KR20150018528A - 인간화 ｐａｎ­ｈｅｒ 항체 조성물 - Google Patents

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클라우스 쾨포드
라스 소가드 닐슨
미켈 완달 펜더슨
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미첼 크라그
아이다 키예르
토마스 투센 포울센
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Abstract

본 발명은 EGFR 패밀리 수용체 EGFR, HER2 및 HER3을 표적화하는 인간화 재조합 항체, 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체, 적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체 및 적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체를 포함하는 조성물, 및 암을 치료하기 위한 항체 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 (예컨대, 췌장암) 및 이전 요법에 대해 획득 내성을 지니는 암을 치료하기 위한 다수의 EGFR-패밀리 수용체를 표적화하는 항체들의 용도에 관한 것이다.

Description

인간화 ＰＡＮ­ＨＥＲ 항체 조성물{HUMANIZED PAN-HER ANTIBODY COMPOSITIONS}
다른 출원과의 전후 참조
본 출원은 2012년 5월 2일 출원된 미국 가특허출원 61/641,756호 및 2013년 4월 5일 출원된 미국 가특허출원 61/809,159호의 우선권을 주장한다. 이러한 출원들의 기재는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리를 표적으로 하는 신규한 인간화 재조합 항체 및 이러한 항체들 중 두 개 이상을 포함하는 암 치료에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
표피 성장 인자 수용체 패밀리 (EGFR 또는 ErbB/HER 패밀리)는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 서브그룹이고 하기 4개의 멤버를 포함한다: EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 및 HER4/ErbB4. EGFR 패밀리의 멤버는 세포외 리간드 결합 영역, 단일 막통과(transmembrane) 도메인 및 세포내 티로신 키나제 도메인을 갖는 밀접하게 관련된 단일-쇄 모듈의 당단백질이다. 정상적인 생리적 환경에서 ErbB 패밀리는 세포 성장, 분화 및 이동의 조정에 있어서 중요한 사건을 조절한다. EGFR, HER2 및 HER3은 정상 세포의 악성 전환 및 암세포의 지속 성장에서 중대한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. EGFR 및 HER2는 다수의 상피암에 의해 과발현되는 것이 발견되었다. EGFR 및 HER2의 과발현은 게다가 여러 인간 상피암에서 질환 진행, 생존 감소, 반응 부족 및 화학요법 내성과 관련되었다. 악성 전환 및 암 진행에서 HER4의 역할은 논쟁의 대상이며 본원에서 추가로 논의되지 않을 것이다.
EGFR 및 HER2는 암 표적으로 확인되었고 이들의 티로신 키나제의 모노클로날 항체 및 소분자 억제제 둘 모두는 다양한 암의 치료를 위해 승인되었다. HER3은 잠재적인 치료 표적으로서 현재 연구되고 있다. 그러나, 초기에 이러한 요법에 반응한 환자들은 종종 획득 내성(acquired resistance)의 전개로 인해 재발한다. 전임상 연구는 내성의 발생에 비표적 수용체들 중 하나 또는 둘 모두가 연루됨을 지적한다. 이에 따라, ErbB 수용체는 서로 대체되는 능력을 지녀서 성장 자극 신호전달 및 악성 표현형을 유지하는 것으로 보인다. 따라서, 2개의 수용체 또는 3개 모두의 수용체의 동시 표적화는 ErbB 패밀리 의존성을 지니는 암세포를 억제하는 더욱 효율적인 방식이 될 수 있었다.
EGFR는 인간 외음부 암종 세포주로부터의 인간 cDNA의 클로닝 및 서열분석에 의해 본래 측정되고 기재된 대로 1186개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되는 170kDa 세포 표면 당단백질이다. EGFR은 하기 3개의 주요 도메인을 함유한다: 티로신 키나제를 함유하는 세포내 도메인, 막통과 도메인 및 세포외 도메인. EGFR 잔기의 촉매 활성은 티로신 키나제 도메인에 있으며 (잔기 685-953) 리간드 결합시에 활성화된다.
EGFR은 2개의 상이한 형태, 즉 계류(tethered) 형태 (폐쇄) 및 연장된 형태 (개방)로 존재한다. 수용체는 2개의 형태 사이에서 변화된다. 계류 형태에서 EGFR의 세포외 영역의 도메인 II 및 IV는 상호작용하여 자가억제된 상태의 수용체를 남긴다. 더욱이, 도메인 III은 도메인 I로부터 상당한 거리에 유지됨으로써 2개의 도메인 모두에 EGF가 동시에 결합할 수 없게 한다. EGFR의 연장된 형태에서, 도메인 I, II 및 III은 입체적으로 C 형상으로 배열되어 EGF 결합을 위한 공간을 제공한다. 또한, 입체형태적 변화는 "이합체화 아암"으로도 알려진, 도메인 II에 있는 20개 잔기 영역으로 구성된 β-헤어핀의 노출을 유도한다. EGFR의 도메인 II로부터 연장된 이합체화 아암은 또 다른 EGFR의 도메인 II와 광범하게 접촉하여 EGFR 호모이합체를 형성한다.
이합체화는 수용체의 활성 세포질 티로신 키나제 도메인이 수용체의 조절 영역에 있는 티로신 잔기의 인산화에 충분할 만큼 가까워 지게 한다. 게다가, 2개 수용체의 인접막(juxtamembrane) 영역은 티로신 키나제 이합체를 안정화시키는데 중요한 것으로 밝혀진 역평행 이합체를 형성한다. "수용체-매개" 이합체화 메커니즘은 "리간드-매개" 이합체화가 더욱 일반적인 근거인 다른 티로신 키나제 수용체에 비해 ErbB 패밀리에 유일한 것이다.
EGFR의 세포내 티로신 키나제 도메인의 다수의 활성화 방식이 제안되었다. 그 밖의 수용체 티로신 키나제와 달리, 디폴트(default)에 의한 EGFR 티로신 키나제 도메인은 인산화되고 활성화된 키나제에서만 보통 관찰되는 형태를 채용한다. 이는 EGFR의 키나제 도메인이 항시적으로 활성임을 나타낸다. 이에 따라 항시적인 티로신 키나제의 조절은 트랜스-인산화를 위한 이합체화 파트너의 C-말단 조절기 영역의 전달을 통해 일어났을 것이다. 또 다른 가능성은, 티로신 키나제 도메인의 활성화가 결정학상 연구에서 가시화되지 않았던 억제 상호작용의 변위를 포함한다는 것이다. 그러나, EGFR의 인접막 및 티로신 키나제의 결정 구조 분석은 2개 EGFR의 이합체화시에 형성된 티로신 키나제의 비대칭 이합체가 티로신 키나제 활성의 조절에 중요함을 드러내었다. 이러한 비대칭 호모이합체에서 티로신 키나제 중 하나는 수용기의 역할을 하는 한편 다른 티로신 키나제는 제공자로 기능한다. 수용기 키나제 도메인만이 촉매 활성을 지니고 수용체의 C-말단 테일에서 티로신 잔기의 인산화를 속행시킨다 (시스 또는 트랜스인지, 둘 다 알려져 있지 않든지 간에).
클라트린-매개 세포내이입은 EGFR의 하향-조절에 가장 중요한 메커니즘이다. EGFR의 운명은 리간드-수용체 복합체의 안정성에 의존적이다. EGFR에 EGF가 결합할 때 EGFR 호모이합체는 클라트린-코팅된 오목부(pit)에 신속하게 표적화되어 리간드-유도 세포내이입을 통해 내재화된다. 동시에 EGFR은 모노유비퀴틴과 폴리유비퀴틴 둘 모두의 부착에 의해 크게 유비퀴틴화된다. 유비퀴틴 라이가제 Cbl은 EGFR의 유비퀴틴화의 원인이다. Cbl은 Grb2와 같은 연결기 단백질을 통해 EGFR의 조절 영역에서 인산화된 티로신 잔기에 직접 또는 간접적으로 결합한다. Grb2를 통한 EGFR로의 Cbl의 결합은 수용체 내재화에 필수적이다. Esp15가 또한 EGFR 내재화에서 역할을 담당한다. 그러나 Esp15의 정확한 역할에 관해서는 아직 논쟁의 여지가 있다. 유비퀴틴화는 EGFR의 세포내이입 하향조절 및 리소좀으로의 EGFR의 엔도솜 분류(endosomal sorting)에 수반된다. 유비퀴틴 사슬은 수송에 요구되는 엔도솜 분류 복합체 (ESCRT) 및 조기 엔도솜의 막에 유비퀴틴화된 단백질을 보유하는 Hrs/STAM에 의해 인지됨으로써 EGFR의 순환을 방해한다. 후속하여 EGFR을 관내 소포 (ILV)로 분류하는데, 이는 후기 엔도솜으로 EGFR을 전달하고 결국 리소좀에서 분해시킨다.
EGF에 결합할 때 EGFR의 분해와 대조적으로, TGF-α 결합은 수용체 순환을 허용한다. TGF-α 리간드는 산성 환경으로 인해 조기 엔도솜에서 EGFR로부터 신속하게 분리되는데, 이는 수용체 탈인산화, 탈-유비퀴틴화를 발생시켜 수용체를 세포 표면으로 역순환시킨다.
인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2, ErbB2 또는 Neu)는 Schechter 등에 의해 1984년에 처음 기재되었다. HER2는 1234개 아미노산으로 구성되며, 4개의 서브도메인 I-IV, 즉 막통과 도메인, 인접막 도메인, 세포내 세포질 티로신 키나제 및 조절 C-말단 도메인으로 구성되는 세포외 도메인을 지니는 EGFR과 구조적으로 유사하다.
HER2에는 계류 EGFR에서 도메인 배열을 제한하는 도메인 II-IV 접촉이 존재하지 않는다. 비활성화된 EGFR에서 계류를 안정화하는데 중요한 7개의 보존된 잔기들 중 3개가 HER2에서 상이하다. 따라서 HER2는 수용체-수용체 상호작용을 유도하도록 노출되고 명백하게 태세를 갖춘 이합체화 아암을 지니는 연장된 (개방) 형태의 EGFR과 비슷하다. 계류된 HER2 형태의 부재는, 수용체에 ErbB 패밀리의 다른 멤버에서 보여진 자가억제가 결여되었음을 나타낸다. 서브도메인 I-III의 안정한 계면들이 EGFR-EGF 복합체의 연장된 형태와 유사한 연장된 형태의 HER2를 유지하는 것처럼 보인다. 도메인 I 및 III 간의 상호작용은 EGFR의 도메인 I 및 III에 있는 리간드-결합 부위에 해당하는 영역을 수반하여 리간드에 대한 어떠한 입체적인 공간도 남기지 않으며 HER2가 결합할 수 없는 리간드가 되게 한다. 도메인 II 및 IV는 HER2와 ErbB 패밀리의 또 다른 멤버의 헤테로이합체 형성을 안정화시키는 2개의 별개의 계면을 형성한다.
생물물리학 연구는 용액 또는 결정에서 현저한 HER2 호모이합체화를 검출하지 못했다. EGFR 및 HER2의 도메인 II의 잔기는 유사하다. 그러나, 이합체 계면에 있는 Arg285가 EGFR 및 HER2 사이에서 보존되지 않는다. HER2에서 잔기 285는 Leu이다. 돌연변이 연구는, 이러한 위치에 있는 Leu가 용액 중 HER2 호모이합체의 부재의 부분적인 원인임을 나타낸다. 생체내 무손상 HER2의 이합체화는 HER2의 막통과 도메인에서 부위들의 추가적인 상호작용을 요구할 수 있다.
HER2는 공지된 리간드에 결합하지 않는 ErbB 패밀리의 유일한 멤버이다. HER2는 대신 다른 ErbB 패밀리 멤버와의 헤테로머 복합체의 형성을 통해 활성화되어 EFGR 및 HER3 리간드에 의해 간접적으로 조절된다. HER2는 3개의 다른 ErbB 수용체의 바람직한 헤테로이합체화 파트너이다. HER2는 리간드-수용체 복합체의 분리 속도를 느리게 함으로써 그 리간드에 대한 그 밖의 ErbB 수용체의 친화성을 향상시키고, 이에 의해 HER2는 신호전달을 향상시키고 연장시킨다. 다른 ErbB 수용체의 리간드 친화성을 향상시키는 HER2의 능력은 헤테로이합체화 파트너로서의 HER2의 불규칙한 거동을 반영할 수 있다. HER2 및 ErbB 패밀리의 또 다른 리간드-결합된 수용체의 헤테로이합체화는 크로스-인산화를 유도하여, C-말단 티로신 잔기의 인산화를 발생시킨다. 가장 활성인 HER2 헤테로이합체는 HER2-HER3 복합체이다. HER2는 활성 키나제를 제공함에 의해 키나제-결핍 HER3을 보완한다.
HER2는 EGFR과 대조적으로 과발현될 때 내재화 내성이다. HER2의 과발현은 다른 ErbB 패밀리 멤버의 세포내이입을 억제한다고 추가로 보고되었다. HER2가 리소좀 분해를 모면함으로써 원형질막에 남게 되는 두 가지 메커니즘이 제안되었다. HER2는 내재화를 회피하거나 엔도솜으로부터 원형질막으로 효율적으로 역순환된다. 표지된 항체를 이용한 연구는, HER2가 끊임없이 내재화되고 순환됨을 나타내었다. 반대로 그 밖의 연구는 순환을 억제하는 것으로 알려진 화합물로 처리된 세포에서 세포내 HER2를 동정하지 못했다.
HER2의 카르복실 말단은 내재화에 요구되는 모든 신호를 지니는 것은 아니거나 이것은 클라트린-매개된 세포내이입에 필수적인 억제 신호를 함유한다고 제안되었다. 추가로, 연구들은 HER2 헤테로이합체가 엔도솜에 전달되지 않는다고 지적하였다. EGFR 상에서 발견된 것과 같은 Cbl 도킹 부위가 또한 HER2 (Y1112) 상에서 확인되었다. 이에 따라 Cbl는 HER2에 동원될 수 있고, 이는 HER2의 유비퀴틴화를 일으키나, Cb1의 실제 결합 효율은 명확하지 않다. HER2는 막 돌출부와 이의 결합으로 인해 내재화 내성인 것으로 제안되었다. 마지막으로, 그 밖의 연구는, HER2-EGFR 헤테로이합체의 세포내이입 내성이 클라트린-코팅된 오목부의 비능률적인 EGF-유도 형성과 관련됨을 나타내었다.
인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3, ErbB3)으로 알려진 ErbB 패밀리의 세 번째 멤버는 1989년에 Kraus M.H. 등에 의해 확인되었다 . HER3 유전자는 EGFR 및 HER2와 현저한 구조적 유사성을 지니는 1342개 아미노산의 단백질을 엔코딩한다. 전체 크기, 2개의 시스테인 클러스터(도메인 II 및 IV)를 갖는 4개의 세포외 서브도메인(I-IV), 및 티로신 키나제 도메인과 같은 특징은 EGFR 및 HER2와 구조적 유사성을 나타낸다. HER3의 티로신 키나제 도메인은 EGFR의 티로신 키나제 도메인과 59%의 서열 상동성을 나타낸다.
마치 EGFR과 같이, HER3은 계류 형태 및 연장된 형태로 존재한다. 계류 형태에서 이합체화 아암(arm)은 도메인 I과 III을 능률적인 리간드 결합부와 매우 멀리 떨어지게 두면서, 도메인 IV와의 상호작용에 의해 숨겨진다. 세포외 도메인 I 및 III에 대한 리간드 결합은 HER3의 연장된 형태에서 발생하여 ErbB 패밀리의 다른 멤버와의 헤테로이합체화를 야기한다. 리간드 결합시에 어떠한 HER3 호모이합체도 형성되지 않는다. 연장되고 리간드-결합된 HER3 분자는 HER2와 우선적으로 헤테로이합체화된다.
EGFR 및 HER2와 대조적으로, HER3의 티로신 키나제는 어떠한 검출가능한 생물학적 반응에 충분치 않은 손상된 촉매 활성을 지닌다. 단백질 키나제의 촉매 도메인에서 고도로 보존된 2개의 아미노산 잔기가 HER3의 촉매 도메인에서 변경된다. 이것은 잔기 815에서 아스파르트산 대신 아스파라긴의 치환 및 잔기 740에서 글루타메이트 대신 히스타민의 치환이다. 2개의 아미노산 치환은 HER3에서 이의 티로신 키나제 도메인의 촉매 활성이 결여된 이유일 수 있다. HER3의 손상된 본질적인 키나제 활성으로 인해, 수용체는 그 고유의 리간드 결합에 반응하기 위해 또 다른 ErbB 패밀리 멤버와 헤테로이합체화될 필요가 있다.
HER3의 세포내이입에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 더욱이, 여러 연구들은 HER3이 HER2와 동일한 정도로 세포내이입 손상된다고 제안하였다. 이와 일치하여 HER3-NRG1 복합체는 EGFR-EGF 복합체보다 덜 효율적으로 느리게 내재화되는 것이 발견되었는데, 이는 HER3이 EGFR만큼 효율적으로 세포내이입되지 않는다는 견해를 시사한다. 그러나, EGFR의 C-말단 테일이 HER3의 C-말단 테일로 대체되었을 때, EGFR은 세포내이입 손상되었는데, 이는 HER3의 C-말단에 있는 영역이 내재화에 대해 수용체를 보호함을 시사하는 것이다. 또한 NRG1은, EGF가 TGFα에 의해 활성화될 때 관찰된 바와 같이, 엔도솜에서 리간드-수용체 복합체의 분리로 인해 분해되도록 HER3을 효율적으로 표적화하지 않음이 제안되었다.
ErbB 패밀리를 표적화하는 것은 암 치료 전략으로서 지난 10년간 광범하게 수행되어 왔다. 티로신 키나제 억제제 (TKI), 모노클로날 항체 (mAb) 및 리간드-트랩과 같은 다양한 치료 양상이 연구되었다. 암 치료에 있어서 모노클로날 항체의 이점은 통상적인 세포독성 암 화학요법에 비해 낮은 독성을 보장하는 표적 특이성에 있다. 모노클로날 항체는 비정상적으로 높은 수준의 EGFR 또는 HER2를 지니는 고형암의 치료를 위해 승인되었고, EGFR 또는 HER2를 표적화하는 다수의 mAb가 임상 시험중에 있다. TKI는 EGFR 및 HER2의 티로신 키나제 도메인에서 ATP-결합 부위에 결합함에 의해 수용체 신호전달을 억제한다. 에를로티닙(Erlotinib)/타세바(Tarceva)®는 EGFR의 티로신 키나제를 억제하는 한편, 라파티닙(lapatinib)/타이커브(Tykerb)®는 EGFR과 HER2 둘 모두의 티로신 키나제를 억제한다. 에를로티닙과 라파티닙 둘 모두는 비소세포폐암 (NSCLC) 및 HER2 과발현 전이성 유밤암의 치료에 각각 사용하기 위해 FDA 승인된 TKI이다.
그러나, 모노클로날 항체 요법 및 TKI의 임상적 유용성에도 불구하고, 치료에 대한 획득 내성의 발생에 대한 문제가 증가하고 있다. mAb 및 통상적인 세포독성 화학요법의 조합 치료는 치료 효능을 증가시키기 위해 수행되는 접근법 중 하나이다. 또한, 효과기 기능의 향상, 및 방사성핵종 또는 독소와 함께 항체의 직접 및 간접적 아밍(arming)을 포함하는, 모노클로날 항체의 효능을 증가시키기 위한 여러 전략들이 연구 중이다.
따라서, 현존하는 치료에 내성이 생긴 환자를 포함하는, 환자에서의 EGFR 패밀리-관련 질환을 치료하기 위한 추가 약물에 대한 요구가 존재한다. 이러한 추가 약물은 또한 인간 환자를 치료하기 위해 이용될 때 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 위험이 낮아야 한다.
발명의 개요
본 발명자들은 EGFR-패밀리의 둘 이상의 멤버(예컨대, EGFR, HER2, 및 HER3)를 인간화 항체로 동시에 표적화하는 것이 암 성장을 효과적으로 억제시킴을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 다수의 EGFR-패밀리 멤버를 표적화하는 조성물을 이용하여, 단 하나의 EGFR-패밀리 멤버를 표적화하는 약물 요법에 내성이 생긴 암을 포함하는 췌장, 골, 결장, 자궁내막, 또는 요도 암과 같은 암을 치료할 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 EGFR, HER2 및 HER3에 대해 유도된 인간화 항체 뿐만 아니라 이러한 표적들 중 둘 이상에 대해 유도된 둘 이상의 인간화 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간 암 치료를 위한 항체 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 인간화 항-EGFR 항체는 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 SEQ ID NO:4의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:5의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 항-EGFR 항체는 Arg44 및 Val83을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Ala19 및 Phe92를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:2); Arg44, Val83 및 Ile104를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Tyr41, Leu51 및 Phe92를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:3); 또는 Arg44, Val83 및 Ile104를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Leu34, Tyr41, Leu51 및 Phe92를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:3)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-EGFR 항체는 Leu20, Ile48 및 Ala68을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:4), 및 Val75 및 Phe87을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:5); 또는 Leu20, Ile48, Leu56, 및 Ala68을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:4), 및 Val75 및 Phe87을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:5)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이 각각 SEQ ID NO:43 및 44, 각각 SEQ ID NO:38 및 39, 각각 SEQ ID NO:41 및 42, 각각 SEQ ID NO:45 및 46, 또는 각각 SEQ ID NO:47 및 48을 포함하는 인간화 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 인간화 항-HER2 항체는 SEQ ID NO:6의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:9의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 항-HER2 항체는 Ser55, Leu70, Val72, Lys74 및 Ala79를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:6), 및 Val44, Met48 및 Tyr70을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:7); 또는 Ser55 및 Val72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:6), 및 Met48 및 Tyr70을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:7)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-HER2 항체는 Ala49, Ile74 및 Ser77을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:8), 및 Thr56, Tyr71, Ser85 및 Leu104를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:9)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이 각각 SEQ ID NO:51 및 52, 각각 SEQ ID NO:49 및 50, 또는 각각 SEQ ID NO:53 및 54를 포함하는 인간화 항-HER2 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 인간화 항-HER3 항체는 SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 항체 SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 항-HER3 항체는 Met49, Ser55 및 Ile68, 또는 Asn44, Ser55 및 Thr93을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:10), 및 Phe36, Val44, Phe49 및 Ile85, 또는 Phe36, Phe49 및 Leu73을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:11)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항-HER3 항체는 Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:12), 및 Val21, Val44 및 Phe87, 및 임의로 Thr29를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:13); 또는 Phe41, Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:12), 및 Val21, Val44, Tyr71, Phe87 및 Leu104를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:13)을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이 각각 SEQ ID NO:55 및 56, 각각 SEQ ID NO:57 및 58, 각각 SEQ ID NO:59 및 60, 또는 각각 SEQ ID NO:61 및 62를 포함하는 인간화 항-HER3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체들 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 항체 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 조성물은 (i) 11294 및/또는 11302; (ii) 11249 및/또는 11145; 및 (iii) 10738 및/또는 11052를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 6개 모두의 항체를 포함한다.
항체 조성물은 (a) 항-EGFR 항체 10292, 10460, 또는 11294; (b) 항-EGFR 항체 10560 또는 11302; (c) 항-HER2 항체 10704 또는 11249; (d) 항-HER2 항체 11145; (e) 항-HER3 항체 10738 또는 10810; 및 (f) 항-HER3 항체 11006 또는 11052를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체 조성물은 항-EGFR 항체 11294 및 11302, 항-HER2 항체 11249 및 11145, 및 항-HER3 항체 10738 및 11052를 포함한다. 항체 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006, 또는 11052는 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 임의의 잔기에 적어도 하나의 추가 치환을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 항체 조성물은 (a) SEQ ID NO:43의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:44의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (b) SEQ ID NO:47의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:48의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (c) SEQ ID NO:51의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:52의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (d) SEQ ID NO:53의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:54의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (e) SEQ ID NO:55의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:56의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 및 (f) SEQ ID NO:61의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:62의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 항체 및 항체 조성물을 생성하는 방법; 본 발명의 항체 또는 항체 조성물 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물; 치료적 유효량의 본 발명의 재조합 항체 조성물 또는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 기타 포유동물에서 암을 치료하는 방법; 암을 치료하는 약제를 제조하기 위한 본 발명의 재조합 항체 조성물 또는 약학적 조성물의 용도; 및 암을 치료하기 위한 약제로서 사용되는 본 발명의 재조합 항체 조성물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 인간 치료를 위해, 항체는 바람직하게는 인간 HER 패밀리 멤버에 대해 유도된다. 일부 구체예에서, 이러한 각각의 조성물은 하나를 초과하는 모노클로날 항체를 포함하고, 각각은 표적화된 HER의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 중 적어도 하나는 세포독성제, 사이토카인, 독소, 또는 방사성핵종과 같은 항암제에 컨쥬게이션된다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 암은 비제한적으로 췌장암 (KRAS 돌연변이에 의해 촉진된 췌장암 포함), 두경부암, 유방암, 골암, 결장암 (결장직장암 포함), 자궁내막암, 요도암, 피부암, 폐암, 전립선암, 위암, 식도암, 난소암, 기타 표피암, 및 EGFR, HER2, 및 HER3 중 하나 이상에 의존하는 암을 포함한다.
환자는 이전에 암에 대해 치료된 적이 있을 수 있다. 예를 들어, 환자는 단일 EGFR-패밀리 멤버를 표적화하는 약물로 치료된 적이 있고 약물 (예컨대, 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 또는 퍼투주맙(pertuzumab))에 대한 획득 내성을 지닐 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 그러한 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 본원에 기재된 항체 중 어느 하나를 발현시킬 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상(in silico) 설계된 서열을 지니는 항-EGFR 인간화 모노클로날 항체 10292, 10460, 및 11294의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 맨 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10292 (SEQ ID NO:38), 10460 (SEQ ID NO:40), 및 11294 (SEQ ID NO:42)의 가변 중쇄 (1277_CDRgrafted-H; SEQ ID NO:62). 중간: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10292 (SEQ ID NO:39)의 가변 경쇄 (1277_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:63). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10460 (SEQ ID NO:41) 및 11294 (SEQ ID NO:43)의 가변 경쇄 (1277A_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:64).
도 2: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상 설계된 서열을 지니는 항-EGFR 인간화 모노클로날 항체 10560 및 11302의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10560 (SEQ ID NO:44) 및 11302 (SEQ ID NO:46)의 가변 중쇄 (1565_CDRgrafted-H; SEQ ID NO:65). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10560 (SEQ ID NO:45) 및 11302 (SEQ ID NO:47)의 가변 경쇄 (1565_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:66).
도 3: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상 설계된 서열을 지니는 항-HER2 인간화 모노클로날 항체 10704 및 11249의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10704 (SEQ ID NO:48) 및 11249 (SEQ ID NO:50)의 가변 중쇄 (4384_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:67). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10704 (SEQ ID NO:49) 및 11249 (SEQ ID NO:51)의 가변 경쇄 (4384_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:68).
도 4: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상 설계된 서열을 지니는 항-HER2 인간화 모노클로날 항체 11145의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 11145 (SEQ ID NO:52)의 가변 중쇄 (4517_CDRgrafted-H; SEQ ID NO:69). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 11145 (SEQ ID NO:53)의 가변 경쇄 (4517_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:70).
도 5: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상 설계된 서열을 지니는 항-HER3 인간화 모노클로날 항체 10738 및 10810의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10738 (SEQ ID NO:54) 및 10810 (SEQ ID NO:56)의 가변 중쇄 (5038_CDRgrafted-H; SEQ ID NO:71). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 10738 (SEQ ID NO:55) 및 10810 (SEQ ID NO:57)의 가변 경쇄 (5038_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:72).
도 6: 완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 가상 설계된 서열을 지니는 항-HER3 인간화 모노클로날 항체 11006 및 11052의 가변 사슬의 아미노산 서열 정렬. 점은 주체를 나타내는 반면, 상이한 위치는 이들의 한 문자 아미노산 약어로 표시된다. 음영 영역은 IMGT에 의해 정의되는 CDR을 나타낸다. 위: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 11006 (SEQ ID NO:58) 및 11052 (SEQ ID NO:60)의 가변 중쇄 (5082_CDRgrafted-H; SEQ ID NO:73). 아래: CDR 그래프트된 서열로 정렬된 11006 (SEQ ID NO:59) 및 11052 (SEQ ID NO:61)의 가변 경쇄 (5082_CDRgrafted-L; SEQ ID NO:74).
도 7: 키메라 항-EGFR 파트너 항체와 조합된 인간화 항-EGFR 항체 변이체 10292의 시험관내 활성. A431NS 세포 (위 패널) 및 H358 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 8: 키메라 항-EGFR 파트너 항체와 조합된 인간화 항-EGFR 항체 변이체 10460의 시험관내 활성. A431NS 세포 (위 패널) 및 H358 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 9: 키메라 항-EGFR 파트너 항체와 조합된 인간화 항-EGFR 항체 변이체 10560의 시험관내 활성. A431NS 세포 (위 패널) 및 H358 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 10: 키메라 항-HER2 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER2 항체 변이체 10704의 시험관내 활성. OE19 세포 (위 패널) 및 BT474 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 11: 키메라 항-HER2 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER2 항체 변이체 11145의 시험관내 활성. OE19 세포 (위 패널) 및 BT474 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 12: 키메라 항-HER3 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER3 항체 변이체 10738의 시험관내 활성. MBA-MD-175 VII 세포 (위 패널) 및 MCF-7 세포 (1 nM의 헤레굴린 베타의 존재하에: 아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 13: 키메라 항-HER3 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER3 항체 변이체 10810의 시험관내 활성. MBA-MD-175 VII 세포 (위 패널) 및 MCF-7 세포 (1 nM의 헤레굴린 베타의 존재하에: 아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 14: 키메라 항-HER3 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER3 항체 변이체 11006의 시험관내 활성. MBA-MD-175 VII 세포 (위 패널) 및 MCF-7 세포 (1 nM의 헤레굴린 베타의 존재하에: 아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 15: 키메라 항-HER3 파트너 항체와 조합된 인간화 항-HER3 항체 변이체 11052의 시험관내 활성. MBA-MD-175 VII 세포 (위 패널) 및 MCF-7 세포 (1 nM의 헤레굴린 베타의 존재하에: 아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 16: 키메라 및 인간화 항체와 인간, 시노몰구스 및 뮤린 HER 패밀리 항원의 교차-반응성 패턴. 450 nm에서 ELISA 판독기를 이용하여 측정된 40 nM 항체로부터의 OD 신호를 음성(-; OD<0.1)에서 강한 양성(+++; OD>2.5)까지 점수로 매겼다.
도 17: 키메라 항-EGFR 파트너 항체와 조합된 인간화 항-EGFR 항체 변이체 11294의 시험관내 활성. A431NS 세포 (위 패널) 및 FaDu 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 18: 키메라 항-EGFR 파트너 항체와 조합된 인간화 항-EGFR 항체 변이체 11302의 시험관내 활성. A431NS 세포 (위 패널) 및 FaDu 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 19: 인간화 항-HER2 파트너 항체 11145와 조합된 인간화 항-HER2 항체 변이체 11249의 시험관내 활성. OE19 세포 (위 패널) 및 BT474 세포 (아래 패널)를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 20: 인간화 항체 (변이체 11294, 11302, 11249, 11145, 10738 및 11052; 인간화 Pan-HER)의 혼합물 및 키메라 항체 (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER)의 혼합물의 시험관내 활성. 지시된 세포주를 상이한 농도의 지시된 항체 혼합물로 96시간 동안 처리하였다. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시한다.
도 21A는 Pan-HER과 이의 EGFR (좌측), HER2 (중간) 및 HER3 (우측) 표적 단백질의 상호작용을 예시하는 도식이다.
도 21B는 각각 A431NS, HCC202, 및 MDA-MB-175-VII 세포주의 대사 활성에 대한 EGFR (좌측), HER2 (중간) 및 HER3 (우측) 항체의 치료 효과를 도시하는 일련의 차트이다. 좌측 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 음성 대조군, 1277, 1565, 1277+1565를 나열한다. 중심 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 음성 대조군, 4384, 4517, 4384+4517을 나열한다. 우측 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 음성 대조군, 5038, 5082, 5038+5082를 나열한다.
도 21C는 지시된 항체 및 항체 혼합물로 처리된, 각각 A431NS, HCC202 및 MDA-MB-175-VII 암 세포의 전체 세포 용해물에서 EGFR (좌측), HER2 (중간), 및 HER3 (우측) 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 22는 Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER)로 처리된 73개 암 세포주에서 EGFR (좌측), HER2 (중간), 및 HER3 (우측)의 수용체 인산화 수준을 도시하는 이미지이다.
도 23은 Pan-HER 혼합물 (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER), Pan-HER 하위성분 및 음성 대조군 항체로의 처리 후 미처리된 (헤레굴린 또는 EGF 없음) 대조군 세포(100%로 설정됨)의 백분율로서 최대 대사 활성을 도시하는 표이다.
도 24는 5 nM 헤레굴린의 존재하에 Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER), Pan-HER 하위성분 및 음성 대조군 항체로의 처리 후 리간드의 부재하에 미처리된 대조군 세포(100%로 설정됨)의 백분율로서 최대 대사 활성을 도시하는 표이다. 세포를 항체 및 리간드를 함유하는 배지에 96시간 동안 노출시켰다 (즉, 리간드 및 항체는 세포에 동시에 첨가되었다).
도 25는 1 nM EGF의 존재하에 Pan-HER (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER), Pan-HER 하위성분 및 음성 대조군 항체로의 처리 후 리간드의 부재하에 미처리된 대조군 세포(100%로 설정됨)의 백분율로서 최대 대사 활성을 도시하는 표이다. 세포를 항체 및 리간드를 함유하는 배지에 96시간 동안 노출시켰다 (즉, 리간드 및 항체는 세포에 동시에 첨가되었다).
도 26은 7개의 췌장암 세포주 (CAPAN-1, PK-1, CFPAC-1, BxPC3, ASPC1, CAPAN-2, Pan08.13, PANC-1, KP4, MiaPaca-2 및 PSN1)의 이미지의 상단에 나열된 유전자의 돌연변이 상태를 도시하는 이미지이다.
도 27은 헤레굴린과 EGF 리간드의 부재하에 (좌측) 또는 헤레굴린 (중간) 및 EGF (우측) 리간드의 존재하에 Pan-HER 처리에 대한 CAPAN-1 세포주의 용량-반응을 도시하는 일련의 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 25는 부모 세포주 (위) 및 세툭시맙, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙에 획득 내성을 지닌 상응하는 내성 클론 (아래)의 대사 활성에 대한 Pan-HER 및 참조 항체의 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. 좌측 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 세툭시맙, 음성 대조군을 나열한다. 중심 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 트라스투주맙, 음성 대조군을 나열한다. 우측 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 퍼투주맙, 음성 대조군을 나열한다.
도 28은 부모 세포주 (위) 및 세툭시맙, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙에 획득 내성을 지닌 상응하는 내성 클론 (아래)의 대사 활성에 대한 Pan-HER 및 참조 항체의 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. 좌측 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 세툭시맙, 음성 대조군을 나열한다. 중심 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 트라스투주맙, 음성 대조군을 나열한다. 우측 위 패널의 그림 범례는 위에서 아래로 Pan-HER, 퍼투주맙, 음성 대조군을 나열한다.
도 29는 항체 처리 후 H292 (위) 및 OVCAR-8 (아래) 세포주의 전체 세포 용해물에서 EGFR, HER2 및 HER3의 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 30은 BxPC-3 이종이식편 모델에서 종양 부피에 대한 Pan-HER 또는 이의 하위성분으로의 치료 효과를 도시하는 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 31은 처리를 중단한 지 3일 후 비히클 및 Pan-HER 치료된 BxPC-3 이종이식편으로부터 절제된 종양의 EGFR 및 HER2 면역표지된 섹션을 도시하는 일련의 이미지이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 32는 Calu-3 이종이식편 모델에서 종양 부피에 대한 Pan-HER 또는 이의 하위성분으로의 치료 효과를 도시하는 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"은 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 33 (위)는 항체 처리 후 BxPC-3 종양 용해물에서 EGFR, HER2, HER3 및 β-액틴 로딩 대조군의 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다. 웨스턴 블롯 밴드 세기에서 EGFR, HER2, 및 HER3 수준의 상대적 정량은 도 30 (아래)의 일련의 차트에 제시된다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 34는 KRAS 돌연변이된 췌장암의 ST191, ST204, ST383, STS021, ST179, ST385, STS064, ST334, STS059, 및 STS058 환자-유래 종양 이종이식편 모델에서 종양 부피에 대한 Pan-HER의 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 35는 KRAS 돌연변이된 췌장암의 ST179 및 ST383 환자-유래 종양 이종이식편 모델에서 종양 부피에 대한 Pan-HER 또는 이의 하위성분으로의 처리 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"은 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 36은 획득된 세툭시맙 내성 HN5 클론의 발생 및 클로닝을 예시하는 도식이다.
도 37은 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에 대한 세툭시맙 처리의 용량-반응 효과를 도시하는 그래프이다.
도 38은 고정된 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에 대한 세툭시맙의 결합 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 39는 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에서 형광 흐름 세포측정에 의해 발견된 EGFR의 상대 표면 수준을 도시하는 그래프이다.
도 40은 미처리되거나 (좌측) EGF로 자극된 (우측) 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14로부터의 세포 용해물에서 EGFR, 인산화 EGFR 종, 및 β-액틴 로딩 대조군의 전체 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 41은 미처리되거나 (좌측) EGF로 자극된 (우측) 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14로부터의 세포 용해물에서 EGFR, AKT, pAKT (Ser473), ERK1/2, pERK1/2(Thr202/Tyr204), 및 β-액틴 로딩 대조군의 전체 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 42는 EGFR-LNA, 세툭시맙, EGFR-2혼합물 (항체 1277 및 1565) 또는 대조군으로 처리된 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2 및 HN5 CR14의 생존력을 도시하는 그래프이다.
도 43은 EGFR-LNA, 세툭시맙, EGFR-2혼합물 (항체 1277 및 1565) 또는 대조군으로 처리된 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2 및 HN5 CR14에서 EGFR의 전체 수준을 도시하는 일련의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 44는 지시된 EGFR 항체로 처리된 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14의 생존력을 도시하는 그래프이다. "EGFR 2혼합물"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "Her3 2혼합물"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
도 45는 지시된 항체로의 처리에 대한 부모 HN5 세포 (도 45A) 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2 (도 45B) 생존력의 용량-반응을 도시하는 일련의 그래프이다. "EGFR 2혼합물"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "Her3 2혼합물"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3 4혼합물"은 항체 1277, 1565, 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일부 모노클로날 항체 (예컨대, 세툭시맙, 트라스투주맙, 및 퍼투주맙)가 EGFR-패밀리-관련 질환을 치료하는데 이용되어 왔으나, 이러한 치료가 모든 환자에게 효과적인 것은 아니다. 또한, 처음 사용 후 환자는 이러한 약물에 대한 내성을 종종 발생시킨다. 본 발명은 EGFR-패밀리 멤버 EGFR, HER2, 및 HER3을 표적화하는 본 발명자들의 신규한 인간화 항체의 발견에 기반하며 이러한 인간화 항체의 혼합물 (인간화 pan-HER 항체 조성물)은 표적을 효과적으로 하향-조절하고 다양한 암 세포주의 성장을 억제할 수 있다. 본 발명자들은 또한 EGFR-패밀리 멤버 EGFR, HER2, 및 HER3을 표적화하는 항체 혼합물이 치료하기 힘든 환자-유래 췌장암 모델을 포함하는 인간 암의 다수의 이종이식편 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제함을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 하나를 초과하는 EGFR-패밀리 멤버를 표적화하는 항체 혼합물이 세툭시맙, 트라스투주맙, 및 퍼투주맙과 같은 치료적 모노클로날 항체에 획득 내성을 지니는 세포에서 이들의 억제 효과를 보유한다고 제시하였다.
인간화 항체
본 발명의 한 양태는 EGFR-패밀리 멤버 EGFR, HER2, 및 HER3에 결합하는 인간화 항체에 관한 것이다. 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 혈청의 기능성 성분을 기재하며, 이는 종종 분자의 집합물(항체 또는 면역글로불린) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)를 언급한다. 항체는 특정 항원성 결정인자(항원 또는 항원성 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 차례로 면역학적 효과기 메커니즘을 유도할 수 있다. 개별적 항체는 보통 단일특이성으로 간주되고, 항체들의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원, 또는 심지어 별개의 상이한 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 2개 이상의 상이한 항체들로 구성)일 수 있다. 각각의 항체는 이의 해당 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 독특한 구조를 갖고, 모든 천연 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 동일한 전체적인 기본 구조를 갖는다. 항체는 또한 총괄적으로 면역글로불린으로 공지되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 단일 쇄 항체, 뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 단편 또는 단일 쇄 Fv(scFv) 단편, 및 다합체 형태, 예를 들어, 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다. 따라서, 본 설명 및 청구범위에서, "항체" 또는 "항체들"에 대한 언급은, 달리 지시되거나 그렇지 않음이 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 특히 결합 단편 및 단일 쇄 항체를 포함하고자 한다.
항체의 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 CH1, CH2 및 CH3으로 지칭되는 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 항체 경쇄는 통상적으로 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 통상적으로 CL로서 지칭되는 단일 도메인을 포함한다. VH 및 VL 영역은 과변이(서열 및/또는 구조적으로 정의된 루프에서 과변이될 수 있는 "과가변 영역")의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. "과가변 영역"은 주로 항체 결합 특이성을 결정짓는 원인이 되는 항체의 가변 도메인에서 발견된다. 이들은 또한 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 더욱 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 지칭된다. 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 명명된 3개의 CDR 영역을 함유하는데, 이 중 CDR3이 가장 큰 가변성을 나타낸다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서대로 정렬되는 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 가변 영역의 아미노산 잔기는 초티아(Chothia) 및 IMGT와 같은 다른 넘버링 양식도 존재하지만, 종종 케이뱃(Kabat) 넘버링 양식으로서 알려진 표준화된 넘버링 방법을 이용하여 넘버링된다 (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
용어 "재조합 항체"는 항체의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터 (또는 가능하게는 하나를 초과하는 발현 벡터, 예컨대 2개의 발현 벡터)로 트랜스펙션된 세포 또는 세포주로부터 발현된 항체를 나타내며, 상기 코딩 서열은 자연적으로 상기 세포와 결합되어 있지 않다.
본원에서 이용되는 네 자리-숫자 항체 번호, 즉, 1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082는 본 발명의 인간화 항체가 유래되는 WO 2012/059857호에 기재된 키메라 부모 항체를 나타낸다. 하기 표 1은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄(LC)의 DNA 및 아미노산 서열에 대한, 표 8에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO를 제시한다.
표 1: 키메라 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄의 DNA 및 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO
Figure pct00001
주로 아미노산 잔기에 있는 표적 항원 잔기와 항체의 상호작용의 특이성은 중쇄 및 경쇄의 6개 CDR에 있다. 따라서 CDR내 아미노산 서열은 CDR의 밖에 있는 서열보다 개별적인 항체들 간에 훨씬 많이 가변적이다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 책임지므로, 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열로 그래프트된 특수한 항체로부터의 CDR 서열을 발현시키는 발현 벡터를 작제함에 의해 특수한 천연 발생 항체의 특징을 모방하는 재조합 항체, 또는 더욱 일반적으로 주어진 아미노산 서열을 지니는 임의의 특수한 항체를 발현시킬 수 있다. 결과적으로, 비-인간 항체를 "인간화"시킬 수 있고 더욱 실질적으로 원래 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지시킬 수 있다. 인간화에 대한 보다 상세한 논의가 하기에 제공된다.
"키메라 항체"는 이의 가장 넓은 의미에서 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 지칭하며, 전형적으로, 부분적으로는 인간 기원의 것이고 부분적으로는 비-인간 기원의 것인, 즉 비-인간 동물, 예를 들어 마우스, 래트 또는 그 밖의 설치류, 또는 닭과 같은 조류에서 일부 유래된 항체이다. 키메라 항체는 인간 항-항체 반응, 예컨대 뮤린 항체의 경우, 인간 항-마우스 항체 반응의 위험성을 감소시키는데 있어서 비-인간 항체보다 바람직하다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변 영역 서열이 마우스의 면역화로부터 유래된 뮤린 서열인 반면 불변 영역 서열이 인간인 것이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 부분은 항체를 인간화하기 위해 추가로 변경될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 발명은 뮤린 가변 영역 서열을 지니는 특정 키메라 항체의 인간화에 기반한다.
용어 "인간화"는 항체가 전체적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원의 것, 예를 들어 관심있는 항원으로 마우스를 면역화시켜 수득된 뮤린 항체 또는 그러한 뮤린 항체에 기반한 키메라 항체인 경우, 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역 및 불변 도메인에 있는 특정 아미노산을 대체시켜 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화할 수 있다는 사실을 지칭한다. 모든 항체는 논의되고 있는 항체의 "인간화(humanness)" 정도와 어느 정도 관련되는 인간 항-항체 반응을 유도할 가능성을 지니는 것으로 알려져 있다. 비록 면역원성, 그리고 이에 의해 특정 항체의 인간 항-항체 반응을 정밀하게 예측할 수는 없지만, 비-인간 항체는 인간 항체보다 더욱 면역원성인 경향이 있다. 외래 (일반적으로 설치류) 불변 영역이 인간 기원의 서열로 대체된 키메라 항체는 완전한 외래 기원의 항체보다 일반적으로 덜 면역원성인 것으로 나타났고, 치료용 항체에서의 추세는 인간화 또는 완전한 인간 항체를 향하고 있다. 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 그 밖의 항체의 경우, 그 결과로서, 이들을 인간화시켜 인간 항-항체 반응의 위험성을 감소시키는 것이 바람직하다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 포함한다. 상보성 결정 영역 (CDR)의 일부인 아미노산 잔기는 인간화와 관련하여 가장 자주 변경되지는 않을 것이나, 특정 경우에, 예를 들어 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파테이트 이성질체화 부위 또는 요망되지 않는 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해 개별적인 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. N-결합된 글리코실화는 올리고사카라이드 사슬이 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 부착함에 의해 일어나며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-글리코실화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 상이한 잔기로 돌연변이시킴에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 의해 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때 특히 탈아미드화되기 쉽고, Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열에서는 적은 정도로 탈아미드화된다. 따라서, 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 전형적으로 관여된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적 치환에 의해 그 부위를 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 많은 방법이 당 분야에 공지되어 있다; 참조: 예컨대, Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633에 의해 개관됨. 한 가지 일반적으로 사용되는 방법은, 예컨대 뮤린-유래된 키메라 항체의 경우 뮤린 가변 영역 유전자에 대한 인간 생식세포 유전자 대응부를 동정하고 뮤린 CDR 서열을 이러한 프레임워크로 그래프트하는 것을 포함하는 CDR 그래프팅이다. CDR 그래프팅은 케이뱃 CDR 정의에 기반할 수 있으나, 보다 최근의 간행물 (Magdelaine-Beuzelin et al. (2007) Crit Rev . Oncol Hematol. 64: 210-225)은 IMGT® 정의 (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org)가 인간화의 결과를 향상시킬 수 있음을 제안하였다 (Lefranc et al. (2003), IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev. Comp Immunol. 27, 55-77 참조). CDR 그래프팅이 CDR 그래프트된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 이에 따라 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 복귀 돌연변이 (때로 "프레임워크 복구"로 지칭됨)를, 전형적으로 프레임워크 영역에서 CDR 그래프트된 항체의 선택된 위치에 도입시켜 부모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 재확립시킬 수 있다. 가능한 복귀 돌연변이를 위한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용하여 수행될 수 있다. 복귀 돌연변이의 후보인 아미노산 잔기는 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 것들인 반면, 숨겨지거나 낮은 정도의 표면 노출을 지니는 잔기는 일반적으로 변경되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 복귀 돌연변이에 대안적인 인간화 기법은 비-인간 기원의 표면 노출되지 않은 잔기를 유지하는 한편 표면 잔기를 인간 잔기로 변경시키는 리서피싱(resurfacing)이다.
특정 경우에, 표적 에피토프에 대한 결합 친화성을 향상시키기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 "친화성 성숙화"로 알려져 있고, 예를 들어 항체의 인간화가 감소된 결합 특이성 또는 친화성을 초래하고 복귀 돌연변이 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 향상시킬 수 없는 상황에서, 임의로 인간화와 함께 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법, 예를 들어 문헌[Burks et al. (1997) PNAS USA, vol. 94, pp. 412-417]에 기재된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이발생 방법 및 문헌[Wu et al. (1998) PNAS USA, vol. 95, pp. 6037-6042]의 단계식 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
본원에서 아미노산 잔기는 1-문자 코드 또는 3-문자 코드에 의해 표시될 수 있다. 참조 서열에 대한 아미노산 치환은, 예컨대 포맷 "G44R"를 이용하여 표시될 수 있는데, 이는 참조 서열의 위치 44에 있는 글리신 잔기가 아르기닌 잔기로 돌연변이되었음을 나타낸다. 예를 들어, 하기 표 3에서, "G44R"은 CDR-그래프트된 항체에서의 글리신 잔기가 아르기닌 잔기로 돌연변이됨을 나타낸다. 포맷 "Arg44"로 기입된 아미노산 잔기는 특정 위치의 특정 잔기, 즉, 이 경우 위치 44의 아르기닌 잔기를 나타낸다. 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 잔기의 넘버링은 첨부된 서열 목록을 나타낸다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 인간화 항체, 보다 특히 WO 2012/059857호에 기재된 특정 키메라 부모 항체에 기반한 인간화 항체에 관한 것이다. 본 발명의 인간화 항체는 CDR 그래프팅 및 복귀 돌연변이, 및 일부 경우에 WO 2012/059857호에 기재된 선택된 키메라 항-EGFR, 항-HER2 및 항-HER3 항체로 시작하는, 원치 않는 서열 모티프의 변경을 이용하여 개발되었다. 이러한 인간화 항체를 개발하는데 사용된 특정 방법 뿐만 아니라 이들이 개발된 원래 키메라 항체 대비 인간화 항체의 기능적 평가의 결과가 하기 실시예에 기재된다. 두드러지게는, 실시예에 제시된 데이터는 본 발명의 인간화 항체를 함유하는 혼합물이 원래 키메라 항체의 상응하는 혼합물의 시험관내 효능에 필적하는 시험관내 효능을 지님을 나타내는데, 이는 인간화 과정이 이러한 항체들의 억제 특성 또는 서로 조합하여 기능하는 이들의 능력에 아무런 영향을 미치지 않았음을 입증하는 것이다. 데이터는 또한 인간화 항체 혼합물이 WO 2012/059857호에 기재된 원래 키메라 항체 혼합물의 생체내 효능에 필적하는 생체내 효능도 나타낼 것임을 강력하게 시사한다.
본원에서 이용된 다섯 자리-숫자 항체 번호, 예컨대 "항체 10560"은 하기 기재된 특수한 인간화 항체를 나타내며, 이는 키메라 부모 항체에 기반한 CDR 그래프팅에 의해 제조되었다. 예를 들어, 항체 10560은 SEQ ID NO:4에 개시된 중쇄 가변 영역 서열 (VH)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:5에 개시된 경쇄 가변 영역 서열 (VL)을 포함하는 경쇄를 지니고, 본래의 CDR-그래프트된 항체에 비해 특정 위치에 치환 (예를 들어, 복귀 돌연변이)을 포함하는 항체이다 (표 3 및 도 1-6 참조). 하기 실시예에서, 항체는 또한 인간 카파 불변 영역 서열 (N-말단 Arg 잔기를 지니는, WO 2012/059858 및 US 2011/0217305의 SEQ ID NO:42) 및 인간 IGHG1 중쇄 불변 영역 서열 (WO 2012/059858 및 US 2011/0217305의 SEQ ID NO:44)을 포함하였다.
본 발명의 특정 인간화 항체는 항체 번호의 방식, 즉, 10292, 10460, 11294, 10560, 10704, 11302, 11145, 11249, 10738, 10810, 11006 또는 11052로 본원에 기재된다. 이들은 실시예 1에 기재된 대로, CDR 그래프팅 및 특정 위치에서의 후속 돌연변이, 주로 복귀 돌연변이에 의해 WO 2012/059857호에 기재된 키메라 항체 (뮤린 가변 영역, 인간 불변 영역)로부터 유래된다. 하기 표 2는 본 발명의 인간화 항체가 WO 2012/059857호에 기재된 키메라 부모 항체와 어떻게 관련되는 지를 요약한다.
표 2: 인간화 및 키메라 부모 항체 번호
Figure pct00002
하기 표 3은 본 발명의 예시적인 인간화 항체의 SEQ ID NO 뿐만 아니라 본래 CDR-그래프트된 항체에 비해 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)에서의 개개 치환 (복귀 돌연변이, 및 특정 경우 요망되지 않는 서열 모티프를 변경시키는 돌연변이(들))을 제공한다. 표 3에 열거된 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 도 1-6 및 표 3에서 괄호 안에 든 분리된 SEQ ID NO로 제공된다. 도 1-6의 CDR 서열은 음영으로 표시된다.
표 3: 선택된 인간화 항체에서 서열 번호 및 치환
Figure pct00003
표 2에 열거된 넘버링된 인간화 항체들 중 어느 것이 "표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서 하나 이상의 추가 치환"을 포함할 수 있다는 표시는 상기 항체가 표 3에 상기 열거된 치환 이외의 추가 치환을 하나 이상의 "Xaa" 잔기에서 포함할 수 있음을 의미한다.
표 4: 선택된 인간화 항체의 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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완전한 인간 프레임워크 영역으로 그래프트된 원래 뮤린 CDR로 구성된 개개의 가상 설계된 서열을 지니는 이러한 인간화 항체의 CDR-그래프트된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 정렬이 도 1-6에 도시된다.
본 발명의 한 양태는 EGFR, HER2 또는 HER3을 표적화하는 특정 인간화 항체에 관한 것이다. 이러한 각각의 항체는 하기를 포함한다:
· (a) SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-EGFR 항체;
· (b) SEQ ID NO:4의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:5의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-EGFR 항체;
· (c) SEQ ID NO:6의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-HER2 항체;
· (d) SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:9의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-HER2 항체;
· (e) SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-HER3 항체; 및
· (f) SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 인간화 항-HER3 항체.
상기 개요된 인간화 항체는 전형적으로 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열 둘 모두에 표 4 및 실시예 및 첨부된 도면에 개시된 하나 이상의 가능한 치환 (주로 복귀 돌연변이, 그러나 특정 경우에 또한 원치 않는 서열 모티프를 변경시키는 돌연변이)을 포함한다. 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 전형적으로 각각 2개, 3개, 4개 또는 5개의 그러한 치환을 포함할 것이다.
바람직한 항-EGFR 항체 (a)의 예는:
(i) Arg44 및 Val83을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Ala19 및 Phe92을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:2)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10292];
(ii) Arg44, Val83 및 Ile104를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Tyr41, Leu51 및 Phe92를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10460]; 또는
(iii) Arg44, Val83 및 Ile104를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:1), 및 Leu34, Tyr41, Leu51 및 Phe92를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:3)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11294]이다.
항-EGFR 항체 (a)는 또한 항체 10292, 10460, 또는 11294에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다. SEQ ID NO:2는 위치 33-34에 Xaa를 포함하는데, 그 이유는 CDR-그래프트된 서열이 이러한 위치에 탈아미드화 부위 (Asn-Gly)를 지니기 때문이다. 두 위치 모두에서 치환을 수행할 수 있으나, 탈아미드화 부위를 제거하기 위해 두 위치 중 단 하나만을 변경하는 것으로 충분하다. 따라서 서열은 전형적으로 위치 33에 Asn 또는 위치 34에 Gly을 포함할 것이다.
바람직한 항-EGFR 항체 (b)의 예는:
(i) Leu20, Ile48 및 Ala68을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:4), 및 Val75 및 Phe87을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:5)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10560]; 또는
(ii) Leu20, Ile48, Leu56, 및 Ala68을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:4), 및 Val75 및 Phe87을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:5)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11302]이다.
항-EGFR 항체 (b)는 또한 항체 10560 또는 11302에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다. SEQ ID NO:4는 위치 55-56에 Xaa를 포함하는데, 그 이유는 CDR-그래프트된 서열이 이러한 위치에 탈아미드화 부위 (Asn-Gly)를 지니기 때문이다. 두 위치 모두에서 치환을 수행할 수 있으나, 탈아미드화 부위를 제거하기 위해 위치들 중 단 하나만을 변경하는 것으로 충분하다. 따라서 서열은 전형적으로 위치 55에 Asn 또는 위치 56에 Gly을 포함할 것이다.
바람직한 항-HER2 항체 (c)의 예는:
(i) Ser55, Leu70, Val72, Lys74 및 Ala79를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:6), 및 Val44, Met48 및 Tyr70을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:7)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10704]; 또는
(ii) Ser55 및 Val72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:6), 및 Met48 및 Tyr70을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:7)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11249]이다.
항-HER2 항체 (c)는 또한 항체 10704 또는 11249에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다.
바람직한 항-HER2 항체 (d)의 예는 Ala49, Ile74 및 Ser77을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:8), 및 Thr56, Tyr71, Ser85 및 Leu104를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:9)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11145]이다. 항-HER2 항체 (d)는 또한 항체 11145에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다.
바람직한 항-HER3 항체 (e)의 예는 Met49, Ser55 및 Ile68을 포함하거나 Asn44, Ser55 및 Thr93을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:10), 및 Phe36, Val44, Phe49 및 Ile85를 포함하거나 Phe36, Phe49 및 Leu73을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:11)을 포함하는 항체이다. 이러한 항-HER3 항체의 특정 예는:
(i) Met49, Ser55 및 Ile68을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:10), 및 Phe36, Val44, Phe49 및 Ile85를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:11)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10738]; 또는
(ii) Asn44, Ser55 및 Thr93을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:10), 및 Phe36, Phe49 및 Leu73을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:11)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 10810]이다.
항-HER3 항체 (e)는 또한 항체 10738 또는 10810에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다.
바람직한 항-HER3 항체 (f)의 예는:
(i) Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:12), 및 Val21, Val44 및 Phe87, 및 임의로 Thr29를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:13)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11006]; 또는
(ii) Phe41, Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:12), 및 Val21, Val44, Tyr71, Phe87 및 Leu104를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 (SEQ ID NO:13)을 포함하는 항체 [예컨대, 항체 11052]이다.
항-HER3 항체 (f)는 또한 항체 11006 또는 11052에 상응하지만, 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함하는 항체일 수 있다.
항체는 상이한 아이소형(isotype), 예컨대 인간 아이소형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 또는 뮤린 아이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA로서 존재함이 잘 알려져 있다. 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD를 포함하는 임의의 아이소형을 지닐 수 있다.
인간화 항체 조성물
본 발명의 추가 양태는 EGFR, HER2 및 HER3으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 수용체에 대해 유도된 본 발명의 적어도 2개의 인간화 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물 (또는 혼합물)에 관한 것이다. 용어 "폴리클로날 항체" 또는 "[모노클로날] 항체들의 혼합물"은 동일하거나 상이한 항원 상에 있는 상이한 특이적 항원성 결정인자와 결합하거나 반응할 수 있는 2개 이상의 상이한 항체 분자들의 조성물을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 항체들의 혼합물의 개별적인 항체는 적어도 2개의 HER 패밀리 수용체의 상이한 항원성 결정인자에 결합한다. 동일한 수용체에 결합하는 2개의 상이한 항체를 함유하는 항체 혼합물의 경우, 개별적인 항체는 바람직하게는 그 수용체의 상이한 에피토프, 더욱 바람직하게는 별개의 그리고 실질적으로 중첩되지 않은 에피토프에 결합한다.
용어 "pan-HER" 또는 "pan-HER 항체 조성물"은 2개 이상의 HER 패밀리 수용체 상의 2개 이상의 상이한 항원에 결합할 수 있는 항체 분자의 조성물을 지칭한다. 본 발명에 관해, 항체 조성물의 개별적인 항체는 HER 패밀리의 상이한 항원성 결정인자에 결합한다. 따라서, 항체 조성물의 개별적인 항체는 EGFR 및 HER2, EGFR 및 HER3, HER2 및 HER3, 또는 EGFR, HER2 및 HER3에 결합하고, 바람직하게는 3개의 수용체 EGFR, HER2 및 HER3에 결합한다.
용어 "에피토프"는 동물에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 큰 분자 (예컨대, 항원 또는 항원성 부위)의 일부를 기재하기 위해 사용된다. 면역원성 활성을 지니는 에피토프는 동물에서 항체 반응을 유도하는 큰 분자의 일부이다. 항원성 활성을 지니는 에피토프는 당 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해 측정시 항체가 면역특이적으로 결합하는 큰 분자의 일부이다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다. 항원은, 독소, 바이러스, 박테리아, 단백질 또는 DNA와 같이, 항체 또는 항체 단편이 면역특이적으로 결합하는 물질이다. 항원 또는 항원성 부위는, 이것이 매우 작지 않은 한, 종종 하나를 초과하는 에피토프를 지니며, 자주 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 에피토프는 선형이거나 입체형태일 수 있다. 선형 에피토프는 일반적으로 항체에 의해 인지되는 단백질 분자 상에 약 6 내지 10개의 인접 아미노산들로 구성된다. 대조적으로, 입체형태적 에피토프는 순차적으로 정렬되지 않지만, 항체가 특정 3차원 구조를 인지하는 경우의 아미노산들로 구성된다. 단백질 분자가 3차원 구조로 폴딩될 때, 에피토프를 형성하는 아미노산은 항체가 입체형태적 에피토프를 인지할 수 있도록 병렬연결된다. 변성된 단백질에서 선형 에피토프만이 인지된다. 입체형태적 에피토프는, 당연히, 폴딩된 단백질의 바깥에 있어야 한다.
용어 "별개의 에피토프"는 본 발명의 2개의 상이한 항체가 별개의 에피토프에 결합할 때, 항원 결합에 대해 100% 미만의 경쟁, 바람직하게는 항원 결합에 대해 80% 미만의 경쟁, 보다 바람직하게는 항원 결합에 대해 50% 미만의 경쟁, 가장 바람직하게는 가능한 한 적은 경쟁, 예컨대 항원 결합에 대해 약 25% 미만의 경쟁이 존재한다는 사실을 지칭한다. 동일한 항원과의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는 항체는 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있거나, 서로의 가까운 근접부에 결합 부위를 지닐 수 있어서, 경쟁이 주로 입체 장해에 의해 야기되게 한다. 항체 쌍의 "별개의 에피토프"에 대한 분석은, 예를 들어 적절한 수용체 항원 및 개별적인 형광 표지된 항체를 발현시키는 세포 상에서 FACS (형광 활성화 세포 분류) 또는 그 밖의 흐름 세포측정 분석을 이용하여 포화 항체 조건하에 결합 실험을 이용함으로써, 또는 흐름 세포 표면에 포획되거나 컨쥬게이션된 항원을 이용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해, 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. SPR을 이용하여 항체들 간의 경쟁을 측정하는 방법은 실시예에 기재되어 있다.
별개의 에피토프는, 동일한 수용체에 결합하는 본 발명의 조성물 중 2개의 상이한 항체가 항원 결합에 대해 충분히 낮게 경쟁하여 2개의 항체가 이들의 개개의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다는 의미에서 "중첩되지 않는(non-overlapping)" 것이 바람직하다. 상이한 정도의 중첩이 존재할 수 있고, 어느 정도의 경쟁이 존재함에도 불구하고 개별적인 항체가 이들의 에피토프에 실질적으로 결합할 수 있는 한, 별개의 에피토프는 "중첩되지 않은" 것으로 고려될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이것은 항원 결합에 대한 2개의 항체들 간의 경쟁이 약 50% 미만일 때의 경우로서 일반적으로 고려된다. 예컨대, WO 2011/107957호에 기재된 대로, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 이용하여 항체들 간의 경쟁을 결정하는 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체는 에피토프의 위치에 따라 이들이 결합하는 항원의 활성에 다양한 영향을 미칠 수 있다. 항원의 활성 부위에서 에피토프에 결합하는 항체는 항원의 기능을 완전히 차단할 수 있는 반면, 상이한 에피토프에 결합하는 또 다른 항체는 항원 단독의 활성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 항체는 여전히 보체를 활성화시킴으로써 항원-발현 세포를 제거시킬 수 있고, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에서의 하나 이상의 항체 결합과 조합될 때 상승적 성장 억제 효과를 발생시킬 수 있다. 본 발명에 관해, 에피토프는 EGFR, HER2 또는 HER3 (야생형 또는 돌연변이됨)의 세포외 도메인의 일부이다. 따라서 본 발명의 항-EGFR 항체는 EGFR의 세포외 도메인에 결합할 것이고, 본 발명의 항-HER2 항체는 HER2의 세포외 도메인에 결합할 것이며, 본 발명의 항-HER3 항체는 HER3의 세포외 도메인에 결합할 것이다.
본 발명의 이러한 양태의 특정 구체예는, 상기 개요된 인간화 항체 (a)-(f)와 관련하여,
· 항-EGFR 항체 (a) 및 항-HER2 항체 (c);
· 항-EGFR 항체 (a) 및 항-HER2 항체 (d);
· 항-EGFR 항체 (a) 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-EGFR 항체 (a) 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-EGFR 항체 (b) 및 항-HER2 항체 (c);
· 항-EGFR 항체 (b) 및 항-HER2 항체 (d);
· 항-EGFR 항체 (b) 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-EGFR 항체 (b) 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-HER2 항체 (c) 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-HER2 항체 (c) 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-HER2 항체 (d) 및 항-HER3 항체 (e); 또는
· 항-HER2 항체 (d) 및 항-HER3 항체 (f)을 포함하는 조성물을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체, 적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체, 및 적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체, 적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체, 및 적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물에 관한 것이고,
여기서 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체는 (a) SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 (b) SEQ ID NO:4의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:5의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택되고;
적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체는 (c) SEQ ID NO:6의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 (d) SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:9의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택되고;
적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체는 (e) SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및 (f) SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택된다.
하나의 항-EGFR 항체, 하나의 항-HER2 항체 및 하나의 항-HER3 항체를 포함하는 항체 조성물의 경우에, 이에 따라 조성물은, 상기 개요된 인간화 항체 (a)-(f)에 관해,
· 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (e);
· 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (f);
· 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (e); 또는
· 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (f)를 포함할 수 있다.
하나의 항-EGFR 항체, 하나의 항-HER2 항체 및 하나의 항-HER3 항체를 포함하는 바람직한 조성물의 예는, 예컨대 다음과 같다:
· 항체 10292, 10704 및 10738;
· 항체 10292, 10704 및 10810;
· 항체 10292, 10704 및 11006;
· 항체 10292, 10704 및 11052;
· 항체 10460, 10704 및 10738;
· 항체 10460, 10704 및 10810;
· 항체 10460, 10704 및 11006;
· 항체 10460, 10704 및 11052;
· 항체 11294, 10704 및 10738;
· 항체 11294, 10704 및 10810;
· 항체 11294, 10704 및 11006; 및
· 항체 11294, 10704 및 11052.
또한 더욱 바람직한 구체예에서, 항체 조성물은, 즉 3개의 수용체 EGFR, HER2 및 HER3 각각에 대해 유도된 2개씩의 인간화 항체인 6개의 인간화 항체를 포함하며, 여기서 동일한 수용체에 결합하는 각각의 항체 쌍은 그 수용체의 별개의 비-중첩 에피토프에 결합한다. 이는 특히 항-EGFR 항체 (a) 및 (b), 항-HER2 항체 (c) 및 (d), 및 항-HER3 항체 (e) 및 (f)를 포함하는 조성물일 수 있다. 이러한 경우에, 6개의 항체들 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두는 항체 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006 및 11052로부터 선택될 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 조성물은,
(a) 항-EGFR 항체 10292, 10460, 또는 11294;
(b) 항-EGFR 항체 10560 또는 11302;
(c) 항-HER2 항체 10704 또는 11249;
(d) 항-HER2 항체 11145;
(e) 항-HER3 항체 10738 또는 10810; 및
(f) 항-HER3 항체 11006 또는 11052를 포함한다.
대안적으로, 이러한 구체예에서 항체 (a)-(f) 중 임의의 하나 이상은 표 4에서 "Xaa"로서 표시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 잔기들 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 추가 치환, 예컨대 조성물에 있는 항체들 중 하나 이상에 대해 항체당 그러한 "Xaa" 잔기들 중 최대 5개 또는 6개에서의 치환, 예컨대 조성물에 있는 항체들 중 하나 이상에 대해 항체당 그러한 "Xaa" 잔기들 중 1개, 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 항체 조성물은 항-EGFR 항체 11294 및 11302, 항-HER2 항체 11249 및 11145, 및 항-HER3 항체 10738 및 11052를 포함한다. 항체 조성물은 (a) SEQ ID NO:43의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:44의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (b) SEQ ID NO:47의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:48의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (c) SEQ ID NO:51의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:52의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (d) SEQ ID NO:53의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:54의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; (e) SEQ ID NO:55의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:56의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 및 (f) SEQ ID NO:61의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:62의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 혼합물의 개별적인 항체가 하나를 초과하는 아이소형의 항체를 포함할 수 있으나, 이들은 모두 동일한 아이소형을 지닐 수 있다.
인간화 항체 및 항체 조성물의 특성
본 발명의 인간화 항체는 HER- 또는 EGFR-패밀리 멤버, EGFR, HER2, 또는 HER3에 결합한다. 용어 "HER"은 "인간 표피 성장 인자 수용체"를 나타내며 4개의 멤버 EGFR/ErbB, HER2/ErbB2, HER3/ErbB3 및 HER4/ErbB4로 구성된 수용체 티로신 키나제(RTK)의 서브그룹을 특징으로 하는 용어 "ErbB"와 종종 상호교환적으로 이용된다. 더불어, 이러한 4개의 수용체는 "HER 패밀리" (또는 ErbB 또는 EGFR 패밀리) 수용체를 구성한다.
본 발명의 하나 이상의 항체, 특히 본 발명의 pan-HER 항체 조성물의 HER 패밀리 수용체로의 결합은 바람직하게는 수용체를 발현시키는 세포 (즉, 전형적으로 종양 세포)의 성장 및 증식을 억제한다. 관련된 메커니즘(들)은, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 수용체 이합체화의 방지, 리간드 결합의 방지, 수용체의 내재화 및 분해 촉진, 티로신 키나제 도메인(TKD) 인산화 감소, 수용체 신호전달 감소, 및 포식작용, CDC 및/또는 ADCC 유도.
본원에서 사용되는 용어 "성장을 억제한다" (예컨대, 세포에 대해 언급됨)는 것은 항-HER 패밀리 항체 또는 pan-HER 항체 조성물의 부재시에 동일한 세포의 성장에 비해, 상기 항체 또는 조성물과 접촉시에 세포의 증식 (세포의 수에서의 증가) 또는 대사에서의 어떠한 측정가능한 감소, 예컨대 세포 배양 성장의 적어도 약 10%, 더욱 바람직하게는, 예컨대 적어도 약 20% 또는 30%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 또는 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 심지어 약 100%의 억제를 포함한다. 성장 억제는, 예컨대 하기 실시예에 기재된 관련 암 세포주에서 측정될 수 있다.
이중특이적 결합 분자
추가의 양태에서, 본원에 기재된 임의의 두 개별적인 항체의 결합 특이성은 하나의 이중특이적 결합 분자에서 조합될 수 있다. 그러한 이중특이적 결합 분자는 EGFR, HER2 및 HER3으로부터 선택되는 2개의 상이한 수용체를 표적화하는 2개의 항체의 결합 특이성을 지닐 수 있거나, 동일한 수용체를 표적화하는 2개의 항체의 결합 특이성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 결합 분자는 항-EGFR 항체 (a) 및 (b)의 결합 특이성, 항-HER2 항체 (c) 및 (d)의 결합 특이성, 또는 항-HER3 항체 (e) 및 (f)의 결합 특이성을 지닐 수 있다. 보다 특히, 이중특이적 결합 분자는, 예컨대 (1) 항-EGFR 항체 10292, 10460, 또는 11294, 및 항-EGFR 항체 10560 또는 11302; (2) 항-HER2 항체 10704 또는 11249, 및 항-HER2 항체 11145; 또는 (3) 항-HER3 항체 10738 또는 10810, 및 항-HER3 항체 11006 또는 11052의 결합 특이성을 지닐 수 있다. 이중특이적 결합 분자는 이중 가변 도메인 항체일 수 있고, 즉, 항체의 2개의 아암은 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하거나, 이중특이적 Fab 단편 또는 이중특이적 scFv와 같은 항체 단편의 형태일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터, 및 항체 및 항체 조성물의 생성
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 항체, 특히 항체 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 11249, 11145, 10738, 10810, 11006 및 11052로 구성된 군으로부터 선택된 항체를 엔코딩하거나, 그러한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 그러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이고, 여기서 상기 숙주 세포는 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 항체를 발현할 수 있다.
용어 "벡터"는 상이한 유전적 환경들 간의 수송 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 서열의 전사를 위한 조절 엘리먼트(적어도 적합한 프로모터)를 지니는 벡터를 "발현 벡터"로서 지칭한다. 용어 "플라스미드" 및" 벡터"는 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 관해 사용된 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같이 당 분야에 공지된 임의의 적합한 유형의 것일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 인간화 재조합 항체 및 상기 항체를 포함하는 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태의 한 구체예는 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 제공하는 단계, 상기 숙주 세포를 항체를 발현시키기에 적합한 조건하에 배양시키는 단계, 및 생성된 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 본원에 정의된 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은,
적어도 제 1, 제 2 및 제 3 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제 1 숙주 세포가 본 발명의 재조합 항-EGFR 항체를 발현시킬 수 있고, 제 2 숙주 세포가 본 발명의 재조합 항-HER2 항체를 발현시킬 수 있으며, 제 3 숙주 세포가 본 발명의 재조합 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있는 단계,
항-EGFR 항체, 항-HER2 항체 및 항-HER3 항체를 발현시키기에 적합한 조건하에 제 1, 제 2 및 제 3 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및
생성된 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 인간화 재조합 항-EGFR 항체, 적어도 하나의 인간화 재조합 항-HER2 항체 및 적어도 하나의 인간화 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 재조합 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성하기 위해 당 분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일 항체를 생성하는 경우에, 재조합 모노클로날 항체를 생성하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 항체의 혼합물을 포함하는 본 발명의 항체 조성물을 생성하기 위해서, 개별적인 항체들은 별도로 생성될 수 있고, 즉 각각의 항체는 분리된 바이오반응기에서 생성되거나, 개별적인 항체들은 단일 바이오반응기에서 함께 생성될 수 있다. 만약 항체 조성물이 하나를 초과하는 바이오반응기에서 생성되는 경우, 각각의 바이오반응기로부터 개별적으로 정제된 상청액에서 수득된 항체들을 푸울링시킴에 의해 정제된 항체 조성물을 수득할 수 있다. 세포주 또는 항체 제조물이 이후 시점에 업스트림에서 또는 다운스트림 프로세싱 이전이나 그 동안에 조합되는 경우, 다수의 바이오반응기에서 폴리클로날 항체 조성물을 생성하기 위한 다양한 접근법이 WO 2009/129814호 (참조로서 포함됨)에 기재되어 있다.
개별적인 항체를 단일 바이오반응기에서 생성하는 경우, 이것은, 예컨대 WO 2004/061104호 또는 WO 2008/145133호 (둘 모두는 본원에 참조로서 포함된다)에 기재된 대로 수행될 수 있다. WO 2004/061104호에 기재된 방법은 항체 코딩 서열의 개별적 숙주 세포의 유전체로의 부위-특이적인 통합에 기반하는 반면, WO 2008/145133호의 방법은 단일 바이오반응기에서 항체들을 생성하기 위해 랜덤 통합을 이용하는 대안적인 접근법과 관련된다.
본 발명의 항체 및 조성물을 제조하는데 적합한 방법에 관한 추가 정보는 WO 2012/059857호 (참조로서 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
치료 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 활성 성분으로서 본 발명의 항체 또는 항체 조성물을 포함하는 약학적 조성물이다. 그러한 조성물은 암의 완화, 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 약학적 조성물은 인간 또는 가축이나 애완동물에 투여될 수 있으나, 전형적으로 인간에게 투여될 것이다.
본 발명의 치료 조성물에서 개별적인 항체들 간의 비, 또는 본 발명의 개별적인 항체가 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여되는 경우에, 개별적인 항체들 간의 비는 종종 항체가 동등한 양으로 투여되도록 하는 비일 것이나, 반드시 그럴 필요가 있는 것은 아니다. 따라서, 2개의 항-EGFR 패밀리 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 종종 이들을 대략 1:1의 비로 함유할 것이고, 3개의 항-EGFR 패밀리 항체를 포함하는 조성물은 종종 이들을 대략 1:1:1의 비로 함유할 것이다. 유사하게, 수용체 EGFR, HER2 및 HER3 각각에 대해 2개씩 6개의 항체를 포함하는 항체 조성물은 종종 이들을 대략 1:1:1:1:1:1의 비로 함유할 것이다. 그러나, 개별적인 항체의 특성에 따라서, 동등하지 않은 양의 상이한 항체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 조성물 중 상이한 항-HER 항체들의 적합한 비는 WO 2010/040356호 (본원에 참조로서 포함됨)에 기재된 대로 측정될 수 있는데, 상기 특허에는 최적의 효력 및 효능을 갖는 조합 약물을 얻기 위해 폴리클로날 항체 조성물과 같은 조합 약물 생성물에서 화학적 개체(entity)들 간의 최적의 화학량론적 비를 확인하고 선택하는 방법이 기재되어 있다.
약학적 조성물은 본 발명의 인간화 재조합 항체 또는 이의 결합 단편 외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 것이다. 이들은, 예를 들어 보존제, 안정화제, 계면활성제/습윤제, 에멀젼화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 점도-증가 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 적합한 pH 값은, 적절한 경우, 완충제를 사용하여 유지된, 일반적으로 약 5.5 내지 8.5의 범위, 예컨대 약 6 내지 8, 예컨대 약 7일 것이다.
예컨대, 당 분야에 공지된 통상적인 투여 경로에 의해 암 환자에게 투여되는 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 조제 실무가 이용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 약학적 조성물은 재조합 항체 조성물의 제조를 위해 그 자체로(per se) 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 제형화, 투여 등에 대한 추가의 정보에 관해서는 PCT/IB2011/054834호를 참조하라.
본 발명의 항체 및 조성물의 치료 용도
본 발명의 항체 및 조성물은 포유동물에서 질병의 치료 또는 개선, 특히 인간에서 암의 치료에 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료"는 징후 또는 질병 상태를 완화, 감소, 개선 또는 근절(치유)하기에 충분한 양으로 본 발명의 항체 또는 바람직하게는 항체 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 일반적으로 본 발명의 2개 이상의 pan-HER 항체의 투여는, 바람직하게는 치료에 이용되는 모든 pan-HER 항체를 함유하는 조성물의 형태로, 항체를 동시 투여함에 의해서일 수 있다. 그러나, 본 발명의 2개 이상의 항체를 별도로 투여하는 것도 가능하다. 따라서, 본원에서 예컨대 2개 이상의 항-HER 패밀리 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물을 투여하는 것에 대한 언급은 2개 이상의 항체를 이와 같이 포함하는 조성물의 투여뿐 아니라, 항체들의 분리된 투여도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 2개 이상의 항체의 조합물은 동시에, 순차적으로 또는 별도로 투여될 수 있다. 본 발명의 한 구체예는 유효량의 본 발명의 약학적 항체 조성물을 인간 또는 그 밖의 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 암과 관련된 하나 이상의 징후를 예방, 치료 또는 개선시키는 방법이다.
특정 구체예는 본원에 정의된 재조합 항체 조성물 또는 약학적 조성물을 어떠한 하나 이상의 EGFR 패밀리 수용체 EGFR, HER2 및 HER3의 발현 또는 과발현 또는 의존성을 특징으로 하는 질병, 특히 암에 걸린 환자, 전형적으로 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 용어 "HER 의존성"은 증식, 성장, 운동성, 침습성, 생존 및/또는 화학 내성과 같은 악성 특성을 유지하기 위해 HER 패밀리 수용체들 중 하나 이상에 의존성을 지닌 암 세포를 지칭한다. 의존성은 수용체 과발현, 수용체 돌연변이, 자가분비 성장 인자 생성, 및/또는 다른 수용체 시스템과의 교차-대화(cross-talk)에 의해 야기될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 유효량의 본원에 정의된 재조합 항체 조성물 또는 약학적 조성물을 항체 및/또는 티로신 키나제 억제제(TKI)를 이용한 치료에 획득 내성을 지니는 환자, 전형적으로 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다수의 요인에 기반하여, 특히 하기 종양 유형에 본 발명의 항체 조성물을 이용한 치료가 필요할 수 있다: 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 직장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 흑색종, 두경부암, 및 비소세포폐암. 본 발명의 항체 조성물은 EGFR 또는 HER2를 과발현시키는 암, 예를 들어 많은 유방암, 난소암 및 위암과 같은 특정 상피암의 치료에 특히 적용될 수 있는 것으로 고려된다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물을 이용하여 췌장암을 지닌 환자를 치료한다. 상기 환자는 KRAS 돌연변이를 지닐 수 있다.
한 구체예에서, 환자는 암에 대해 이전에 치료된 적이 없다. 또 다른 구체예에서, 환자는 암에 대해 이전에 치료된 적이 있다. 환자는 이전에 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙으로 치료된 적이 있을 수 있다. 환자의 암은 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙에 대해 획득 내성을 지닐 수 있다.
이러한 적응증 각각과 관련하여, 2가지의 주요 임상 경로, 즉 1) 한 가지 이상의 추가의 치료적 처치에 관한 보조 요법 또는 2) 단일요법이 고려된다.
1) 보조 요법: 조합 요법으로도 알려진 보조 요법에서, 환자는 한 가지 이상의 추가의 치료적 처치, 전형적으로 화학요법제 또는 항신생물제 및/또는 방사선 요법과 함께 본 발명의 항체로 치료될 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 조성물은 또한 VEGF를 표적화하는 항체와 같은 상이한 항암 항체와 함께 이용될 수 있다. 따라서 상기 나열된 일차 암 표적은 표준 1차 라인 및 2차 라인 요법 외에 본 발명의 항체 또는 조성물을 투여함에 의해 치료될 수 있다. 프로토콜 설계는, 예컨대 종양 부피의 감소 뿐만 아니라 표준 화학요법제의 통상적인 양을 감소시키는 능력에 의해 평가되는 유효성을 다룰 것이다. 이러한 투여량 감소는 화학요법제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가적이고/이거나 지속된 요법을 가능케 할 것이다.
본 발명의 항체 조성물을 암 세포의 최종 분화를 유도하는 것으로 알려진 작용제와 조합시킴에 의해, 효과가 추가로 향상될 수 있다. 그러한 화합물은, 예를 들어 레티노산, 트랜스-레티노산, 시스-레티노산, 페닐부티레이트, 신경 성장 인자, 디메틸 설폭시드, 활성 형태 비타민 D3, 과산화소체 증식-활성화 수용체 감마, 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트, 헥사메틸렌-비스-아세트아미드, 형질전환 성장 인자-베타, 부티르산, 시클릭 AMP, 및 베스나리논(vesnarinone)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 레티노산, 페닐부티레이트, 모든-트랜스-레티노산, 및 활성 형태 비타민 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체 조성물 및 하나 이상의 화학요법제 또는 항신생물성 화합물을 포함하는 약제 물품은 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합 치료제로서 이용될 수 있다. 화학요법 화합물은 대상이 되는 특정 암의 치료에 적합한 임의의 화학요법제, 예를 들어 알킬화제, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 및/또는 옥살리플라틴과 같은 백금 유도체; 식물 알코이드, 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀 및/또는 이리노테칸; 항종양 항생제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신 미톡산트론, 닥티노마이신, 블레오마이신, 액티노마이신, 루테오마이신, 및/또는 미토마이신; 토포테칸과 같은 토포아이소머라제 억제제; 및 항대사산물, 예를 들어 플루오로우라실 및/또는 그 밖의 플루오로피리미딘으로 구성된 군으로부터 선택된 작용제일 수 있다.
또한 본 발명의 항체 조성물은 티로신 키나제 억제제에 관한 보조 요법으로서 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인과 상호작용하고, 세포내 Mg-ATP 결합 부위에 대해 경쟁함으로써 리간드 유도 수용체 인산화를 억제하는 주로 퀴나졸린 유래된 합성 저분자량 분자이다. HER2 키나제를 차단하는 여러 티로신 키나제 억제제가 현재 임상 개발중에 있다. 이들 중 일부는 또한 EGFR 또는 그 밖의 EGFR 패밀리 수용체를 표적화한다. 이러한 TKI의 검토에 관해서는 문헌[Spector et al. (2007) Breast Cancer Res. 9(2): 205]을 참조하라. 이렇게 본 발명의 항체 조성물 및 HER2를 표적화하는 하나 이상의 TKI를 포함하는 약제 물품을 또한 암 요법에서 동시, 별개 또는 연속 투여를 위한 조합 치료제로서 이용할 수 있다.
그 밖의 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 그 밖의 항체 치료제, 예컨대 VEGF에 대한 항체(아바스틴(Avastin)®)와 함께 이용될 수 있다. 또한 그 밖의 구체예에서, 본 발명의 항체 조성물은 면역계의 세포를 자극하는 것으로 알려진 작용제와 함께 이용될 수 있고, 그러한 조합 치료는 본 발명의 항체 조성물의 효능에 있어서 강화된 면역-매개된 개선을 초래한다. 그러한 면역-자극제의 예는 재조합 인터루킨 (예컨대, IL-21 및 IL-2)을 포함한다.
2) 단일요법: 종양의 단일요법에 있어서 본 발명에 따른 항체 조성물의 이용과 관련하여, 항체 조성물은 화학요법제 또는 항신생물제를 함께 사용하지 않으며, 즉 독립형 요법으로서 환자에게 투여될 수 있다.
면역컨쥬게이트
본 발명의 조성물의 치료 용도를 위한 또 다른 옵션은 면역컨쥬게이트, 즉 하나 이상의 항암제에 컨쥬게이션된 항체의 형태이다. 특히 별개의 에피토프에 결합하는 본 발명의 조성물의 경우, 이것은 세포 표면 상에 가교된 항체-수용체 격자를 생성함으로써 단일 모노클로날 항체를 이용한 것에 비해 수용체 내재화의 수준을 잠재적으로 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서 하나 이상의 항암제에 그러한 조성물의 개별적인 항체들 중 하나 이상을 컨쥬게이션하는 것은 종양 세포의 내부에 컨쥬게이션된 항암제를 특이적으로 그리고 효과적으로 전달할 가능성을 지니므로, 본 발명의 항체 조성물의 효과를 증대시켜 향상된 종양 세포-사멸 활성을 제공한다.
세포독성제 (통상적인 화학요법제 및 그 밖의 소분자 항암 약물 포함), 사이토카인 (컨쥬게이트가 "면역사이토카인"으로 명명될 수 있는 경우), 독소 (컨쥬게이트가 "면역독소"로 명명될 수 있는 경우) 및 방사성핵종을 포함하는 다양한 유형의 항암제가 본 발명의 항체에 컨쥬게이션될 수 있고, 소수의 면역컨쥬게이트는 이미 임상용으로 승인된 바 있다. 여기에는 제발린(Zevalin)® (90Y에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체), 벡사르(Bexxar)® (131I에 컨쥬게이션된 뮤린 항-CD20 항체) 및 밀로타르그(Mylotarg)® (칼리케아미신에 컨쥬게이션된 인간화 항-CD33 항체)가 포함된다. 임상 시험 테스트를 받은 그 밖의 면역컨쥬게이트는, 예컨대 독소루비신 또는 메이탄시노이드 화합물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 임상 시험 테스트를 받은 면역독소는 트렁케이션된 슈도모나스 외독소 A에 컨쥬게이션된 여러 개의 항체를 포함한다. IL-2에 컨쥬게이션된 인간화 EpCAM 항체를 포함하는 면역사이토카인도 테스트를 받았다.
세포독성제에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체의 경우, 이들은 알킬화제 (예컨대, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴), 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트, 카페시타빈, 겜시타빈), 안트라사이클린 (예컨대, 블레오마이신, 독소루비신, 미토마이신-C) 및 식물 알칼로이드 (예컨대, 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산, 및 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드)를 포함하는 화학요법 약물의 주요 부류들 중 어느 것에 속할 수 있다. 면역컨쥬게이트의 이용은 항암제를 종양에, 특히 내재화 이후 종양 세포의 내부에 명확하게 겨냥하기 때문에, 본 발명의 항체에 기반한 면역컨쥬게이트는 유리하게는 칼리케아미신 또는 메이탄신 유도체와 같은 고도의 세포독성제, 또는 박테리아 독소 (예컨대, 슈도모나스 외독소 A, 디프테리아 독소) 또는 식물 독소 (예컨대, 리신)와 같은 독소에 기반할 수 있다.
면역컨쥬게이트에서 컨쥬게이션된 항암제는 혈청에서 비교적 안정하지만 면역컨쥬게이트가 표적 세포내로 내재화될 때 작용제의 방출을 허용하는 불안정한 링커에 의해 일반적으로 항체에 연결된다. 적합한 링커는, 예를 들어 혈청의 중성 pH에서는 안정하지만 내재화 이후 리소좀 내의 약산성 조건에서는 산 가수분해되는 화학적 링커, 세포내 티올에 의해 절단되는 디설파이드 링커, 및 혈청에서는 안정하지만 세포내 구획에서 효소 절단되는 펩티드 링커를 포함한다.
다양한 컨쥬게이션 정렬이 본 발명의 2개 이상의 항체를 함유하는 조성물에서 구상될 수 있다. 예를 들어, 2개의 항체를 이용하여 항체들을 2개 이상의 상이한 항암 약물에 컨쥬게이션하거나 하나의 항체를 다른 항체에 컨쥬게이션된 효소와 같은 작용제에 의해 활성화되는 프로드럭에 컨쥬게이션시킬 수 있을 것이다. 항체-지향성 효소 프로드럭 요법 (ADEPT)의 일반적 개념이 모노클로날 항체에 대해 기재되었는데, 여기서 프로드럭은 mAB-효소 컨쥬게이트에 의해 종양에 표적화된 효소에 의해 활성화되지만, 본 발명은 이러한 접근법을 특정 상황에 맞출 기회를 제공할 수 있다. 따라서, 정상 조직에 대한 손상을 회피하거나 감소시키면서 종양 세포 사멸을 특이적으로 증가시킬 수 있다.
항암 면역컨쥬게이트에 대한 추가의 정보에 관해서는, 문헌[Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159; and Rohrer (2009) chimica oggi / Chemistry Today 27(5):56-60]을 참조하라.
2개 이상의 EGFR 패밀리 수용체에 대해 유도된 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 단일 항체를 면역컨쥬게이트의 형태로 함유할 수 있거나, 2개 이상의 항체를 면역컨쥬게이트의 형태로 함유할 수 있으며, 예컨대 하나 또는 가능하게는 2개의 면역컨쥬게이트가 수용체 EGFR, HER2 및 HER3 각각을 표적화한다.
투여 용량 및 경로
본 발명의 항체 조성물은 대상이 되는 질환의 치료에 효과적인 양, 즉 요망되는 결과를 달성하는데 필요한 투여량으로 그러한 기간 동안 투여될 것이다. 치료적 유효량은 치료되는 특정 질환, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 항체가 독립형 치료로서 투여되는지 또는 하나 이상의 추가의 항암 치료와 함께 투여되는지 여부와 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다.
종양 요법을 위한 유효량은 환자에서 질환 진행을 안정화시키고/거나 징후를 개선시키고, 바람직하게는, 예컨대 종양 크기를 감소시킴에 의해 질환 진행을 역전시키는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하는 본 발명의 항체 또는 조성물의 능력은, 예컨대 실시예에 기재된 시험관내 검정에 의해서, 뿐만 아니라 인간 종양에서의 효능을 예측하게 하는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 적합한 투여 섭생은, 예를 들어 단일 볼루스(bolus) 또는 연속 주입으로서 투여되고, 각 경우의 긴급성에 따라 투여량의 조정이 가능한, 각각의 특정 상황에서의 최적 치료 반응을 제공하도록 선택될 것이다.
본 발명에 따른 항체에 대한 구체적인 용량은 아직 결정되지 않았으나, 치료 용도로 승인된 유사한 제품 (예컨대, HER2 또는 EGFR에 대해 유도된 모노클로날 항체)과의 비교를 통해 정확한 용량 항목이 결정될 수 있다. 따라서 본 발명의 항체 조성물의 적절한 투여량은 항-HER2 모노클로날 항체 트라스투주맙 (헤르셉틴®) 또는 항-EGFR 모노클로날 항체 파니투무맙 (벡티빅스®)에 대해 권고된 투여량과 유사할 것으로 고려된다. 특정 질환에 따라, 헤르셉틴®은 4 mg/kg의 초기 용량 및 후속하는 2 mg/kg의 주 1회 용량, 또는 8 mg/kg의 초기 용량 및 후속하는 3주마다의 6 mg/kg의 용량으로 유방암의 치료를 위해 (주입에 의해) 투여되는 한편, 벡티빅스®는 14일마다 6 mg/kg의 용량으로 투여된다.
본 발명의 항체 조성물의 적합한 용량은 0.1-100 mg/kg의 범위, 예컨대 약 0.5-50 mg/kg, 예컨대 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 고려된다. 항체 조성물은, 예를 들어 적어도 0.25 mg/kg, 예컨대 적어도 0.5 mg/kg, 예컨대 적어도 1 mg/kg, 예컨대 적어도 1.5 mg/kg, 예컨대 적어도 2 mg/kg, 예컨대 적어도 3 mg/kg, 예컨대 적어도 4 mg/kg, 예컨대 적어도 5 mg/kg; 및 예컨대 많아야 50 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 30 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 20 mg/kg 이하, 예컨대 많아야 15 mg/kg 이하의 투여량으로 투여될 수 있다. 투여는, 보통, 예컨대 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회, 및 필요한 경우 투여량을 임의로 증가시키거나 감소시킬 수 있는 주치의가 적절하다고 판단하는 동안의 적합한 간격으로 반복될 것이다.
3개의 별개의 전달 접근법이 본 발명에 따른 항체의 전달을 위해 고려된다. 통상적인 정맥내 전달은 아마 대부분의 종양에 대한 표준 전달 기법일 것이다. 그러나, 복막강 내의 종양, 예를 들어, 난소, 담도, 다른 관 등의 종양과 관련하여, 복막내 투여가 종양에서 고 용량의 항체를 수득하고 항체 제거율을 최소화하는데 유리함이 증명될 수 있다. 유사하게, 특정 고형 종양은 국부 관류에 적합한 맥관 구조를 가진다. 국부 관류는 종양 부위에서 고용량의 항체의 획득을 가능케 하고, 항체의 단기 제거를 최소화할 수 있다.
임의의 단백질 또는 항체 융합 기반-치료제를 이용함에 따른, 안전성 우려는 주로, (ⅰ) 사이토카인 방출 증후군, 즉 저혈압, 열, 진전, 오한, (ⅱ) 단백질에 대한 면역원성 반응의 발생 (즉, 재조합 항체 생성물에 대한 환자에 의한 인간 항체의 발생), 및 (ⅲ) HER 패밀리 수용체를 발현시키는 정상 세포, 예컨대 많은 상피 세포에 대한 독성과 관련된다. 상기 임의의 안전성 우려를 모니터하기 위해 표준 시험 및 후속 절차가 이용된다.
진단 용도 및 조성물
본 발명의 항체는 또한 진단 과정(예컨대, 시험관내, 생체외)에서 유용하다. 예를 들어, 항체를 이용하여 환자로부터의 샘플(예컨대, 조직 샘플, 또는 체액 샘플, 예컨대 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 타액, 또는 소변) 중 EGFR, HER2, 또는 HER3의 수준을 검출하고/하거나 측정할 수 있다. 적합한 검출 및 측정은 흐름세포측정법, 효소-결합된 면역흡수 검정(ELISA), 화학발광 검정, 방사성면역측정법, 및 면역조직학과 같은 면역학적 방법을 포함한다. 본 발명은 본원에 기재된 항체를 포함하는 키트(예컨대, 진단 키트)를 추가로 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌 및 그 밖의 참조문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 다수의 문서가 본원에 이용되었으나, 이러한 인용은, 임의의 이러한 문서가 당 분야의 보통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 용인함을 성립시키는 것은 아니다. 본 명세서 및 구체예를 통틀어, 단어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 어떠한 그 밖의 정수 또는 정수의 그룹을 배제시키지 않고 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함시킴을 함축하는 것임이 이해될 것이다. 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 물질을 예시하기 위한 것이다. 당 분야에서 일반적으로 만나게 되는 당업자에게 명백한 기재된 조건 및 변수의 적합한 변경 및 개작이 본 발명의 사상 및 범위 내에 있다. 용어 "항원-결합 단편" 및 "항원-결합 부분"은 본원에서 상호교환적으로 이용된다.
실시예
실시예 1: 키메라 항체의 인간화
돌연변이를 위한 억셉터 프레임워크 및 중요한 위치의 확인
인간화를 위해 선택된 방법은 상보성 결정 영역(CDR) 그래프팅 후에 조합 라이브러리 접근법을 이용한 중요 잔기들의 복귀 돌연변이에 기반하였고, 여기서 최대 13개의 복귀 돌연변이의 모든 조합이 동시에 평가되었다.
공여자 뮤린 항체의 CDR은 가장 가까운 인간 V-영역 억셉터 프레임워크로 그래프트되었고, 이는 공여자 항체의 V 영역 아미노산 서열을 V 및 J 영역 서열의 인간 생식세포 레퍼토리와 비교함에 의해 발견되었다 (IMGT reference directory). 각각의 항체에 대해 확인된 가장 가까운 생식세포 V 및 J 영역은 하기 표 5에 제시된다.
1277VL의 경우, 가장 가까운 인간 생식세포 V-영역은 IGKV2-30*02였다. 그러나, IGKV2 패밀리가 인간 레퍼토리에서 거의 이용되지 않으므로, 제 2 억셉터 프레임워크가 또한 IGKV1 패밀리로부터 선택되었다. 2개의 프레임워크 각각을 VL 복귀 돌연변이 라이브러리의 생성에 이용하여 단일 1277 VH 복귀 돌연변이 라이브러리와 조합하였다.
CDR 그래프팅 단독은 설치류 항체의 결합 특이성 및 친화성, 및 이에 따른 생물학적 활성을 재생성하기에 충분하지 않을 수 있으므로, 복귀 돌연변이가 중요한 위치에 도입되어야 할 수도 있다. 잠재적으로 중요한 위치는 공여자 항체에서 체세포적으로 과돌연변이된 위치, 항원과 직접 접촉하거나 CDR 구조에 영향을 줄 수 있는 위치(잔기 또는 Vernier 구역 잔기를 결정하는 위치), VH/VL 계면 또는 VH/VL 패킹 각도를 책임지는 위치, 및 통계적으로 드물거나(항체 레퍼토리 대비) 또는 구조적으로 불리한 잔기에 의해 점유된 위치를 포함한다. 이러한 위치는 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용하거나 (예컨대, Padlan (1994) Mol.Immunol. 31: 169-217; Honegger and Pluckthun (2001) J.Mol.Biol. 309: 657-670; http://www.bioc.uzh.ch/antibody; Martin and Thornton (1996) J.Mol.Biol.. 263: 800-815; http://www.bioinf.org.uk/abs/; Foote and Winter (1992) J.Mol.Biol. 224: 487-499), 가상 그래프트된 서열의 구조적 모델링을 수행함에 의해 확인될 수 있다. 이러한 두 접근법의 조합을 이용하여 각각의 항체에서 복귀 돌연변이에 잠재적으로 중요한 위치를 확인하였다.
복귀 돌연변이 위치 외에, CDR에서 노출된 원치 않는 서열 모티프도 확인되었다. 이러한 모티프는 아스파라긴 탈아미드화를 위한 부위(Asn-Gly), 아스파테이트 이성질체화를 위한 부위(Asp-Gly) 및 메티오닌 산화를 위한 부위를 포함하였다. 확인된 서열 모티프는 보존적 치환 또는 그 위치들 중 하나에서 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기로의 대체에 의해 변경되었다(뮤린 서열로의 복귀 돌연변이와 반대로).
최대 13개의 중요한 위치가 확인되었고 각각의 항체에 대한 라이브러리 설계에 포함되었다 (표 5). 생성된 복귀 돌연변이 라이브러리의 크기에 기반하여 위치의 수가 선택되었다. 예를 들어, 13개 위치가 2 상이한 아미노산(예컨대, 인간 또는 뮤린 잔기) 간에 변화되는 경우, 이는 하나의 분자 라이브러리와 조합시 8192개의 변이체를 산출한다. 각각의 항체에서 확인된 위치의 소재가 첨부된 서열 목록에서 제시되며, 여기서 "Xaa"에 의해 표시된 아미노산 잔기는 돌연변이를 위해 선택된 잠재적으로 중요한 위치이다.
표 5: 인간화를 위한 라이브러리의 설계
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복귀 돌연변이 라이브러리의 생성
각각의 VH 및 VL 서열에 대한 복귀 돌연변이 라이브러리를 서열의 60-80개 염기쌍에 걸친 중첩 DNA 올리고의 PCR 유전자 어셈블리에 의해 합성하였다. 중첩 연장 PCR에 의해 경쇄 불변 영역을 첨가하여 전장 경쇄 유전자를 생성하였다. 각 항체에 대한 VH 및 경쇄 라이브러리를 포유동물 발현 벡터로 서브-클로닝시킨 후 다른 곳에서 기술된 바와 같이 384-웰 포맷으로 HEK293 세포에서 개별적인 항체 변이체를 일시적 발현시킴에 의해 인간화 항체 변이체의 분자 라이브러리를 제조하였다 (Meijer et al. (2009) Methods Mol Biol. 525:261-77). 발현 상청액을 회수하고 스크리닝에 이용하였다.
인간화 라이브러리의 오프 - 레이트 스크리닝
저밀도로 코팅된 항-인간 IgG Fc에 의한 IgG 포획을 이용한 샌드위치 ELISA 이후 일가 바이오티닐화된 항원으로의 검출에 의해 라이브러리 발현 상청액을 스크리닝하였다. 이러한 ELISA 설정은 개별적인 클론의 다양한 발현 수준 또는 결합 효과로부터의 간섭 없이 민감하고 신뢰할 만한 결합 친화성의 순위를 매기도록 한다. 총 24개의 384-웰 플레이트를 각각의 라이브러리 스크리닝에 이용하였는데, 이는 8832개의 개별적인 웰 및 대략 1의 라이브러리 샘플링에 상응하는 것이다 (별개의 라이브러리 멤버를 검색하기 위해 p=0.65). 5 μl의 각각의 라이브러리 발현 상청액을 코팅된 항-인간 IgG Fc 포획 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켜. 항체 발현 수준에도 불구하고, 모든 상청액이 평형 결합에 도달하였음을 보장하였다. 이어서, 웰을 세척하고 바이오티닐화된 항원(인간 EGFR, HER2 또는 HER3; Sino Biological, Beijing, P.R. China; biotinylated in-house)을 키메라 항체 표준의 포화에 충분한 것으로 사전에 결정된 농도로 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 키메라 부모 항체 표준의 측정된 분리에 따른 소정의 시간 간격 동안 항원이 포획된 항체로부터 분리되게 하였다. 마지막으로, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 중합체(Sigma)를 첨가하고, TMB-플러스 기질(Kem-En-Tec Diagnostics, Taastrup, Denmark)을 이용하여 플레이트를 현상하였다.
키메라 부모 항체와 유사하거나 그보다 더 높은 OD 신호를 산출한 각각의 라이브러리로부터의 대략 100 히트(hit)를 Octet® QK384 기계 (Fortebio, Menlo Park, CA)를 이용하여 오프-레이트 순위를 매겼다. 단백질 G 바이오센서(Fortebio)를 이용하여 40 μl의 발현 상청액으로부터 항체를 포획한 후 200 nM의 인간 또는 시노몰구스 항원과 인큐베이션시켰다. 인간 항원은 Sino Biologicals로부터 수득되었고 시노몰구스 항원은 CHO 또는 HEK293 세포에서의 일시적 발현에 의해 내부(in-house) 생성되었다 (Koefoed et al. (2011) mAbs, 3:6, 1-12). 후속하여, 바이오센서를 PBS에서 인큐베이션시키고, 항원의 분리를 20분 동안 기록하여 분리 속도의 신뢰할 만한 측정을 가능케 하였다. 반응들은 분리 상수의 계산을 위해 총괄적으로 랭뮤어 1:1 결합 모델에 핏팅되었다. 전반적으로, 각각의 라이브러리로부터의 다수의 히트는 부모 항체와 유사하거나 그보다 느린 인간 및 시노몰구스 항원 둘 모두로부터의 분리 상수를 지니는 것이 발견되었다.
서열 분석
오프-레이트 순위를 매기기 위해 선택된 히트를 엔코딩하는 플라스미드를 DNA 서열분석하고(MWG Biotech, Ebersberg, Germany), 수득된 서열들을 정렬시켜 가상 생성된 CDR-그래프트된 V 영역들과 비교하였다. 선택된 히트의 정렬은 도 1-6에 도시된다. 항체 1277 및 1565에 기반한 초기 라이브러리의 스크리닝으로부터의 모든 히트는 CDRL1 및 CDRH2 각각에서 탈아미드화 부위(Asn-Gly)를 보유한 것으로 발견되었는데, 그런 까닭에 이는 표적과의 상호작용을 위한 모티프의 중요성을 나타낸다. 그러나, 단일 대체 돌연변이 (Asn에서 Ser으로)만이 둘 모두의 경우에 시도되었고, 서열 모티프가 없는 결합 변이체는 모티프로 구성된 하나 또는 두 위치 모두의 포화된 돌연변이발생에 의해 생성될 가능성이 매우 높다. 탈아미드화 부위의 PCR-기반 포화된 돌연변이발생에 의해 생성된 라이브러리의 스크리닝은 이러한 원치 않는 서열 모티프가 없는 히트를 산출하였다(도 1 및 2). 강력하게는 원치 않는 서열 모티프가 없는 결합 항체 변이체가 그 밖의 모든 라이브러리에서 발견되었다.
각각의 라이브러리 스크리닝으로부터 4개 내지 10개의 히트를 인간 및 시노몰구스 항원에 대한 유지되거나 개선된 결합능, 복귀-돌연변이의 수 및 더 큰 규모의 발현 및 단백질 A 크로마토그래피에 의한 정제를 위한 원치 않는 서열 모티프의 부재에 기반하여 선택하였다. 인간화 변이체들 중 하나인 항체 11006은 라이브러리 설계의 일부가 아닌 CDRL1 (I29T; SEQ ID NO:13 및 도 6)에서 우연적 돌연변이를 지니는 것으로 발견되었으나, 그럼에도 불구하고 개선된 분리 속도 및 CDRH2에서 아스파테이트 이성질체화 부위의 제거로 인해 발현을 위해 선택되었다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 인간화 변이체의 동역학적 결합 분석
일가 조건하에 가용성 항원에 대한 전체 IgG 분자들의 항체 친화성을 측정할 수 있는 문헌[Canziani et al. (Anal. Biochem. (2004) 325:301-307)]에 기재된 IgG 포획 검정을 이용하는 ProteOn™ XPR36 바이오센서 (BioRad, USA) 상에서 정제된 인간화 변이체의 동역학적 결합 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 대략 5000 공명 단위 (RU)의 모노클로날 마우스 항-인간 IgG Fc 항체 (GE Healthcare, Denmark)를 제조사의 지시에 따라 GLC 칩 표면(BioRad, USA)에 컨쥬게이션시킨 후 항-Fc 센서 표면 상에서 본 발명의 개별적인 항체 또는 음성 대조군을 포획하였다. 포획된 항체의 밀도를 각각의 클론에 대해 최적화시킴으로써, 검정에 이용된 가장 높은 항원 결합 농도가 ~30 RU를 초과하지 않도록 하였다. 이어서, 250 μl의 일가 항원(Sino Biologicals)을 100 nM 원액으로부터 연속 3배 희석시켜 50 μl/분의 유속으로 주입시켜 반응 곡선을 생성하였다. 3 M MgCl2 (GE Healthcare, Denmark)의 10초 주입을 3회 반복시켜 포획된 항체/항원 복합체를 표면에서 벗겨냄으로써 사이클 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 마지막으로, 온-레이트(on-rate) (kon 또는 ka), 오프-레이트 (koff 또는 kd) 및 친화성 (KD) 상수를 산출하기 위해 결합 반응을 이중 참조를 이용하여 랭뮤어 1:1 결합 모델에 핏팅시켰다. 동역학적 결합 분석의 결과는 선택된 변이체가 키메라 부모 항체에 비해 인간 및 시노몰구스 항원에 대해 유지되거나 심지어 개선된 친화성을 지님을 나타낸다 (표 6).
표 6: 키메라 부모 항체 및 인간화 항체의 결합 친화성
Figure pct00021
인간화 변이체의 시험관내 기능성 평가
인간화 항체 변이체를 특정 표적의 상이한 에피토프에 대한 2개의 항체를 함유하는 항체 혼합물에서 키메라 "파트너 항체"와 조합된 생존력 검정에서의 기능적 효과에 대해 시험하여 (여기서 "파트너 항체"는 항체1277 변이체 (항-EGFR)가 키메라 항-EGFR 항체 1565와 함께 시험되었고, 항체 4384 변이체 (항-HER2)는 키메라 항-HER2 항체 4517와 함께 시험되었다는 사실을 나타낸다, 기타 등등), 동일한 수용체를 표적화하는 2개의 항체 사이의 기능적 상승작용이 인간화 후에 보존되었는지를 확인하였다. 각각의 인간화 변이체를 2개의 세포주에서 시험하고, 2개의 키메라 항체의 부모 혼합물 및 음성 대조군 항체와 비교하였다. 이용되는 세포주는 이들의 사전에 측정된 수용체-의존성에 기반하여 선택되었고, 즉, EGFR의 경우, A431NS 표피모양암, H358 비소세포폐암, 및 FaDu 두경부암, HER2의 경우, OE19 식도암 및 BT474 유방암, 및 HER3의 경우, MDA-MB-175 VII 및 MCF-7 유방암이다.
또한, 6개의 인간화 변이체 (11294, 11302, 11249, 11145, 10738 및 11052; 인간화 Pan-HER)의 조합물을 다수의 세포주에서 시험하였고 6개의 키메라 항체 (1277, 1565, 4384, 4517, 5038 및 5082; 키메라 Pan-HER)의 조합물과 비교하였다. 이용된 세포주인 N87 위암, FaDu 두경부암, A431NS 표피모양암, OE19 식도암, HN5 두경부암, MDA-MB-175 VII 유방암 및 MFE-280 자궁내막암은 HER 패밀리 수용체에 대한 이들의 사전에 측정된 의존성에 기반하여 선택되었다.
생존력 검정을 수행하기 전, 적절한 항체 및 항체 혼합물을 0.5-2% FBS 및 1% P/S (페니실린/스트렙토마이신)로 보충된 적절한 배지에서 100 μg/ml의 최종 전체 항체 농도로 희석시켜, 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰에서 50 μg/ml의 최종 전체 항체 농도를 발생시켰다. 이후 항체의 3배 연속 희석을 384-웰 플레이트에서 수행한 후, 적절한 수의 세포를 실험 웰에 첨가하였다. MCF-7 세포를 또한 1 nM 헤레굴린 베타로 자극하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. WST-1 시약 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)을 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1-3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 오비탈 플레이트(orbital plate) 진탕기로 1시간 동안 옮기고, ELISA 판독기를 사용하여 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 비율을 하기와 같이 미처리 대조군의 백분율로 계산하였다:
Figure pct00022
선택된 인간화 항체 변이체의 시험관내 활성을 도 7-15 및 17-19에 도시한다. 상기 결과는, 선택된 모든 인간화 변이체가 이들의 키메라 또는 인간화 파트너와 조합시에 2개의 키메라 부모 항체의 관련 혼합물의 효과와 매우 유사한 항-증식 효과를 나타냄을 도시한다. 더욱이, 6개의 인간화 변이체의 조합물 역시 6개의 키메라 부모 항체의 조합물의 효과와 매우 유사한 효과를 나타낸다 (도 20).
인간화 변이체의 특이성 (교차-반응성)
인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스로부터의 EGFR, HER2 및 HER3, 뿐만 아니라 인간 및 뮤린 HER4와의 결합에 대해 키메라 부모 항체 및 선택된 인간화 변이체를 시험하여, 인간화가 교차-반응성 패턴에 어떠한 변화를 일으켰는지를 확인하였다.
항체-항원 결합을 코팅된 항원을 지니는 ELISA에 의해 측정하였다. 인간 항원은 Sino Biologicals로부터 수득하였다. 그 밖의 모든 항원은 CHO 또는 HEK293 세포에서의 일시적 발현에 의해 내부 생성되었다. 키메라 및 인간화 항체, 뿐만 아니라 아이소형 대조군 항체를 상이한 농도의 코팅된 항원과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, 결합된 항체를 HRP- (호스래디쉬 퍼옥시다제)-컨쥬게이션된 이차 항체에 의해 검출하였다. ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정된 40 nM 항체로부터의 OD 신호를 음성 (-; OD<0.1) 내지 강한 양성 (+++; OD>2.5)으로 기록하였다.
도 16의 표에 도시된 결과는 개개의 인간 및 시노몰구스 항원 간의 교차-반응성이 모든 인간화 항체 변이체에서 보존되며, 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 멤버에 대한 어떠한 새로운 반응성도 도입되지 않았음을 나타낸다.
요약 및 결론
PCT/IB2011/054834호에 기재된 키메라 항-EGFR, 항-HER2 및 항-HER3 항체의 다수의 인간화 변이체를 잠재적으로 중요한 프레임워크 위치의 복귀 돌연변이에 의해 그리고 일부 경우에 원치 않는 CDR 서열 모티프의 변경에 의해 생성된 CDR-그래프트된 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성하였다. 적절한 표적 항원과의 결합 친화성에 대해 선택된 각각의 라이브러리로부터의 대략 100 히트의 오프-레이트 순위를 매기고, 부모 키메라 항체의 것과 유사하거나 그보다 느린 분리 속도를 갖는 변이체를 선택하여 서열화하였다. 각각의 라이브러리 스크리닝으로부터 4 내지 10 히트를 인간 및 시노몰구스 항원에 대한 유지되거나 개선된 결합능, 복귀-돌연변이의 수 및 더 큰 규모의 발현 및 정제를 위한 원치 않는 서열 모티프의 부재에 기반하여 선택하였다. 인간 및 시노몰구스 항원에 대한 결합 친화성을 확인하기 위해 선택된 정제된 인간화 항체 변이체를 동역학적 결합 분석으로 처리하고, 동일한 수용체의 상이한 에피토프에 결합하는 키메라 파트너 항체와 함께 생존력 검정에서 시험관내 기능성 분석하고, 교차-반응성 검정하였다.
인간화 변이체 항체 10292, 10460, 11294, 10560, 11302, 10704, 112449, 11145, 10738, 10810, 11006 및 11052는 각각 하기를 포함하여, 이들이 유래된 본래 키메라 부모 항체의 것과 매우 유사한 기능적 특성을 나타내는 것으로 발견되었다:
· 유사하거나 더 높은 결합 친화성;
· 유사하거나 더 느린 분리 속도;
· 마우스 항원 또는 그 밖의 EGFR 패밀리 수용체에 대한 결합능이 없는 동일한 인간 시노몰구스 항원에 대한 결합능; 및
· 키메라 파트너 항체와 함께 기능성 시험관내 검정으로 시험시 두 상이한 세포주에서 고도로 유사한 항-증식 효과.
따라서, 이러한 결과는 본 발명의 인간화 항체 변이체가 이들이 유래된 개개의 부모 키메라 항체와 고도로 유사한 기능적 특성을 지님을 나타낸다. 이는, 본 발명의 인간화 항체의 혼합물, 예컨대 EGFR 패밀리 수용체 EGFR, HER2 및 HER3 각각에 대한 하나 또는 2개의 그러한 항체를 함유하는 혼합물이 PCT/IB2011/054834호에 기재된 부모 키메라 항체의 혼합물의 효과와 유사한 생체내 항암 효과를 나타낼 것으로 예상될 수 있음을 강력하게 시사한다.
실시예 2: EGFR , HER2 또는 HER3 상의 비-중첩 에피토프에 대한 2개의 모노 클로날 항체는 상승적인 시험관내 성장 억제 활성을 나타내고 효과적으로 표적 하향-조절을 유도한다
도 21A에 도시된 EGFR (즉, 1277 및 1565), HER2 (즉, 4384 및 4517), 및 HER3 (즉, 5038 및 5082) 상의 비-중첩 에피토프에 대한 항체를 생존력 검정을 이용하여 각각 암 세포주 A431NS, HCC202, 및 MDA-MB-175-VII의 성장 및 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 항체 처리는 단독 또는 하기 조합으로 투여된 각각의 수용체에 대한 항체로 구성되었다: 1277 및 1565 혼합물, 4384 및 4517 혼합물, 및 5038 및 5082 혼합물. 세포 손상은 대사성 세포 기능 및 성장을 위한 에너지를 유지하고 제공하기 위해 불가피하게 세포 능력의 손실을 초래할 것이다. 대사 활성 검정은 이러한 전제에 기반하며 일반적으로 미토콘드리아 활성을 측정한다. 세포 증식 시약 WST-1(Roche Cat. No. 11 644 807 001)은 생존가능 세포의 대사 활성을 측정하는 미리 제조된(ready-to-use) 기질이다. 대사 활성은 생존가능 세포의 수와 관련되는 것으로 추정된다. 이러한 실시예에서, 암 세포를 다양한 농도의 항체로 96시간 동안 처리한 후에 대사적으로 활성인 세포의 수를 측정하는데 WST-1 검정을 이용하였다.
WST-1 검정을 수행하기 전, 적절한 항체 및 항체 혼합물을 2% FBS 및 1% P/S로 보충된 적절한 배지에서 100 μg/ml의 최종 전체 항체 농도로 희석시켜, 가장 높은 항체 농도를 함유하는 웰에서 50 μg/ml의 최종 전체 항체 농도를 발생시켰다. 이후 항체의 3배 연속 희석을 수행하였다. 이어서 적절한 수의 세포를 384-웰 플레이트의 실험 웰에 첨가하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 그 후 WST-1 시약을 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 한 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 오비탈 플레이트 진탕기로 1시간 동안 옮기고, ELISA 판독기를 사용하여 450 및 620 nm(기준 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포(MAC)의 양을 하기와 같이 미처리 대조군의 백분율로 계산하였다:
Figure pct00023
항체 처리의 시험관내 효과는 항체의 혼합물이 시험된 3개의 HER 수용체 각각에 대한 개별적인 항체보다 우수함을 나타내었다 (도 21B). 더욱이, 항체 처리된 A431NS, HCC202 및 MDA-MB-175-VII 세포(48시간 동안의 각 처리에 대해 20 μg/ml의 총 항체)로부터 분리된 세포 용해물에서 웨스턴 블롯 분석에 의한 EGFR, HER2 및 HER3 수준의 분석은 항체 처리된 세포가 미처리된 세포에 비해 감소된 EGFR, HER2 및 HER3 수준을 나타내었음을 제시하였다 (도 21C).
이러한 실시예는 EGFR, HER2 또는 HER3에 대한 2개의 항체가 상승적인 시험관내 성장 억제 활성을 나타내고 효과적으로 표적 하향-조절을 유도함을 입증한다.
실시예 3: Pan - HER 은 상이한 조직 기원의 많은 수의 세포주 및 유전적 배경에서 광범하게 억제성이다
EGFR, HER2, 및/또는 HER3 상의 비-중첩 에피토프에 대한 항체의 혼합물을 광범한 범위의 암 세포주의 성장 및 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. Pan-HER (EGFR, HER2 및 HER3에 대한 6개의 모노클로날 항체의 혼합물; 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082), 2개의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR 및 HER2, EGFR 및 HER3, 및 HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물, 및 하나의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR, HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물로의 처리 효과를 하기 세포주에서 측정하였다: HN5, MDA-MB175-VII, HCC827, N87, A431NS, FaDu, OE19, SW948, BT474, RMG-1, TE11, GEO, H358, CALU-3, H292, HCC202, LS174T, ZR-75-30, H1975, KYSE520, AU-565, CAPAN-1, IGR-OV1, OE33, PK-1, CFPAC-1, BxPC3, A431, SW1463, COLO678, H820, COLO680N, ASPC1, HCC1937, H661, MFE-280, OVCAR-3, OVCAR-5, SK-BR-3, SW403, OVCAR-8, RL95-2, RMUG-S, SW837, T84, CAPAN-2, GP5d, CaCO2, BT20, MDA-MB-468, DU145, A549, CAL-120, EBC1, H1993, H226, HEC-108, LoVo, Panc08.13, RT-112, U2-OS, DLD-1, SKOV3, H460, KATOIII, MDA-MB-134-VI, MKN-45, PANC-1, RT-4, SNU-16, A2058, MCF7, SW480. 이러한 73개 세포주에서 PathScan RTK 시그널링 항체 어레이 (Cell Signaling Technology)를 이용한 EGFR, HER2 및 HER3의 수용체 인산화 수준의 특성규명에 의해 상승된 HER 패밀리 활성화를 입증하였다 (도 22).
대사 활성에 대한 70개가 넘는 암 세포주 (시험된 100개가 넘는 세포주 중에서)에서의 항체 처리의 효과를 실시예 2에 기재된 것과 유사한 WST-1 검정을 이용하여 96시간 인큐베이션 후에 결정하였다. 결과는, Pan-HER이 헤레굴린 (도 24) 또는 EGF (도 25)의 존재하에, 또는 어느 리간드도 없는 경우에 (도 23) 상이한 조직 기원의 많은 수의 암 세포주 및 유전적 배경에서 광범하게 억제성임을 나타내었다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. 이러한 결과는 3개 수용체의 동시 표적화가 단일 수용체의 표적화 또는 HER 패밀리의 2개 수용체의 임의의 조합의 표적화보다 광범한 효능을 제공하였음을 추가로 입증하였다.
실시예 4: Pan - HER 은 리간드 -유도된 증식을 효과적으로 억제한다
항체 혼합물이 EGFR 및 HER3 리간드의 존재하에 효능이 있는지를 확인하기 위해, 1개, 2개 또는 3개의 HER 패밀리 수용체에 대한 항체 혼합물을 헤레굴린 또는 EGF의 존재하에, 또는 어느 리간드도 없는 경우에 췌장암 세포주의 성장 및 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. Pan-HER (EGFR, HER2 및 HER3에 대한 6개의 모노클로날 항체의 혼합물; 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082), 2개의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR 및 HER2, EGFR 및 HER3, 및 HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물, 및 하나의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR, HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물로의 처리 효과를 하기 세포주에 대해 측정하였다: CAPAN-1, PK-1, CFPAC-1, BxPC 3, ASPC1, CAPAN-2, Panc08.13, PANC-1, KP4, MiaPaca-2 및 PSN1). 이러한 세포주의 돌연변이 상태를 도 26에 도시한다. 헤레굴린 또는 EGF의 존재하에, 또는 어느 리간드도 없는 경우에 광범하게 다양한 암 세포주의 성장 및 증식을 억제하는 1개, 2개 또는 3개의 HER 패밀리 수용체에 대한 항체 혼합물을 능력을 또한 시험하였다 (도 23-25). 세포를 항체 및 리간드를 함유하는 배지에 96시간 동안 노출시켰다 (리간드 및 항체는 세포에 동시에 첨가되었다). 대사 활성을 인큐베이션한 지 96시간 후에 실시예 2에 기재된 것과 유사한 WST-1 검정을 이용하여 측정하였다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. Pan-Her은 EGF 또는 헤레굴린의 존재하에 광범하게 다양한 암 세포주의 효과적인 억제를 나타내었다.
실시예 5: Pan - HER 은 승인된 치료 항체에 획득 내성을 지닌 세포에서 억제 효과를 유지한다
Pan-HER (EGFR, HER2 및 HER3에 대한 6개의 모노클로날 항체의 혼합물; 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082)을 HN5, OE19 및 MDA-MB-175-VII 세포주 또는 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙 각각에 획득 내성을 지닌 세포 푸울의 성장 및 증식을 억제하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 세툭시맙 내성 HN5 세포주를 실시예 11에 기재된 대로 생성하였다. 트라스투주맙 내성 OE19 세포 및 퍼투주맙 내성 MDA-MB-175-VII 세포는, 부모 세포를 증가하는 농도의 각각의 트라스투주맙 [10-100 μg/ml] 및 퍼투주맙 [1-50 μg/ml]에 각각 8개월 및 12개월의 기간 동안 노출시킴에 의해 확립되었다. 세포를 지수 성장기로 유지하기 위해 세포를 1주일에 1회 또는 2회 분할하였다. 내성 세포의 푸울이 달성될 때까지, 내성 수준을 실시예 2에 기재된 WST-1 생존력 검정으로 매달 시험하였다. 트라스투주맙 내성 OE19 세포의 단일 세포 클론은 실시예 11에 기재된 대로 OE19 세포의 획득된 트라스투주맙 내성 푸울의 제한 희석 클로닝을 통해 생성되었다.
인큐베이션한 지 96시간 후에 대사 활성을 실시예 2에 기재된 것과 유사한 WST-1 검정을 이용하여 측정하였다. Pan-HER-처리된 내성 세포 뿐만 아니라 부모 세포는 감소된 수준의 대사 활성을 나타내었다 (도 28). 대조적으로, 대사 활성은 부모 HN5, OE19 ? MDA-MB-175-VII 세포에서 감소되었으나, 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙으로 각각 처리된 내성 클론에서는 변화가 없었다. 이러한 실시예는 Pan-HER이 승인된 치료 항체에 획득 내성을 지니는 세포에서 억제 효과를 유지함을 입증한다.
실시예 6: Pan - HER 은 시험관내에서 보상적인 수용체 상향-조절을 효과적으로 방지한다
보상적인 수용체 상향-조절의 방지가 본 발명의 항체 혼합물로의 처리 결과로서 발생하는 지를 확인하기 위해, 48시간 동안의 항체 처리 (20 μg/ml) 후 H292 및 OVCAR8 세포주로부터의 전체 세포 용해물에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 EGFR, HER2 및 HER3 수준을 측정하였다. Pan-HER (EGFR, HER2 및 HER3에 대한 6개의 모노클로날 항체의 혼합물; 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082) 및 하나의 HER 패밀리 멤버를 표적화하는 항체 혼합물 (즉, EGFR (항체 1277, 1565, 또는 1277+1565), HER2 (항체 4384, 4517, 또는 4384+4517) 및 HER3 (항체 5038, 5082, 또는 5038+5082))로의 처리 효과를 측정하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 이용하였다. 결과는, 항-EGFR 처리가 H292 세포에서 HER2 상향조절을 발생시켰고 (도 29, 위; 세툭시맙 레인, 1277, 1565, 및 1277 + 1565 레인), 항-HER3 처리가 OVCAR-8에서 HER2 상향-조절을 발생시킨 한편 (도 29, 아래; MM-121 레인, 5038, 5082, 및 5038 + 5082 레인), Pan-HER 처리가 EGFR, HER2 및 HER3의 하향조절을 발생시켰음을 (도 29; Pan-Her 레인) 나타내었다. 이러한 결과는 Pan-HER이 3개 모두의 표적의 동시 하향-조절을 효과적으로 유도하였고 내성을 획득하기 위한 잠재적 메커니즘인 보상적인 수용체 상향-조절을 방지하였음을 입증하였다.
실시예 7: BxPC -3 (췌장암) 이종이식편 모델에서 다수의 HER 패밀리 수용체를 표적화하는 상승적인 효과
인간 암의 이종이식편 모델에서 EGFR, HER2, HER3 및 2개 및 3개 수용체 표적의 조합에 대한 항체 혼합물의 효능을 평가하기 위해, BxPC-3 (췌장암) 이종이식편 모델을 항체 혼합물로 처리하고 종양 크기에 대한 효과를 검정하였다.
이러한 검정에서, BxPC-3 췌장암 세포를 마우스에 접종하였다. 간단히 말해, 5x106개 BxPC3 세포를 8 내지 10주령 암컷 무흉선 누드 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종하였다. 캘리퍼스를 이용하여 매주 3회 종양을 측정하였고, 종양 부피를 하기 식에 따라 mm3으로 산출하였다: (폭)2 x 길이 x 0.5. 평균 종양 크기가 140 mm3일 때, 마우스를 랜덤화하고 처리를 개시하였다. 마우스를 매주 3회 50 mg/kg의 복막내 주입으로 처리하고 (총 10회 주입) 관찰 기간을 두었다. 종양 부피 데이터의 그래픽 표현을 평균 ± SEM로서 제시하였다.
결과는, Pan-HER (항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082)이 BxPC-3 이종이식편 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제하였음을 나타내었다 (도 30; N=7/그룹; 처리 기간은 그래프 상에서 밝은 회색 영역으로 표시되었다). EGFR 및 HER3 뿐만 아니라 EGFR 및 HER2를 표적화할 때 분명한 상승작용이 관찰되었고, 전자의 조합은 BxPC3 종양 이종이식편의 성장을 제어하는데 가장 효율적이다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. 더욱이, 생체내 Pan-HER에 의한 EGFR 및 HER2 하향-조절은 처리를 중단한 지 3일 후 절제된 종양으로부터의 조직 섹션에 대한 면역조직화학에 의해 확인되었다 (도 31).
실시예 8: Calu -3 ( NSCLC ) 이종이식편 모델에서 다수의 HER 패밀리 수용체를 표적화하는 상승적인 효과
인간 암의 이종이식편 모델에서 EGFR, HER2, HER3 및 2개 및 3개 수용체 표적의 조합에 대한 항체 혼합물의 효능을 평가하기 위해, Calu-3 (NSCLC) 이종이식편 모델을 항체 혼합물로 처리하고 종양 크기에 대한 효과를 검정하였다.
이러한 검정에서, Calu-3 NSCLC 세포를 마우스에 접종하였다. 간단히 말해, 1x107개 Calu-3 세포를 8 내지 10주령 암컷 무흉선 누드 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종하였다. 캘리퍼스를 이용하여 매주 3회 종양을 측정하였고, 종양 부피를 하기 식에 따라 mm3으로 산출하였다: (폭)2 x 길이 x 0.5. 평균 종양 크기가 170 mm3일 때, 마우스를 랜덤화하고 처리를 개시하였다. 마우스를 매주 3회 50 mg/kg의 복막내 주입으로 처리하였다 (총 8회 주입). 종양 부피 데이터의 그래픽 표현을 평균 ± SEM로서 제시하였다.
결과는, Pan-HER (항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082)이 Calu-3 이종이식편 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제하였음을 나타내었다 (도 32; N=5/그룹; 처리 기간은 그래프 상에서 밝은 회색 영역으로 표시되었다). 결과는 EGFR, HER2 및 HER3을 동시에 표적화하는 상승적인 효과를 나타내는 반면, EGFR 및 HER2 또는 EGFR 및 HER3을 표적화하는 경우 EGFR 단일-표적화의 항-종양 반응에 비해 뚜렷한 상승작용이 관찰될 수 없었음을 나타낸다. "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
실시예 9: Pan - HER 은 생체내에서 보상적인 수용체 상향-조절을 효과적으로 방지한다
보상적인 수용체 상향-조절이 본 발명의 항체 혼합물로의 처리 결과로서 생체내에서 발생하는 지를 확인하기 위해, EGFR, HER2 및 HER3 수준을 항체-처리된 BxPC-3 종양 용해물에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. Pan-HER (EGFR, HER2 및 HER3에 대한 6개의 모노클로날 항체의 혼합물; 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082), 2개의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR 및 HER2, EGFR 및 HER3, 및 HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물, 및 하나의 HER 패밀리 멤버 (즉, EGFR, HER2 및 HER3)를 표적화하는 항체 혼합물로의 처리 효과를 확인하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 이용하였다. 결과는, 항-EGFR 처리가 EGFR 하향조절을 발생시켰고 (도 33 위), 항-HER2 처리가 HER2 하향조절을 발생시켰으며 (도 33 위), 항-HER3 처리가 HER3 하향조절을 발생시켰음을 (도 33 위) 나타내었다. 웨스턴 블롯 밴드 세기의 상대 정량은, HER2가 항-HER3 처리에 대한 반응에서 현저하게 상향-조절되었음을 나타내었다 (도 33; 아래). 대조적으로, Pan-HER 처리는 EGFR, HER2 및 HER3의 동시적이고 효과적인 하향조절을 발생시켰다 (도 33 위; 녹색 박스 및 도 33 아래). "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
이러한 실시예는 Pan-HER이 3개 모두의 표적의 동시적인 하향-조절을 효과적으로 유도하고 생체내에서 보상적인 수용체 상향-조절을 방지할 수 있음을 입증하였다.
실시예 10: 환자- 유래된 KRAS 돌연변이된 췌장 종양 이종이식편 모델에서 다수의 HER 패밀리 수용체를 표적화하는 상승적인 효과
EGFR, HER2, HER3 및 2개 및 3개 수용체 표적의 조합에 대한 항체 혼합물의 생체내 효능을 평가하기 위해, KRAS 돌연변이된 췌장암의 환자-유래된 종양 이종이식편 모델 (START Discovery, San Antonio, TX)을 항체 혼합물로 처리하고 종양 크기에 대한 효과를 검정하였다.
이러한 검정에서, 환자-유래된 췌장암 세포를 마우스에 접종하였다. 간단히 말해, 생존가능한 절제된 환자 종양 물질을 면역약화된 마우스에 이식하고 생체내에서 연속 계대시켰다. 종양 부피가 100-200 mm3일 때, 동물을 처리군 및 대조군으로 랜덤화하고 투약을 개시하였다. 투약 스케쥴: 50 mg/kg i.p. 매주 3회, 총 10회 용량 (0-20일). N=5/그룹. 데이터를 평균 ± SEM로서 제시하였다. 별표는 p<0.05인 첫째 날을 나타낸다. 그룹 간에 처리 반응에서의 통계적으로 유의한 차이가 연구 기간을 통틀어 유지되었다.
결과는, Pan-HER이 췌장암의 치료하기 어려운 환자-유래된 모델에서 종양 성장을 효과적으로 억제하였음을 나타내었다 (도 34; N=5/그룹). 더욱이, 디콘볼루션 연구는, ST179 이종이식편 모델에서 EGFR 및 HER2의 표적화 및 EGFR 및 HER3의 표적화의 강한 상승작용을 나타내었고, ST383 이종이식편 모델에서 EGFR 및 HER2의 표적화의 낮은 정도의 상승작용 효과를 나타내었다 (도 35; N=7-8/그룹; 처리 기간은 그래프 상에서 밝은 회색 영역으로 표시되었다). "EGFR"은 항체 1277 및 1565의 혼합물을 나타낸다. "HER2"는 항체 4384 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "HER3"은 항체 5038 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER2"는 항체 1277, 1565, 4384, 및 4517의 혼합물을 나타낸다. "EGFR+HER3"은 항체 1277, 1565, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "HER2+HER3"은 항체 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다. "Pan-HER"은 항체 1277, 1565, 4384, 4517, 5038, 및 5082의 혼합물을 나타낸다.
표 7: 췌장암의 환자- 유래된 이종이식편 모델
Figure pct00024
실시예 11: 획득된 세툭시맙 내성 HN5 클론은 높은 EGFR 활성과 함께 EGFR 의 감소된 총 수준을 나타낸다
세툭시맙 내성 HN5 클론은, 부모 HN5 세포를 6개월의 기간 동안 증가하는 농도의 세툭시맙 [1-100 μg/ml]에 노출시킴에 의해 확립되었다. 세포를 지수 성장기로 유지하기 위해 세포를 1주일에 2회 분할하였다. 세툭시맙 내성 세포의 푸울이 달성될 때까지, 세툭시맙에 대한 내성 수준을 실시예 2에 기재된 WST-1 생존력 검정으로 매달 시험하였다. HN5 세포의 획득된 세툭시맙 내성 푸울의 제한 희석 클로닝을 통해 단일 세포 클론이 생성되었다. 0.5 세포/웰을 384 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 단일 세포 집락의 성장 및 증식은 Novartis Cellavista Imager를 이용하여 관찰되었다. 가장 내성인 개개 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14를 추가 특성규명을 위해 선택하였다 (도 36).
생존력:
개개 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14의 세툭시맙 내성 수준을 앞서 실시예 1에 기재된 WST-1 생존력 검정으로 시험하였다. 간단히 말해, 세포를 소정 농도 범위의 세툭시맙으로 처리하고 96시간 후에 검정하였다. 부모 NH5 세포와 달리, 내성 클론은 증가하는 농도의 세툭시맙 처리시에 생존가능하였다 (도 37).
고정된 세포로의 세툭시맙 결합:
부모 HN5 및 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에 대한 세툭시맙의 결합 강도를 측정하였다. 세포의 수 (DRAQ-5 염색)로 표준화된 형광 신호 및 세툭시맙 농도를 플롯팅함에 의해 결합 곡선을 생성하였다. 결과는, 세툭시맙의 최대-절반(half-maximal) 결합(즉, EC50 값)이 변경되지 않은 반면, 최대 결합은 부모 세포에 비해 내성 클론에서 감소되었음을 나타낸다 (도 38).
EGFR 발현 및 신호전달:
EGFR의 상대 표면 수준을 부모 HN5 및 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에서 확인하였다. 간단히 말해, 세포를 항-EGFR-FITC (abcam, #11400) 또는 아이소형 대조군 (abcam, #18446)으로 염색하고 살아 있는 세포의 상대 형광을 흐름세포측정에 의해 정량하였다. EGFR의 상대 표면 수준은 부모 세포에 비해 세툭시맙 내성 HN5 클론에서 더 낮았다 (도 39).
EGF 자극에 대한 세툭시맙 내성 클론의 반응을 시험하였다. EGFR의 총 수준, 인산화된 EGFR의 수준 및 다운스트림 신호전달 분자를 부모 HN5 및 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에서 결정하였다. 부모 HN5 세포 및 세툭시맙 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14를 미처리하거나 1nM EGF로 15분 동안 자극시킨 후 회수하였다. 용해물을 SDS-PAGE 상에서 분획화시킨 후 EGFR, 인산화된 EGFR 종 pEGFR (Tyr1068), pEGFR(Tyr1045), pEGFR(Tyr1173), pEGFR(Tyr992), pEGFR(Thr669), 및 pEGFR(Ser1046/1047), 및 신호전달 분자 AKT, pAKT (Ser473), ERK1/2, pERK1/2(Thr202/Tyr204)에 대해 웨스턴 블롯팅시켰다 (도 40 및 41). β-액틴을 로딩 대조군으로서 이용하였다. 결과는, EGFR 및 인산화된 EGFR의 총 수준이 부모 세포에 비해 세툭시맙 내성 HN5 클론에서 더 낮음을 나타내었다 (도 40). 결과는 또한 세툭시맙 내성 클론에서 pEGFR(Ser1046/1047)의 감소된 수준을 나타내었는데, 이는 EGFR을 조절하는 피드백 메커니즘이 세툭시맙 내성 클론에서 덜 활성임을 나타낸다 (도 40). EGF로의 자극은 부모 HN5 세포에 비해 세툭시맙 내성 클론에서 pAKT 및 pERK1/2의 더 강한 활성화를 유도하였다 (도 41). 더불어, 이러한 결과는 EGFR 발현이 부모 HN5 세포에 비해 감소하긴 하지만, EGFR이 세툭시맙 내성 클론에서 여전히 활성임을 입증한다.
실시예 12: EGFR 을 표적화하는 항체 혼합물은 효율적인 EGFR 내재화 이후 수용체의 분해를 통해 세툭시맙 내성을 극복한다
EGFR 상의 비-중첩 에피토프를 표적화하는 항체의 혼합물을 세툭시맙 내성 HN5 클론 HN5 CR2 및 HN5 CR14에서 세툭시맙 유도된 내성을 부분적으로 극복하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 부모 HN5, HN5 CR2, 및 HN5 CR14 세포를 EGFR-LNA™ (EGFR 표적화 잠금된 핵산, Exiqon), 세툭시맙 또는 EGFR-2혼합물 (항체 1277 및 1565)로 48시간 동안 처리하였다. 성장 및 증식을 실시예 2에 기재된 대로 WST-1 검정을 이용하여 측정하였고 효과의 정량을 평균 +/- SEM (n=4)을 나타내는 데이터 포인트로 플롯팅하였다 (도 42). EGFR-LNA, 및 EGFR-2혼합물 둘 모두는 세포 생존력에 있어서 유사한 감소를 유도하였다. 이러한 결과는 EGFR 상의 비-중첩 에피토프를 표적화하는 항체의 혼합물이 세툭시맙 유도된 내성을 부분적으로 극복하고 세툭시맙 내성 클론이 성장 및 증식을 위해 EGFR에 대한 의존성을 유지함을 입증하였다 (도 42).
세포 용해물을 SDS-PAGE 상에서 분획화시킨 후 EGFR에 대해 웨스턴 블롯팅시킴에 의해 EGFR-LNA, 세툭시맙 또는 EGFR-2혼합물로 48시간 동안 처리된 세포에서의 EGFR의 수준을 측정하였다. 결과는, 효율적인 EGFR 내재화 후에 수용체의 리소좀 분해가 항체 처리된 내성 세포에서 유도되었음을 나타내며 (도 43), 이에 따라 EGFR을 표적화하는 항체 혼합물의 능력에 대한 메커니즘이 세툭시맙 내성을 극복함을 제공한다.
실시예 13: 세툭시맙 내성 HN5 클론은 HER3 및 IGF1R 을 통해 처리를 회피한다
그러나, 항-EGFR 혼합물에 의한 내성 클론의 관찰된 억제 수준은 부모 세포에서와 같이 효율적인 성장 억제를 유도하지 않았는데, 이는 대안적인 수용체 티로신 키나제 (RTK)가 획득된 세툭시맙 내성의 메커니즘에 관련될 수 있음을 시사한다. 부모 NH5 및 내성 클론 HN5 CR2, HN5 CR6, HN5 CR13, 및 HN5 CR14에서 HER3 활성의 역할을 시험하기 위해, 세포를 2개의 EGFR 항체 (항체 1277 및 1565)의 혼합물, 2개의 HER3 항체 (항체 5038 및 5082)의 혼합물, 2개의 EGFR 및 2개의 HER3 항체 (항체 1277, 1565, 5038 및 5082)의 혼합물, 또는 세툭시맙으로 48시간 동안 처리하였다. 성장 및 증식을 실시예 2에 기재된 대로 WST-1 검정을 이용하여 측정하였고 효과의 정량을 평균 +/- SEM (n=6)을 나타내는 데이터 포인트로 플롯팅하였다. 결과는 EGFR 항체 혼합물 단독에 의해 유도된 효과에 비해 HER3 및 EGFR 둘 모두를 표적화하는 항체를 함유하는 혼합물의 탁월한 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 획득된 세툭시맙 내성에서 대안적인 RTK의 관련 가설을 뒷받침한다 (도 44). 항체 혼합물에 대한 부모 HN5 및 내성 HN5 CR2 세포의 용량 반응 곡선은 도 45A 및 B에 도시된다.
본원에 도시된 세툭시맙에 대한 획득된 내성에서의 HER3의 관련성은 시험관내 세툭시맙에 대한 획득된 내성의 메커니즘으로서 RTK 패밀리의 유연성(plasticity)을 나타낸다.
표 8: 선택된 키메라 항체의 서열
항체 1277: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00025
항체 1277: VH 아미노산 서열
Figure pct00026
Figure pct00027
항체 1277: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00028
항체 1277: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00029
항체 1565: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00030
Figure pct00031
항체 1565: VH 아미노산 서열
Figure pct00032
항체 1565: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00033
항체 1565: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00034
Figure pct00035
항체 4384: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00036
항체 4384: VH 아미노산 서열
Figure pct00037
항체 4384: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00038
항체 4384: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00039
Figure pct00040
항체 4517: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00041
항체 4517: VH 아미노산 서열
Figure pct00042
항체 4517: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00043
Figure pct00044
항체 4517: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00045
항체 5038: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00046
항체 5038: VH 아미노산 서열
Figure pct00047
항체 5038: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00048
항체 5038: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00049
항체 5082: VH 뉴클레오티드 서열
Figure pct00050
항체 5082: VH 아미노산 서열
Figure pct00051
Figure pct00052
항체 5082: 경쇄 뉴클레오티드 서열
Figure pct00053
항체 5082: 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00054
SEQUENCE LISTING <110> LANTTO, JOHAN ANDERSEN, KIM VILBOUR ANDERSEN, PETER SEJR STRANDH, MAGNUS KOEFOED, KLAUS NIELSEN, LARS SOGAARD PEDERSEN, MIKKEL WANDAHL JACOBSEN, HELLE KRAGH, MICHAEL KJAER, IDA POULSEN, THOMAS TUXEN <120> HUMANIZED PAN-HER ANTIBODY COMPOSITIONS <130> 110285-0048-WO1 <140> PCT/IB2013/001027 <141> 2013-05-02 <150> 61/809,159 <151> 2013-04-05 <150> 61/641,756 <151> 2012-05-02 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Humanized 1277 VH polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> /replace="Arg" <220> <221> VARIANT <222> (49)..(49) <223> /replace="Ala" <220> <221> VARIANT <222> (83)..(83) <223> /replace="Val" <220> <221> VARIANT <222> (104)..(104) <223> /replace="Ile" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(117) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant 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those in the annotations for variant positions" <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Gly Tyr Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic Humanized 5082 VL polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> /replace="Val" <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> /replace="Thr" <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> /replace="Val" <220> <221> VARIANT <222> (69)..(69) <223> /replace="Ile" 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polynucleotide" <400> 14 cgcgccgaag tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agagtccttg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcgct ttcagttact ctgacatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcatacatga gtagtgctgg tgatgtcacc 180 ttctattcag acactgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240 ctgtatctgc aagtgagcag tctgaagtct gaggacacag ccatatatta ctgtgtaaga 300 caccgggacg tggctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcg 354 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 15 Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser 20 25 30 Tyr Ser Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ala Tyr Met Ser Ser Ala Gly Asp Val Thr Phe Tyr Ser Asp 50 55 60 Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Lys 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gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 <210> 17 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 17 Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val 20 25 30 His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser 85 90 95 Gln Ser Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln 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polypeptide" <400> 19 Arg Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Ile Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Phe Asn Glu 50 55 60 Glu Phe Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 115 120 <210> 20 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 20 gctagccaac attgtgatga cacagtctca caaattcatg tccacattaa taggagccag 60 ggtctccatc acctgcaagg ccagtcagga tgtggatacg gctgtagcct ggtatcaaca 120 gaaaccaggt caatctccta aattattaat ttattgggca tccacccggc acactggagt 180 ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc 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Asp Phe Ser Leu Thr Val Ser Asn Val 65 70 75 80 Gln Ser Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr 85 90 95 Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 22 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 22 caggtgcagc tgcagcagcc tggcacagag ctggtgaaac ctggcgcctc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcccactgga tgcactgggt gaaacagcgg 120 cctggacagg gcctggaatg gatcggcaac atcaacccct ccaacggcgg caccaactac 180 aacgagaagt tcaagtcccg ggccaccctg accgtggaca aggcctcctc caccgcctac 240 atgcagctgt cctccctgac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagagcctac 300 tacgacttca gttggttcgt gtactggggc cagggcaccc tggtgacagt ctcg 354 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 24 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 24 gatatccaga tgacccagac ctcctccagc ctgtccgcct ccctgggcga cagagtgacc 60 atctcctgcc ggtcctccca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaaaccc 120 gacggcaccg tgaagctgct gatgtacatc tcccggctgc actccggcgt gccctccaga 180 ttctccggct ctggctccgg caccgagtac tccctgacca tcagcaacct ggaacaggaa 240 gatatcgcta cctacttctg tcagcagggc aacaccctgc ccctgacctt cggcgctggc 300 accaagctgg aactgaagcg gaccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc 360 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 480 tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 540 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 600 tccagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgc 639 <210> 25 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Ile Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 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ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caactcccag 480 gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 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gtttcagcag 120 aaaccaggtg gaactgttaa gctcctgatc ttccacacat caagattaca ctcaggagtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaccctg 240 gaacaggaag atattgccat ttacttttgc caacagggta ttacgcttcc gtggacgttc 300 ggtggcggca ccaagctgga aataaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta ataagcggcc 660 <210> 33 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 33 Leu Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Pro Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr 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Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg His Arg Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 64 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 64 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 65 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Phe Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 66 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Phe Ser Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ile Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Lys Leu Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 71 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Phe Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Gly Tyr Asp Gly Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Gly Asp Tyr Gly Tyr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (37)

  1. 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 재조합 항체 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 인간화 항-EGFR 항체가,
    (a) SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:2의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및
    (b) SEQ ID NO:4의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:5의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택되고;
    적어도 하나의 인간화 항-HER2 항체가,
    (c) SEQ ID NO:6의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및
    (d) SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:9의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택되고;
    적어도 하나의 인간화 항-HER3 항체가,
    (e) SEQ ID NO:10의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체, 및
    (f) SEQ ID NO:12의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체로부터 선택되는 항체 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:43의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:44의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
    (b) SEQ ID NO:47의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:48의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
    (c) SEQ ID NO:51의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:52의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
    (d) SEQ ID NO:53의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:54의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체;
    (e) SEQ ID NO:55의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:56의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체; 및
    (f) SEQ ID NO:61의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:62의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 포함하는 항체 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 항-EGFR 항체 (a) 및 (b), 항-HER2 항체 (c) 및 (d), 및 항-HER3 항체 (e) 및 (f)를 포함하는 항체 조성물.
  5. 제 2항에 있어서,
    (i) 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (e);
    (ii) 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (f);
    (iii) 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (e);
    (iv) 항-EGFR 항체 (a), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (f);
    (v) 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (e);
    (vi) 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (c), 및 항-HER3 항체 (f);
    (vii) 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (e); 또는
    (viii) 항-EGFR 항체 (b), 항-HER2 항체 (d), 및 항-HER3 항체 (f)를 포함하는 항체 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체 (a)가,
    (i) Arg44, Val83 및 Ile104를 지니는 SEQ ID NO:1을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Leu34, Tyr41, Leu51 및 Phe92를 지니는 SEQ ID NO:3을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열;
    (ii) Arg44, Val83 및 Ile104를 지니는 SEQ ID NO:1을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Tyr41, Leu51 및 Phe92를 지니는 SEQ ID NO:3을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (iii) Arg44 및 Val83을 지니는 SEQ ID NO:1을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Ala19 및 Phe92를 지니는 SEQ ID NO:2를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체 (b)가,
    (i) Leu20, Ile48 및 Ala68을 지니는 SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Val75 및 Phe87을 지니는 SEQ ID NO:5를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) Leu20, Ile48, Leu56, 및 Ala68을 지니는 SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Val75 및 Phe87을 지니는 SEQ ID NO:5를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체 (c)가,
    (i) Ser55, Leu70, Val72, Lys74 및 Ala79를 지니는 SEQ ID NO:6을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Val44, Met48 및 Tyr70을 지니는 SEQ ID NO:7을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) Ser55 및 Val72를 지니는 SEQ ID NO:6을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Met48 및 Tyr70을 지니는 SEQ ID NO:7을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER2 항체 (d)가 Ala49, Ile74 및 Ser77을 지니는 SEQ ID NO:8을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Thr56, Tyr71, Ser85 및 Leu104를 지니는 SEQ ID NO:9를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER3 항체 (e)가 Met49, Ser55 및 Ile68, 또는 Asn44, Ser55 및 Thr93을 지니는 SEQ ID NO:10을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Phe36, Val44, Phe49 및 Ile85, 또는 Phe36, Phe49 및 Leu73을 지니는 SEQ ID NO:11을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-HER3 항체 (f)가,
    (i) Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 지니는 SEQ ID NO:12를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Val21, Thr29, Val44, 및 Phe87을 지니는 SEQ ID NO:13을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) Phe41, Val46, Met49, Ser55 및 Arg72를 지니는 SEQ ID NO:12를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열, 및 Val21, Val44, Tyr71, Phe87 및 Leu104를 지니는 SEQ ID NO:13을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 조성물.
  12. 제 2항에 있어서, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 항체를 포함하는 항체 조성물.
  13. 제 2항에 있어서,
    (a) 항-EGFR 항체 10292, 10460, 또는 11294;
    (b) 항-EGFR 항체 10560 또는 11302;
    (c) 항-HER2 항체 10704 또는 11249;
    (d) 항-HER2 항체 11145;
    (e) 항-HER3 항체 10738 또는 10810; 및
    (f) 항-HER3 항체 11006 또는 11052를 포함하는 항체 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 인간화 재조합 항체 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제 3항의 항체 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 조성물 중 적어도 하나의 항체가, 항체가 항암제에 컨쥬게이션되어 있는 면역컨쥬게이트인 약학적 조성물.
  17. 인간화 항-EGFR 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이,
    각각 SEQ ID NO:43 및 44,
    각각 SEQ ID NO:38 및 39,
    각각 SEQ ID NO:41 및 42,
    각각 SEQ ID NO:45 및 46, 또는
    각각 SEQ ID NO:47 및 48을 포함하는 인간화 항-EGFR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 인간화 항-HER2 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이,
    각각 SEQ ID NO:51 및 52,
    각각 SEQ ID NO:49 및 50, 또는
    각각 SEQ ID NO:53 및 54를 포함하는 인간화 항-HER2 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 인간화 항-HER3 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열이,
    각각 SEQ ID NO:55 및 56,
    각각 SEQ ID NO:57 및 58,
    각각 SEQ ID NO:59 및 60, 또는
    각각 SEQ ID NO:61 및 62를 포함하는 인간화 항-HER3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경좨, 또는 둘 모두를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  21. 제 20항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제 21항에 따른 핵산 분자 또는 제 21항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 상기 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 항체 또는 항원-결합 단편을 발현시킬 수 있는 숙주 세포.
  23. 제 22항에 따른 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양시키고, 생성된 항체를 분리시키는 것을 포함하는, 항체를 생성하는 방법.
  24. 적어도 하나의 인간화 재조합 항-EGFR 항체, 적어도 하나의 인간화 재조합 항-HER2 항체 및 적어도 하나의 인간화 재조합 항-HER3 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물을 생성하는 방법으로서,
    적어도 제 1, 제 2 및 제 3 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 제 1 숙주 세포가 제 17항에 정의된 재조합 항-EGFR 항체를 발현시킬 수 있고, 제 2 숙주 세포가 제 18항에 정의된 재조합 항-HER2 항체를 발현시킬 수 있으며, 제 3 숙주 세포가 제 18항에 정의된 재조합 항-HER3 항체를 발현시킬 수 있는 단계,
    제 1, 제 2 및 제 3 숙주 세포를 항-EGFR 항체, 항-HER2 항체 및 항-HER3 항체를 발현하기에 적합한 조건하에 배양시키는 단계, 및
    생성된 항체를 분리시키는 단계를 포함하는, 재조합 항체 조성물을 생성하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 조성물 또는 제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 조성물 또는 제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, EGFR, HER2 및/또는 HER3의 발현 또는 과발현을 특징으로 하는 질병을 지닌 환자를 치료하는 방법.
  27. 유효량의 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 조성물 또는 제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항체 및/또는 티로신 키나제 억제제로의 치료에 획득 내성을 지닌 환자에서 암을 치료하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 조성물 또는 제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암 성장을 억제하는 방법.
  29. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 조성물 또는 제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 EGFR, HER2, 또는 HER3 발현을 감소시키거나, EGFR, HER2, 또는 HER3 상향-조절을 방지하는 방법.
  30. 제 25항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 췌장암, 골암, 결장암, 자궁내막암, 또는 요도암 환자인 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 환자가 췌장암 및 KRAS 돌연변이를 지니는 방법.
  32. 제 25항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체들 중 적어도 하나가 항암제에 컨쥬게이션되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 항암제가 세포독성제, 사이토카인, 독소, 또는 방사성핵종인 방법.
  34. 제 25항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전에 암에 대해 치료된 적이 없는 방법.
  35. 제 25항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 이전에 암에 대해 치료된 적이 있는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 환자가 이전에 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙으로 치료된 적이 있는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 환자에서의 암이 세툭시맙, 트라스투주맙, 또는 퍼투주맙에 획득 내성을 지니는 방법.
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