reivindicaciones, por lo tanto se propone que las referencias a un "anticuerpo" o "anticuerpos" abarquen, en particular, fragmentos de unión y anticuerpos de cadena individual, a menos que se indique de otro modo o sea evidente del contexto que esto no es el caso.
Cada cadena pesada de un anticuerpo incluye típicamente una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada incluye tres dominios, referidos como CH1, CH2 y CH3 . Cada cadena ligera de anticuerpo incluye típicamente una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera incluye típicamente un dominio individual, referido como CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad ("regiones hipervariables" , que pueden ser de secuencia hipervariable y/o en asas estructuralmente definidas). Las regiones "hipervariables" encontradas en los dominios variables de un anticuerpo que son principalmente responsables para determinar la especificidad de unión del anticuerpo. También se refieren como regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), que se entremezclan con regiones que están más conservadas, llamadas regiones menos variables (FR, por sus siglas en inglés) . Cada una de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo contiene tres regiones CDR, referidas como CDR1, CDR2 y CDR3, de las cuales CDR3 muestra la variabilidad más grande. Cada VH y VL incluye típicamente tres CDR y cuatro FR, arregladas desde el término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los residuos de aminoácido en las regiones variables frecuentemente se numeran usando un método estandarizado de numeración conocido como el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), aunque también existen otros esquemas de numeración tal como Chothia e IMGT .
El término "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se expresa de una célula o una línea celular transfectada con un vector de expresión (o posiblemente más de un vector de expresión, por ejemplo, dos vectores de expresión) que comprende la secuencia codificadora del anticuerpo, donde la secuencia codificadora no está asociada de forma natural con la célula.
Los números de anticuerpo de cuatro dígitos usados en la presente, es decir 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082, se refieren a los anticuerpos quiméricos de origen descritos en la WO 2012/059857, de la cual se derivan los anticuerpos humanizados de la invención. La Tabla 1 posterior muestra la SEQ ID NOs, como se expone en la Tabla 8, para las secuencias de ADN y de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH) y las cadenas ligeras (LC) de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
Tabla 1: SEQ ID NOs para las secuencias de ADN y de aminoácidos de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras de Anticuerpos quimericos La especificidad de la interacción de un anticuerpo con un antígeno diana reside principalmente en los residuos de aminoácido localizados en las seis CDR de la cadena pesada y ligera. Las secuencias de aminoácidos dentro de la CDR por lo tanto son mucho más variables entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de la CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de un anticuerpo específico que se presenta de forma natural, o de manera más general cualquier anticuerpo específico con una secuencia dada de aminoácidos, al construir vectores de expresión que expresan secuencias de CDR del anticuerpo específico injertado en secuencias de regiones menos variables de un anticuerpo diferente. Como resultado, es posible "humanizar" un anticuerpo no humano y que mantenga aun sustancialmente la especificidad de unión y la afinidad del anticuerpo original. Se proporciona más adelante un análisis más detallado de la humanización.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere en su sentido más amplio a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes, típicamente un anticuerpo que es parcialmente de origen humano y parciamente de origen no humano, es decir, derivado en parte de un animal no humano, por ejemplo un ratón, rata u otro roedor, o un ave tal como un pollo. Los anticuerpos quiméricos se prefieren con respecto a los anticuerpos no humanos a fin de reducir el riesgo de una respuesta de anti-anticuerpos humanos, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón en el caso de un anticuerpo murino. Un ejemplo de un anticuerpo quimérico típico es uno en el cual las secuencias de la región variable son secuencias murinas derivadas de la inmunización de un ratón, en tanto que las secuencias de las regiones constantes son humanas. En el caso de un anticuerpo quimérico, las partes no humanas se pueden someter a alteración adicional a fin de humanizar el anticuerpo. Como se describe en otra parte de la presente, la presente invención se basa en la humanización de ciertos anticuerpos quiméricos que tienen secuencias de regiones variables murinas.
El término "humanizar" se refiere al hecho que en donde un anticuerpo es completamente o parcialmente de origen no humano, por ejemplo, un anticuerpo murino obtenido de la inmunización de ratones con un antígeno de interés o un anticuerpo quimérico basado en este anticuerpo murino, es posible reemplazar ciertos aminoácido, en particular en las regiones menos variables y regiones constantes de las cadenas pesada y ligera a fin de evitar o reducir al mínimo una respuesta inmunitaria en humanos. Se conoce que todos los anticuerpos tienen el potencial de producir una respuesta anti-anticuerpos humanos, que correlacionan a ningún grado con el grado de "humanización" del anticuerpo en cuestión. Aunque no es posible predecir de manera precisa la inmunogenicidad y de este modo la respuesta de anti-anticuerpos humanos de un anticuerpo particular, los anticuerpos no humanos tienden a ser más inmunogénicos que los anticuerpos humanos. Los anticuerpos quiméricos, donde las regiones constantes extrañas (usualmente de roedor) se han reemplazado consecuencias de origen humano, se ha mostrado que son en general menos inmunogénicos que los anticuerpos de origen completamente extraño, y la tendencia en los anticuerpos terapéuticos es hacia anti-anticuerpos humanizados o completamente humanos. Para los anticuerpos quiméricos u otros anticuerpos de origen no humano, por lo tanto se prefiere que se humanicen para reducir el riesgo de una respuesta anti-anticuerpos humanos.
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización comprende típicamente la modificación de las regiones menos variables de la secuencias de regiones variables. Los residuos de aminoácido que son parte de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) más frecuentemente no se alteran en unión con la humanización, aunque ciertos casos puede ser deseable alterar residuos de aminoácidos individuales de CDR, por ejemplo para remover un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación, un sitio de isomerización de aspartato o un residuo indeseado de cisteína o metionina. La glicosilación N- enlazada se presenta por la unión de una cadena de oligosacárido o a un residuo de asparagina en la secuencia tripeptídica Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La remoción de un sitio de N-glicosilación se puede lograr al mutar ya sea el residuo Asn o el residuo Ser/Thr a un diferente residuo, probablemente por medio de la sustitución conservadora. La desamidación de los residuos de asparagina y glutamina puede presentarse dependiendo de factores tal como el pH y exposición en superficie. Los residuos de asparagina son particularmente susceptibles a desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn- Gly, y en un menor grado en otras secuencias dipeptídicas tal como Asn-Ala. Cuando este sitio de desamidación, en particular Asn-Gly, está presente en una secuencia de CDR, por lo tanto puede ser deseable remover el sitio, típicamente por sustitución conservadora para remover uno de los residuos implicados.
En la téenica se conocen numerosos métodos para la humanización de una secuencia de anticuerpo; ver la revisión por Almagro & Fransson (2008) Front Biosci . 13: 1619-1633. Un método comúnmente usado el injerto de CDR, que para un anticuerpo quimérico derivado de murino comprende la identificación de las contrapartes del gen de línea germinal humana a los genes de las regiones variables murinas y el injerto de las secuencias murinas de CDR en sus regiones menos variables. El injerto de CDR se puede basar en las definiciones de CDR de Kabat, aunque una publicación más reciente (Magdelaine-Beuzelin et al. (2007) Crit Rev. Oncol Hematol .64: 210-225) ha sugerido que la definición IMGTMR (el sistema de información internacional, www.imgt.org) pueden mejorar el resultado de la humanización (ver Lefranc et al. (2003), IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev. Comp Immunol .27, 55-77). Puesto que el injerto de CDR puede reducir la especificidad y afinidad de unión, y de esta manera la actividad biológica, de un anticuerpo no humano injertado con CDR, se pueden introducir retro-mutaciones (referidas algunas veces como "reparación de regiones menos variables") en punto seleccionados del anticuerpo injertado con CDR, típicamente en las regiones menos variables, a fin de restablecer la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo de origen. La identificación de posiciones para las posibles retromutaciones se puede realizar usando información disponible en la literatura y en bases de datos de anticuerpos. Los residuos de aminoácido que son candidatos para las retromutaciones son típicamente aquellos que están localizados en la superficie de una molécula de anticuerpo, en tanto que los residuos que están enterrados o que tienen un bajo grado de exposición en superficie normalmente no se alterarán. Una téenica alternativa de humanización al injerto de CDR y retromutaciones es el revestimiento, en el cual se retienen los residuos no supuestos en superficie de origen no humano en tanto que los residuos de superficie se alteran a los residuos humanos.
En ciertos casos, también puede ser deseable alterar uno o más residuos de aminoácido de CDR a fin de mejorar la afinidad de unión al epítopo diana. Esto se conoce como "maduración por afinidad" y se puede realizar opcionalmente en unión con la humanización, por ejemplo en situaciones donde la humanización de un anticuerpo conduce a especificidad o afinidad reducida de unión y no es posible mejorar de manera suficiente la especificidad o afinidad de unión solo por las retromutaciones. La téenica se conoce en varios métodos de maduración por afinidad, por ejemplo en el método de mutagénesis por saturación de exploración in vitro descrito por Burks et al. (1997) PNAS USA, vol.94, páginas 412417 y el método de maduración por afinidad in vitro gradual de Wu et al. (1998) PNAS USA, vol.95, páginas 6037-6042.
Los residuos de aminoácido en la presente se pueden indicar ya sea por el código de una letra o el código de tres letras las sustituciones de aminoácido con relación a una secuencia de referencia se puede indicar por ejemplo usando el formato "G44R", que indica que un residuo de glicina en la posición 44 de una secuencia de referencia se ha mutado a un residuo de arginina. Por ejemplo, la Tabla 3 posterior, "G44R" indica una mutación del residuo de glicina en un anticuerpo injertado de CDR a un residuo de arginina. Un residuo de aminoácido descrito en el formato "Arg44" indica un residuo particular en una posición particular, es decir en este caso un residuo de arginina en la posición 44. A menos que se indique de otro modo, la numeración de residuos de aminoácidos se refiere al listado anexo de secuencias.
Como se señala anteriormente, la presente invención se refiere a anticuerpos humanizados, de manera más particular a anticuerpos humanizados basados en ciertos anticuerpos quiméricos de origen descritos en la WO 2012/059857. Los anticuerpos humanizados de la invención se desarrollaron usando injerto de CDR y retromutaciones y en algunos casos mediante la alteración de los motivos indeseados de secuencia, iniciando con anticuerpos anti-EGFR, anti-HER2 y anti-HER3 quiméricos seleccionados descritos en la WO 2012/059857. Los métodos particulares usados para desarrollar estos anticuerpos humanizados, así como los resultados de la evaluación funcional de los anticuerpos humanizados en comparación a los anticuerpos quiméricos originales de los cuales se desarrollaron, se describen en los ejemplos posteriores. Sorprendentemente, los datos presentados en los ejemplos muestran que las mezclas que contienen un anticuerpo humanizado de la invención tienen una eficaz in vitro que es comparable a aquella de las correspondientes mezclas de los anticuerpos quiméricos originales, demostrando que el proceso de humanización no afecta las propiedades inhibitorias de estos anticuerpos o su capacidad para funcionar en combinación entre sí. Los datos también siguieren fuertemente que las mezclas de anticuerpos humanizados también mostrarán una eficacia in vivo que es comparable a aquella de las mezclas de anticuerpos quiméricos originales descritas en WO 2012/059857.
Los números de anticuerpo de cinco dígitos usados en la presente, por ejemplo "anticuerpo 10560", se refieren a los anticuerpos humanizados específicos descritos más adelante, que se han preparado por injerto de CDR con base a un anticuerpo quimérico de origen. Por ejemplo, el anticuerpo 10560 es un anticuerpo con una cadena pesada que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada (VH) expuesta en SEQ ID NO:4 y una cadena ligera que comprende la secuencia de región variable de cadena ligera (VL) expuesta en SEQ ID NO:5, y que comprende sustituciones (por ejemplo, retromutaciones) en cierta posiciones en comparación al anticuerpo original injertado de CDR (ver Tabla 3 y Figuras 1-6). En los ejemplos posteriores, los anticuerpos también incluyeron una secuencia de región constante kappa humana (SEQ ID NO:42 en WO 152012/059858 y US 2011/0217305, con un residuo Arn N-terminal) y una secuencia de región constante de cadena pesada IGHG1 humana (SEQ ID NO:44 en WO 2012/059858 y US 2011/0217305).
Los anticuerpos humanizados particulares de la invención se describen en la presente por medio de un número de anticuerpo es decir, 10292, 10460, 11294, 10560, 10704, 11302, 11145, 11249, 10738, 10810, 11006 O 11052. Estos se derivan de los anticuerpos quiméricos (regiones variables murinas, regiones constantes humanas) descritos en WO 2012/059857 por injerto de CDR y mutación subsiguiente en ciertas posiciones, principalmente retromutaciones, como se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 2 posteriores resume como los anticuerpos humanizados de la invención están relacionados a los anticuerpos quiméricos de origen descritos en WO 2012/059857.
Tabla 2: Números de anticuerpos humanizados y quiméricos de origen La Tabla 3 posterior proporciona los SEQ ID NOs de los anticuerpos humanizados de ejemplo de la invención, así como las sustituciones individuales (retromutaciones , y en ciertos casos mutaciones para alterar los motivos indeseados de secuencias) en la cadena pesada (HC, por sus siglas en inglés) y cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés) en comparación al anticuerpo original injertado de CDR . Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos listados en la Tabla 3 se proporcionan en las Figuras 1-6 y en SEQ ID NOs separados anexados en paréntesis en la Tabla 3. Las secuencias de CDR en las Figuras 1-6 se indican con sombreado.
Tabla 3: Números y sustituciones de secuencia en anticuerpos humanizados seleccionados Una indicación que cualquiera de los anticuerpos humanizados numerados listados en la Tabla 2 puede comprender "al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o cadena ligera indicada como "Xaa" en la Tabla 4" significa que los anticuerpos pueden comprender sustituciones adicionales en residuos "Xaa" diferentes de las sustituciones listadas anteriormente en la Tabla 3.
Tabla 4: Secuencias de anticuerpos humanizados seleccionados SEQ ID NO:1 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Xaa Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Asn lie Asn Pro Ser Xaa Xaa Gly Thr Ser Phe Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Xaa Tyr Trp Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Asn lie Asn Pro Ser Xaa Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Xaa Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Xaa Lys Leu Leu Xaa 35 40 45 Tyr lie Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr Xaa Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp lie Ala Thr Tyr Xaa Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Lys Leu Ala Tyr Trp Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xaa 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Xaa Gly Phe lie Ser Tyr Xaa Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Xaa Thr lie Ser Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Las alineaciones de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera injertadas de CDR de estos anticuerpos humanizados con la respectiva secuencia diseñada in silico constituida de CDR murinas, originales, injertadas en las regiones menos variables completamente humanas se muestran en las figuras 1-6.
Un aspecto de la invención se refiere a anticuerpos humanizados particulares que tienen como diana EGFR, HER2 o HER3 . Estos anticuerpos individuales incluyen los siguientes: (a) un anticuerpo anti-EGFR humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; (b) un anticuerpo anti-EGFR humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 5; (c) un anticuerpo anti-HER2 humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7; (d) un anticuerpo anti-HER2 humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 9; (e) un anticuerpo anti-HER3 humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; y (f) un anticuerpo anti-HER3 humanizado que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13.
Los anticuerpos humanizados resumidos anteriormente incluyen típicamente, en tanto la secuencia de región variable de cadena pesada como en la secuencia de región variable de cadena ligera, una o más de las sustituciones posibles sustituciones (principalmente retromutación, pero en ciertos casos también la mutación para alterar los motivos indeseados de secuencia) expuestas en la tabla 4 y en los ejemplos y figuras anexas. La secuencia de región variable de cadena pesada y la secuencia de región variable de cadena ligera comprenderá cada una típicamente dos, tres, cuatro o cinco de estas sustituciones.
Los ejemplos de un anticuerpo anti-EGFR preferido (a) son anticuerpos que comprenden: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) que comprende Arg44 y Val83, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 2) que comprende Alal9 y Phe92 [por ejemplo, anticuerpo 10292]; (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) que comprende Arg44, Val83 y Ilel04, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 3) que comprende Tyr41, Leu51 y Phe92 [por ejemplo, anticuerpo 10460]; o (iii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) que comprende Arg44, Val83 e Ilel04, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 3) que comprende Leu34, Tyr41, Leu51 y Phe92 [por ejemplo, anticuerpo 11294].
El anticuerpo anti-EGFR (a) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 10292, 10460, u 11294, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácidos de cadena pesada y/o cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa". SEQ ID NO: 2 incluye Xaa en las posiciones 33-34, puesto que la secuencia injertada de CDR tiene un sitio de desamidación (Asn-Gly) en estas posiciones. Aunque es posible realizar sustituciones en ambas posiciones, es suficiente alterar solo una de las dos posiciones a fin de eliminar el sitio de desamidación. La secuencia por lo tanto incluirá típicamente ya sea Asn en la posición 33 o Gly en la posición 34.
Un ejemplo de un anticuerpo anti-EGFR preferido (b) es uno que comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 4) que comprende Leu20, Ile48 y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 5) que comprende Val75 y Phe87 [por ejemplo, anticuerpo 10560]; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 4) que comprende Leu20, Ile48, Leu56, y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 5) que comprende Val75 y Phe87 [por ejemplo, anticuerpo 11302].
El anticuerpo anti-EGFR (b) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 10560 u 11302, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa". SEQ ID NO: 4 incluye Xaa en las posiciones 55-56, puesto que la secuencia injertada de CDR tiene un sitio de desamidación (Asn-Gly) en estas posiciones. Aunque es posible realizar sustituciones en ambas posiciones, es suficiente alterar solo una de las posiciones a fin de eliminar el sitio de desamidación. Por lo tanto la secuencia incluirá típicamente ya sea Asn en la posición 55 o Gly en la posición 56.
Un ejemplo de un anticuerpo anti-HER2 preferido (c) es uno que comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 6) que comprende Ser55, Leu70, Val72, Lys74 y Ala79, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 7) que comprende Val44, Met48 y Tyr70 [por ejemplo, anticuerpo 10704]; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 6) que comprende Ser55 y Val72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 7) que comprende Met48 y Tyr70 [por ejemplo, anticuerpo 11249].
El anticuerpo anti-HER2 (c) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 10704 u 11249, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa".
Un ejemplo de un anticuerpo anti-HER2 preferido (d) es uno que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 8) que comprende Ala49, Ile74 y Ser77, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 9) que comprende Thr56, Tyr71, Ser85 y Leul04 [por ejemplo, anticuerpo 11145]. El anticuerpo anti-HER2 (d) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 11145, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa".
Los ejemplos de un anticuerpo anti-HER3 preferido (e) son anticuerpos que comprenden una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) que comprende Met49, Ser55 y Ile68, o que comprende Asn44, Ser55 y Thr93, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 11) que comprende Phe36, Val44, Ile85 y Phe49, o que comprende Phe36, Phe49 y Leu73. Los ejemplos particulares de estos anticuerpos anti-HER3 son aquellos que comprenden: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) que comprende Met49, Ser55 e Ile68, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 11) que comprende Phe36, Val44, Ile85 y Phe49 [por ejemplo, anticuerpo 10738]; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) que comprende Asn44, Ser55 y Thr93, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: ii) que comprende Phe36, Phe49 y Leu73 [por ejemplo, anticuerpo 10810].
El anticuerpo anti-HER3 (e) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 10738 o 10810, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa".
Los ejemplos de un anticuerpo anti-HER3 preferido (f) son anticuerpos que comprenden: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 12) que comprende Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 13) que comprende Val21, Val44 y Phe87, y opcionalmente Thr29 [por ejemplo, anticuerpo 11006]; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 12) que comprende Phe41, Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 13) que comprende Val21, Val44, Tyr71, Phe87 y Leul04 [por ejemplo, anticuerpo 11052].
El anticuerpo anti-HER3 (f) también puede ser un anticuerpo que corresponde al anticuerpo 11006 u 11052, pero que comprende al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa".
Es bien conocido en la téenica que los anticuerpos existen como diferentes isotipos, tal como los isotipos humanos IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2, o los isotipos murinos IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA. Un anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, o IgD.
Composiciones de anticuerpos humanizados Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición (o mezcla) de anticuerpos recombinantes que comprende al menos dos anticuerpos humanizados de la invención dirigidos contra al menos dos diferentes receptores seleccionados de EGFR, HER2 y HER3. Los términos "anticuerpo policlonal" o "mezcla de anticuerpos [monoclonales] " se refieren a una composición de dos o más diferentes moléculas de anticuerpo que son capaces de unirse a o reaccionar con diferentes determinantes antigénicos específicos en los mismos o en diferentes antígenos. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos individuales de una mezcla de anticuerpos se unen a diferentes determinantes antigénicos de al menos dos receptores de la familia de HER. En el caso de mezclas de anticuerpos que contienen dos diferentes anticuerpos que se unen al mismo receptor, los anticuerpos individuales se unen de manera preferente a dos diferentes epítopos de ese receptor, más preferentemente epítopos distintos y sustancialmente no traslapados.
Los términos "pan-HER" o "composición de anticuerpos de pan-HER" se refieren a una composición de moléculas de anticuerpo que son capaces de unirse a al menos dos diferentes antígenos en al menos dos receptores de la familia de HER. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos individuales de una composición de anticuerpos se unen a diferentes determinantes antigénicos de la familia de HER. Los anticuerpos individuales de la composición de anticuerpos de esta manera pueden unirse a EGFR y HER2, HER3 y EGFR, HER2 y HER3, o EGFR, HER2 y HER3, de manera preferente a los tres receptores EGFR, HER2 y HER3.
El término "epítopo" se usa para describir una parte de una molécula más grande (por ejemplo, sitio antigénico o antígeno) que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de una molécula más grande que produce una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de una molécula más grande a la cual se une de manera inmunoespecífica un anticuerpo como se determina por cualquier método conocido en la téenica. Los epítopos antigénicos no son necesariamente in unogénicos. Un antígeno es una sustancia a la cual se une de manera inmunoespecífica a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, una toxina, virus, bacteria, proteína o ADN. Un antígeno o sitio antigénico tiene frecuentemente más de un epítopo, a menos que sea muy pequeño y frecuentemente es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales. Un epítopo lineal consiste en general de aproximadamente 6 a 10 aminoácidos adyacentes en una molécula de proteína que se reconocen por un anticuerpo. En contraste, un epítopo conformacional consiste de aminoácidos que no están arreglados de manera secuencial, pero donde un anticuerpo reconoce una estructura tridimensional particular. Cuando una molécula de proteína se pliega en una estructura tridimensional, los aminoácidos que forman el epítopo están yuxtapuestos, permitiendo el anticuerpo reconozca el epítopo conformacional. En una proteína desnaturalizada solo se reconocen epítopos lineales. Un epítopo conformacional, por definición, debe estar en el exterior de la proteína plegada.
El término "distintos epítopos" se refiere al hecho que cuando dos anticuerpos diferentes de la invención se unen a diferentes epítopos, hay menos de 100% de competición para la unión al antígeno, preferentemente menos de 80% de competición para la unión al antígeno, de manera más preferente menos de 50% de competencia para la unión al antígeno, y de manera más preferente tan poca competición como sea posible, tal como menos de aproximadamente 25% de competición para la unión al antígeno. Los anticuerpos capaces de competir entre sí para la unión al mismo antígeno pueden unirse a los mismos epítopos o epítopos traslapados o pueden tener un sitio de unión en vecindad cercana entre sí, de modo que la competición se provoque principalmente por impedimento estérico. Un análisis para "epítopos distintos" de pares de anticuerpos se puede realizar por métodos conocidos en la téenica, por ejemplo por medio de experimentos de unión bajo condiciones de saturación de anticuerpo usando ya sea FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) u otro análisis de citometría de flujo en células que expresan el antígeno de receptor pertinente y anticuerpos marcados, fluorescentes, individuales, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando antígeno capturado o conjugado a una superficie de celda de flujo.
Los distintos epítopos están preferentemente "no traslapados" en el sentido que los dos diferentes anticuerpos en una composición de la invención que se unen al mismo receptor tienen una competición suficientemente baja a la unión al antígeno de modo que los dos anticuerpos son capaces de unirse a sus respectivos epítopos de forma simultánea. Se entenderá por las personas expertas que puede haber diferentes grados de traslape, y que se pueden considerar diferentes epítopos como que están "no traslapados" a pesar de la presencia de algún grado de competición, en tanto que los respectivos anticuerpos son capaces de unirse sustancialmente a sus epítopos. Esto se considera en general que es el caso cuando la competición para la unión al antígeno entre dos anticuerpos es menos de aproximadamente 50%. En la téenica se conocen métodos para determinar la competición entre anticuerpos, por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial (SPR) como se describe por ejemplo en WO 2011/107957.
Los anticuerpos que se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno pueden tener efectos variables en la actividad del antígeno al cual se unen, dependiendo de la ubicación del epítopo. Un anticuerpo que se une a un epítopo en un sitio activo del antígeno puede bloquear la función del antígeno completamente, en tanto que otro anticuerpo que se une a un diferente epítopo puede no tener o tener poco efecto en la actividad del antígeno solo. Sin embargo estos anticuerpos pueden activar aun el complemento y dar por resultado de este modo la eliminación de la célula que expresa el antígeno, y pueden dar por resultado efectos sinérgicos de inhibición de crecimiento cuando se combinan con uno o más anticuerpos que se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno. En el contexto de la presente invención, el epítopo es una porción del dominio extracelular de EGFR, HER2 o HER3 (ya sea tipo silvestre o mutado). Un anticuerpo anti-EGFR de la invención de esta manera se unirá al dominio extracelular de EGFR, un anticuerpo anti-HER2 de la invención se unirá al dominio extracelular de HER2, y un anticuerpo anti-HER3 de la invención se unirá al dominio extracelular de HER3.
Las modalidades particulares de este aspecto de la invención incluyen, con referencia a los anticuerpos humanizados (a)-(f) resumidos anteriormente, composiciones que comprenden: - anticuerpo anti-EGFR (a) y anticuerpo anti-HER2 (c); - anticuerpo anti-EGFR (a) y anticuerpo anti-HER2 (d),- - anticuerpo anti-EGFR (a) y anticuerpo anti-HER3 (e); - anticuerpo anti-EGFR (a) y anticuerpo anti-HER3 (f); - anticuerpo anti-EGFR (b) y anticuerpo anti-HER2 (c); - anticuerpo anti-EGFR (b) y anticuerpo anti-HER2 (d); - anticuerpo anti-EGFR (b) y anti-HER3 anticuerpo (e); - anticuerpo anti-EGFR (b) y anticuerpo anti-HER3 (f); - anticuerpo anti-HER2 (c) y anti-HER3 anticuerpo (e); - anticuerpo anti-HER2 (c) y anti-HER3 anticuerpo (f); - anticuerpo anti-HER2 (d) y anti-HER3 anticuerpo (e); o - anticuerpo anti-HER2 (d) y anticuerpo anti-HER3 (f).
En una modalidad, la invención se refiere a una composición de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado, al menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado, y al menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado.
En algunas modalidades, la invención se refiere a una composición de anticuerpos que comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado, al menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado, y al menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado, en donde: el por lo menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado se selecciona de (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y (b) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 5; el por lo menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado se selecciona de (c) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 7, y (d) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 9; y el por lo menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado se selecciona de (e) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11, y (f) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13.
En el caso de una composición de anticuerpos que comprende un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-HER2 y un anticuerpo anti-HER3, la composición puede comprender de esta manera con referencia a los anticuerpos humanizados (a) -(f) resumidas anteriormente: - anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (e); anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (f); anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (e); anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (f); anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (e); - anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (f); anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (e); o anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (f).
Los ejemplos de composiciones preferidas que comprenden un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-HER2 y un anticuerpo anti-HER3 son, por ejemplo: - anticuerpos 10292, 10704 y 10738; - anticuerpos 10292, 10704 y 10810; - anticuerpos 10292, 10704 y 11006; - anticuerpos 10292, 10704 y 11052; - anticuerpos 10460, 10704 y 10738; - anticuerpos 10460, 10704 y 10810; - anticuerpos 10460, 10704 y 11006; - anticuerpos 10460, 10704 y 11052; - anticuerpos 11294, 10704 y 10738; - anticuerpos 11294, 10704 y 10810; - anticuerpos 11294, 10704 y 11006; y - anticuerpos 11294, 10704 y 11052.
En una modalidad aun más preferida, la composición anticuerpos comprende seis anticuerpos humanizados, es decir, dos anticuerpos humanizados dirigidos contra cada uno de los tres receptores EGFR, HER2 y HER3, donde cada par de anticuerpos que se unen al mismo receptor se unen a distintos epítopos y epítopos no traslapados de ese receptor. Esto puede ser en particular una composición que comprenden anticuerpos anti-EGFR (a) y (b), anticuerpos anti-HER2 (c) y (d), y anticuerpos anti-HER3 (e) y (f). En este caso, se pueden seleccionar uno, dos, tres, cuatro, cinco o los seis anticuerpos de los anticuerpos 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006 y 11052.
En una modalidad particular, la composición de anticuerpos comprende: (a) anticuerpo anti-EGFR 10292, 10460, o 11294; (b) anticuerpo anti-EGFR 10560 o 11302; (c) anticuerpo anti-HER210704 o 11249; (d) anticuerpo anti-HER211145; (e) anticuerpo anti-HER310738 o 10810; y (f) anticuerpo anti-HER311006 u 11052.
De manera alternativa, cualquiera de uno o más de los anticuerpos (a) - (f) en esta modalidad puede comprender al menos una sustitución adicional en cualquiera de los residuos de aminoácido de cadena pesada y/o de cadena ligera indicados como "Xaa" en la tabla 4, por ejemplo, sustitución en hasta cinco o seis de estos residuos "Xaa" por anticuerpo para uno o más de los anticuerpos en la composición, tal como sustitución en uno, dos, tres o cuatro de estos residuos "Xaa" por anticuerpo para uno o más de los anticuerpos en la composición.
En una modalidad preferida, la composición de anticuerpos comprende anticuerpos anti-EGFR 11294 y 11302, anticuerpos anti-HER211249 y 11145, y anticuerpos anti-HER3 10738 y 11052. La composición de anticuerpos puede comprender (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44; (b) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 48; (c) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 52; (d) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 54; (e) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 55 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 56; y (f) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 61 y la secuencia de región variable de cadena ligera SEQ ID NO: 62.
Aunque es posible que los anticuerpos individuales de una mezcla de anticuerpos de la invención incluyan anticuerpos de más de un isotipo, pueden ser todos del mismo isotipo. humanizados iciones de Los anticuerpos humanizados de la invención se unen a los miembros de la familia de HER o de EGFR, EGFR, HER2, o HER3 . El término "HER" significa "receptor del factor de crecimiento epidérmico humano" y se usa frecuentemente de manera indistinta con el término "ErbB" para caracterizar el subgrupo de receptor-tirosina-cinasas (RTK, por sus siglas en inglés) que consiste de los cuatro miembros EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 y HER4/ErbB4. Conjuntamente, estos cuatro receptores constituyen los receptores de la "familia de HER" (o familia de ErbB o EGFR).
La unión de uno o más anticuerpos de la invención, en particular una composición de anticuerpos de pan-HER de la invención, a los receptores de la familia de HER inhibe de manera preferente el crecimiento y proliferación de células que expresan los receptores (es decir, típicamente células tumorales). Los mecanismos comprendidos pueden incluir, uno o más de lo siguiente: prevención de la dimerización del receptor, prevención de la unión al ligando, promoción de la internalización y degradación del receptor, reducción de la fosforilación del dominio de tirosina-cinasa (TKD, por sus siglas en inglés), reducción de la señalización del receptor, e inducción de la fagocitosis, CDC y/o ADCC.
Como se usa en la presente, el término "inhibe el crecimiento" (por ejemplo, con referencia a células) se propone que incluya cualquier disminución medible en la proliferación (incremento en el número de células) o metabolismo de una célula cuando se pone en contacto con un anticuerpo anti-familia-HER o una composición de anticuerpos de pan-HER en comparación al crecimiento de las mismas células en la ausencia del anticuerpo o composición, por ejemplo, inhibición del crecimiento de un cultivo celular por al menos aproximadamente 10%, y de manera más preferente más, tal como al menos aproximadamente 20% o 30%, de manera más preferente al menos aproximadamente 40% o 50%, tal como al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, o aun aproximadamente 100%. La inhibición del crecimiento se puede determinar por ejemplo, en líneas pertinentes de células de cáncer como se describe en los ejemplos posteriores.
Moléculas de unión biespecífica En un aspecto adicional, las especificidades de unión de cualquiera de dos anticuerpos individuales descritos en la presente se pueden combinar en una molécula de unión biespecífica. Esta molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de dos anticuerpos que tienen como objetivo dos diferentes receptores seleccionados de EGFR, HER2 y HER3, o pueden tener las especificidades de unión de los dos anticuerpos que tienen como diana el mismo receptor. Por ejemplo, una molécula de unión biespecífica puede tener las especificidades de unión de los anticuerpos anti-EGFR (a) y (b), las especificidades de unión de los anticuerpos anti-HER2 (c) y (d), o las especificidades de unión de los anticuerpos anti-HER3 (e) y (f). De manera más particular, una molécula de unión biespecífica puede tener por ejemplo las especificidades de unión de (1) el anticuerpo anti-EGFR 10292, 10460, o 11294, y el anticuerpo anti-EGFR 10560 u 11302; (2) anticuerpo anti-HER2 10704 u 11249, y anti-HER2 anticuerpo 11145; o (3) anticuerpo anti-HER310738 o 10810, y anticuerpo anti-HER311006 u 11052. La molécula de unión biespecífica puede ser un anticuerpo de dominio variable dual, es decir, en donde los dos brazos del anticuerpo comprenden dos diferentes dominios variables, o pueden estar en la forma de un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab biespecífico o un scFv biespecífico. Moléculas de ácido nucleico, vector, y producción de anticuerpos y composiciones de anticuerpos de la invención Los aspectos adicionales de la invención se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo de la invención, en particular un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de los anticuerpos 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006 y 11052, o que codifica para una secuencia de región variable de cadena pesada y/o de cadena ligera de este anticuerpo, así como vectores de expresión que comprenden esta molécula de ácido nucleico, y células hospedadoras que comprenden la molécula de ácido nucleico o vector de expresión, en donde las células hospedadoras son capaces de expresar un anticuerpo codificado por la molécula de ácido nucleico.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para el transporte entre diferentes ambientes genéticos y/o para la expresión en una célula hospedadora. Un vector que tiene elementos reguladores para la transcripción de la secuencia de ácido nucleico (al menos un promotor adecuado) se refiere como un "vector de expresión". Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera indistinta. Los vectores de expresión usados en el contexto de la presente invención pueden ser de cualquier tipo adecuado conocido en la téenica, por ejemplo un plásmido o un vector viral.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a métodos para producir anticuerpos recombinantes humanizados y composiciones que comprenden los anticuerpos de la invención. Una modalidad de este aspecto de la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo como se define en la presente, que comprende proporcionar una célula hospedadora capaz de expresar el anticuerpo, cultivar la célula hospedadora bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y aislar el anticuerpo resultante.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para producir una composición de anticuerpos recombinantes que comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR recombinante humanizado, al menos un anticuerpo anti-HER2 recombinante humanizado y al menos un anticuerpo anti-HER3 recombinante humanizado, el método que comprende: proporcionar al menos una primera, una segunda y una tercera células hospedadoras, en donde la primera célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo anti-EGFR recombinante de la invención, la segunda célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo anti-HER2 recombinante de la invención, y la tercera célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo anti-HER3 recombinante de la invención, cultivar la primera, segunda y tercera células hospedadoras bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-HER2 y el anticuerpo anti-HER3, y aislar los anticuerpos resultantes.
Un anticuerpo o la composición de anticuerpos, de la presente invención, se puede producir por métodos en general conocidos en la téenica para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales recombinantes. De esta manera, en el caso de la producción de un anticuerpo individual de la invención, se puede usar cualquier método conocido en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes . Para la producción de una composición de anticuerpos de la invención que comprende una mezcla de anticuerpos, los anticuerpos individuales se pueden producir de manera separada, es decir, cada anticuerpo que se produce en un biorreactor separado, o los anticuerpos individuales se pueden producir conjuntamente en un biorreactor individual. Si la composición de anticuerpos se produce en más de un biorreactor, la composición de anticuerpos purificados se puede obtener al mezclar los anticuerpos obtenidos de sobrenadantes individualmente purificados a partir de cada biorreactor. Varios planteamientos para la producción de una composición de anticuerpos policlonales en múltiples biorreactores, donde las líneas celulares o preparaciones de anticuerpo se combinan en un punto final posterior o antes o durante el procesamiento de etapa anterior, se describen en W0 2009/129814 (incorporada en la presente como referencia).
En el caso de la producción de anticuerpos individuales en un biorreactor individual, esto se puede realizar por ejemplo como se describe en WO 2004/061104 o WO 2008/145133 (ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia). El método descrito en WO 2004/061104 se basa en la integración específica del sitio de la secuencia codificadora de anticuerpo en el genoma de las células hospedadoras individuales, en tanto que el método de WO 2008/145133 comprende un planteamiento alternativo que usa integración aleatoria para producir anticuerpos en un biorreactor individual.
Se puede encontrar en información adicional con respecto a método adecuados para preparar los anticuerpos y composiciones de la invención en WO 2012/059857 (incorporada como referencia).
Composiciones terapéuticas Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo un anticuerpo o composición de anticuerpo de la invención. Estas composiciones se proponen para mejorar, prevenir y/o tratar cáncer. La composición farmacéutica se puede administrar a un humano o a un animal o mascota doméstica, pero típicamente se administrará a humanos.
La relación entre los anticuerpos individuales en una composición terapéutica de la invención, o en el caso de anticuerpos individuales de la invención que se administren de manera simultánea, de forma secuencial o de forma separada, frecuentemente será tal que los anticuerpos se administran en cantidades iguales, pero esto no necesita ser necesariamente el caso. De esta manera, una composición de la invención que comprende dos anticuerpos de la familia anti-EGFR frecuentemente los contendrá en aproximadamente una relación 1:1, y una composición que comprende tres anticuerpos de la familia anti-EGFR frecuentemente los contendrá en aproximadamente una relación 1:1:1. De manera similar, una composición de anticuerpos que comprende seis anticuerpos, dos contra cada uno de los receptores EGFR, HER2 y HER3, los contendrá frecuentemente en aproximadamente una relación 1:1:1:1:1:1. Dependiendo de las características de los anticuerpos, sin embargo, puede ser deseable usar cantidades no iguales de los diferentes anticuerpos. Las relaciones adecuadas para los diferentes anticuerpos anti-HER en las composiciones de la invención se pueden determinar como se describe en W0 2010/040356 (incorporada en la presente como referencia), que describe métodos para identificar y seleccionar la relación estequiométrica óptima entre entidades químicas en un producto de fármaco de combinación, por ejemplo, una composición de anticuerpos policlonales, para obtener un fármaco combinatorio con potencia y eficiencia óptima.
Además de los anticuerpos recombinantes humanizados de la invención o fragmentos de unión de los mismos, la composición farmacéutica comprenderá adicionalmente al menos un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos pueden incluir por ejemplo conservadores, estabilizadores, agentes tensoactivos/agentes humectantes, agentes emulsionantes, solubilizadores, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores. Las soluciones o suspensiones pueden comprender adicionalmente sustancias que incrementan la viscosidad, tal como carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Un valor adecuado de pH para la composición farmacéutica estará en general en el intervalo de aproximadamente 5.5 a 8.5, tal como de aproximadamente 6 a 8, por ejemplo aproximadamente 7, mantenido donde se ha apropiado por el uso de un amortiguador.
La práctica farmacéutica convencional se puede emplear para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar a por ejemplo pacientes con cáncer por rutas convencionales de administración conocidas en la téenica. De manera similar, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de una manera conocida per se para la preparación de composiciones de anticuerpos recombinantes. Para información adicional de la formulación, administración, etc, ver PCT/IB2011/054834.
Usos terapéuticos de anticuerpos y composiciones de la invención Los anticuerpos y composiciones de la presente invención se pueden usar para el tratamiento o mejora de una enfermedad en un mamífero, en particular el tratamiento de cáncer en humanos. El término "tratamiento" como se usa en la presente se refiere a la administración de un anticuerpo, o de manera preferente, una composición de anticuerpos de la invención en una cantidad suficiente para facilitar, reducir, mejorar o erradicar (curar) los síntomas o estados de enfermedad. La administración de dos o más anticuerpos de pan-HER de la invención será en general por medio de la administración simultánea de los anticuerpos, preferentemente en la forma de una composición que contiene todos los anticuerpos de pan-HER que se van a usar para el tratamiento. Sin embargo, también es posible administrar dos o más anticuerpos de la invención de manera separada. Las referencias en la presente a por ejemplo administración de una composición de anticuerpos recombinantes que comprende al menos dos anticuerpos de la familia anti-HER por lo tanto se deben entender como que abarca no solo la administración de una composición que comprende al menos dos anticuerpos tal como, pero también, la administración separada de los anticuerpos. De esta manera las combinaciones de dos o más anticuerpos de la invención se pueden administrar de manera simultánea, secuencialmente o de forma separada. Una modalidad de la invención es un método para prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con cáncer en un humano u otro mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de anticuerpos de la presente invención al mamífero.
Una modalidad particular se refiere a un método para tratar un paciente, típicamente un paciente humano, con un trastorno caracterizado por la expresión o sobreexpresión de, o la dependencia en cualquiera de uno o más de los receptores EGFR, HER2 y HER3 de la familia de EGFR, en particular cáncer, el método que comprende administrar al paciente una composición de anticuerpos recombinantes o composición farmacéutica como se define en la presente. El término "dependencia de HER" se refiere a una célula de cáncer con dependencia de uno o más de los receptores de la familia de HER para mantener propiedades malignas tal como proliferación, crecimiento, motilidad, invasión, supervivencia y/o quimioresistencia. La dependencia se puede provocar por la sobreexpresión del receptor, por mutaciones del receptor, por la producción de factores autócrinos de crecimiento y/o comunicación intercelular con otros sistemas receptores.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para tratar cáncer en un paciente, típicamente un paciente humano, que tiene resistencia adquirida al tratamiento con un anticuerpo y/o un inhibidor de tirosina-cinasas (TKI, por sus siglas en inglés), el método que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición de anticuerpos recombinantes o composición farmacéutica como se define en la presente.
En base a varios factores, se pueden indicar los siguientes tipos de tumor en particular para el tratamiento con una composición de anticuerpos de la invención: cáncer de mama, de ovario, gástrico, de colon, de recto, de próstata, de vejiga, de páncreas, melanoma, de cabeza y cuello y cáncer de pulmón de células no pequeñas. Las composiciones de anticuerpo de la invención se contemplan como que son particularmente aplicables al tratamiento de cánceres que sobreexpresan EGFR o HER2, por ejemplos ciertos cánceres epiteliales tal como muchos cánceres de mama, cánceres ováricos y cánceres gástricos (de estómago).
En una modalidad, se usan composiciones de anticuerpos de la invención para tratar un paciente con cáncer pancreático. El paciente puede tener una mutación de KRAS.
En una modalidad, el paciente no se ha tratado previamente para cáncer. En otra modalidad, el paciente se ha tratado previamente para cáncer. El paciente puede haber sido tratado con cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab previamente. El cáncer en el paciente puede tener resistencia adquirida a cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab.
En unión con cada una de estas indicaciones, se contemplan dos rutas clínicas principales, específicamente 1) terapia adjunta en unión con al menos un tratamiento terapéutico adicional o 2) como una monoterapia 1) Terapia adjunta: En la terapia adjunta, también conocida como terapia de combinación, los pacientes se tratarán con los anticuerpos de la presente invención en combinación con al menos un tratamiento terapéutico adicional, típicamente un agente quimioterapéutico o antineoplástico y/o terapia de radiación. De manera alternativa o adicionalmente, la composición de la invención también se puede usar en combinación con un diferente anticuerpo anti-cáncer, por ejemplo un anticuerpo que tiene como diana VEGF. Las dianas de cáncer primario, listadas anteriormente de esta manera se pueden tratar mediante la administración de un anticuerpo o composición de la invención además de una terapia normal de primera línea y de segunda línea. Los diseños de protocolo afrontarán la efectividad como se valora por ejemplo mediante la reducción en la masa tumoral así como la capacidad para reducir las dosis usuales de quimioterapia normal. Estas reducciones de dosis pueden permitir terapia adicional y/o prolongada al reducir la toxicidad relacionada a la dosis del agente quimioterapéutico.
Al combinar las composiciones de anticuerpos de la invención con agentes que se conoce que inducen diferenciación terminal de células de cáncer, el efecto se puede mejorar adicionalmente. Estos compuestos se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de ácidos retinoico, ácido trans-retinoicos, ácidos cis-retinoicos, fenilbutirato, factor de crecimiento de nervios, sulfóxido de dimetilo, vitamina D3 en forma activa, receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma, 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol, hexametilen-bis-acetamida, factor-beta de crecimiento transformante, ácido butírico, AMP cíclico, y vesnarinona. De manera preferente, el compuesto se selecciona del grupo que consiste de ácido retinoico, fenilbutirato, ácido transretinoico total y vitamina D en forma activa.
Los artículos farmacéuticos que comprenden una composición de anticuerpos de la invención y al menos un compuesto quimioterapéutico o antineoplástico se pueden usar como un tratamiento de combinación para la administración simultánea, separada o sucesiva en terapia de cáncer. El compuesto quimioterapéutico puede ser cualquier agente quimioterapéutico adecuado para el tratamiento del cáncer particular en cuestión, un agente seleccionado del grupo que consiste de agentes de alquilación, por ejemplo derivados de platino tal como cisplatina, carboplatina y/o oxaliplatina; alcaloides vegetales, por ejemplo paclitaxel, docetaxel y/o irinotecano; antibióticos antitumorales, por ejemplo doxorubicina (adriamicina), daunorubicina, epirubicina, idarubicina-mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina, actinomicina, luteomicina, y/o mitomicina; inhibidores de topoisomerasa tal como topotecano; y/o antimetabolitos, por ejemplo fluorouracilo y/u otras fluoropirimidinas.
También se contempla que las composiciones de anticuerpos de la invención se pueden usar en terapia adjunta en unión con inhibidores de tirosina-cinasas. Estas son moléculas sintéticas de bajo peso molecular, principalmente derivadas de quinazolina que interactúan con el dominio intracelular de tirosina-cinasa de los receptores e inhiben la fosforilación del receptor inducida por el ligando al competir por el sitio intracelular de unión de Mg-ATP. Varios inhibidores de tirosina-cinasas que bloquean HER2-cinasa actualmente están en desarrollo clínico. Algunos de estos también tienen como diana EGFR u otros receptores de la familia de EGFR. Para una revisión de estos TKI ver Spector et al. (2007) Breas t C ncer Res . 9(2): 205. Los artículos farmacéuticos que comprenden una composición de anticuerpos de la invención y al menos un TKI que tiene como diana HER2 de esta manera también se pueden usar como un tratamiento de combinación par la administración simultánea, separada o sucesiva en terapia de cáncer.
En otras modalidades, las composiciones de anticuerpos de la presente invención se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo contra VEGF (por ejemplo AvastinMR). En aún otras modalidades, las composiciones de anticuerpos de la presente invención se pueden usar en combinación con un agente conocido por estimular células del sistema inmunitario, este tratamiento de combinación que conduce a mejora inmunomediada, mejorada de la eficiencia de las composiciones de anticuerpos de la invención. Los ejemplos de esos agentes inmuoestimuladores incluyen interleucinas recombinantes (por ejemplo IL-21e e IL-2). 2) Monoterapia: En unión con el uso de la composición de anticuerpos de acuerdo con la presente invención en monoterapia de tumores, la composición de anticuerpos se puede administrar a pacientes sin el uso concurrente de un agente quimioterapéutico o antineoplásico, es decir como una terapia independiente.
Inmunoconjugados Otra opción para el uso terapéutico de las composiciones de la invención está en la forma de inmunoconjugados, es decir, anticuerpos conjugados a uno o más agentes anti-cáncer. En particular en el caso de composiciones de la invención que se unen a diferentes epítopos, se contempla que esto puede generar una retícula reticulada de anticuerpo-receptor en la superficie celular, dando por resultado de este modo potencialmente un nivel incrementado de internalización del receptor en comparación al uso de un anticuerpo monoclonal individual. La conjugación de uno o más de los anticuerpos individuales de esta composición a uno o más agentes anti-cáncer tiene por lo tanto el potencial de distribuir de manera específica y de forma efectiva los agentes anti-cáncer conjugados al interior de las células tumorales, aumentando de este modo el efecto de la composición de anticuerpos de la invención para proporcionar una actividad mejorada de aniquilación de células tumorales.
A los anticuerpos de la invención se pueden conjugar varios tipos de agente anti-cáncer, incluyendo agentes citotóxicos (incluyendo agentes convencionales de quimioterapia y otros fármacos anti-cáncer de molécula pequeña), citocinas (caso en el cual el conjugado se puede llamar una "inmunocitocina"), toxinas (caso en el cual el conjugado se puede llamar una "inmunotoxina") y radionúclidos, y unos pocos inmunoconjugados se han aprobado ya para uso clínico.00. Estos incluyen ZevalinMR (un anticuerpo anti-CD20 murino conjugado a 90Y), BexxarMR (un anticuerpo anti-CD20 murino conjugado a 131I) y MylotargMR (un anticuerpo anti-CD33 humanizado conjugado a caliqueamicina). Otros inmunoconjugados que se han probado en ensayos clínicos incluyen anticuerpos conjugados a por ejemplo doxorubicina o un compuesto maitansinoide. Las inmunotoxinas que se han probado en ensayos clínicos incluyen varios anticuerpos conjugados a una exotoxina A truncada de Pseudomonas . También se ha probado una inmunocitocina que comprende un anticuerpo EpCAM humanizado conjugado a IL-2.
En el caso de anticuerpos de la invención conjugados a agentes citotóxicos, estos pueden corresponder por ejemplo a cualquiera de las clases principales de fármacos de quimioterapia, incluyendo agentes de alquilación (por ejemplo carboplatina, cisplatina, oxaliplatina), antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, capecitabina, gemcitabina), antracielinas (por ejemplo bleomicina, doxorubicina, mitomicina-C) y alcaloides vegetales (por ejemplo taxanos tal como docetaxel y paclitaxel, y alcaloides de vincapervinca tal como vinblastina, vincristina y vinorelbina). Puesto que el uso de los inmunoconjugados dirige específicamente el agente anti-cáncer a los tumores, y en particular al interior de las células tumorales subsiguiente a la internalización, los inmunoconjugados basados en los anticuerpos de la invención se pueden basar de manera ventajosa en agentes altamente citotóxicos tal como caliqueamicina o derivados de maitansina, o en toxinas tal como toxinas bacterianas (por ejemplo exotoxina A de Pseudomonas , toxina de difteria) o toxinas vegetales (por ejemplo ricino).
El agente anti-cáncer conjugado en un inmunoconjugado se enlaza en general al anticuerpo por medio de un ligador lábil que es relativamente estable en suero pero que permite la liberación del agente cuando el inmunoconjugado se internaliza en la célula diana. Los ligadores adecuados incluyen, por ejemplo, ligadores clínicos que son estables a pH neutral en suero pero que se someten a hidrólisis ácida en las condiciones mediadamente ácidas dentro de los lisosomas subsiguiente a la internalización, ligadores de disulfuro que se escinden por los dioles intracelulares, y ligadores peptídicos que son estables en suero pero que se someten a escisión enzimática en los compartimientos intracelulares.
Se pueden contemplar varios arreglos de conjugación en las composiciones que contienen dos o más anticuerpos de la invención. Por ejemplo, con dos anticuerpos será posible conjugar los anticuerpos a dos o más diferentes fármacos anti-cáncer o conjugar un anticuerpo a un profármaco que se activa por un agente tal como una enzima conjugada al otro anticuerpo. El concepto general de la terapia de profármaco enzimático dirigida por anticuerpo (ADEPT, por sus siglas en inglés) se ha descrito para anticuerpos monoclonales, donde se activa un profármaco por una enzima dirigida al tumor por un conjugado de mAB-enzima, pero la presente invención puede proporcionar una oportunidad para ajustar este planteamiento a condiciones particulares. De esta manera, puede ser posible incrementar de manera específica la aniquilación de células tumorales en tanto que se prescinde o reduce el daño a los tejidos normales.
Para información adicional de los inmunoconjugados anti-cáncer, ver Wu et al. (2005) Na ture 20 Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159; y Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60.
Las composiciones de la invención que comprenden anticuerpos dirigidos contra dos o más receptores de la familia de EGFR pueden contener un anticuerpo individual en la forma de un inmunoconjugado, o pueden contener dos o más anticuerpos en la forma de un inmunoconjugado, por ejemplo, uno o posiblemente dos inmunoconjugados que tienen como diana cada uno de los receptores EGFR, HER2 y HER3.
Dosis y ruta de Administración Las composiciones de anticuerpos de la invención se administran en una cantidad efectiva para el tratamiento de la condición en cuestión, es decir a dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr un resultado deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar de acuerdo a factores tal como la condición particular que se trate, la edad, género y peso del paciente y si los anticuerpos se administran como un tratamiento independiente o en combinación con uno o más tratamientos anti-cáncer adicionales.
Una cantidad efectiva para terapia de tumor se puede medir por su capacidad para estabilizar el progreso de la enfermedad y/o mejorar los síntomas en un paciente, y de manera preferente para invertir el progreso de la enfermedad, por ejemplo al reducir el tamaño del tumor. La capacidad de un anticuerpo o composición de la invención para inhibir cáncer se puede evaluar por ensayos in vitro, por ejemplo como se describe en los ejemplos, así como en modelos animales adecuados que son predictivos de la eficiencia en tumores humanos. Los regímenes adecuados de dosis se seleccionarán a fin de proporcionar una respuesta terapéutica óptima en cada situación particular, por ejemplo, administrado como un bolo individual o como una infusión continua y con ajuste posible de la dosis como se indica por las exigencias de cada caso.
En tanto que aún no se ha determinado la dosificación específica para los anticuerpos de acuerdo con la invención, se pueden determinar ciertas consideraciones de dosificación a través de la comparación con un producto similar (por ejemplo un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2 o EGFR) que se ha probado para uso terapéutico. De esta manera, se contempla que una dosis apropiada de una composición de anticuerpos de la invención se hará similar a la dosis recomendada para el anticuerpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab (HerceptinMR) o el anticuerpo monoclonal anti-EGFR panitumumab (VectibixMR). Dependiendo de la condición particular, se administra HerceptinMR (por medio de infusión) para el tratamiento de cáncer de mama ya sea en una dosis inicial de 4 mg/kg y subsiguientemente a dosis semanales de 2 mg/kg, o una dosis inicial de 8 mg/kg y dosis subsiguientes de 6 mg/kg cada tres semanas, en tanto que se administra VectibixMR a una dosis de 6 mg/kg cada 14 días.
Se contempla que una dosis adecuada de una dosis adecuada de una composición de anticuerpos de la invención estará en el intervalo de 0.1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0.5-50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 1-20 mg/kg. La composición de anticuerpo se puede administrar por ejemplo en una dosis de al menos 0.25 mg/kg, por ejemplo al menos 0.5 mg/kg, tal como al menos 1 mg/kg, por ejemplo al menos 1.5 mg/kg, tal como al menos 2 mg/kg, por ejemplo al menos 3 mg/kg, tal como al menos 4 mg/kg, por ejemplo al menos 5 mg/kg; y por ejemplo hasta a lo mucho 50 mg/kg, tal como hasta a lo mucho 30 mg/kg, por ejemplo hasta a lo mucho 20 mg/kg, tal como hasta a lo mucho 15 mg/kg. La administración se repetirá normalmente a intervalos adecuados, por ejemplo una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas y tan largo como se juzga apropiado por el doctor responsable quien puede incrementar o disminuir opcionalmente la dosis como sea necesario.
Se contemplan tres distintos planteamientos de administración para la administración de los anticuerpos de la invención. La administración intravenosa convencional será presumiblemente la téenica de administración normal para la mayoría de los tumores. Sin embargo, en unión con tumores en la cavidad peritoneal, tal como tumores del ovario, conducto biliar, otros conductos y similares, la administración intraperitoneal puede probar ser favorable para obtener una alta dosis del anticuerpo en el tumor y para reducir al mínimo la depuración del anticuerpo. De manera similar, ciertos tumores sólidos poseen vasculatura que es apropiada para la perfusión regional. La perfusión regional puede permitir la obtención de una alta dosis del anticuerpo en el sitio de un tumor y reducir al mínimo la depuración acorto plazo del anticuerpo.
Como con cualquier producto terapéutico a base de infusión de proteína o anticuerpo, las cuestiones de seguridad se refieren principalmente a (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, sacudimiento, escalofríos, (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica a la proteína (es decir, desarrollo de anticuerpos humanos por el paciente al producto de anticuerpos recombinantes), y (iii) toxicidad a células normales que expresan los receptores de la familia de HER, por ejemplo muchas células epiteliales. Se utilizan pruebas normales y procedimientos de seguimiento para monitorizar cualquiera de estas cuestiones de seguridad.
Usos de Diagnóstico y Composiciones Los anticuerpos de la presente invención también son útiles en procesos de diagnóstico (por ejemplo, in vitro, ex vivo) . Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para detectar y/o medir el nivel de EGFR, HER2, o HER3 en una muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, saliva u orina. Los métodos adecuados de detección y medición incluyen métodos inmunológicos tal como citometría de flujo, ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISA), ensayos quimioluminiscentes, radioinmunoensayo, e inmunohistología. La invención abarca adicionalmente equipos o kits (por ejemplo, equipos de diagnóstico) que comprenden los anticuerpos descritos en la presente.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde está invención. Los métodos y materiales de ejemplo se describen más adelante, aunque en la práctica o prueba de la presente invención también se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, controlará la presente descripción, incluyendo las definiciones. Aunque en la presente se citan varios documentos, esta cita no constituye una admisión que cualquiera de estos documentos formen parte del conocimiento general común en la téenica. A todo lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" o variaciones tal como "comprenden" o "que comprende" se entenderán que aplica a la inclusión de un número entero señalado o grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se propone que sean limitantes.
Se propone que los siguientes ejemplos ilustren métodos y materiales de la presente invención. Las modificaciones y adaptaciones adecuadas de las condiciones y parámetros descritos, normalmente encontrados en la técnica que son obvios para los expertos en la técnica que son obvio para los expertos en la técnica, están dentro del alcance y espíritu de la presente invención. Los términos "fragmento de unión a antígeno" y "porción de unión a antígeno" se usan de manera indistinta en la presente .
Ejemplos Ejemplo 1: Humanización de anticuerpos quimericos Identificación de regiones menos variables de aceptador y posiciones críticas para mutación.
El método elegido para la humanización se basó en el injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR) seguido por retromutación de residuos críticos usando un planteamiento de biblioteca combinatoria, donde se evaluaron simultáneamente todas las combinaciones de hasta 13 retromutaciones.
Las CDR de los anticuerpos murinos donadores ser injertaron en la región menos variable del aceptador de región V humana más cercana, que se encontró al comparar las secuencias de aminoácidos de la región V de los anticuerpos donadores con el repertorio de línea germinal humana de las secuencias de la región V y J (directorio de referencia IMGT). Las regiones V y J de línea germinal más cercanas identificadas para cada anticuerpo se muestran en la Tabla 5 posterior.
Para 1277VL, la región V de línea germinal humana más cercana fue IGKV2-30*02. Sin embargo, puesto que la familia de IGKV2 raramente se usa en el repertorio humano, también se seleccionó una segunda región menos variable del aceptador a partir de la familia de IGKV1. Cada una de las dos regiones menos variables se usaron para la generación de una biblioteca de retromutaciones de VL y se combinó con la biblioteca de retromutaciones de VH 1277 individual.
Puesto que el injerto de CDR sólo no puede ser suficiente para recrear la especificidad y afinidad de unión, y de esta manera la actividad biológica, de un anticuerpo de roedor, se pueden tener que introducir retromutaciones en posiciones críticas. Las posiciones potencialmente críticas incluyen aquellas que están somáticamente hipermutadas en el anticuerpo donador, las posiciones que pueden estar en contacto directo con el antígeno o la estructura de CDR de influencia (residuos determinantes de estructura y residuos de la zona Vernier) , las posiciones en la interfaz VH/VL o responsables del ángulo de empaquetado de VH/VL, y las posiciones que están ocupadas por residuos estadísticamente raros (en comparación al repertorio de anticuerpos) o estructuralmente desfavorables. Estas posiciones se pueden identificar usando información disponible en la literatura y en las bases de datos de anticuerpos (por ejemplo, Padlan (1994) Mol.Immunol. 31: 169-217; Honeggel y Plückthun (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670; http ://www.bioc.uzh.ch/antibody ; Martin y Thornton (1996) J. Mol. Biol., 263: 800-815; Foote y Winter (1992) J.
Mol. Biol. 224: 487-499), o al realizar el modelado estructural de la secuencia injertada in silico . Una combinación de estos dos planteamientos se usó para identificar posiciones potencialmente críticas para la retromutación en cada uno de los anticuerpos.
Además de las posiciones de retromutación, también se identificaron motivos indeseados expuestos de secuencia en las CDR. Estos motivos incluyeron sitios de desamidación de asparagina (Asn-Gly) , isomerización de aspartato (Asp-Gly) y oxidación de metionina. Los motivos identificados de secuencia se alteraron por sustitución conservadora o reemplazo con un residuo de aminoácido que se presenta frecuentemente en una de las posiciones (como lo opuesto a la retromutación a la secuencia murina).
Se identificó e incluyó un máximo de 13 posiciones críticas en el diseño de la biblioteca para cada anticuerpo (Tabla 5). El número de posiciones se seleccionó en base al tamaño de las bibliotecas resultantes de retromutaciones. Por ejemplo, si se varían 13 posiciones entre dos diferentes aminoácidos (por ejemplo, residuo humano o murino) que produce 8192 variantes cuando se combina en una biblioteca molecular. La ubicación de las posiciones identificadas en cada anticuerpo se muestra en el listado anexo de secuencias. Donde los residuos de aminoácido indicados por "Xaa" son posiciones potencialmente críticas seleccionadas para mutación .
Tabla 5: Diseño de bibliotecas para humanización *Número de posiciones donde se introducen retromutaciones o están alterados los motivos indeseados de secuencia.
Generación de bibliotecas de retromutaciones Las bibliotecas de retromutaciones para cada secuencia de VH y VL se sintetizaron por montaje génico de PCR de oligos de ADN traslapados que abarcan 60-80 pares de base de la secuencia. La región constante de cadena ligera se adicionó por PCR de extensión de traslape para generar genes de cadena ligera de longitud completa. Se prepararon bibliotecas moleculares de variantes de anticuerpos humanizados al sub-clonar las bibliotecas de VH y de cadena ligera para cada anticuerpo en un vector de expresión de mamífero seguido por expresión transitoria de variantes de anticuerpo individuales en células HEK293 en el formato de 384 pocilios como se describe en otra parte de la presente (Meijer et al., (2009) Methods Mol Biol. 525:261-77). Los sobrenadantes de expresión se recolectaron y usaron para examen.
Examen de constante de disociación de bibliotecas de humanización Los sobrenadantes de expresión de la biblioteca se examinaron en un ELISA de intercalación que emplea captura por IgG por Fe a anti-IgG humana a baja densidad seguido por detección con antígeno biotinilado monovalente. Este escenario de ELISA permitió la clasificación sensible y confiable de la afinidad de unión sin interferencia de los efectos de avidez o niveles variables de expresión de clones individuales. En total se usaron 24 placas de 384 pocilios para cada examen de biblioteca que corresponde a 8832 pocilios individuales y un muestreo de biblioteca de aproximadamente 1 (p=0.65 para recuperar un miembro distinto de bibliotecas). Se incubaron 5 ml de cada sobrenadante de expresión de biblioteca con anticuerpos de captura Fe anti-IgG humana, revestidos a 4°C durante la noche para asegurar que todos los sobrenadantes, a pesar del nivel de expresión del anticuerpo, alcanzaron la unión de equilibrio. Entonces, las pocilios se lavaron y se adicionó el antígeno biotinilado (EGFR, HER2 o HER3 de humano; Sino Biological, Beijing, P.R. China; biotinilado en casa) a una concentración previamente determinada como suficiente para la saturación de las normas de anticuerpos quiméricos. Las placas se lavaron y el antígeno se dejó disociar de los anticuerpos capturados durante un intervalo predeterminado de tiempo dependiendo de la disociación medida de la norma del anticuerpo quimérico de origen. Finalmente, se adicionó polímero de estreptavidina-peroxidasa (Sigma) y las placas se desarrollaron usando substrato de TMB-plus (Kem-En-Tec Diagnostics, Taastrup, Dinamarca).
Se sometieron aproximadamente 100 aciertos de cada biblioteca que produjo una señal de OD similar a o mayor que aquella del anticuerpo quimérico de origen a una clasificación de la constante de disociación usando un instrumento OctetMR QK384 (Fortebio, Menlo Park, CA). Se usaron biosensores de proteína G (Fortebio) para captura del anticuerpo de 40 ml de sobrenadante de expresión seguido por incubación con antígeno humano o de cynomolgus a 200 nM. Los antígenos humanos se obtuvieron de Sino Biologicals y los antígenos de cynomolgus se produjeron en casa por expresión transitoria en células CHO o HEK293 (Koefoed et al. (2011) mAbs, 3:6, 1-12). Subsiguientemente, los biosensores se incubaron en PBS y se registró la disociación del antígeno durante 20 minutos para permitir una determinación confiable de las constantes de disociación. Las respuestas se ajustaron globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 para el cálculo de las constantes de disociación. En conjunto, se encontró que múltiples aciertos de cada biblioteca tienen constantes de disociación tanto del antígeno humano como de cynomolgus similares a o más lentos que aquel del anticuerpo de origen.
Análisis de secuencia Los plásmidos que codifican para los aciertos seleccionados para la clasificación por constante de disociación se sometieron a secuenciación de ADN (M G Biotech, Ebersberg, Alemania), y las secuencias obtenidas se alinearon y compararon a las regiones V injertadas de CDR generadas in silico. En las Figuras 1-6 se muestran las alineaciones de los aciertos seleccionados. Todos los aciertos del examen de las bibliotecas iniciales con base a los anticuerpos 1277 y 1565 se encontró que han retenido el sitio de desamidación (Asn-Gly) en CDRL1 y CDRH2 , respectivamente, indicando de este modo la importancia del motivo para la interacción con la diana. Sin embargo, solo se intentó en ambos casos una mutación de reemplazo individual (Asn a Ser) y es bastante probable que se puedan generar variantes de unión desprovistas del motivo de secuencia mediante la mutagénesis saturada de una o ambas posiciones que constituyen el motivo. El examen de las bibliotecas generadas por mutagénesis saturada basada en PCR de los sitios de desamidación produjo aciertos desprovistos de este motivo indeseado de secuencia (Figuras 1 y 2). Las variantes de anticuerpo potencialmente de unión desprovistas de los motivos indeseados de secuencia, se encontraron en todas las otras bibliotecas.
Se seleccionaron entre cuatro y diez aciertos de cada examen de biblioteca en base a la unión retenida o mejorada a antígeno humano y de cynomolgus, el número de retromutaciones y la ausencia de motivos indeseados de secuencia para la expresión a mayor escala y purificación por cromatografía de proteína A. Se encontró que una de las variantes humanizadas, el anticuerpo 11006, tiene una mutación fortuita en CDRL1 (I29T; SEQ ID NO: 13 y Figura 6) que no fue parte del diseño de la biblioteca, pero sin embargo se seleccionó para la expresión debido a la constante de disociación mejorada y la remoción mejorada de un sitio de isomerización de aspartato en CDRH2.
Análisis de unión cinética de variantes humanizadas por resonancia de plasmón superficial Se realizó el análisis de unión cinética de las variantes humanizadas purificadas en un biosensor ProteOn XPR36 (BioRad, EUA) que emplea un ensayo de captura de IgG por Canziani et al. (Anal. Biochem. (2004) 325:301-307) que permite la medición de las afinidades de anticuerpo de moléculas de IgG enteras contra antígenos solubles baja condiciones monovalentes. De forma breve, se conjugaron aproximadamente 5000 unidades de resonancia (RU) de un anticuerpo Fe anti-IgG humana de ratón monoclonal (GE Healthcare, Dinamarca) a una superficie de chip GLC (BioRad, EUA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, seguido por captura de anticuerpos individuales de la invención o un control negativo en la superficie del sensor anti-Fc. Las densidades de los anticuerpos capturados se optimizaron para cada clon, de modo que la unión de la concentración más alta de antígeno empleada en este ensayo no excede ~30 RU. Entonces, se inyectaron 250 ml de antígeno monovalente (Sino Biologicals) a una velocidad de flujo de 50 ml/min en diluciones en serie de tres veces desde solución concentrada 100 nM para generar curvas de respuesta. La superficie del chip se generó entre ciclos al despojar los complejos de antígeno/anticuerpo capturados de la superficie con una inyección de 10 segundos de MgCl2 3 M (GE Healthcare, Dinamarca) repetido tres veces. Finalmente, las respuestas de unión se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1 para cálculo de la constante de asociación (kon o ka), constante de disociación (koff o kd) o constantes de afinidad (KD) usando doble referencia. Los resultados del análisis de unión cinética muestran que las variantes seleccionadas han retenido o aún mejoraron una afinidad para el antígeno humano y de cynomolgus en comparación a los anticuerpos quiméricos de origen (Tabla 6).
Tabla 6: Afinidad de unión de anticuerpos quiméricos de origen y anticuerpos humanizados *KD no se puede determinar debido a una constate de disociación muy lenta. Se estima que está en el intervalo picomolar.
Evaluación funcional in vitro de variantes humanizadas Se probaron variantes de anticuerpos humanizados para el efecto funcional en un ensayo de viabilidad en combinación con un "anticuerpo compañero" quimérico en una mezcla de anticuerpos que contiene dos anticuerpos contra diferentes epítopos de una diana particular (donde "anticuerpo compañero" se refiere al hecho que las variantes del anticuerpo 1277 (anti-EGFR) se probaron conjuntamente con el anticuerpo anti-EGFR quimérico 1565, las variantes del anticuerpo 4384 (anti-HER2) se probaron en combinación con el anticuerpo anti-HER2 quimérico 4517, y así sucesivamente) para determinar si se conservó después de la humanización la sinergia funcional entre los dos anticuerpos que tienen como diana el mismo receptor. Cada variante humanizada se probó en dos líneas celulares y se comparó a la mezcla parental de dos anticuerpos quiméricos y un anticuerpo de control negativo. Las líneas celulares usadas se seleccionaron en base a su dependencia previamente determinada del receptor, es decir, cáncer A431NS epidermoide, cáncer de pulmón de células no pequeñas H358 y cánceres de cabeza y cuello FaDu par EGFR, cáncer 0E19 esofágico y de mama BT474 para HER2, y cáncer de mama MDA-MB-175 VII y MCF-7 para HER3. Además, se probó una combinación de seis variantes humanizada (11294, 11302, 11249, 11145, 10738 y 11052; Pan-HER Humanizado) en varias líneas celulares y se compararon a la combinación de los seis anticuerpos quiméricos (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082; Pan-HER Quimérico). Las líneas celulares usadas, cáncer gástrico N87, de cabeza y cuello FaDu, epidermoide A431NS, esofágico 0E19, de cabeza y cuello HN5, de mama MDA-MB-175 VII y endometrial MFE-280, se seleccionaron en base a su dependencia previamente determinada en los receptores de la familia HER.
Antes de realizar el ensayo de viabilidad, los anticuerpos apropiados y las mezclas de anticuerpos se diluyeron a una concentración total final de anticuerpo de 100 mg/ml en el medio apropiado complementado con 0.5-2% de FBS y 1% de P/S (penicilina/estreptomicina), produciendo una concentración total final de anticuerpo de 50 pg/ml en la pocilio que contiene la concentración más alta de anticuerpos. Entonces, se realizó una dilución en serie tres veces de los anticuerpos en una placa de 384 pocilios, seguido por la adición de números pertinentes de células a las pocilios experimentales. Las células MCF-7 también se estimularon con heregulina beta 1 nM. Las placas se incubaron durante 4 días en una incubadora humidificada a 37°C. Se adicionó el reactivo WST-1 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) a las placas y las placas se incubaron durante 1-3 horas a 37°C. Las placas se transfirieron a un agitador orbital de placas durante una hora y se midió la absorbancia a 450 y 620 nm (longitud de onda de referencia) usando un lector ELISA. Se calcula el porcentaje de células metabólicamente activas (MAC) como un porcentaje del control no tratado como sigue: — En las figuras 7-15 y 17-19 se muestra la actividad in vitro de las variantes seleccionadas de anticuerpos humanizados. Los resultados muestran que todas las variantes humanizadas seleccionadas presentan un efecto anti-proliferativo cuando se combinan con su compañero quimérico o humanizado que es muy similar al efecto de la mezcla pertinente de dos anticuerpos quiméricos de origen. Adicionalmente, la combinación de seis variantes humanizadas también presenta un efecto muy similar al efecto de la combinación de los seis anticuerpos quiméricos de origen (figura 20).
Especificidad de variantes humanizadas (reactividad cruzada) Los anticuerpos quiméricos de origen y las variantes humanizadas seleccionadas se probaron para la unión a EGFR, HER2 y HER3 de humanos, monos cynomolgus y ratones, así como HER4 humano y murino, para determinar si la humanización ha introducido algún cambio en el patrón de reactividad cruzada.
Se midió la unión de anticuerpo-antígeno mediante ELISA con antígenos revestidos. Los antígenos humanos se obtuvieron de Sino Biologicals. Todos los otros antígenos se produjeron en casa mediante la expresión transiente en células CHO o HEK293. Se incubaron anticuerpos quiméricos y humanizados, así como un anticuerpo de control de isotipo, con los antígenos revestidos a diferentes concentraciones. Después del lavado, los anticuerpos unidos se detectaron por anticuerpos secundarios conjugados a HRP (peroxidasa de rábano). La señal OD del anticuerpo 40 nM, medida a 450 nm usando un lector de ELISA, se clasificó de negativo (-; OD <0.1) a fuertemente positivo (+++; OD> 2.5).
Los resultados, mostrados en la tabla en la figura 16, demuestran que la reactividad cruzada entre los respectivos antígenos de humano y de cynomolgus está conservada en todas las variantes de anticuerpos humanizados, y que no se ha introducido nueva reactividad a los miembros de la familia de receptores de factor de crecimiento epidérmico.
Sumario y conclusiones Se produjeron varias variantes humanizadas de los anticuerpos anti-EGFR, anti-HER2 y anti-HER3 quiméricos descritos en PCT/IB2011/054834 mediante examen de bibliotecas injertadas de CDR generadas por retro-mutación de posiciones menos variables potencialmente críticas y en algunos casos mediante la alteración de motivos indeseados de secuencia de CDR. Aproximadamente 100 aciertos de cada biblioteca seleccionados para afinidad de unión al antígeno diana pertinente se sometieron a clasificación de constante de disociación, y las variantes con una constante de disociación similar o más lenta que aquella del anticuerpo quimérico de origen se seleccionaron y se secuenciaron. Se seleccionaron entre cuatro y diez ciertos de cada examen de biblioteca con base a la unión retinada o mejorada al antígeno humano y de cynomolgus, varias retromutaciones y la ausencia de motivos indeseados de secuencia para la expresión y purificación a gran escala. Las variantes purificadas, seleccionadas de anticuerpos humanizados se sometieron a un análisis de unión cinética para determinar la afinidad de unión a antígeno humano y de cynomolgus, al análisis funcional in vitro en un ensayo de viabilidad en combinación con un anticuerpo compañero quimérico que se une a un diferente epítopo del mismo receptor y a un ensayo de reactividad cruzada.
Se encontró que cada uno de los anticuerpos variantes humanizados 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 112449, 11145, 10738, 10810, 11006 y 11052 exhibe propiedades funcionales que son muy similares aquellas del anticuerpo quimérico original de origen del cual se derivaron, incluyendo: - afinidad de unión similar o superior; - constante de disociación similar o más lenta; - unión al mismo antígeno humano y de cynomolgus combinado con carencia de unión al antígeno de ratón o a otros receptores de la familia de EGFR; y - efectos anti-proliferativos altamente similares en dos diferentes líneas de células cuando se prueba en un ensayo in vitro funcional en combinación con el anticuerpo compañero quimérico.
Estos resultados demuestran de esta manera que las variantes de anticuerpos humanizados de la invención tienen características funcionales que son altamente similares a los respectivos anticuerpos quiméricos de origen de los cuales se derivan. Esto sugiere fuertemente que las mezclas de los anticuerpos humanizados de la invención, por ejemplo, mezclas que contienen uno o dos de estos anticuerpos contra cada uno de los receptores EGFR, HER2 y HER3 de la familia a de EGFR, se pueden esperar que demuestren efectos anti-cáncer in vivo que son similares a los efectos de las mezclas de los anticuerpos quiméricos de origen descritos en PCT/IB2011/054834.
Ejemplo 2: Dos anticuerpos monoclonales contra epítopos no traslapados en EGFR, HER2 o HER3 presentan actividad sinérgica inhibitoria de crecimiento in vitro e inducen efectiva la reducción de la expresión de la diana Se probaron anticuerpos contra epítopos no traslapados en EGFR (es decir, 1277 y 1565), HER2 (es decir, 4384 y 4517), y HER3 (es decir, 5038 y 5082) como se ilustra en la figura 21A, para su capacidad para inhibir el crecimiento y la proliferación de las líneas de las células de cáncer A431NS, HCC202, y MDA-MB-175-VII, respectivamente, usando un ensayo de viabilidad. Los tratamientos con anticuerpos consistieron de anticuerpos a cada receptor administrado ya sea solo o en las siguientes combinaciones: mezcla de 1277 y 1565, mezclas de 4384 y 4517, y mezclas de 5038 y 5082. El daño celular dará por resultado inevitablemente la pérdida de la capacidad de la célula para mantener y proporcionar energía para el crecimiento y función celular metabólica. Los ensayos de actividad metabólica se basan en esta premisa y usualmente miden la actividad mitocondrial. El reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche Cat. No 11 644 807 001) es un substrato listo para usar que mide la actividad metabólica de células viables. Se asume que la actividad metabólica correlaciona con el número de células viables. En este ejemplo, se uso el ensayo de WST-1 para medir el número de células metabólicamente activas después del tratamiento de células de cáncer con diferentes concentraciones de anticuerpos durante 96 horas.
Antes de realizar el ensayo de WST-1, los anticuerpos apropiados y las mezclas apropiadas de anticuerpos se diluyeron a una concentración final total de anticuerpo de 100 mg/ml en un medio apropiado complementado con 2% de FBS y 1% de P/S produciendo una concentración total final de anticuerpo de 50 pg/ml en la pocilio que contiene la concentración más alta de anticuerpo. Entonces, se realizó una dilución en serie tres veces de los anticuerpos. Entonces se adicionaron números pertinentes de células a las pocilios experimentales en una placa de 384 pocilios. Las placas se incubaron durante 4 días en una incubadora humidificada a 37°C. Entonces se adicionó el reactivo WST-1 a las placas y las placas se incubaron durante una hora a 37°C. Las placas se transfirieron a un agitador orbital de placas durante una hora y se midió la absorbancia a 450 y 620 nm (longitud de onda de referencia) usando un lector de ELISA. La cantidad de células metabólicamente activas (MAC) se calcula como un porcentaje del control no tratado como sigue: Los efectos in vitro con el tratamiento con anticuerpos mostraron que las mezclas de los anticuerpos son superiores a los anticuerpos individuales a cada uno de los tres receptores HER probados (figura 21B). Adicionalmente, el análisis de los niveles de EGFR, HER2 y HER3 en los U sados celulares aislados de células A431NS, HCC202 y MDA-MB-175-VII tratadas con los anticuerpos (20 mg/ml de anticuerpo total para cada tratamiento durante 48 horas) por análisis de Western blot mostró que las células tratadas con anticuerpo exhibieron niveles reducidos de EGFR, HER2 y HER3 en comparación a las células no tratadas (figura 21C).
Este ejemplo demuestra que dos anticuerpos contra EGFR, HER2 o HER3 presentan actividad sinérgica inhibitoria de crecimiento in vitro e inducen de manera efectiva la regulación de la expresión de la diana.
Ejemplo 3: Pan-HER es ampliamente inhibitorio en un gran número de líneas de células de diferente origen de tejido y antecedente genético Se probaron mezclas de anticuerpos contra epítopos no traslapados en EGFR, HER2, y/o HER3 para su capacidad para inhibir el crecimiento y proliferación de una amplia variedad de líneas de células de cáncer. El efecto del tratamiento con Pan-HER (una mezcla de seis anticuerpos monoclonales contra EGFR, HER2 y HER3; anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082), mezclas de anticuerpos que tienen como diana dos miembros de la familia de HER (es decir, EGFR y HER2, EGFR y HER3 y HER2 y HER3), y mezclas de anticuerpos que tienen como diana un miembro de la familia de HER (es decir, EGFR, HER2 y HER3) se midieron en las siguientes líneas celulares: HN5, MDA-MB175-VII, HCC827, N87, A431NS, FaDu, 0E19, SW948, BT474, RMG-1, TE11, GEO, H358, CALU-3, H292, HCC202, LS174T, ZR-75-30, H1975, KYSE520, AU-565, Capan-1, RIG-OV1, OE33, PK-1, CFPAC-1, BxPC3, A431, SW1463, C0L0678, H820, COLO680N, AsPCl, HCC1937, H661, MFE-280, OVCAR-3, OVCAR-5, SK-BR-3, SW403, OVCAR-8, RL95-2, RMUG-S, SW837, T84, CAPAN-2, GP5d, CaC02, BT20, MDA- MB-468, DU145, A549, CAL-120, EBC1, H1993, H226, HEC-108, LoVo, Panc08.13, RT-112, U2-OS, DLD-1, SKOV3, H460, KATOIII, MDA-MB-134-VI, MKN-45, PANC-1, RT-4, SNU-16, A2058, MCF7, SW480. La caracterización de los niveles de fosforilación del receptor de EGFR, HER2 y HER3 en estas 73 líneas celulares usando arreglos de anticuerpos de señalización PathScan RTK (Cell Signaling Technology) demostró activación elevada de la familia de HER (figura 22).
Los efectos de los tratamientos con anticuerpos en más de 70 líneas de células de cáncer (de más de 100 líneas celulares probadas) en la actividad metabólica se determinaron después de la incubación de 96 horas usando un ensayo de WST-1 similar como se describe en el ejemplo 2. Los resultados mostraron que Pan-HER es ampliamente inhibitorio en un gran número de líneas de células de cáncer de diferente origen de tejido y antecedente genético en la presencia de heregulina (figura 24), EGF (figura 25), o ningún ligando (figura 23) . "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384 y 4517. "EGFR + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2 + HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082. Estos resultados demostraron adicionalmente que la orientación simultánea de diana de tres receptores proporcionó eficiencia más amplia que la selección de diana de un receptor individual o cualquier combinación de dos receptores en la familia de HER.
Ejemplo 4: Pan-HER inhibe efectivamente la proliferación inducida por ligando Para determinar si las mezclas de anticuerpo son eficaces en la presencia de ligados de EGFR y HER3, se probaron mezclas de anticuerpos contra de uno, dos o tres receptores de la familia de HER para su capacidad para inhibir el crecimiento y proliferación de líneas de células de cáncer pancreático en la presencia de heregulina, EGF, o ningún ligando. Los efectos del tratamiento con pan-HER (una mezcla de seis anticuerpos monoclonales contra EGFR, HER2 y HER3; anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082), mezclas de anticuerpos que tienen diana dos miembros de la familia de HER (es decir, EGFR y HER2, EGFR y HER3 y HER2 y HER3), y mezclas de anticuerpos que tienen como diana un miembro de la familia HER (es decir, EGFR, HER2 y HER3) se midieron en las siguientes líneas celulares: Capan-1, PK-1, CFPAC-1 , BxPC 3, AsPCl, Capan-2, Panc08.13, PANC-1, KP4, MiaPaca-2 y PSN1). El estado de la mutación de estas líneas celulares se muestra en la figura 26. La capacidad de las mezclas de anticuerpos contra uno, dos o tres receptores de la familia de HER para inhibir el crecimiento y proliferación de una amplia variedad de líneas de células de cáncer en la presencia de heregulina, EGF, o ningún ligando también se probó (figuras 23-25). Las células se expusieron a medio que contiene anticuerpos y ligandos durante 96 horas (se adicionan simultáneamente a las células el ligando y el anticuerpo). Se determinó la actividad metabólica después de 96 horas de incubación usando un ensayo WST-1 similar como se describe en el ejemplo 2. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2 + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082. Pan-Her exhibió inhibición efectiva de una amplia variedad de líneas de células de cáncer en la presencia de EGF o heregulina.
Ejemplo 5: Pan-HER mantiene efecto inhibitorio en células con resistencia adquirida a anticuerpos terapéuticos aprobados Se probó Pan-HER (una mezcla de seis anticuerpos monoclonales contra EGFR, HER2 y HER3; anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082) se probó para su capacidad para inhibir el crecimiento y proliferación de las líneas celulares HN5, 0E19 y MDA-MB-175-VII o mezclas celulares con resistencia adquirida a cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab, respectivamente. Se generaron líneas de células de HN5 resistentes a cetuximab como se describe en el ejemplo 11. Se establecieron células 0E19 resistentes a trastuzumab y células MDA-MB-175-VII resistentes a pertuzumab al exponer células parentales a concentraciones crecientes de trastuzumab [10-100 mg/ml] y pertuzumab [1-50 mg/ml] respectivamente, durante un período de ocho meses y 12 meses, respectivamente. Las células se dividieron una vez o dos veces por semana a fin de mantener las células en crecimiento exponencial. El nivel de resistencia se probó cada mes en un ensayo de viabilidad de WST-1 como se describe en el ejemplo 2, hasta que se estableció una mezcla de células resistentes.
Se generaron clones celulares individuales de células 0E19 resistentes a trastuzumab a través de la clonación por dilución limitada de la mezcla de células 0E19 con resistencia adquirida a trastuzumab como se describe en el ejemplo 11.
Se determinó la actividad metabólica después de 96 horas de incubación usando un ensayo WST-1 similar como se describe en el ejemplo 2. Las células resistentes, tratadas con Pan-HER así como las células parentales exhibieron niveles reducidos de actividad metabólica (figura 28). En contraste, se redujo la actividad metabólica en las células parentales HN5, 0E19 y MDA-MB-175-VII, pero no se alteraron en clones resistentes tratados con cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab, respectivamente. Este ejemplo demuestra que Pan-HER mantiene efecto inhibitorio en células con resistencia adquirida a anticuerpos terapéuticos aprobados. Ejemplo 6: Pan-HER impide de manera efectiva el favorecimiento compensatorio de la expresión del receptor in vi tro Para determinar si se presenta el favorecimiento compensatorio de la expresión del receptor como resultado del tratamiento con las mezclas de anticuerpos de la presente invención, se midieron los niveles de EGFR, HER2 y HER3 en lisados celulares completos de las líneas celulares H292 y 0VCAR8 después del tratamiento con anticuerpos (20 mg/ml) durante 48 horas por análisis por Western blot. Se determinaron los efectos del tratamiento con Pan-HER (una mezcla de seis anticuerpos monoclonales contra EGFR , HER2 y HER3; anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082) y mezclas de anticuerpos que tienen como diana un miembro de la familia de HER (es decir, EGFR (anticuerpos 1277, 1565, o 1277 + 1565), HER2 (anticuerpos 4384, 4517, o 4384 + 4517) y HER3 (anticuerpos 5038, 5082, o 5038 + 5082)) . Se uso b-actina como un control de carga. Los resultados mostraron que el tratamiento anti-EGFR condujo al favorec imiento de la expresión de HER2 en células H292 (figura 29, parte superior; senda de cetuximab, sendas 1277, 1565, 1277 y 1565) , y el tratamiento anti-HER3 condujo al favorecimiento de la expresión de HER2 en OVCAR-8 (figura 29, parte inferior; senda MM-121, sendas 5038, 5082, y 5038 + 5082), en tanto que el tratamiento con Pan-HER condujo a la reducción de la expresión de EGFR, HER2 y HER3 (figura 29; sendas Pan-Her) . Estos resultados demostraron que Pan-HER indujo de manera efectiva la reducción simultánea de la expresión de las tres dianas e impidió el favorecimiento compensatorio de la expresión del receptor, un mecanismo potencial para adquirir resistencia .
Ejemplo 7: Efecto sinergico de selección como diana de múltiples receptores de la familia de HER en el modelo de xenoinjerto de BxPC-3 (cáncer pancreático) Para evaluar la eficacia de mezclas de anticuerpos contra EGFR, HER2, HER3 y combinaciones de dos y tres dianas del receptor en el modelo de xenoinjerto de cáncer humano, se trataron modelos de xenoinjerto BxPC-3 (cáncer pancreático) con mezclas de anticuerpos y se valoró el efecto en el tamaño tumoral.
En este ensayo, se inocularon en ratones células BxPC-3 de cáncer pancreático. En resumen, se inocularon subcutáneamente 5xl06 células BxPC3 en el flanco izquierdo de ratones desnudos atímicos hembras de ocho a diez semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana con calibradores y se calculó el volumen tumoral en mm3 de acuerdo a la fórmula: (ancho)2 x longitud x 0.5. A un tamaño tumoral promedio de 140 mm3 los ratones se aleatorizaron y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales tres veces por semana de 50 mg/kg (10 inyecciones en total), seguido por un período de observación. Las representaciones gráficas de los datos de volumen tumoral se presentan como media ± SEM.
Los resultados muestran que Pan-HER (anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082) suprimió efectivamente el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de BxPC-3 (figura 30; N = 7/grupo; período de tratamiento indicado por el área verde claro en la gráfica). Se observó una clara sinergia cuando se tienen como diana EGFR y HER3, así como EGFR y HER2, con la anterior combinación que es más eficiente en controlar el crecimiento de los xenoinjertos tumorales de BxPC3. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR + HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038 y 5082. "HER2 + HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038 y 5082. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082. Adicionalmente, se confirmó la reducción de la expresión de EGFR y HER2 por Pan-HER in vivo mediante inmunohistoquímica en secciones de tejido de tumores extirpados 3 días después del retiro del tratamiento (figura 31).
Ejemplo 8: Efecto sinérgico de selección como diana de múltiples receptores de la familia de HER en el modelo de xenoinjerto de Calu-3 (NSCLC) Para evaluar la eficiencia de las mezclas de anticuerpos contra EGFR, HER2 , HER3 y combinaciones de dos y tres dianas de receptor en modelos de xenoinjerto de cáncer humano, el modelo de xenoinjerto Calu-3 (NSCLC) se trató con mezclas de anticuerpos y se valoró el efecto en tamaño tumoral. En el ensayo, se inocularon células Calu-3 NSCLC en ratones. En resumen, se inocularon subcutáneamente lxlO7 células Calu-3 en el flanco izquierdo de ratones desnudos atímicos hembras de ocho a diez semanas de edad. Los tumores se midieron tres veces por semana con calibradores y se calculó el volumen tumoral en mm3 de acuerdo a la fórmula: (ancho)2 x longitud x 0.5. A un tamaño tumoral promedio de 170 mm3, los ratones se aleatorizaron y se inició el tratamiento. Los ratones se trataron con inyecciones intraperitoneales tres veces por semanales de 50 mg/kg (8 inyecciones en total) . Las representaciones gráficas de los datos del volumen tumoral se presentan como media + SEM.
Los resultados mostraron que Pan-HER (anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082) suprimió de manera efectiva el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto Calu-3 (figura 32, N = 5/grupo; período de tratamiento indicado por el área verde claro en la gráfica) . Los resultados muestran un efecto sinérgico de la selección como diana de EGFR, HER2 y HER3 simultáneamente en tanto que no se puede observar sinergia clara cuando se seleccionan como diana EGFR y o EGFR y HER3 en comparación a la respuesta anti- tumoral de la selección como una diana de EGFR. "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038, y 5082. "HER2 + HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
Ejemplo 9: Pan-HER impide de manera efectiva el favorecimiento compensatorio del receptor in vivo Para determinar si se presenta prevención del favorecimiento compensatorio de la expresión del receptor in vivo como resultado del tratamiento con mezclas de anticuerpos de la presente invención, se midieron los niveles de EGFR, HER2 y HER3 en U sados de tumores de BxPC-3 tratados con anticuerpo mediante el análisis de Western blot . Los efectos del tratamiento con Pan-HER (una mezcla de seis anticuerpos monoclonales contra EGFR, HER2 y HER3; anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 y 5082), se determinaron mezclas de anticuerpos que tienen como diana dos miembros de la familia HER (es decir, EGFR y HER2 , EGFR y HER3 y HER2 y HER3 ), y mezclas de anticuerpos que tienen como diana un miembro de la familia HER (es decir, EGFR, HER2 y HER3). Se uso b-actina como un control de carga. Los resultados mostraron que el tratamiento anti-EGFR condujo a la reducción de la expresión de EGFR (figura 33 parte superior), el tratamiento anti-HER2 conduce a la reducción de la expresión de HER2 (figura 33 parte superior), y el tratamiento anti-HER3 conduce a la reducción de la expresión de HER3 (figura 33 parte superior) . La cuantif icación relativa de las intensidades de banda de la Western blot muestra que HER2 se favoreció significativamente en la expresión en respuesta al tratamiento anti-HER3 (figura 33 parte inferior) . En contraste, el tratamiento con Pan-HER da por resultado la reducción simultánea y efectiva de la expresión de EGFR, HER2 y HER3 (figura 33 parte superior; cuadros verdes y figura 33, parte inferior) . "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038 y 5082. "HER2 + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038 y 5082. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
Este ejemplo demostró que Pan-HER es capaz de inducir de manera efectiva la reducción simultánea de la expresión de las tres dianas e impedir el favorecimiento compensatorio de la expresión del receptor in vivo.
Ejemplo 10: Efecto sinergico de la selección como diana de múltiples receptores de la familia de HER en modelos de xenoinjertos de tumor pancreático mutado en KRAS derivado de pacientes.
Para evaluar la eficiencia in vivo de mezclas de anticuerpo contra EGFR, HER2, HER3 y combinaciones de dos y tres dianas de receptor, se trataron modelos de xenoinjerto de tumor derivado de paciente de cáncer pancreático mutado de KRAS (START Discovery, San Antonio, TX) con mezclas de anticuerpos y se valoró el efecto en el tamaño tumoral.
En este ensayo, en ratones se inocularon células de cáncer pancreático derivado de paciente. En resumen, se implantó material tumoral de paciente, extirpado, viable, en ratones inmunocompromet idos y se hizo pasar enserie in vivo . A un volumen tumoral de 100-200 mm3, los animales se aleatorizaron en grupos de tratamiento y de control y se inició la dosificación. Programa de dosificación: 50 mg/kg i.p. tres veces por semana, 10 dosis en total (días 0-20). N = 5/grupo. Los datos se presentan como media ± SEM. El asterisco indica el primer día con p <0.05. La diferencia estadísticamente significativa en la respuesta al tratamiento entre los grupos se mantuvo a todo lo largo del período de estudio.
Los resultados mostraron que Pan-HER suprimió de manera efectiva el crecimiento tumoral en modelos de cáncer pancreático, derivados de paciente, difíciles de tratar. (figura 34, N = 5/grupo). Adicionalmente, los estudios de desconvolución revelaron fuerte sinergia de la selección como diana de EGFR y HER2 en el modelo de xenoinjerto ST179 y de EGFR y HER3, y a un menor grado de selección como diana de EGFR y HER2, en el modelo de xenoinjerto ST383 (figura 35; N = 7-8/grupo; período de tratamiento indicado por el área gris clara en la gráfica) . "EGFR" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277 y 1565. "HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384 y 4517. "HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 5038 y 5082. "EGFR + HER2" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, y 4517. "EGFR + HER3" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 5038 y 5082. "HER2 + HER3 " se refiere a una mezcla de los anticuerpos 4384, 4517, 5038, y 5082. "Pan-HER" se refiere a una mezcla de los anticuerpos 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, y 5082.
Tabla 7: Modelos de xenoinjerto de cáncer pancreático derivado de paciente wt: tipo silvestre, PD: enfermedad progresiva; ND: No determinado.
Ejemplo 11: Clones HN5 con resistencia adquirida a Cetuximab muestran niveles totales disminuidos de EGFR conjunto con al alta actividad de EGFR Se establecieron clones HN5 resistentes a cetuximab al exponer células HN5 parentales a concentraciones crecientes de cetuximab [1-100 mg/ml] durante un período de seis meses. Las células se dividieron dos veces una semana a fin de mantener las células en crecimiento exponencial. El nivel de resistencia a cetuximab se probó cada mes en un ensayo de viabilidad de WST-1 como se describe en el ejemplo 2 hasta que se estableció una mezcla de células resistentes a cetuximab. Se generaron clones celulares individuales a través de la clonación por dilución limitada de la mezcla de células HN5 con resistencia adquirida a cetuximab. 0.5 células/pocillo se colocaron en placas de 384 pocilios. Se siguió el crecimiento y proliferación de las colonias celulares individuales usando Novartis Cellavista Imager. Los clones individuales más resistentes, HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14, se seleccionaron para caracterización adicional (figura 36).
Viabilidad: El nivel de resistencia cetuximab de los clones individuales HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14 se probó en un ensayo de viabilidad de WST-1 como se describe previamente en el ejemplo 1. Brevemente, se trataron células con cetuximab en un intervalo de concentraciones y se valoró 96 horas más tarde. Diferente de las células NH5 parentales, los clones resistentes fueron viables con concentraciones crecientes de tratamiento de cetuximab (figura 37).
Unión de cetuximab a células fijadas: Se determinó la resistencia de unión de cetuximab a HN5 parental y clones resistentes HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14. Se generaron curvas de unión al graficar las señales de fluorescencia que se normalizaron al número de células (tinción por DRAQ-5) y concentraciones de cetuximab. Los resultados demuestran que en tanto que permaneció sin alterar la unión media-máxima (es decir, valor EC50) de cetuximab se disminuyó la unión máxima en los clones resistentes en comparación a las células parentales (figura 38).
Señalización y expresión de EGFR: Se determinaron los niveles superficiales relativos de EGFR en HN5 parental y clones resistentes HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14. De forma breve, las células se tiñeron con anti-EGFR-FITC (Abcam, # 11400) o un control de isotipo (Abcam, # 18446) y la fluorescencia relativa de las células vivas se cuantificó por citometría de flujo. Los niveles superficiales relativos de EGFR fueron menores en los clones NH5 resistentes a cetuximab en comparación a las células parentales (figura 39).
Se probó la respuesta de clones resistentes a cetuximab a la estimulación de EGF. Los niveles totales de EGFR, los niveles de EGFR fosforilado y las moléculas de señalización de etapa posterior se determinaron en HN5 parental y clones resistentes HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14. Células HN5 parentales y clones resistentes a cetuximab HN5 CR2 , HN5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14 se dejaron sin tratar o se estimularon con EGF 1 nM durante 15 min antes de la recolección. Los lisados se fraccionalizaron en SDS-PAGE seguido por Western blot para EGFR, las especies de EGFR fosforiladas pEGFR (Tyr106 8), pEGFR (Tyrl045), pEGFR (Tyrll73), pEGFR (Tyr992 ), pEGFR (Thr669), y pEGFR (Serl046/1047), y las moléculas de señalización AKT , pAKT (Ser473), ERKl/2, pERKl/2 (Thr202/Tyr204) (figuras 40 y 41) . Se uso b-actina como un control de carga. Los resultados mostraron que los niveles totales de EGFR y EGFR fosforilado fueron menores en los clones HN5 resistentes a cetuximab en comparación a las células parentales (figura 40) . Los resultados también mostraron un nivel disminuido de pEGFR (Serl046/1047 ) en los clones resistentes a cetuximab, indicando que el mecanismo de retroalimentación que regula EGFR es menos activo en los clones resistentes a cetuximab (figura 40). La estimulación con EGF indujo una más fuerte activación de pAKT y pERKl/2 en los clones resistentes a cetuximab en comparación a células HN5 parentales (figura 41). Conjuntamente, estos resultados demuestran que EGFR aun es activo en los clones resistentes a cetuximab, aunque la expresión de EGFR está disminuida en comparación a las células HN5 parentales. Ejemplo 12: Mezclas de anticuerpo que tienen como diana EGFR la resistencia a cetuximab a través de la internalización eficiente de EGFR seguido por la degradación del receptor Una mezcla de anticuerpos que tienen como diana epítopos no traslapados en EGFR se probó para su capacidad para superar parcialmente la resistencia inducida a cetuximab en clones HN5 resistentes a cetuximab HN5 CR2 y HN5 CR14. Se trataron células HN5, HN5 CR2, y HN5 CR14 parentales con EGFR-LNAMR (selección de diana EGFR ácido nucleico asegurado, Exiqon), Cetuximab o EGFR-2mix (anticuerpos 1277 y 1565) durante 48 horas. Se midió el crecimiento y proliferación usando un ensayo WST-1 como se describe en el ejemplo 2 y la cuantificación de los efectos se gráfico con puntos de datos que representan una media +/- SEM (n = 4) (figura 42). EGFR-LNA, y EGFR-2mix indujeron ambos una reducción similar en la viabilidad celular. Estos resultados demostraron que una mezcla de anticuerpos que se selecciona como diana a epítopos no traslapados en EGFR superó parcialmente la resistencia inducida a cetuximab y que los clones resistentes a cetuximab permanecieron dependientes de EGFR para el crecimiento y proliferación (figura 42).
Los niveles de EGFR en células tratadas con EGFR-LNA, cetuximab o mezcla de EGFR-2 durante 48 horas se determinaron al fraccionar lisados celulares en una SDS-PAGE seguido por Western blot para EGFR. Los resultados mostraron que la internalización eficiente de EGFR seguida por degradación lisosómica del receptor se indujo en células resistentes tratadas con anticuerpo (figura 43), y de esta manera se proporciona un mecanismo para la capacidad de la mezcla de anticuerpos que tiene como diana EGFR superé la resistencia a cetuximab.
Ejemplo 13: Clones HN5 resistentes a cetuximab escapan al tratamiento a través de HER3 e IGF1R El nivel observado de inhibición de los clones resistentes por la mezcla anti-EGFR no induce, sin embargo, una inhibición eficiente de crecimiento como en las células parentales, sugiriendo que pueden estar comprendidas receptor-tirosina-cinasas (RTK) alternativas en el mecanismo de resistencia adquirida a cetuximab. Para probar el papel de la actividad de HER3 en NH5 parental y clones resistentes HN5 CR2, H 5 CR6, HN5 CR13, y HN5 CR14, se trataron células con una mezcla de dos anticuerpos de EGFR (anticuerpos 1277 y 1565), una mezcla de dos anticuerpos de HER3 (anticuerpos 5038 y 5082), una mezcla de dos anticuerpos de EGFR y dos anticuerpos de HER3 (anticuerpos 1277, 1565, 5038 y 5082), o cetuximab durante 48 horas. Se midió el crecimiento y proliferación usando un ensayo WST-1 como se describe en el ejemplo 2 y la cuantificación de los efectos se gráfico con puntos de datos que representan una media +/- SEM (n = 6).
Los resultados mostraron efectos superiores de la mezcla que contiene anticuerpos que tienen como diana tanto HER3 como EGFR en comparación a los efectos inducidos por la mezcla sola de anticuerpos de EGFR. Estos resultados soportan la hipótesis de la implicación de RTK alternativas en la resistencia adquirida a cetuximab (figura 44). Las curvas de respuesta de dosis de HN5 parental y células HN5 CR2 resistentes a la mezcla de anticuerpos se muestran en las figuras 45A y 45B.
La implicación de HER3 en la resistencia adquirida a cetuximab mostrada aquí indica la plasticidad de la familia RTK como un mecanismo de resistencia adquirida a cetuximab in vitro.
Tabla 8: Secuencias de anticuerpos quiméricos seleccionados Anticuerpo 1277: secuencia de nucleótidos de VH cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agagtccttg aaactctcct gtgcagcctc tggattcgct ttcagttact ctgacatgtc ttgggttcgc cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcatacatga gtagtgctgg tgatgtcacc ttctattcag acactgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc ctgtatctgc aagtgagcag tctgaagtct gaggacacag ccatatatta ctgtgtaaga caccgggacg tggctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcg (SEQ ID NO: 14).
Anticuerpo 1277: secuencia de aminoácidos de VH Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Met Ser Ser Ala Gly Asp Val Thr Phe Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Val Arg His Arg Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser (SEQ ID NO: 15) Anticuerpo 1277: secuencia de nucleótidos de cadena ligera ctagccgatg ttgtgatgac ccagactcca ctctccctgc ctgtcagtct tggagatcaa gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc cttgtacaca gtaatggaaa cacctattta cattggtacc tgcagaagcc aggccagtct ccaaagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcagca gagtggaggc tgaggatctg ggagtttatt tctgctctca aagtacacat gttccgacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt (SEQ ID NO: 16) Anticuerpo 1277: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 17) Anticuerpo 1565: secuencia de nucleótidos de VH ggcgcgccga ggtccaactg caacagtctg ggactgaatt ggtgaagcct ggggcttcag tgatactgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcaccag ctactggatg cagtgggtga agcagaggcc tggacaaggc cttgagtgga ttggaaatat taatcctagc aatggtggaa ctagtttcaa tgaggagttc aagagtaggg ccacactgac tgtagacaaa tcctccagta cagcctacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tattgtgcaa gagacggggg cctttacgac ggatactact ttgacttctg gggccaaggc accactctca cagtctcgag (SEQ ID NO: 18) Anticuerpo 1565: secuencia de aminoácidos de VH Arg Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val lie Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Asn lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Phe Asn Glu Glu Phe Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser (SEQ ID NO: 19) Anticuerpo 1565: secuencia de nucleótidos de cadena ligera gctagccaac attgtgatga cacagtctca caaattcatg tccacattaa taggagccag ggtctccatc acctgcaagg ccagtcagga tgtggatacg gctgtagcct ggtatcaaca gaaaccaggt caatctccta aattattaat ttattgggca tccacccggc acactggagt ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc tctctcaccg ttagcaatgt gcagtctgag gacttaacag attatttctg tcagcaatat agcagctatc ctctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aataagcggc cgc (SEQ ID NO: 20) Anticuerpo 1565: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Leu Ala Asn lie Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Leu lie Gly Ala Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Val Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 21) Anticuerpo 4384: secuencia de nucleótidos de VH caggtgcagc tgcagcagcc tggcacagag ctggtgaaac ctggcgcctc cgtgaagctg tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcccactgga tgcactgggt gaaacagcgg cctggacagg gcctggaatg gatcggcaac atcaacccct ccaacggcgg caccaactac aacgagaagt tcaagtcccg ggccaccctg accgtggaca aggcctcctc caccgcctac atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagagcctac tacgacttca gttggttcgt gtactggggc cagggcaccc tggtgacagt ctcg (SEQ ID NO: 22) Anticuerpo 4384: secuencia de aminoácidos de VH Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Asn lie Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser (SEQ ID NO: 23) Anticuerpo 4384: secuencia de nucleótidos de cadena ligera gatatccaga tgacccagac ctcctccagc ctgtccgcct ccctgggcga cagagtgacc atctcctgcc ggtcctccca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaaaccc gacggcaccg tgaagctgct gatgtacatc tcccggctgc actccggcgt gccctccaga ttctccggct ctggctccgg caccgagtac tccctgacca tcagcaacct ggaacaggaa gatatcgcta cctacttctg tcagcagggc aacaccctgc ccctgacctt cggcgctggc accaagctgg aactgaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc (SEQ ID NO: 24) Anticuerpo 4384: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Asp lie Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Met Tyr lie Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 25) Anticuerpo 4517: secuencia de nucleótidos de VH gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgac ctggtgaaac ctggcggctc cctgaagctg tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgtcctgggt gcgactgacc cccgacaagc ggctggaatg ggtggcaacc atctccggcg gaggctccta cacctactac cccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggata tcgccaagtc caccctgtac ctgcagatgt cctccctgaa gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaagggc aactacggca attacggcaa gctggcctac tggggccagg gcacctccgt gacagtctcg (SEQ ID NO: 26) Anticuerpo 4517: secuencia de aminoácidos de VH Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Leu Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp lie Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Lys Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser (SEQ ID NO: 27) Anticuerpo 4517: secuencia de nucleótidos de cadena ligera gatatccaga tgacccagtc ccccgcctcc ctgtccgtgt ctgtgggcga gacagtgacc atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tccaacctgg cctggtatca gcaggaacag ggcaagtccc cccagctgct ggtgtacgcc gccaccaatc tggccgacgg cgtgccctcc agattctccg gctctggctc cggcacccag tactccctga agatcaactc cctgcagtcc gaggacttcg gctcctacta ctgccagcac ttctggggca ccccctggac cttcggcgga ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctac ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caactcccag gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt ge (SEQ ID NO: 28) Anticuerpo 4517: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 29) Anticuerpo 5038: secuencia de nucleótidos de VH cgcgccgagg tgaagctggt tgagtcagga cctggcctcg tgaaaccttc tcagtctctg tctctcacct gctctgtcac tggctactcc atcaccagtg gtttttactg gacctggatc cggcagtttc caggcaacaa attggaatgg atgggcttca taagctacga tggtagcaat aactacaacc catctctcaa aaatcgaatc tccatcactc gtgacacatc taagaaccag tttttcctga agttgaattc tgtgactact gaggacacag ccacatatta ctgtgcaaga ggcggaggct actatggtaa cctctttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcga (SEQ ID NO: 30) Anticuerpo 5038: secuencia de aminoácidos de VH Arg Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Gly Phe Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Phe lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser (SEQ ID NO: 31) Anticuerpo 5038: secuencia de nucleótidos de cadena ligera ctagccgata ttgtgatgac tcaaactaca tcctccctgt ccgcctctct gggagacaga gtcaccatca gttgcaggcc aagtcaggac attagcaatt atgtaaactg gtttcagcag aaaccaggtg gaactgttaa gctcctgatc ttccacacat caagattaca ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaccctg gaacaggaag atattgccat ttacttttgc caacagggta ttacgcttcc gtggacgttc ggtggcggca ccaagctgga aataaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataagcggcc (SEQ ID NO: 32) 5038: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Pro Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr Val Lys Leu Leu lie Phe His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Thr Leu Glu Gln Glu Asp lie Ala lie Tyr Phe Cys Gln Gln Gly lie Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 33) Anticuerpo 5082: secuencia de nucleótidos de VH cgcgccgagg tgcagctgaa ggagtcagga cctggcctcg tgaaaccttc tcagtctctg tctctcacct gctctgtcac cggctactcc atcaccagtg cttattactg gaactggatc cggcagtttc caggaaacaa agtggaatgg atgggctaca taggctacga tggtcgtaat acctacaacc catctctcaa aaatcgaatc tccatcactc gtgacacatc taagaaccag tttttcctga aattgaattc tctgactact gaggacacag ccacatatta ttgttcaaga gagggggact acggttactc tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcga (SEQ ID NO: 34) Anticuerpo 5082: VH secuencia de aminoácidos de VH Arg Ala Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Val Glu Trp Met Gly Tyr lie Gly Tyr Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser (SEQ ID NO: 35) Anticuerpo 5082: secuencia de nucleótidos de cadena ligera ctagccgata ttgtgatgac gcaagctaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccgtca gttgcagggc aagtcaggac attaacaatt atttaaattg gtatcagcag aagccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca gtcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga atagattatt ctctcaccat tagcaacctg gagcaggaag attttgtcac ttacttttgc caacagagtg aaacgcttcc gtggacgttc ggtggaggca ccaagctgga gctgaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataagcggcc (SEQ ID NO: 36) Anticuerpo 5082: secuencia de aminoácidos de cadena ligera Leu Ala Asp lie Val Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly lie Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Val Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Glu Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 37) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una composición de anticuerpos recombinantes, caracterizada porque comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, al menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y al menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el por lo menos un anticuerpo anti-EGFR humanizado se selecciona de (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2, y (b) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 5; el por lo menos un anticuerpo anti-HER2 humanizado se selecciona de (c) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: V, y (d) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 9; y el por lo menos un anticuerpo anti-HER3 humanizado se selecciona de (e) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 , y (f) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13.
3. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende (a) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44; (b) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 48; (c) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 52; (d) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 54; (e) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 55 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 56; y (f) un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 61 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 62.
4. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende anticuerpos anti-EGFR (a) y (b), anticuerpos anti-HER2 (c) y (d), y anticuerpos anti-HER3 (e) y (f).
5. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende: (i) anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (e); (ii) anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (f); (iii) anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (e); (iv) anticuerpo anti-EGFR (a), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (f); (v) anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (e); (vi) anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (c), y anticuerpo anti-HER3 (f); (vii) anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (e); o (viii) anticuerpo anti-EGFR (b), anticuerpo anti-HER2 (d), y anticuerpo anti-HER3 (f).
6. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-EGFR (a) comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 que tiene Arg44, Val83 y Ilel04, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 3 que tiene Leu34, Tyr41, Leu51 y Phe92; (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 que tiene Arg44, Val83 y Ilel0 , y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 3 que tiene Tyr41, Leu51 y Phe92; o (iii) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 que tiene Arg44 y Val83, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 2 que tiene Alal9 y Phe92.
7. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-EGFR (b) comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4 que tiene Leu20, Ile48 y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 5 que tiene Val75 y Phe87; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4 que tiene Leu20, Ile48, Leu56, y Ala68, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 5 que tiene Val75 y Phe87.
8. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-HER2 (c) comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6 que tiene Ser55, Leu70, Val72, Lys74 y Ala79, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 7 que tiene Val44, Met48 y Tyr70; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6 que tiene Ser55 y Val72, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 7 que tiene Met48 y Tyr70.
9. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-HER2 (d) comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 8 que tiene Ala49, Ile74 y Ser77, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 9 que tiene Thr56, Tyr71, Ser85 y Leul04.
10. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-HER3 (e) comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 10 que tiene Met49, Ser55 y Ile68, o Asn44, Ser55 y Thr93, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 11 que tiene Phe36, Val44, Phe49 e Ile85, o q tiene Phe36, Phe49 y Leu73.
11. La composición de anticuerpos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el anticuerpo anti-HER3 (f) comprende: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 12 que tiene Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 13 que tiene Val21, Thr29, Val44, y Phe87; o (ii) una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 12 que tiene Phe41, Val46, Met49, Ser55 y Arg72, y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 13 que tiene Val21, Val44, Tyr71, Phe87 y Leul04.
12. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende tres, cuatro, cinco, o seis anticuerpos.
13. La composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende: (a) anticuerpo anti-EGFR 10292, 10460, o 11294; (b) anticuerpo anti-EGFR 10560 o 11302; (c) anticuerpo anti-HER210704 o 11249; (d) anticuerpo anti-HER211145; (e) anticuerpo anti-HER310738 o 10810; y (f) anticuerpo anti-HER311006 o 11052.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una composición de anticuerpos recombinantes humanizados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y al menos un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la composición de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 3 y al menos un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque al menos un anticuerpo en la composición es un inmunoconjugado en donde el anticuerpo se conjuga a un agente anti-cáncer.
17. Un anticuerpo anti-EGFR humanizado, caracterizado porque sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera comprenden: SEQ ID NOs: 43 y 44, respectivamente, SEQ ID NOs: 38 y 39, respectivamente, SEQ ID NOs: 41 y 42, respectivamente, SEQ ID NOs: 45 y 46, respectivamente, o SEQ ID NOs: 47 y 48, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
18. Un anticuerpo anti-HER2 humanizado, caracterizado porque sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera comprenden: SEQ ID NOs: 51 y 52, respectivamente, SEQ ID NOs: 49 y 50, respectivamente, o SEQ ID NOs: 53 y 54, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
19. Un anticuerpo anti-HER3 humanizado, caracterizado porque sus secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera comprenden: SEQ ID NOs: 55 y 56, respectivamente, SEQ ID NOs: 57 y 58, respectivamente, SEQ ID NOs: 59 y 60, respectivamente, o SEQ ID NOs: 61 y 62, respectivamente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
20. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera, o ambas, de un anticuerpo o fragmento de un antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-19.
21. Un vector de expresión, caracterizado porque que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20.
22. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21 o un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 21, en donde la célula hospedadora es capaz de expresar el anticuerpo o fragmento de un antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico.
23. Un método para producir un anticuerpo, caracterizado porque comprende proporcionar una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 22, cultivar la célula hospedadora bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y aislar el anticuerpo resultante.
24. Un método para producir una composición de anticuerpos recombinantes, que comprende al menos un anticuerpo anti-EGFR recombinante humanizado, al menos un anticuerpo anti-HER2 recombinante humanizado, y al menos un anticuerpo anti-HER3 recombinante humanizado, caracterizado porque comprende: proporcionar al menos una primera, segunda y tercera células hospedadoras, en donde la primera célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo anti-EGFR recombinante como se define en la reivindicación 17, la segunda célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo anti-HER2 recombinante como se define en la reivindicación 18, y la tercera célula hospedadora es capaz de expresar un anticuerpo recombinante anti-HER3 como se define en la reivindicación 18, cultivar la primera, segunda y tercera células hospedadoras bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-HER2 y el anticuerpo anti-HER3, y aislar los anticuerpos resultantes.
25. Un método para tratar cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición de anticuerpos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14 o 15.
26. Un método para tratar un paciente con un trastorno, que se distingue por la expresión o sobreexpresión de EGFR, HER2 y/o HER3, el método está caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición de anticuerpos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14 o 15.
27. Un método para tratar cáncer en un paciente que tiene resistencia adquirida al tratamiento con un anticuerpo y/o un inhibidor de tirosina-cinasa, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición de anticuerpos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14 ó 15.
28. Un método para inhibir el crecimiento de cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición de anticuerpos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14 ó 15.
29. Un método para reducir la expresión de EGFR, HER2, o HER3, o para prevenir el favorecimiento de la expresión de EGFR, HER2, o HER3 en un paciente con cáncer, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición de anticuerpos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-29, caracterizado porque el paciente tiene cáncer pancreático, óseo, colónico, endométrico o del tracto urinario.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el paciente tiene cáncer pancreático y una mutación KRAS.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-31, caracterizado porque al menos uno de los anticuerpos está conjugado a un agente anti-cáncer.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente anti-cáncer es un agente citotóxico, una citocina, una toxina, o un radionúclido.
34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-33, caracterizado porque el paciente no se ha tratado previamente para cáncer.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-33, caracterizado porque el paciente se ha tratado previamente para cáncer.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el paciente se ha tratado previamente con cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el cáncer en el paciente tiene resistencia adquirida a cetuximab, trastuzumab, o pertuzumab.
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