KR101633520B1

KR101633520B1 - Ｃｓｆ－１ｒ에 대한 항체

Info

Publication number: KR101633520B1
Application number: KR1020107020397A
Authority: KR
Inventors: 헬렌 헤겔; 크리스틴 시우델렛; 미셸 가이스트; 베노이트 그렐리어
Original assignee: 트랜스진 에스.에이.
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2016-06-24
Also published as: NZ587830A; KR20100122923A; CN102702358B; RU2547586C2; BRPI0909044A2; EP2262836B1; CA2718499A1; US9221912B2; WO2009112245A1; AU2010257416A1; HK1174644A1; US20110081353A1; IL208045A0; JP2011512851A; RU2010141584A; HUE028756T2; JP2015096522A; AU2009224955A1; BRPI0909044B8; CN101970496A

Abstract

본 발명은 CSF-1R에 특이적인 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용하는 치료 방법을 제공한다.

Description

ＣＳＦ－１Ｒ에 대한 항체{ANTIBODY AGAINST THE CSF-1R}

CSF-1 (콜로니-자극 인자-1)은 특히 각종 유형의 세포에 의해 발현되는 사이토카인이다. 이는 CSF-1에 대한 수용체 (CSF-1R)를 발현하는 단핵 포식세포 계통의 세포에 대한 분화, 성장 및 생존 인자이다 (문헌 [SHERR. Colony-stimulating factor-1 receptor, blood. 1990, vol.75, no.1, p.1-12.]). CSF-1R은 5개의 면역글로불린-유사 서브도메인에 조직화되어 있는 리간드-결합 세포외 영역과 세포내 키나제 도메인을 포함하는, c- fms 프로토온코진에 의해 코딩되는 티로신 키나제 수용체이다. CSF-1에 대해 반응하며 생존, 성장 분화, 및 기능의 가역적 변화는 증가하게 된다. c- fms 유전자 그 자체가 대식세포 분화 마커이다. c- fms 발현 정도는 리소자임 및 대식세포-특이 단백질 티로신 포스파타제를 비롯한, 기타 다른 대식 세포-특이 유전자의 발현보다 강하다 (문헌 [HUME, et al. Regulation of CSF-1 Receptor expression. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1, p.46-52.]).

단핵 포식세포 계통의 세포 이외에도, CSF-1R은 또한 여러 많은 유형의 인간 종양에 의해 발현된다. 유방암에서 CSF-1R 발현은 보다 큰 종양 크기 및 생존율 감소와 관련이 있다 (문헌 ([KLUGER, et al. Macrophage colony-stimulating factor-1 receptor expression is associated with poor outcome in breast cancer by large cohort tissue microarray analysis. Clinical cancer research . 2004, vol.10, no.1, p.173-7.]; [SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6.])). 상피성 난소암에서 대다수의 원발 성 종양 및 전이는 CSF-1R을 강하게 발현하고, 전이는 빈번하게는 CSF-1과 CSF-1R을 함께 발현한다. CSF-1R은 또한 종양-침윤성 대식세포에 의해서도 발현된다 (문헌 ([CHAMBERS, et al. Overexpression of epithelial macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) and CSF-1 receptor: a poor prognostic factor in epithelial ovarian cancer, contrasted with a protective effect of stromal CSF-1. Clinical Cancer Research. 1997, vol.3, no.6, p.999-1007.]). 난소암 및 자궁내막암에서는 노던 블롯 분석 결과 대다수의 종양이 CSF-1과 CSF-1R을 함께 발현하는 반면, CSF-1R 발현은 정상적인 자궁내막 조직 샘플에서는 단지 약하게 검출되는 것으로 나타났다 (문헌 [BAIOCCHI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies. Cancer. 1991, vol.67, no.4, p.990-6.]). 자궁경부암종에서 CSF-1R 발현은 정상 자궁내막과 비교하였을 때 종양 기질 및 종양 상피, 둘 모두에서 상향조절되어 있다 (문헌 [KIRMA, et al. Elevated expression of the oncogene c-fms and its ligand, the macrophage colony-stimulating factor-1, in cervical cancer and the role of transforming growth factor-beta1 in inducing c-fms expression. Cancer res.. 2007, vol.67, no.5, p.1918-26.]). 신장 암종에서 고수준의 CSF-1R을 발현하는 종양-관련 대식세포의 침윤은 종양 진행과 관련이 있다 (문헌 [HEMMERLEIN, et al. Expression of acute and late-stage inflammatory antigens, c-fms, CSF-1, and human monocytic serine esterase 1, in tumor-associated macrophages of renal cell carcinomas. Cancer immunology , immunotherapy. 2000, vol.49, no.9, p.485-92.]). CSF-1R은 약 100％ 전립선 상피내 종양 또는 암 샘플에 의해 발현된다 (문헌 [IDE, et al. Expression of colony-stimulating factor 1 receptor during prostate development and prostate cancer progression. Proc. Natl. Acad . Sci . U.S.A.. 2002, vol.99, no.22, p.14404-9.]). CSF-1R 발현은 또한 급성 골수모구 백혈병 및 B-세포 만성 림프성 백혈병에서 검출되었다 (문헌 [RAMBALDI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and c-fms genes in human acute myeloblastic leukemia cells. Journal of Clinical Investigation. 1988, vol.81, no.4, p.1030-5.]).

면역조직화학적 방법 및 동소 혼성화 방법에 의해 수행된 연구에서는 침윤성 유방암 세포에서 CSF-1 발현의 특이성이 입증된 반면, 관내성 또는 비침윤성 종양 세포에서의 상기 CSF-1의 생산은 관찰되지 않았다 ([SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6.]; [TANG, et al. M-CSF (monocyte colony stimulating factor) and M-CSF receptor expression by breast tumour cells: M-CSF mediated recruitment of tumour infiltrating monocytes?. Journal of cellular biochemistry . 1992, vol.50, no.4, p.350-6.])). 침윤성 종양 세포에 의한 CSF-1의 생산은 환자 혈장 중의 그 농도의 증가와 상관관계에 있는데, 상기 농도는 정상 피험체에서는 300 pg/ml 미만인 것과 비교하면 1000 pg/ml를 초과할 수 있다. 높은 혈청 농도는 질환의 진행 단계와 바람직하지 못한 단기간의 예후와 상관관계가 있다 (문헌 ([SCHOLL, et al. Circulating levels of colony-stimulating factor 1 as a prognostic indicator in 82 patients with epithelial ovarian cancer. British journal of cancer. 1994, vol.69, no.2, p.342-6.]; [SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83.])). 또한, CSF-1이 종양 세포의 이동과 침윤을 자극한다는 것인 입증되었다 (문헌 ([DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1, p.186-90.]; [WANG, et al. Induction of monocyte migration by recombinant macrophage colony-stimulating factor. Journal of immunology. 1988, vol.141, no.2, p.575-9.]; [FILDERMAN, et al. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) enhances invasiveness in CSF-1 receptor-positive carcinoma cell lines. Cancer res .. 1992, vol.52, no.13, p.3661-6.])).

CSF-1은 또한 골수성 세포주의 전구체에 화학주성 효과를 미치는데, 이는 종양에서 단핵구의 침윤을 촉진시킨다. 그러나, 면역계에 의한 종양 파괴를 관찰하기에는 상기 단핵구 존재만으로는 충분하지 못하다 (문헌 [DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1, p.186-90.]). 유방 종양, 난소 종양 또는 췌장 종양 환자에서 공통적으로 발견되는 고함량의 혈청내 CSF-1은 이들 단핵구가 가지 세포가 아닌 대식세포로 분화할 수 있게 적응시킴으로써 종양 항원을 제시할 수 있게 하고, 종양 세포에 대하여 지시되는 효율적인 세포독성 면역 반응을 개시할 수 있게 하는 것으로 보인다 (문헌 ([SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83.]; [BARON, et al. Modulation of MHC class II transport and lysosome distribution by macrophage-colony stimulating factor in human dendritic cells derived from monocytes. Journal of cell science . 2001, vol.114, no.pt5, p.999-1010.])).

CSF-1은 또한 파골세포의 증식과 분화에 필수적이다 (문헌 [CECCHINI, et al. Role of CSF-1 in bone and bone marrow development. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1, p.75-83.]). 파골세포는, 주로 골 발생, 항상성 및 수복시에 무기질화된 골을 분해시키는 조혈 전구체로부터 유래하는 것으로서, CSF-1R을 발현하는 다핵 세포이다. 예로서, 골다공증, 악성종양으로 인한 고칼슘혈증, 류마티스 관절염, 종양 전이 및 파제트병과 같은 다양한 골격 질병에 있어서, 파골세포에 의한 골흡수가 골모세포에 의한 골형성을 초과함으로써 골량은 감소하게 되고, 골격 취약증과 골절이 일어나게 된다 (문헌 [BRUZZANITI, et al. Molecular regulation of osteoclast activity. Reviews in endocrine. 2006, vol.7, no.1-2, p.123-39.]). 예를 들면, 진행성 유방암 환자에서는 빈번하게 골로 전이된다. 골로 전이됨에 따라 종양-유도성 골 손실 (골용해)에 기인하는 난치성 동통 및 고도로 위험한 골절이 일어나게 되는데, 이는 파골세포 활성의 증가로 발생하게 되는 것이다 (문헌 [CICEK, et al. Breast cancer bone metastasis and current small therapeutics. Cancer metastasis reviews. 2006, vol.25, no.4, p.635-44.]). 골용해는 고수준의 순환 CSF-1과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [KITAURA, et al. The journal of clinical investigation. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. 2005, vol.115, no.12, p.3418-27.]).

CSF-1 경로는 또한 예로서, 염증성 장 질환과 같은 질환의 간질성 염증을 매개하는데 (문헌 [MARSHALL, et al. Blockade of colony stimulating factor-1 (CSF-1) leads to inhibition of DSS-induced colitis. Inflammatory bowel diseases. 2007, vol.13, no.2, p.219-24.]), 급성 동종이식 거부 동안 대식세포 증식을 매개하는데 (문헌 [JOSE, et al. Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophage proliferation and accumulation in renal allograft rejection. American journal of transplantation. 2003, vol.3, no.3, p.294-300]), 및 감염된 대시세포에서 HIV-1 복제에 (문헌 [KUTZA, et al. Macrophage colony-stimulating factor antagonists inhibit replication of HIV-1 in human macrophages. Journal of immunology . 2000, no.164, p.4955-4960])에 관여한다.

이러한 이유에서, 암 및 골 분해를 치료하기 위한 목적으로 각종 화합물을 이용해서 CSF-1 활성을 저해시키는 것이 제안되어 왔다.

배경 분야

WO 01/30381은 종양 질환 치료용 약제 생산에서 CSF-1 활성의 저해제의 용도에 관한 것이다. CSF-1 활성을 저해시키기 위한 목적으로 제안된 2가지 접근법은 CSF-1의 활성, 그 자체를 억제시키는 것과, CSF-1R의 활성을 억제시키는 것이다. CSF-1 또는 그의 수용체에 대한 중화 항체가 CSF-1 활성의 저해제로서 바람직하다.

WO 03/059395에는 CSF-1 활성을 저해시킬 수 있는 물질, 및 암 치료를 위한 세포독성 활성을 갖는 물질을 포함하는 조합 생성물이 기술되어 있다.

WO 2005/068503에는 CSF-1에 대한 항체를 피험체에게 투여함으로써 골용해, 암 전이 및 암 전이와 관련된 골 손실을 예방 및 치료하는 방법이 개시되어 있다.

EP 1488792 A는 CSF-1R 티로신 키나제 활성을 효과적으로 저해시킴으로써 분화, 증식 또는 매개인자 방출을 선택적으로 저해시키는 것으로 보이는, 모노사이클릭 및/또는 비사이클릭 아릴 또는 헤테로아릴 퀴나졸린 화합물이 용도에 관한 것이다. 상기 출원은 또한 비정상적인 세포 증식을 저해시키는 약제의 제조를 위한 상기 화합물의 용도에도 관한 것이다.

US 2005059113은 aCSF-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 상기 발명은 또한 인간 항-CSF-1 항체 및 그의 항원 결합부에 관한 것이다. 상기 출원 발명은 또한 인간 항-CSF-1 항체를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 사용하는 요전자 요법도 제공한다.

발명의 개시

본 발명은 CSF-1R에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 출원 전역에서 사용되는 바, "하나("a" 및 "an")라는 용어는 문맥상 달리 명확하게 언급하지 않는 한, "적어도 하나," "적어도 제1," "하나 이상" 또는 "복수개의" 언급한 성분 또는 단계를 의미한다는 개념으로 사용된다. 예를 들면, "하나의 세포"라는 용어는 그의 혼합물을 비롯한 복수개의 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 경우, "및/또는"이라는 용어는 "및," "또는," 및 "상기 용어로 연결되어 있는 요소들 모두 또는 그의 임의의 기타 다른 조합"을 의미하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 20％ 이내, 바람직하게는 10％ 이내, 및 더욱 바람직하게는 5％ 이내에 포함된다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "~을 포함하는" 및 "~을 포함한다"라는 용어는 부품으로 구성된 키트, 생성물, 조성물 및 방법이 기타 다른 것을 제외하는 것은 아니면서, 언급한 성분 또는 단계를 포함한다는 것을 의미하는 것으로 한다. 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우, "본질적으로 ~로 구성된"이라는 것은 임의로 본질적인 중요성을 갖는 기타 다른 성분 또는 단계는 제외시키는 것을 의미하여야 한다. 따라서, 본질적으로 열거된 성분으로 구성된 조성물은 미량의 오염물질 및 제약상 허용되는 담체는 제외시키지 않을 것이다. "~로 구성된"이라는 것은 기타 다른 성분 또는 단계 중 다량의 미량 성분을 제외시키는 것을 의미하여야 한다.

본원에서 사용되는 바, "~에 특이적으로 결합한다"라는 용어는 단백질 및 기타 다른 생물 물질로 구성된 이종성 군집의 존재하에 표적 단백질이 존재하는지를 결정지어 주는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 분석 조건하에서 본 발명에 따른 항체는 우선적으로 CSF-1R의 적어도 일부에 결합을 하지만, 시험 샘플 중에 존재하는 기타 다른 성분에는 유의적인 양으로 결합하지는 않는다. 본 발명에 따른 항체와 CSF-1R 표적 사이의 특이적인 결합이란 결합 친화성이 적어도 10³ M^-1, 및 바람직하게 10⁵ M^-1, 10⁶ M^-1, 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1 또는 10¹⁰ M^-1인 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "CSF-1R"이라는 용어는 인간 CSF1 수용체를 의미한다. 인간 CSF-1 수용체의 서열은 분석되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열 번호: 29에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "항체" 또는 "Ab"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 그러므로, "항체" 또는 "Ab"는 천연적으로 생성된 것이거나, 합성된 것일 수 있고, 예로서는, 통상의 하이브리도마 기술, 재조합 기술에 의해 생산된 모노클로날 항체 (mAb) 또는 그의 기능적 단편일 수 있다. 본 발명의 항체는 온전한 면역글로불린 분자, 예를 들면, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 동물 항체 (예로서, 카멜화된 항체), 키메라 항체 뿐만 아니라, 예를 들면, 경쇄가 없는 면역글로불린 (예를 들면, US 6,005,079 참조), Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, 항체 단편, 디아바디, Fd, CDR 영역 또는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 임의의 일부분 또는 펩티드 서열과 같이, (예로서, 제한하는 것은 아니지만, 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기법과 같은 임의의 공지 기법에 의해 제공되는) 항체의 일부분, 단편, 영역, 펩티드 및 유도체, 이 둘 모두를 포함하는 의미를 갖는다. 항체가 분자와 특이적으로 반응함으로써 상기 분자가 항체에 결합할 수 있게 되다면, 여기서, 항체를 분자에 "결합할 수 있는 것"으로 본다. 항체 단편 또는 일부분은 온전한 항체의 Fc 단편이 포함하지 않을 수 있고, 온전한 항체보다 더욱 빠르게 순환으로부터 제거될 수 있고, 비특이적인 조직 결합을 온전한 항체보다 덜 할 수 있다. 일례의 항체들은 효소, 예로서, 예로서, 파파인 (Fab 단편 생산) 또는 펩신 (F(ab')₂ 단편 생산)을 사용하는 단백분해성 절단과 같이 당업계에 주지된 방법을 사용하여 온전한 항체로부터 생산될 수 있다. 예로서, 문헌 [Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983)]을 참조할 수 있다. 항체의 일부분은 상기 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 분자의 일부분을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 재조합 항체의 CDR 영역(들)은 단리될 수 있고, 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "가변 영역"이라는 용어는 결합, 인식, 특이성에 대한 결정인자를 포함하는 경쇄 (VL) 또는 중쇄 (VH)의 가변 영역 또는 도메인을 의미하는 것이다. 가변 도메인은 항원 인식에 관여하고, 항원 결합 부위를 형성한다. 본원에서 사용되는 바, "프레임워크 영역"이라는 용어는 같은 종의 다른 항체 간에 적어도 85％의 상동성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 부위 (즉, CDR 이외의 영역 부위)를 의미하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, "상동성"이라는 용어는, 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 (문헌 [SMITH, et al. Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology. 1981, no.147, p.195-7.])을 사용하여 정렬하였을 때에 동일한 아미노산을 대략 명시된 비율로 갖는 것인, 두 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 간의 비교를 의미하는 것이다. 예를 들면, "85％ 상동성"이라는 것은, 최적으로 정렬하였을 때에 85％의 아미노산 동일성을 갖는 것인, 두 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 간의 비교를 의미하는 것이다. 카바트(Kabat) 데이타베이스 (문헌 [Kabat et al., op. cit])에서 정의된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘 모두는 3개의 초가변 서열 신장부 또는 상보성 결정 영역 (CDR)이 중간에 끼어 있는 4개의 프레임워크 서브영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 포함하는 세그먼트로 나누어질 수 있는데, 이에 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치하고 있다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 서브영역을 구체적으로 언급하지 않고, 다른 경우에서 언급되는 바와 같이 프레임워크 영역은 단일의 천연적으로 발생된 면역글로불린 쇄 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 하나의 FR은 4개의 서브영역 중 하나를 나타내며, FR은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 서브영역 중 2개 이상을 나타낸다. 다른 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서는 상대적으로 보존성을 띤다. 항체의 프레임워크 영역은 구성적 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역이고, 이는 CDR의 위치를 정하고 정렬시키는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합 특이성과 친화성을 부여하면서, 항체의 결합 부위를 형성하는 역할을 담당한다. 특이성이 다른 항체 간에는 극도의 가변성을 나타나기 때문에 항원 결합 영역에 제공되는 H 또는 L 쇄의 가변 영역 내에 보다 작은 서열인 더빙된 "초가변부"가 존재하게 된다. 그러한 초가변 영역은 또한 "상보성 결정 영역"으로서도 지칭된다. 이들 CDR 영역이 특정 항원 결정 구조에 대하여 항체가 갖는 기본적인 특이성의 원인이 된다. CDR은 가변 영역 내의 비-인접 아미노산 신장부를 나타내지만, 종과는 상관없이, 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내에 존재하는 이들 중요한 아미노산 서열의 위치적 장소는 가변 쇄의 아미노산 서열 내에서 유사한 장소를 갖는 것으로 밝혀졌다. 모든 항체의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR 영역을 갖는데, 이들 각각은 각 경쇄 (L) 및 중쇄 (H)에 대해 다른 것 (L1, L2, L3, H1, H2, H3으로 명명)과 서로 비-인접해 있다. 용인된 CDR 영역은 문헌 [Kabat et al, 252 J. Biol. Chem. 6609-16 (1977)]에 기재되어 있고, CDR 루프는 선형 아미노산 서열을 조사하는 동안 상기 방식을 적용시킴으로써 확인할 수 있다. CDR-H3 루프를 정의하는 방식은 달라질 수 있지만 (문헌 [Chapter 4, Antibody Engineering: Methods & Protocols, (Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2004] 참조), 몇몇 CDR-H3 루프의 실제 경계에 대해서는 예로서, 원편광 이색성 분광 측정법, 핵 자기 공명법 또는 X선 결정학적 방법과 같은 실험적 기법없이는 확인할 수가 없을 수도 있다. 모든 포유동물 종에서 항체 펩티드는 불변 영역 (즉, 고도로 보존적인 영역) 및 가변 영역을 포함하며, 가변 영역 내에는 CDR과, 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 중에 포함되어 있되 CDR 밖의 아미노산 서열로 구성된 소위 "프레임워크 영역"이라는 영역이 존재한다. CDR 영역은 또한 코티아(Chothia) 명명법 (문헌 [CHOTHIA and LESK. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (1987) J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17])의 사용으로도 정의될 수 있다. 그러므로, 특정 실시태양에서의 CDR은 카바트로 정의된 CDR이고, 다른 실시태양에서의 CDR은 코티아로 정의된 CDR이다. 항체의 CDR 영역에 의해 인식되는 항원 결정기에 관하여, 이는 또한 "에피토프"로도 지칭된다. 다시 말해, 에피토프란 항체가 인식할 수 있고, 결합할 수 있는 임의의 분자 부위를 의미하는 것이다 (상응하는 항체 결합 영역은 파라토프로 지칭될 수 있다). 일반적으로, 에피토프는 분자, 예를 들면, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은, 화학적으로 활성인 표면 기로 구성되어 있고, 특이적인 3차원적 구조상의 특징과 특이적인 전하적 특징을 갖는다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체" 또는 "mAb"라는 용어는 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 예로서, 문헌 ([HARLOW. Antibodies: A Laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor: Laboratory press, 1988] 및 [HAMMERLING, et al. Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas. New York: Elsevier, 1981. p.563-681])에 개시되어 있는 것과 같은 하이브리도마 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "인간 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 것이거나, 그와 매우 유사하게 매치를 이루는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해서는 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예로서, 시험관내 무작위 또는 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "인간 항체"라는 용어는 실질적으로 단백질 모든 부분이 인간 생식계열 항체와 실질적으로 유사한 항체를 의미한다. "실질적으로 유사하다"라는 것은 인간 생식계열 항체의 핵산 서열과 적어도 80, 바람직하게 85, 더욱 바람직하게 90 및 더욱더 바람직하게 95％ 상동성인 핵산 서열을 갖는 항체를 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "Fab"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하며, 결합 활성을 보이는 항체 분자의 영역을 의미하는 것이다. "Fab"는 응집을 통해서도 특정 항원 또는 항체 패밀리와 선택적으로 반응할 수만 있다면, 공유적으로 또는 비공유적으로 응집되었는지와는 상관없이, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄로 이루어진 응집체 (보통 Fab로서 알려져 있다)를 포함한다. Fab 단편은 VL, 및 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체이다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 Fab' 단편이다. Fab' 단편은 항체 "힌지 영역"으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 수개의 잔기를 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 포함하고 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다.

"F(ab')₂"는 항체의 펩신 처리로 수득되는 항체 단편 또는 기타 다른 기법, 예로서, 재조합 기술을 통해 수득되는 등가의 단백질을 의미한다. F(ab')₂ 단편은 2개의 항원-결합부를 갖고, 여전히 항원과 가교결합할 수 있다 .

"Fv"는 하나의 완전한 항원 인식 결합부를 포함하는 최소의 항체 단편이다. 이 영역은 매우 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 결합되어진 이량체로 구성된다. 각 가변 도메인에 있는 3개의 CDR이 상호작용하여 VH VL 이량체의 표면 상에 있는 항원 결합부를 정의하는 입체형상 구조를 갖는다. 종합하면, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여하는 것이다. 그러나, 전체 결합부보다는 친화성이 낮기는 하지만, 단일의 가변 도메인 조차도 (또는 항원에 특이적인 오직 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반부) 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"는 단일의 폴리펩티드 쇄로 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게, scFv는 추가로 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 VH와 VL 도메인 사이에 포함한다 (문헌 [LENNARD. Standard protocols for the construction of scFv libraries. Methods in molecular biology. 2002, no.178, p.59-71.]).

본원에서 사용되는 바, "항체 단편"이라는 용어는 CSF-1R에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는, 항체의 하나 이상의 단편을 의미하는 것이다.

"디아바디"라는 용어는 같은 폴리펩티드 쇄 (VH VL)에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 것인, 2개의 항원-결합부를 갖는 작은 항체 단편을 의미하는 것이다. 같은 쇄 상에 있는 두 도메인 사이에서 쌍이 형성되게 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 또다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하고 2개의 항원-결합부를 생성할 수 있도록 한다. 디아바디는 1개 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 디아바디에 대해서 문헌 ([POLJAK. Production and structure of diabodies. Structure. 1994, vol.2, no.12, p.1121-3.], [HUDSON, et al. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of immunological methods. 1999, vol.231, no.1-2, p.177-89] 및 [KIPRIYANOV. Generation of bispecific and tandem diabodies. Methods in molecular biology . 2002, no.178, p.317-31])에 보다 상세하게 설명되어 있다.

항체 단편 생산을 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백분해성 소화를 통해 유래되었다. 그러나, 이러한 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편 모두 E. 콜라이(E. coli)에서 발현될 수 있고, 그로부터 분비될 수 있는 바, 이를 통해 상기 단편들을 다량으로 생산할 수 있다. 항체 단편을 생산하는 기법은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에서, 최상의 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다.

본원에서 사용되는 바, "도메인 항체" (dAb)는 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 중 어느 하나의 가변 영역에 상응하는, 항체의 최소 기능적 결합 단위에 있다. 도메인 항체의 분자량은 대략 13 kDa이거나, 그 크기는 전장 항체의 1/10 미만이다.

본원에서 사용되는 바, "Fd"는 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미한다.

"항체" 또는 "Ab"라는 용어는 또한 예를 들면, 문헌 ([HOLLIGER, et al. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature biotechnology. 2005, vol.23, no.9, p.1126-36] 및 [HOOGENBOOM, et al. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunology today. 2000, vol.21, no.8, p.371-8])에 기재되어 있는 것과 같은, 당업자에게 주지되어 있는 기타 다른 항체 단편도 의미한다.

하나의 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

(i) 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열, 서열 번호: 2의 66번 위치에서 출발하여 87번 위치에서 끝나는 서열 또는 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 것인 적어도 하나의 CDR; 또는

(ii) 서열 번호: 4의 44번 위치에서 출발하여 56번 위치에서 끝나는 서열, 서열 번호: 4의 66번 위치에서 출발하여 76번 위치에서 끝나는 서열 또는 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 것인 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

- 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 2의 66번 위치에서 출발하여 87번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 4의 44번 위치에서 출발하여 56번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 4의 66번 위치에서 출발하여 76번 위치에서 끝나는 서열, 또는

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2, 3, 4 또는 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

(iii) - 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2개 및 더욱더 바람직하게는 3개의 CDR을 포함하거나,

(iv) - 서열 번호: 4의 44번 위치에서 출발하여 56번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열의 적어도 5개의 연속되는 아미노산을 포함하는 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2개 및 더욱더 바람직하게는 3개의 CDR을 포함한다.

(i) - 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 2의 66번 위치에서 출발하여 87번 위치에서 끝나는 서열, 및

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 CDR, 또는

(ii) - 서열 번호: 4의 44번 위치에서 출발하여 56번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 4의 66번 위치에서 출발하여 76번 위치에서 끝나는 서열, 및

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2, 3, 4 또는 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

(iv) - 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2개 및 더욱더 바람직하게는 3개의 CDR, 또는

- 서열 번호: 4의 66번 위치에서 출발하여 76번 위치에서 끝나는 서열,

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택되는 2개 및 더욱더 바람직하게는 3개의 CDR을 포함한다.

하나의 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 11, 12 또는 13 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 2, 3, 4, 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 11, 12 또는 13 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 어느 하나에 기재되어 있는 2, 3, 4 또는 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 17, 18 또는 19 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 2, 3, 4, 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 17, 18 또는 19 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 어느 하나에 기재되어 있는 2, 3, 4, 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 23, 24 또는 25 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 2, 3, 4, 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 23, 24 또는 25 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR; 또는 (ii) 서열 번호: 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재된 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 중 어느 하나에 기재되어 있는 2, 3, 4, 5개 및 더욱더 바람직하게는 6개의 CDR을 포함한다.

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 11, 12, 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 17, 18, 및 19에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 23, 24, 및 25에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 26, 27, 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 가변 영역은 추가로 1개, 더욱 바람직하게는 2개, 더욱더 바람직하게는 3개, 및 확실히 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역, 및 더욱 바람직하게는 인간 FR을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "인간 FR"은 천연적으로 발생된 인간 항체의 프레임워크 영역과 적어도 75％ 상동성인 프레임워크 영역이다.

하나의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

더욱 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 6에 기재된 것인 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

또다른 더욱 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 9에 기재된 것인 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 2개의 가변 영역을 포함하며, 여기서 가변 영역은

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 가변 영역;

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 가변 영역;

(ii) 서열 번호: 11, 12, 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역;

(iii) 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역;

(iv) 서열 번호: 17, 18, 및 19에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역;

(v) 서열 번호: 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역;

(vi) 서열 번호: 23, 24, 및 25에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역; 및

(vii) 서열 번호: 26, 27 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역으로 이루어진 군에서 서로로부터 독립적으로 선택된다.

(i) - 서열 번호: 2의 45번 위치에서 출발하여 54번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR,

- 서열 번호: 2의 66번 위치에서 출발하여 87번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR, 및

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 제1 가변 영역; 및

(ii) - 서열 번호: 4의 44번 위치에서 출발하여 56번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR,

- 서열 번호: 4의 66번 위치에서 출발하여 76번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR, 및

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 제2 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 11, 12, 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 17, 18, 및 19에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 23, 24, 및 25에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 26, 27 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 6에 기재된 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 9에 기재된 가변 영역을 포함한다.

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 11, 12, 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 17, 18, 및 19에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호: 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 23, 24, 및 25에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 번호: 26, 27, 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, (i) 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, scFv이되, 여기서, 상기 scFv는

- 서열 번호: 2의 117번 위치에서 출발하여 126번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 26, 27, 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함한다.

더욱 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, scFv이되, 여기서, 상기 scFv는

(i) 서열 번호: 6에 기재된 가변 영역 및

(ii) 서열 번호: 9에 기재된 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 11, 12, 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 17, 18, 및 19에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 23, 24, 및 25에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

(ii) 서열 번호: 26, 27, 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

(i) 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 가변 영역 및

(ii) 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

더욱더 바람직한 실시태양에서, 서열 번호: 6 및 9에 기재된 아미노산 서열 내에 있는 적어도 하나의 아미노산이 (표 1 및 표 2에 따라) 치환되어 있는 것인 scFv를 제공한다. 확실히 바람직한 실시태양에서, 서열 번호: 6 및 9에 기재된 아미노산 서열 내의 표 1 및 표 2에 제시되어 있는 아미노산 모두가 (표 1 및 표 2에 따라) 치환되어 있는 것인 인간 항체를 제공한다.

또다른 바람직한 실시태양에서 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 2에 기재된 중쇄를 포함한다.

또다른 바람직한 실시태양에서 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 4에 기재된 경쇄를 포함한다.

더욱 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 2에 기재된 중쇄 및 서열 번호: 4에 기재된 경쇄를 포함한다.

더더욱 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 CSF-1R에 특이적으로 결합하고, 서열 번호: 2에 기재된 중쇄 2개 및 서열 번호: 4에 기재된 경쇄 2개를 포함한다. 이러한 특정 항체를 본 출원 전역에서 CXIIG6으로 명명할 것이다.

또다른 바람직한 실시태양에서 따라, 본 발명은 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

- 서열 번호: 4의 109번 위치에서 출발하여 117번 위치에서 끝나는 서열에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

(ii) 서열 번호: 14, 15, 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이다.

(ii) 서열 번호: 20, 21, 및 22에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이다.

(ii) 서열 번호: 26, 27, 및 28에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명은 CSF-1R에 특이적으로 결합하고,

(i) 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 가변 영역, 및

(ii) 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이다.

더욱 바람직한 실시태양에서, 서열 번호: 6 및 9에 기재된 아미노산 서열 내에 있는 적어도 하나의 아미노산이 (표 1 및 표 2에 따라) 치환되어 있는 것인 인간 항체를 제공한다. 더욱더 바람직한 실시태양에서, 서열 번호: 6 및 9에 기재된 아미노산 서열 내의 표 1 및 표 2에 제시되어 있는 아미노산 모두가 (표 1 및 표 2에 따라) 치환되어 있는 것인 인간 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항체, 더욱 특히, 인간 항체는 상이한 이소형, 예로서, IgG, IgA, IgM 또는 IgE의 것일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체, 더욱 특히, 인간 항체는 IgG이다.

관련된 실시태양에서, 인간 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 변형된 또는 비변형된 불변 영역을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 불변 영역은 인간 IgG1 또는 IgG4이며, 이는 특정의 특성을 증진 또는 감소시키기 위해 임의로 변형될 수 있다.

IgG1의 경우, 불변 영역, 특히, 힌지 또는 CH2 영역에 대한 변형은 ADCC 및/또는 CDC 활성을 비롯한 효과기 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, IgG2 불변 영역은 항체-항원 응집체 형성을 감소시키기 위해 변형된다. IgG4의 경우, 불변 영역, 특히, 힌지 영역에 대한 변형은 항체의 절반부가 형성되는 것을 감소시킬 수 있다.

항체 중 하나 이상의 아미노산이 돌연변이화되더라도 원하는 결합 친화성은 유지될 수 있다. 이러한 변이체에서는 항체 내의 적어도 하나의 아미노산가 다른 잔기로 치환되어 있다. 또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 CDR(들)에 포함되어 있는 아미노산 중 적어도 하나가 보존적으로 치환된, 상기 기술된 바와 같이 CSF1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 보존적 치환에 대해서는 표 3에 제시되어 있다.

본 발명은 또한 친화성 돌연변이에 의해 본 발명의 항체를 변형시키는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "친화성 돌연변이"란, 치환을 통해서 CSF-1R에 대한 항체의 친화성이 그러한 치환(들)을 포함하지 않는 모체 항체에 비해 개선되는 것인, 하나 이상의 CDR에 포함되어 있는 하나 이상의 아미노산의 치환을 의미하는 것이다. 친화성 돌연변이 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 ([MARKS, et al. By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology . 1992, vol.10, no.7, p.779-83.]; [BARBAS, et al. In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, vol.91, no.9, p.3809-13.]; [SCHIER. identification of functional and structural amino-acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene. 1996, vol.169, no.2, p.147-55.]; [YELTON. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma antibody by codon-based mutagenesis. J. Immunol.. 1995, vol.155, no.4, p.1994-2004.]; [JACKSON, et al. In vitro antibody maturation. Improvement of a high affinity, neutralizing antibody against IL-1 beta. J. immunol. 1995, vol.154, no.7, p.3310-9]. 및 [HAWKINS, et al. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of molecular biology . 1992, vol.226, no.3, p.889-96])에 개시되어 있는 방법을 참조한다.

본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 친화성 돌연변이에 의해 수득된, CSF-1R에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 기술된 항체의 아미노산 서열과 적어도 80％, 바람직하게 적어도 85％, 더욱 바람직하게 적어도 90％, 및 더욱더 바람직하게 적어도 98％ 상동성인 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 기술된 항체의 변이체를 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 1 초과의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체는 CSF-1R의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 본 발명에 따른 항체는 CSF-1R 및 또다른 분자에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 1 초과의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 가교 결합된 항체일 수 있다. 예를 들면, 하나의 항체는 아비딘에, 나머지 한 항체는 비오틴에 커플링될 수 있다. 가교 결합된 항체는 당업계에 주지되어 있는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기법 또한 예를 들면, 문헌 ([BRENNAN, et al. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science . 1985, vol.229, no.4708, p.81-3.] 및 [SHALABY, et al. Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. The Journal of experimental medicine . 1992, vol.175, no.1, p.217-25], [KOSTELNY, et al. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. Immunol.. 1992, vol.148, no.5, p.1547-33.])에 기재되어 있다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른, 1 초과의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 디아바디이다.

또다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른, 1 초과의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 문헌 [ZAPATA, et al. Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein engineering. 1995, vol.8, no.10, p.1057-62.]에 기재되어 있는 것과 같은 선형 항체이다.

본 발명에 따른 항체는 글리코실화되거나, 비-글리코실화될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "글리코실화"라는 용어는 항체에 공유 결합된 당질 유닛이 존재한다는 것을 의미하는 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 방사선감작제, 수용체 및/또는 세포독성제에 접합된다.

본원에서 사용되는 바, "방사선감작제"라는 용어는 세포를 방사선 요법에 대하여 더욱 감작화시키는 분자를 의미한다. 방사선감작제로는 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘 (BUdR), 5-요오도데옥시우리딘 (IUdR), 브로모데옥시시티딘, 플루오로데옥시우리딘 (FUdR), 하이드록시우레아 및 시스플라틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "수용체"라는 용어는 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 수용체는 비오틴이다.

본원에서 사용되는 바, 세포독성제라는 용어는 세포에 대해 직접적으로 독성을 띠며, 이를 통해 세포의 재생산 또는 성장을 방해하는 화합물을 의미한다. 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명과 관련하여 사용되는 세포독성제는 암 치료제, 독소 (예로서, 세균, 진균, 식물 또는 동물로부터 기원된, 효소적으로 활성을 띠는 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소를 포함하는 군으로부터 선택된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 표지화제에 접합된다.

본원에서 사용되는 바, "표지화제"는 검출가능한 화합물을 의미한다. 표지화제는 그 자체에 의해서 (예로서, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)에 의해 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물의 화학적 변형을 촉매화시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "접합된"이라는 용어는 본 발명에 따른 항체와 표지화제가 공유 또는 비공유적으로 결합되어 있는 것을 의미한다.

"공유 결합"이란 임의로는 가교결합제 또는 기타 다른 활성화제를 중간에 사용하여 반응성 관능기를 통해 이루어지는 커플링을 의미한다 (예를 들면, 문헌 [HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996.] 참조). 본 발명에 따른 항체 및/또는 접합된 물질은 예를 들면, 활성화된 카르보닐기 (동소의 활성화된 것 포함) 상에서의 또는 이미도에스테르 상에서의 치환을 통해, 불포화된 카르보닐기 상에서의 첨가를 통해서, 환원적 아미드화에 의해, 포화된 탄소 원자 또는 헤테로원자 상에서의 친핵성 치환에 의해, 방향족 사이클 상에서의 반응에 의해 그들이 커플링할 수 있도록 변형될 수 있다. 특히, 동종이기능성 또는 이종이기능성 가교결합제를 사용함으로써 커플링을 수행할 수 있다. 글루타르알데히드, 숙신산 및 DMS (디메틸 수베르이미데이트)와 같은 비스-이미도에스테르를 비롯한, 동종이기능성 가교결합제는 각종 부분 상에 존재할 수 있는 아민기를 커플링시키는 데 사용될 수 있다. 다수의 일례가 문헌 [HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.118-228]에 제공되어 있으며, 이들은 당업자에게 주지되어 있다. 이종이기능성 가교결합제로는 아민 반응기와 설프하이드릴 반응기 둘 모두, 카르보닐 반응기와 설프하이드릴 반응기 둘 모두, 및 설프하이드릴 반응기와 광반응성 링커 둘 모두를 갖는 가교결합제를 포함한다. 적합한 이종이기능성 가교결합제는 예를 들면, 문헌 [HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.229-285.]에 기재되어 있다. 그 예로는 예를 들면, SPDP (N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SMBP (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), SMPT (숙신이미딜옥시카르보닐-메틸-(-2-피리딜디티오)톨루엔), MBS (m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르), SIAB (N-숙신이미딜 (4 요오도아세틸) 아미노벤조에이트), GMBS (γ-말레이미도부티릴옥시) 숙신이미드 에스테르), SIAX (숙신이미딜-6-요오도아세틸 아미노 헥소네이트, SIAC (숙신이미딜-4-요오도아세틸 아미노 메틸), NPIA (p-니트로페닐 요오도아세테이트)가 있다. 기타 다른 예는 당질-함유 분자 (예로서, env 당단백질, 항체)를 설프하이드릴 반응기에 커플링시키는 데 유용하다. 예로는 MPBH (4-(4-N 말레이미도페닐) 부티르산 히드라지드) 및 PDPH (4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실-히드라지드 (M2C2H 및 3-2(2-피리딜디티오)프로프리오닐 히드라지드)를 포함한다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

"핵산 서열"이라는 용어는 선형의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 뉴클레오티드는 선형의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두의 혼합물이다. 본 발명과 관련하여 폴리뉴클레오티드의 예로는 싱글 및 더블 스트랜드 DNA, 싱글 및 더블 스트랜드 RNA, 및 싱글 및 더블 스트랜드 DNA 및 RNA의 혼합물, 둘 모두를 갖는 하이브리드 분자를 포함한다. 추가로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 핵산 서열은 벡터에 포함된다.

벡터는 플라스미드 또는 바이러스 기원인 것일 수 있고, 적절하다면, 벡터의 형질감염 효율 및/또는 안정성을 개선시키는 하나 이상의 물질과 조합될 수 있다. 이러한 물질은 당업자가 이용할 수 있는 문헌에 널리 기재되어 있다 (예를 들면, 문헌 ([FELGNER, et al. Cationic liposome mediated transfection. Proceedings of the Western Pharmacology Society . 1989, vol.32, p.115-21.]; [HODGSON, et al. Virosomes: cationic liposomes enhance retroviral transduction. Nature biotechnology. 1996, vol.14, no.3, p.339-42.]; [REMY, et al. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. Bioconjugate chemistry. 1994, vol.5, no.6, p.647-54.])). 비제한적인 예로서, 상기 물질은 중합체, 지질, 특히 양이온성 지질, 리포좀, 핵 단백질 또는 중성 지질일 수 있다. 이러한 물질은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 구현될 수 있는 조합물은 양이온성 지질 (DOGS, DC-CHOL, 스퍼민-chol, 스퍼미딘-chol 등), 리소인지질 (예를 들면, 헥사데실포스포콜린) 및 중성 지질 (DOPE)과 조합된 재조합 플라스미드 벡터 조합물이다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 사용될 수 있는 양이온성 지질은 EP 901463 B에 기재되어 있는 양이온성 지질, 및 더욱 바람직하게 pcTG90이다.

본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 플라스미드들의 선택은 매우 방대하다. 이는 클로닝 벡터 및/또는 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 이 벡터들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 벡터들이 상업적으로 입수가능하지만, 또한 유전적 조작 기법을 사용함으로써 이들 벡터를 작제하거나 변형시킬 수도 있다. 그 예로는 pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (스트라테이진(Stratagene)), pREP4, pCEP4 (인비트로겐(Invitrogene)) 또는 pPoly (문헌 [LATHE, et al. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts. Gene. 1987, vol.57, no.2-3, p.193-201.])로부터 유래한 플라스미드들이 언급될 수 있다. 바람직하게, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 플라스미드는 생산자 세포 및/또는 숙주 세포에서 복제의 개시를 유도하는 복제 기점을 포함한다 (예를 들면, ColE1 원점은 E. 콜라이에서 생산시키고자 하는 플라스미드를 위해 선택될 수 있고, oriP/EBNA1 시스템은 포유동물 숙주 세포에서 자가-복제하는 플라스미드가 요구되는 경우 선택될 수 있다, 문헌 ([LUPTON, et al. Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitate extrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived plasmids in human cells. Molecular and cellular biology . 1985, vol.5, no.10, p.2533-42.]; [YATES, et al. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 1985, vol.313, no.6005, p.812-5.])). 플라스미드는 추가로 형질감염된 세포가 선별되거나 확인될 수 있도록 하는 선별 유전자를 포함할 수 있다 (영양요구 돌연변이의 상보, 항생제에 대한 내성을 코딩하는 유전자 등). 천연적으로 플라스미드는 주어진 세포에서 세포의 유지 및/또는 안정성을 개선시켜 주는 추가의 요소를 포함할 수 있다 (플라스미드가 단량체 형태로 유지되는 것을 증진시켜 주는 cer 서열 (문헌 [SUMMERS, et al. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 1984, vol.36, no.4, p.1097-103.]), 세포 내로의 통합을 위한 서열).

바이러스 벡터와 관련하여, 폭스바이러스 (백시니아 바이러스, 특히, MVA, 카나리폭스바이러스 등)로부터, 아데노바이러스로부터, 레트로바이러스로부터, 헤르페스바이러스로부터, 알파바이러스로부터, 거품 형성 바이러스로부터 또는 아데노바이러스-관련 바이러스로부터 유래한 벡터가 구현될 수 있다. 복제 가능 또는 복제 불능 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 비통합형 벡터를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이와 관련하여, 특히 본 발명을 실행하는데 아데노바이러스 벡터 및 폭스바이러스 및 더욱 바람직하게 백시니아 바이러스 및 MVA로부터 유래된 벡터가 매우 적합하다.

바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)로부터 유래된다. MVA 벡터 및 상기 벡터를 생산하는 방법은 유럽 특허 EP 83286 A 및 EP 206920 A 뿐만 아니라, 문헌 [SUTTER, et al. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A.. 1992, vol.89, no.22, p.10847-51.]에 상세히 기재되어 있다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 핵산 서열은 MVA 벡터의 결실부 I, II, III, IV, V 및 VI, 및 더욱더 바람직하게는, 결실부 III에 삽입될 수 있다 (문헌 ([MEYER, et al. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. The Journal of general virology . 1991, vol.72, no. Pt5, p.1031-8.]; [SUTTER, et al. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine. 1994, vol.12, no.11, p.1032-40.])).

레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 특성, 및 대개의 경우에는 분열 세포에 통합할 수 있는 특성을 가지며, 이러한 점은 암과 관련하여 사용하기에 특히 적절하다. 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스는 일반적으로 LTR 서열, 캡시드화 영역 및 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이 뉴클레오티드 서열은 레트로바이러스 LTR의 제어하에 또는 예로서, 하기 기술하는 것과 같은 내재 프로모터의 제어하에 배치된다. 재조합 레트로바이러스는 임의 기원 (뮤린, 영장류, 고양이, 인간 등)의 레트로바이러스로부터, 및 특히 MoMuLV (몰로니 뮤린 백혈병 바이러스), MVS (뮤린 육종 바이러스) 또는 프렌드(Friend) 뮤린 레트로바이러스 (Fb29)로부터 유래될 수 있다. 바이러스 입자를 구성하는데 필요한 바이러스 폴리펩티드인 gag, pol 및/또는 env를 트랜스로 공급할 수 있는 캡시드화 세포주에서 증식하게 된다. 상기와 같은 세포주는 문헌에 기재되어 있다 (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 등). 본 발명에 따른 레트로바이러스 벡터는 특히, LTR (프로모터 영역을 진핵세포 프로모터로 대체)에 또는 캡시드화 영역 (이종성 캡시드화 영역, 예를 들면, VL3O형으로 대체) (US 5747323 참조)에 변형을 포함할 수 있다.

숙주 유기체 또는 환경 내에서 벡터가 증식하지 못하도록 하기 위해, 복제에 필수적이고, E1, E2, E4 및 L1-L5 영역으로부터 선택되는 적어도 하나의 영역 모두 또는 그 일부가 없는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직할 것이다. E1 영역의 결실이 바람직하다. 그러나, 상보성 세포주 및/또는 헬퍼 바이러스를 수단으로 하여 결손된 필수 기능이 트랜스로 상보되는 정도까지 특히 E2, E4 및/또는 L1-L5 영역 모두 또는 그 일부에 영향을 줄 수 있는 다른 (또다른) 변형(들)-/결실(들)과 조합될 수 있다. 이러한 점에서, 제2 세대의 최첨단 벡터를 사용할 수 있다 (예를 들면, 국제 출원 WO 94/28152 및 WO 97/04119 참조). 일례로, 특히 E1 영역 및 E4 전사 유닛의 주요부를 결실시키는 것이 매우 이롭다. 클로닝 능력을 증가시키기 위한 목적으로 비필수 E3 영역 모두 또는 그 일부를 추가로 아데노바이러스 벡터에서 제거할 수 있다. 또다른 대안에 따라, 캡시드화에 필수적인 서열, 즉, 5' 및 3' ITR (역위 말단 반복부), 및 캡시드화 영역을 보유하는 최소의 아데노바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 다양한 아데노바이러스 벡터, 및 이러한 벡터를 제조하는 기법이 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [GRAHAM, et al. Methods in molecular biology. Edited by MURREY. The human press inc, 1991. p.109-128.] 참조).

추가로, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터의 기원은 종의 관점으로부터 및 형청형의 관점, 이 둘 모두로부터 달라질 수 있다. 벡터는 인간 또는 동물 (개, 조류, 소, 뮤린, 양, 돼지, 원숭이 등) 기원의 아데노바이러스의 게놈으로부터 또는 적어도 2개의 상이한 기원을 갖는 아데노바이러스 게놈 단편을 포함하는 하이브리드로부터 유래될 수 있다. 더욱 특히, 개 기원의 CAV-1 또는 CAV-2 아데노바이러스, 조류 기원의 DAV 아데노바이러스 또는 소 기원의 Bad 3형 아데노바이러스를 언급할 수 있다 (문헌 ([ZAKHARCHUK, et al. Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Archives of virology. 1993, vol.128, no.1-2, p.171-6.]; [SPIBEY, et al. Molecular cloning and restriction endonuclease mapping of two strains of canine adenovirus type 2. The Journal of general virology. 1989, vol.70, no.Pt 1, p.165-72.]; [JOUVENNE, et al. Cloning, physical mapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2 genomes. Gene. 1987, vol.60, no.1, p.21 -8.]; [MITTAL, et al. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. The Journal of general virology. 1995, vol.76, no. Pt 1, p.93-102.])). 그러나, 바람직하게 혈청형 C-아데노바이러스, 특히, 2형 또는 5형 혈청형 C 아데노바이러스로부터 유래된, 인간 기원의 아데노바이러스 벡터가 바람직할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "복제 가능"이라는 용어는 임의의 트랜스-상보없이도 숙주 세포에서 복제할 수 있는 바이러스 벡터를 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 복제 가능 벡터는 복제 가능 아데노바이러스 벡터이다. 이러한 복제 가능 아데노바이러스 벡터는 당업자에게 주지되어 있다. 이중, ONYX-015 바이러스에서와 같이, 55 kD P53 저해제를 코딩하는 E1b 영역에서 결실된 아데노바이러스 벡터 (문헌 ([BISCHOFF, et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science. 1996, vol. 274, no.5286, p.373-6.]; [He HEISE, et al. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nature Medicine. 2000, vol.6, no.10, p.1134-9.]; WO 94/18992))가 특히 바람직하다. 이러한 바이러스는 p53-결핍 신생물성 세포를 선택적으로 감염시키고 사멸시키는 데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련인은 또한 확립된 기법에 따라 아데노바이러스 5 또는 기타 다른 바이러스에서 p53 저해제 유전자를 돌연변이화하고 파괴시킬 수 있다. E1A Rb 결합 영역에서 결실된 아데노바이러스 벡터 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들면, E1A 영역에 24개의 염기쌍 결실을 보유하는 돌연변이체 아데노바이러스인 델타24 바이러스가 있다 (문헌 [FUEYO, et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. Oncogene. 2000, vol.19, no.1, p.2-12.]). 델타24는 Rb 결합 영역에 결실을 갖고, Rb에 결합하지 않는다. 따라서, 돌연변이체 바이러스의 복제는 정상 세포에서 Rb에 의해 저해된다. 그러나, Rb가 불활성화된 상태이고 세포가 신생물성이라면, 델타24는 더 이상 저해되지 않는다. 대신, 돌연변이체 바이러스는 효율적으로 복제되고, Rb-결핍 세포를 용해시키게 된다.

본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 결찰에 의해 또는 상동성 재조합에 의해 (예를 들면, 국제 출원 WO 96/17070 참조) 또는 그 밖에 상보성 세포주에서의 재조합에 의해 시험관내 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) (E. 콜라이)에서 생성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 벡터는 본 발명에 따른 항체의 발현에 필요한 요소를 추가로 포함한다.

발현에 필요한 요소는 핵산 서열이 RNA로 전사될 수 있게 하고, mRNA가 폴리펩티드로 번역될 수 있게 하는 모든 요소로 구성된다. 이러한 요소는 특히 프로모터를 포함할 수 있는데, 이는 조절형 프로모터이거나 구성적 프로모터일 수 있다. 천연적으로, 프로모터는 선택된 벡터 및 숙주 세포에 맞게 적합화된다. 그 예로는 PGK (포스포글리세레이트 키나제), MT (메탈로티오네인; 문헌 [MCIVOR. Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase: gene transfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by using recombinant amphotropic retroviruses. Molecular and cellular biology. 1987, vol.7, no.2, p.838-46.]), α-1 항트립신, CFTR, 계면활성제, 면역글로불린, 액틴 (문헌 [TABIN, et al. Adaptation of a retrovirus as a eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Molecular and cellular biology. 1982, vol.2, no.4, p.426-36.]) 및 SRα (문헌 [TAKEBE, et al. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Molecular and cellular biology. 1988, vol.8, no.1, p.466-72.]) 유전자의 진핵성 프로모터, SV40 바이러스 (시미안 바이러스)의 조기 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스)의 LTR, HSV-1 TK 프로모터, CMV 바이러스 (사이토메갈로바이러스)의 조기 프로모터, 백시니아 바이러스의 p7.5K pH5R, pK1L, p28 및 p11 프로모터, 키메라 프로모터, 예로서, p11 K7.5 및 E1A 및 MLP 아데노바이러스 프로모터를 언급할 수 있다. 프로모터는 또한 종양 또는 암 세포에서의 발현을 자극하는 프로모터일 수 있다. 특히, 유방암 및 전립선암에서 과다발현되는 MUC-1 유전자 (문헌 [CHEN, et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol.96, no.6, p.2775-82.]), 결장암에서 과다발현되는 CEA (이는 암종 배아 항원을 나타낸다) 유전자 (문헌 [SCHREWE, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular and cellular biology. 1990, vol.10, no.6, p.2738-48.]), 흑색종에서 과다발현된 티로시나제 유전자 (문헌 [VILE, et al. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res . 1993, vol.53, no.17, p.3860-4.]), 유방암 및 췌장암에서 과다발현되는 ERBB-2 유전자 (문헌 [HARRIS, et al. Gene therapy for cancer using tumour-specific prodrug activation. Gene therapy. 1994, vol.1, no.3, p.170-5.]), 및 간암에서 과다발현되는 α-태아단백질 유전자 (문헌 [KANAI, et al. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res .. 1997, vol.57, no.3, p.461-5.])의 프로모터를 언급할 수 있다. 특히, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 프로모터가 매우 바람직하다.

그러나, 백시니아 바이러스로부터 유래된 벡터 (예를 들면, MVA 벡터)를 사용할 경우에는 티미딘 키나제 7.5K 유전자의 프로모터 및 pH5R 프로모터가 특히 바람직하다.

필요한 요소는 숙주 세포에서의 본 발명에 따른 핵산 서열의 발현과 그의 유지를 개선시켜 주는 추가의 요소를 추가로 포함할 수 있다. 특히, 인트론 서열, 분비 신호 서열, 핵 위치 서열, IRES형의 번역 재개시를 위한 내부 부위, 전사 종결 폴리A 서열, 3부분 리터 및 복제 기점을 언급할 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 공지되어 있다. 분비 신호 서열 중, 서열 번호: 5 및/또는 8에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 또한 관심의 대상이 되는 하나 이상의 추가의 유전자를 포함할 수 있는데, 이들 유전자는 동일한 조절 요소 (다중시스트론 카세트) 또는 독립적인 요소의 제어하에 위치할 수 있다. 그러한 유전자로는 특히 인터루킨 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, 케모카인, 예로서, CCL19, CCL20, CCL21, CXCL-14, 인터페론, 종양 괴사 인자 (TNF), 및 선천 면역 및 혈관형성에 작용할 수 있는 요소 (예를 들면, PAI-1 (플라스미노겐 활성인자 저해제를 나타낸다))를 코딩하는 유전자를 언급할 수 있다. 하나의 특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 IL-2를 코딩하는, 관심의 대상이 되는 유전자를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 세포에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포는 진핵 세포 및 더욱 바람직하게, 포유동물 세포이다. 발현용으로 이용가능한 포유동물 세포는 당업계에 주지되어 있고, 다수의 무한증식 세포주, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 기타 다수를 포함한다. 적합한 추가의 진핵 세포로는 효모 및 기타 다른 진균을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포를 항체 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 세포 또는 세포 주변의 배지로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열 또는 벡터 중 어느 하나, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 제약 조성물은 관심의 대상이 되는 화합물을 추가로 포함한다.

제약상 허용되는 담체는 바람직하게 등장성, 저장성 또는 약한 고장성이고, 상대적으로 낮은 이온 강도를 갖는 것, 예를 들면, 수크로스 용액이다. 또한, 상기와 같은 담체는 임의의 용매 또는 수성 또는 부분적으로 수성인 액체, 예로서, 비발열성 멸균수를 함유할 수 있다. 추가로, 생체내 사용 요건을 충족시킬 수 있도록 제약 조성물의 pH는 조절되고 완충처리된다. 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 희석제, 애주번트 또는 부형제 뿐만 아니라, 가용화제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있다. 주사 투여를 위해서는 수용액, 비수성 용액 또는 등장액 중의 제제가 바람직하다. 이는 액체로 또는 사용시에 적절한 희석제로 재구성될 수 있는 건식 형태 (분말, 동결건조물 등)로 단일 투여량 또는 다회투여량으로 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 (i) 본 발명에 따른 제약 조성물, 항체, 핵산 서열 또는 벡터, 및 (ii) 관심의 대상이 되는 화합물을 포함하는 부품으로 구성된 키트에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "관심의 대상이 되는 화합물"이라는 용어는 치료학적 화합물 및 바람직하게는 암 치료제 또는 골량 감소를 치료하는 데 유용한 화합물에 관한 것이다.

바람직한 실시태양에 따라, 암 치료제는 아브락산 (파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제), 아드리아마이신 (독소루비신 하이드로클로라이드), 아드루실 (플루오로우라실), 알다라 (이미퀴모드), 알렘투주맙, 아림타 (페메트렉스트 디소듐), 아미노레불린산, 아나스트로졸, 아트레피탄트, 아리미덱스 (아나스트로졸), 아로마신 (엑세메스탄), 아레논 (넬라라빈), 3산화 비소, 아바스틴 (베바시주맙), 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 보르테조밉, 캠파스 (알렘투주맙), 캄프토자 (이리노테칸 하이드로클로라이드), 카페시타빈, 카보프라틴, 세툭시맙, 시스플라틴, 클라펜 (사이클로포스파미드), 클로파라빈, 클로파렉스 (클로파라빈), 클로라르 (클로파라빈), 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이토사르-U (사이타라빈), 사이톡산 (사이클로포스파미드), 다코젠 (데시타빈), 다사티빕, 데시타빈, 데포Cyt (리포좀 사이타라빈), 데포폼 (리포좀 사이타라빈), 덱스라족산 하이드로클로라이드, 도세탁셀, 독실 (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, 독스-SL (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에퓨덱스 (플루오로우라실), 엘렌세 (에피루비신 하이드로클로라이드), 엘록사틴 (옥살리플라틴), 에멘드 (아트레피탄트), 에피루비신 하이드로클로라이드, 어비툭스 (세툭시맙), 엘로티닙 하이드로클로라이드, 에바세트 (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 에비스타 (랄록시펜 하이드로클로라이드), 엑세메스탄, 파스로덱스 (풀베스트란트), 페마라 (레트로졸), 플루오로플렉스 (플루오로우라실), 플루오로우라실, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈 하이드로클로라이드, 겜투주맙 오조가미신, 젬자 (겜시타빈 하이드로클로라이드), 글리벡 (이마티닙 메실레이트), 허셉틴 (트라스투주맙), 하이캄틴 (토포테칸 하이드로클로라이드), 이마티닙 메실레이트, 이미퀴모드, 이레사 (제피티닙), 이리노테칸 하이드로클로라이드, 이자베필론, 익셈프라 (이자베필론), 케옥시펜 (랄록시펜 하이드로클로라이드), 케피반스 (팔리페르민), 라파티닙 디토실레이트, 레날리도미드, 레트로졸, 레블란 (아미노레불산), 리포독스 (독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 리포좀 사이타라빈, 메타졸라스톤 (테모졸로미드), 메토트렉세이트, 마이로사르 (아자시티딘), 마일로타그 (겜투주맙 오조가미신), 나노입자 파클리탁셀 (파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제), 넬라라빈, 네오사르 (사이클로포스파미드), 넥사바 (소라페닙 토실레이트), 닐로티닙, 놀바덱스 (타목시펜 시트레이트), 온캐스파 (페가스파르가제), 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제제, 팔리페르민, 파니투무맙, 파라플랫 (카르보플라틴), 파라플라틴 (카르보플라틴), 페가스파르가제, 페메트렉스트 디소듐, 플라티놀-AQ (시스플라틴), 플라티놀 (시스플라틴), 랄록시펜 하이드로클로라이드, 레브리미드 (레날리도미드), 리툭산 (리툭스맙), 리툭스맙, 스클레로졸 흉막내 에어로졸 (탈크), 소라페닙 토실레이트, 스프라이셀 (다사티닙), 멸균 탈크 분말 (탈크), 스테리탈크 (탈크), 수니티닙 말레이트, 수텐트 (수니티닙 말레이트), 시노비르 (탈리도미드), 탈크, 타목시펜 시트레이트, 타라빈 PFS (사이타라빈), 타르세바 (엘로티닙 하이드로클로라이드), 타그레틴 (벡사로텐), 타시그나 (닐로티닙), 탁솔 (파클리탁셀), 택소티어 (도세탁셀), 테모다르 (테모졸로미드), 테모졸로미드, 템시로리무스, 탈로미드 (탈리도미드), 탈리도미드, 토텍 (덱스라족산 하이드로클로라이드), 토포테칸 하이드로클로라이드, 토리셀 (템시로리무스), 트라스투주맙, 트리세녹스 (3산화 비소), 타이커브 (라파티닙 디토실레이트), 벡티빅스 (파니투무맙), 벨케이드 (보르테조밉), 비다자 (아자시티딘), 보리노스타트, 젤로다 (카페시타빈), 지네카드 (덱스라족산 하이드로클로라이드), 졸레드론산, 졸린자 (보리노스타트) 및 조메타 (졸레드론산)를 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 골량 감소를 치료하는 데 유용한 화합물은 비포스포네이트, 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM), 부갑상선 호르몬 (PTH) (예로서, 테리파라티드 (포르테오)), 스트론튬 라넬레이트, 데노수맙 또는 칼시토닌 또는 그의 조합물이다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, 비포스포네이트는 알렌드로네이트 (포사맥스, 포사맥스 플러스 D), 에티드로네이트 (디드로넬), 이반드로네이트 (보니바), 파미드로네이트 (아레디아), 리세드로네이트 (액토넬, 액토넬 W/칼슘), 틸루드로네이트 (스키리드), 및 졸레드론산 (레클라스트, 조메타)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 실시태양에 따라, SERM은 랄록시펜 (에비스타), 바제독시펜/프레마린 (아프렐랄) 및 타목시펜을 포함하는 군으로부터 선택된다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 파골세포 활성 증가와 관련된 질환을 치료하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다. 그러한 질환으로는 내분비 장애 (고코르티솔증, 생식샘기능저하증, 원발성 또는 속발성 부갑상선항진증, 갑상선기능항진증), 고칼슘혈증, 영양결핍 상태 (구루병/골연화증, 괴혈병, 영양실조), 만성 질환 (흡수장애 증후군, 만성 신부전증 (신장성 골이영양증), 만성 간 질환 (간 골이영양증), 약물 (글루코코르티코이드 (글루코코르티코이드-유도성 골다공증), 안드로겐 차단 요법, 아로마타제 저해제 요법, 헤파린, 알코올), 및 유전병 (불완전 골생성증, 호모시스틴뇨증), 골다공증, 골경화증, 관절염 및 류마티스 관절염과 관련된 골 염증, 치주 질환, 섬유 형성이상, 및/또는 파제트병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 염증 및/또는 자가면역과 관련된 질환을 치료하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다. 그러한 질환으로는 혈청검사 음성인 척추관절병증 (건선 관절염, 강직척추염, 라이터 증후군, 염증성 장 질환과 관련된 척추관절병증), 인공 관절 이완, 결합 조직 질환 (소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 및 루푸스 신장염, 공피증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직병, 다발근육염, 피부근육염), 염증성 장 질환 (예로서, 크론병; 궤양성 대장염), 휘플병, 육아종 회결장염과 관련된 관절염, 염증성 피부 병태 (자가면역 수포성 유천포창, 자가면역 심상성 천포창, 부종, 피부염), 염증성 폐 질환 (폐포염, 폐 섬유증, 사르코이드증, 천식, 기관지염, 폐쇄 세기관지염), 염증성 신장 질환(사구체신염, 신장 동종이식 거부, 신세뇨관 염증), 죽상동맥경화증, 전신성 혈관염 (측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 타카야수 동맥염, 결절 다발동맥염, 가와사키병, 베게너 육아종증, 초그-스토라우스 증후군, 현미경 다발혈관염, 괴사 사구체신염, 헤노흐 쇤라인 자색반, 본태성 한랭글로블린 혈관염 및 기타 소혈관 혈관염, 베체트병), 대식세포 활성화 질환 (대식세포 활성화 증후군 (MAS), 성인 발병성 스틸병, 적혈구잠식성 증후군), 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담즙성 경화, 경화 담관염, 자가면역 간염, 1형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 다발 경화증 (MS), 길랭-바레 증후군, 애디슨병, 및/또는 레이노드 현상, 굿파스처 증후군을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 암을 치료하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "암"이라는 용어는, 제한하는 것은 아니지만, 아데노암종, 샘꽈리 세포 아데노암종, 부신 피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지원성 암종, 레날아디놀(renaladinol) 암종, 배아 암종, 아노메트로이드(anometroid) 암종, 섬유층판 간 세포 암종, 소포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 진피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질성 암종, 멜라닌 암종, 수막 암종, 중후신장 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 관상 세포 암종, 사기질모세포 육종, 혈관결석 육종, 포도형 육종, 자궁내막 기질 육종, 유잉 육종, 섬유속 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 면역모세포 육종, 측피질 골육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구 육종 (백혈병), 림프계 육종 (림프 육종), 수질성 육종, 골수성 육종 (과립구 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관확장성 청각원성 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH 및 미만성 림프성을 의미한다. 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명의 방법은 골로 전이되는 전이성 암 치료에 관한 것으로, 여기서, 전이성 암은 유방암, 폐암, 신장암, 다발 골수종, 갑상선암, 전립선암, 아데노암종, 혈액 세포 악성 종양 (백혈병 및 림프종 포함); 두경부암; 위장관암 (식도암, 위암, 결장암, 소장암, 결장직장암, 직장암, 췌장암, 간암, 담관암 또는 담낭암 포함); 여성 생식기 암 (난소 암종, 자궁 자궁내막암, 질암, 및 자궁경부암 포함); 방광암; 뇌암 (신경모세포종 포함); 육종, 골육종; 및 피부암 (악성 흑색종 또는 편평 세포 암 포함)이다.

본 발명은 암 치료제를 사용한 화학요법적 치료를 받고 있는 암 환자를 상기 개시된 방법을 함께 사용하여 공-치료하는 단계를 포함하는, 상기 암 환자의 치료를 개선시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 세포독성 약물 또는 방사선요법을 필요로 하는 환자를 상기 개시된 방법을 함께 사용하여 공-치료하는 단계를 포함하는, 상기 세포독성 약물 또는 방사선요법의 세포독성 효능을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 비스포스포네이트, 선택성 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM), 부갑상선 호르몬 (PTH) (예로서, 테리파라티드 (포르테오)), 스트론튬 라넬레이트, 데노수맙 또는 칼시토닌 또는 그의 조합물을 사용한 치료를 받고 있는 환자를 상기 개시된 방법을 함께 사용하여 공-치료하는 단계를 포함하는, 파골세포 활성 증가와 관련된 질환을 앓고 있으며, 상기와 같은 치료를 받고 있는 환자의 치료를 개선시키는 방법에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체의 용도는 전이성 암 환자에서 골로 전이되는 전이성 암을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 주시된다. 관련된 실시태양에서, 전이성 암은 유방암, 폐암, 신장암, 다발 골수종, 갑상선암, 전립선암, 아데노암종, 혈액 세포 악성 종양 (백혈병 및 림프종 포함); 두경부암; 위장관암 (식도암, 위암, 결장암, 소장암, 결장직장암, 직장암, 췌장암, 간암, 담관암 또는 담낭암 포함); 여성 생식기 암 (난소 암종, 자궁 자궁내막암, 질암, 및 자궁경부암 포함); 방광암; 뇌암 (신경모세포종 포함); 육종, 골육종; 및 피부암 (악성 흑색종 또는 편평 세포 암 포함)이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 암 환자 치료용 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 파골세포 활성 증가와 관련된 질환을 앓는 환자 치료용 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 염증성 질환, 더욱 특히, 염증성 장 질환 환자 치료용 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

또다른 실시태양에 따라, 본 발명은 류마티스 관절염 환자 치료용 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트를 투여하는 것은 당업자에게 공지되어 있는 임의의 수잔에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로로는 진피내, 피하, 경구, 비경구, 근육내, 비내, 설하, 기관내, 흡입, 안내, 질내, 및 직장내 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트는 전신 투여된다.

단일 투여량으로 또는 일정한 시간 간격을 두고 1회 또는 수회에 걸쳐 반복되는 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 항체, 핵산 서열, 벡터, 제약 조성물 또는 부품으로 이루어진 키트는 주 간격으로 1 내지 10회에 걸쳐 투여된다.

일반 가이던스를 위한 항체의 적합한 투여량은 약 2 mg/kg (체중) 내지 30 mg/kg (체중), 0.1 mg/kg (체중) 내지 30 mg/kg (체중) 또는 0.1 mg/kg (체중) 내지 10 mg/kg (체중)이다. 본 발명에 따른 벡터의 적합한 투여량은 MVA 벡터의 경우, 약 10⁴ 내지 10¹⁰ pfu (플라크 형성 단위), 바람직하게는, 약 10⁵ 내지 10⁸ pfu로 다양한 반면, 아데노바이러스 기반 벡터의 경우에는 약 10⁵ 내지 10¹³ iu (감염유발 단위), 바람직하게는, 약 10⁷ 내지 10¹² iu로 다양하다. 벡터 플라스미드 기반 조성물은 10 ㎍ 내지 20 mg 사이, 이롭게는, 100 ㎍ 내지 2 mg 사이의 투여량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 용도 또는 방법이 암 치료를 위한 것인 경우, 본 발명의 방법 또는 용도는 하나 이상의 통상적인 치료 요법 (예로서, 방사선 요법, 화학요법 및/또는 수술)과 함께 수행될 수 있다. 다중 치료학적 접근법을 사용하면 좀더 광범위한 기반을 가진 중재적 요법을 환자에게 제공할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 외과적 중재 요법 이전에 또는 그 이후에 수행될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 방사선요법 (예로서, 감마 방사선) 이전에 또는 그 이후에 수행될 수 있다. 당업자는 사용될 수 있는 적절한 방사선 요법 프로토콜 및 파라미터를 쉽게 수립할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [PEREZ. Principles and practice of radiation oncology. 2nd edition. LIPPINCOTT, 1992.]).

도 1은 CSF-1R-형질감염된 NIH/3T3 세포의 mAb CXIIG6에 의한 특이적인 염색을 도시한다.
도 2는 mAb CXIIG6 존재하의 CSF-1의 세포 표면 CSF-1R에의 결합 저해를 나타낸다.
도 3은 가용성 인간 CSF-1R의 mAb CXIIG6에 의한 특이적인 차단을 나타낸다 ('ctrl'은 대조군을 의미하고; 'neg SN'은 음성 대조군 하이브리도마 상등액을 의미한다).
도 4는 mAb CXIIG6 존재하의 매트릭스-메탈로프로테아제-9 (MMP-9)의 인간 파골세포 분화 및 분비 저해를 나타낸다 ('ctrl'은 대조군을 의미하고; 'CXIIG6 SN'은 CXIIG6 하이브리도마 상등액을 의미하고; 'neg SN'은 음성 대조군 하이브리도마 상등액을 의미한다).
도 5는 CSF-1R과 상동성인 기타 다른 티로신 키나제 수용체와 mAb CXIIG6과의 비-교차-반응성을 나타낸다 ('SN'은 하이브리도마 상등액을 의미한다).
도 6은 CXIIG6 중쇄의 핵산 서열 (서열 번호: 1) 및 연역 추론된 아미노산 서열 (서열 번호: 2). 뉴클레오티드 서열에 첨가되어 있는, 클로닝을 위한 프라이머 서열 (제한 부위 포함)은 밑줄로 표시되어 있다. 제한 부위는 이탤릭체와 밑줄로 표시되어 있다. V-도메인의 아미노산 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 7은 CXIIG6 경쇄의 핵산 서열 (서열 번호: 3) 및 연역 추론된 아미노산 서열 (서열 번호: 4). 뉴클레오티드 서열에 첨가되어 있는, 클로닝을 위한 프라이머 서열 (제한 부위 포함)은 밑줄로 표시되어 있다. 제한 부위는 이탤릭체와 밑줄로 표시되어 있다. V-도메인의 아미노산 서열은 굵은체로 강조 표시되어 있다.
도 8은 플라스미드 작제물 pTG17753을 나타낸다.
도 9는 플라스미드 작제물 pTG17727을 나타낸다.
도 10은 플라스미드 작제물 pOptiVEC™를 나타낸다.
도 11은 플라스미드 작제물 pTG17895를 나타낸다.
도 12는 플라스미드 작제물 pTG17812를 나타낸다.
도 13은 플라스미드 작제물 pTG17868을 나타낸다.
도 14는 플라스미드 작제물 pTG17869를 나타낸다.
도 15는 인간화된 CXIIG6 경쇄 변이체를 나타낸다.
도 16은 인간화된 CXIIG6 IgG1 중쇄 변이체를 나타낸다.
도 17은 재조합 뮤린 CXIIG6 및 키메라 CXIIG6 IgG1에 의한 가용성 인간 CSF-1R의 특이적인 차단을 나타낸다.
도 18은 재조합 뮤린 CXIIG6 및 키메라 CXIIG6 IgG1의 존재하의 매트릭스-메탈로프로테아제-9 (MMP-9)의 인간 파골세포 분화 및 분비 저해를 나타낸다.

본 발명의 수행 모드(들)

CSF-1R-형질감염된 NIH/3T3 세포의 mAb CXIIG6에 의한 특이적인 염색

전장의 인간 CSF-1R을 코딩하는 발현 플라스미드로 NIH/3T3 세포를 안정적으로 형질감염시킴으로써 B4-800-5 세포주를 생성하였다. B4-800-5 세포 상에서의 세포-표면 CSF-1R 발현은 이소형 대조군과 비교하여 항-인간 CSF-1R mAb 61701 (마우스 IgG₁, R&D 시스템즈(R&D Systems)) 또는 2-4A5-4 (래트 IgG₁ _,κ, 진텍스(GeneTex))로 간접적으로 면역염색시켜 확인하였다 (도 1, 상단 및 중간 패널). 하이브리도마 CXIIG6 또는 음성 대조군 하이브리도마로부터 유래된 배양물 상등액은 B4-800-5 세포 또는 모체 NIH/3T3 세포를 면역염색시키는데 사용하였다 (도 1, 하단 패널).

유세포 측정 분석법을 통해 하이브리도마 CXIIG6으로부터 유래된 배양물 상등액이 B4-800-5 세포를 선택적으로 염색시킨 것으로 나타났고, 이를 통해 세포-표면 CSF-1R에 대한 mAb 특이성이 입증되었다.

CSF-1의 세포 표면 CSF-1R에의 결합 저해

3 x 10⁵개의 THP-1 세포 (인간 CSF-1R-양성 단핵구성 백혈병 세포주)를 하이브리도마 배양물 상등액, 천연 또는 항-CSF-1R-면역화된 마우스로부터 유래된 혈청 (1:1000 희석액), mAb 항-CSF-1R 2-4A5-4 (진텍스) 또는 대조군 래트 IgG₁ (10 ㎍/ml) 또는 시약 무함유 물질의 존재하에 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 냉 PBS로 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 30분 동안 1 ㎍/ml 비오틴화된 재조합 인간 CSF-1과 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 10 ㎍/ml 스트렙트아비딘-알렉사 플루오르 488 (인비트로겐)과 함께 4℃에서 30분 동안 추가로 인큐베이션시켰다. PBS로 세척하고, 4％ 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 유세포 측정법에 의해 세포 염색을 분석하였다.

대조군 샘플과 비교하여 형광 강도가 감소하였다는 것은 CSF-1의 세포 표면 CSF-1R에의 결합이 저해되었다는 것을 반영한다. CSF-1R-면역화된 마우스로부터 유래된 혈청이, CSF-1이 THP-1 세포에 결합하는 것을 차단한다 (도 2). 음성 대조군 하이브리도마 상등액 또는 관련없는 mAb는 어떤 효과도 나타내지 않은 반면, 하이브리도마 CXIIG6으로부터 유래된 배양물 상등액은 mAb 2-4A5-4 (좌측 하단 패널)와 같이 CSF-1이 THP-1 세포에 결합하는 것을 저해시킨다 (도 2, 우측 하단 패널)

mAb CXIIG6 결합 부위 위치 측정

CSF-1R 상의 mAb CXIIG6의 결합 부위를 확인하기 위해, 5개의 세포외 면역글로불린-유사 도메인 (Met 1 내지 Glu 512, R&D 시스템즈) 또는 단지 3개의, CSF-1R의 세포외 영역의 N-말단 면역글로불린-유사 도메인 (Met 1 내지 Ser 290) (두가지 모두 그의 C-말단 종단부에서 인간 IgG₁의 Fc 영역에 융합되어 있다)을 포함하는 가용성 형태의 인간 CSF-1R을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 인간 IgG₁의 Fc 영역에 융합된 가용성 형태의 EGFR (R&D 시스템즈)을 음성 대조군으로서 사용하였다.

니트로셀룰로스 쉬트로 옮기기 전에 천연 조건하에서 100 ng의 각각의 가용성 수용체를 전기영동시키고, 하이브리도마 상등액, 토끼 pAb c-fms/CSF-1R H300 (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology)), 마우스 mAb 61701 (R&D 시스템즈) 또는 천연 또는 CSF-1R-면역화된 마우스로부터 유래된 혈청으로 프로빙하였다.

pAb c-fms/CSF-1R H300, mAb 61701 또는 면역화된 마우스로부터 유래된 혈청으로 프로빙하였을 때, 가용성 형태의 CSF-1R, 두가지 모두가 광범위한 밴드로서 검출되었다. 천연 마우스 혈청 또는 음성 대조군 하이브리도마 상등액을 사용한 경우에는 어떤 검출가능한 신호도 관찰되지 않았다. CXIIG6 하이브리도마 상등액은 CSF-1R₁ _-290:Fc 뿐만 아니라, CSF-1R₁ _-512:Fc를 인식하였지만, EGFR:Fc는 인식하지 못하였고, 이는 CXIIG6이 인간 CSF-1R의 3개의 N-말단 면역글로불린-유사 도메인 (잔기 1 내지 290 사이) 내에 위치하는 에피토프에 특이적으로 결합한다는 것을 시사한다.

가용성 인간 CSF-1R의 mAb CXIIG6에 의한 특이적인 차단

CSF-1-의존성 뮤린 골수성 백혈병 M-NFS-60 세포주 (#CRL-1838, ATCC)를 사용하여 CXIIG6 하이브리도마 상등액이 인간 및 뮤린 CSF-1R에 미치는 차단 활성을 평가하였다. 5 ng의 가용성 인간 CSF-1R (R&D 시스템즈로부터 입수한 CSF-1R₁ _-512:Fc)을 하이브리도마 상등액, mAb 61701 (R&D 시스템즈) 또는 뮤린 이소형 대조군 mAb의 일련의 희석액과 함께 백색 96웰 마이크로플레이트 중에서 사전인큐베이션시켰다. 이어서, CSF-1의 부재하에서 밤새도록 배양시킨 10E4 M-NFS-60 세포를 배양 웰에 0.1 ng의 인간 CSF-1과 함꼐 최종 부피 100 ㎕로 첨가하였다. 배양물을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시키고, 세포 증식 ELISA(Cell Proliferation ELISA) (로슈(Roche))를 사용하여 BrdU 혼입에 의해 증식을 정량하였다.

음성 대조군 IgG₁을 함유하거나 함유하지 않는 음성 하이브리도마 상등액의 존재하에서 나타난 바와 같이, 가용성 인간 CSF-1R은 인간 CSF-1에 의해 매개되는 M-NFS-60 세포의 증식을 완전하게 저해시켰다 (도 3; 웰 3개의 평균 +/- SEM). 대조적으로, CXIIG6 하이브리도마 상등액 및 양성 대조군 mAb 61701, 둘 모두는 용량-의존성 방식으로 세포 증식을 회복시킬 수 있었으며, 이는 가용성 인간 CSF-1R을 중화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

본 분석법에서, 낮은 희석 비율로 희석된 CXIIG6 하이브리도마 상등액의 존재하의 활성을 띠는 M-NFS-60 세포 증식을 통해 mAb CXIIG6이 M-NFS-60 세포에 의해 발현되는 뮤린 CSF-1R을 차단할 수 없다는 것으로 나타났다. 또한, 가용성 CSF-1R의 부재하에서 수행된 뮤린 CSF-1-지원 M-NFS-60 증식 분석법에서, mAb AFS98 항-마우스 CSF-1R (e바이오사이언스(eBioscience))로 처리하자 세포 성장은 농도에 의존하는 방식으로 급격히 감소하였다 (데이타는 나타내지 않았다). 음성 대조군 항체 및 음성 하이브리도마 상등액과 같이 CXIIG6 하이브리도마 상등액은 세포 증식을 감소시키지 않았다. 이러한 결과는 mAb CXIIG6이 인간 CSF-1R을 특이적으로 표적한다는 것을 입증한다.

매트릭스-메탈로프로테아제-9 (MMP-9)의 인간 파골세포 분화 및 분비 저해

건강한 혈액 기증자로부터 유래된 PBMC를 용출시켜(elutriation) 수득한 인간 단핵구로부터 파골세포를 생성하였다. 간략하면, 단핵구를 96-웰 플레이트 중 웰 1개당 2 x 10E4개의 세포로 시딩하고, 45분 동안 하이브리도마 배양물 상등액, mAb 항-인간 CSF-1R 61701 (R&D 시스템즈) 또는 2-4A5-4 (진텍스), mAb 항-인간 CSF-1 26730 (R&D 시스템즈), 뮤린 또는 래트 이소형 대조군 또는 하이브리도마 배양 배지 중에 희석시킨, 천연 및 CSF-1R-면역화된 마우스로부터 유래된 혈청으로 처리하였다. 인간 CSF-1 및 RANKL (페프로테크(PeproTech), 각각 25 및 40 ng/ml)을 포함하거나 포함하지 않는 배양물 웰에 완전 a-MEM 배지를 첨가하였다. 하이브리도마 상등액, mAb 및/또는 사이토카인을 포함하거나 포함하지 않는 배지를 9일 동안 매 3일마다 보충해 주었다. 9일째 조절된 배양물 상등액을 수거하고, ELISA 분석법 (R&D 시스템즈)를 사용하여 전체 인간 MMP-9에 대해 분석하였다. 파골세포 형성은 백혈구 산성 포스파타제 키트 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로부터 입수)를 사용하여 타르트레이트-내성 산성 포스파타제 (TRAP) 염색에 의해 평가하였다.

CSF-1 + RANKL은 단핵구가 파골세포 (큰 다핵 TRAP-양성 세포로 정의된다)로 분화되는 것을 유도한 반면, 사이토카인의 부재하에서는 어떤 TRAP-양성 파골세포도 관찰되지 않았다. MMP-9 분비가 일어나지 않은 것으로 보여지는 바와 같이, 0.5 ㎍/ml 항-CSF-1 mAb 26730을 첨가하자 파골세포 분화는 완전히 폐기되었다. 같은 농도의 항-CSF-1R mAb 61701 또는 2-4A5-4, 및 면역화된 마우스 혈청(1:1000 희석액)은 단지 부분적으로만 파골세포 형성을 저해시켰다 (도 4; 사이토카인 포함 (+) 또는 사이토카인 미포함 (-); 웰 3개의 평균 +/- SEM; *: 웰 2개의 평균). 2개의 음성 대조군 하이브리도마 상등액 (A, B)과 비교하였을 때, 1:20 또는 1:100으로 희석된 CXIIG6 하이브리도마 배양물 상등액 처리는 MMP-9 생산 수준을 현저히 감소시켰다. 이러한 결과는 mAb CXIIG6이 세포 표면 CSF-1R의 기능을 차단함으로써 인간 단핵구로부터 파골세포로 분화되는 것을 저해시킨다는 것을 입증한다.

CSF-1R의 CSF-1-의존성 인산화 저해

인간 CSF-1R을 발현하는 플라스미드로 NIH/3T3 세포를 안정적으로 형질감염시켜 수득된 B4-800-5 세포주를 사용하여 CXIIG6 하이브리도마 상등액이 CSF-1-의존성 CSF-1R 인산화에 미치는 효과를 조사하였다. 세포를 60-mm 페트리 디쉬 1개당 2 x 10E5개의 세포로 시딩하고, 48 내지 72시간 동안 배양하였다. 37℃에서 1시간 동안 혈청을 제거한 후, 세포를 37℃에서 1시간 동안 CXIIG6 하이브리도마 상등액, mAb 2-4A5-4 (네오마커스(NeoMarkers)) 또는 이소형대조군 mAb (음성 하이브리도마 상등액 중에 희석된 것)를 함유하는 배양 배지로 처리한 한 후, 37℃에서 5 분 동안 100 ng/ml hCSF-1로 자극시키거나, 자극없이 방치하였다. 이어서, 세포층을 용해시키고, 전체 단백질을 추출하였다. 토끼 pAb c-fms/CSF-1R H300 또는 토끼 pAb p-c-fms/CSF-1R (Tyr708)-R (산타 크루즈 바이오테크놀러지)로, 이어서 염소 항-토끼 면역글로불린^HRP로 웨스턴 블롯을 프로빙하여 10 ㎍ 단백질을 분석하였다.

708번 위치에서 인산화된 CSF-1R에 대해 특이성을 갖는 항체에 대해 관찰된 바와 같이, CSF-1의 부재하에서는 CXIIG6 하이브리도마 상등액도 mAb 2-4A5-4도 수용체 인산화를 유도하지는 못했는데, 이는 mAb CXIIG6이 단독으로는 효현제 효과를 발휘하지 못한다는 것을 나타낸다. CSF-1로 자극시킨 경우, CSF-1R의 양은 자극을 받지 않은 세포와 비교하여 이소형 대조군-처리된 세포에서 감소하였고, CSF-1R은 Tyr708 상에서 인산화되었다 (데이타는 나타내지 않았다). CXIIG6 하이브리도마 상등액 또는 mAb 2-4A5-4로 전처리하였을 때 CSF-1R 소실은 증진되지 못했다. CXIIG6 하이브리도마 상등액 또는 mAb 2-4A5-4 처리 후에 CSF-1R의 인산화가 감소하였다. 이러한 결과는 mAb CXIIG6이 CSF-1R의 CSF-1-의존성 인산화를 차단할 수 있다는 것을 나타낸다.

mAb CXIIG6의 교차-반응성

티로신 키나제 수용체의 III형 서브패밀리에 속하고, 그의 세포외 Ig-유사 도메인 중에서 CSF-1R과 상동성을 나타내는 일련의 정제된 가용성 수용체 상에서 ELISA에 의해 mAb CXIIG6의 교차-반응성을 시험하였다: 가용성 VEGFR-1, VEGFR-2, Flt-3 및 PDGFRβ (4가지 모두 Fc 융합 단백질로서 발현된다) 뿐만 아니라, PDGFRα 및 SCFR (c-kit)도 R&D 시스템즈로부터 입수하고, ELISA 플레이트를 코딩하는데 사용하였다. 티로신 키나제 수용체의 EGFR 서브패밀리로부터의 가용성 EGFR (R&D 시스템즈)는 음성 대조군으로서 사용하였다.

하이브리도마 CXIIG6 (CXIIG6 SN) 또는 음성 대조군 하이브리도마 또는 항-CSF-1R 마우스 IgG₁ 61701 (R&D 시스템즈)로부터의 배양물 상등액을 항체 농도 500 ng/ml로 코팅된 ELISA 상에서 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트를 세척한 후, 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 Ig (시그마)를 사용하여 결합된 항체를 나타내고, OD _{(450 - 540} _nm ₎를 측정하였다. 도 5에 도시한 결과는, mAb 61701과 같이, CXIIG6이 CSF-1R에 강하게 결합한 반면, 특이적인 신호는 어떤 다른 티로신 키나제 수용체 상에서도 검출되지 않았음을 나타낸다. 이는 시험된 각종 III형 티로신 키나제 수용체 중에서 CXIIG6이 CSF-1R에 대하여 특이적이라는 것을 나타낸다.

mAb CXIIG6에 대한 발현 벡터 작제

DG44 포유동물 세포주에서 mAb CXIIG6을 생산하기 위한 목적으로 CXIIG6 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 옵티CHO™ 항체 발현 키트(OptiCHO™ Antibody Express Kit) (인비트로겐, 카탈로그 번호 12762-019)를 사용하였다. 옵티CHO™ 항체 발현 키트는 하기를 포함한다: (1) pOptiVEC™ 벡터 (CMV 프로모터 하류의 관심의 대상이 되는 유전자가 클로닝될 수 있도록 하는 이시스트론 플라스미드. 관심의 대상이 되는 유전자의 전사는 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)에 의해 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 영양요구 선별 마커로부터 분리되어 있고, 이로써 동일한 mRNA 상에 있는 관심의 대상이 되는 유전자와 선별 마커의 전사가 이루어질 수 있다); (2) CMV 프로모터 하류의 관심의 대상이 되는 유전자가 클로닝될 수 있도록 pcDNA™3.3 벡터 (DNA™3.3은 네오마이신 내성 유전자를 함유하고, 이로써 게네티신(Geneticin)®을 이용하여 선별할 수 있다). pOptiVEC™ 및 pcDNA™3.3 벡터는 관심의 대상이 되는 유전자의 mRNA의 3' 말단에서의 적절한 프로세싱을 지시하는 TK 폴리-A 서열을 포함한다.

특이적인 프라이머 (표 4 참조)를 합성하고, 전체 CXIIG6 중쇄 및 경쇄 유전자 (각각 서열 번호:1 및 서열 번호: 3; 각각 도 6 및 도 7 참조)의 PCR 증폭 및 플로닝을 위해 상기 프라이머를 사용하였다. 효율적인 진핵세포 번역을 위해 역방향 프라이머로는 Kozak 공통 서열을 포함하였다 (문헌 [KOZAK M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res. 1987,15(20): 8125-8148.]).

플라스미드 pTG17753 (도 8)을 주형으로서 이용하고 OTG18929 및 OTG18930를 사용함으로써 CXIIG6 중쇄를 PCR 증폭시키고, 벡터 pOptiVEC™-TOPO® (pOptiVEC™-TOPO® TA 클로닝® 키트(pOptiVEC™-TOPO® TA Cloning® Kit), 인비트로겐, 카탈로그 번호 12744-017-01) 및 pcDNA™3.3-TOPO® 벡터 (pcDNA™3.3-TOPO® TA 클로닝® 키트(pcDNA™3.3-TOPO® TA Cloning® Kit), 인비트로겐, 카탈로그 번호 K8300-01)로 클로닝하여 각각 pTG17786 및 pTG17789를 수득하였다.

플라스미드 pTG17727 (도 9)을 주형으로서 이용하고 OTG18931 및 OTG18932를 사용함으로써 CXIIG6 경쇄를 PCR 증폭시키고, 벡터 pOptiVEC™-TOPO® (pOptiVEC™-TOPO® TA 클로닝® 키트, 인비트로겐, 카탈로그 번호 12744-017-01) 및 pcDNA™3.3-TOPO® 벡터 (pcDNA™3.3-TOPO® TA 클로닝® 키트, 인비트로겐, 카탈로그 번호 K8300-01)로 클로닝하여 각각 pTG17788 및 pTG17787을 수득하였다.

CMV 프로모터 및 TK 폴리A 신호를 포함한, pTG17786, pTG17787, pTG17788 및 pTG17789의 전체 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열을 그의 이론상의 서열에 따라 서열 분석하고, 확인하였다.

mAb CXIIG6으로부터의 키메라 항체 생성

mAb CXIIG6의 가변 도메인을 인간 불변 영역과 조합하였다.

키메라 경쇄 (키메라 CXIIG6 Igκ 쇄로 명명)를 생성하기 위해, CXIIG6 VΚ 도메인을 코딩하는 서열 (서열 번호: 3으로부터의 것)을 인간 IGΚC 영역을 코딩하는 서열 (진뱅크(GenBank) 수탁 번호: J00241)에 결합시켜 이론상의 서열을 디자인하였다. 이러한 XbaI NotI DNA 단편은 뮤린 버전에서 사용된 것 (상기 기술된 pTG17787 및 pTG17788에서의 것)과 동일한 비번역 서열 (Kozak 서열 포함)을 5' 말단에 유지하였다. CHO에서 발현할 수 있도록 키메라 CXIIG6 경쇄 서열의 코돈을 최적화시키고, 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하고, XbaI NotI을 통해 pOptiVEC™ (도 10)로 서브클로닝하였다 (진아트 아게(GeneArt AG)에 의해 실시). 수득된 키메라 CXIIG6 경쇄 (가변 및 불변 영역)의 코돈이 최적화된 핵산 서열이 서열 번호: 34에 기재되어 있다. 수득된 플라스미드를 PTG17895 (도 11)로 명명하였다.

키메라 중쇄 IgG1 및 IgG4 (각각 키메라 CXIIG6 IgG1 및 키메라 CXIIG6 IgG4 쇄로 명명)를 생성하기 위해, CXIIG6 VH 도메인을 코딩하는 서열 (서열 번호: 1로부터의 것)을 인간 IGHG1C 영역 (진뱅크 수탁 번호: J00228) 또는 인간 IGHG4C 영역 (진뱅크 수탁 번호: K01316)을 코딩하는 서열에 결합시켜 이론상의 서열을 디자인하였다. 이러한 XbaI NotI DNA 단편은 뮤린 버전에서 사용된 것 (상기 기술된 pTG17786 및 pTG17789에서의 것)과 동일한 비번역 서열 (Kozak 서열 포함)을 5' 말단에 유지하였다. 이어서, CHO에서 발현할 수 있도록 키메라 CXIIG6 중쇄의 코돈을 최적화시키고, 합성하고, XbaI NotI을 통해 pTG17812 (도 12)로 클로닝하였다 (진아트 아게에 의해 실시). 수득된 키메라 CXIIG6 IgG1 중쇄 (가변 및 불변 영역)의 코돈이 최적화된 핵산 서열이 서열 번호: 35에 기재되어 있고, 수득된 플라스미드를 pTG17868 (도 13)로 명명하였다. 수득된 키메라 CXIIG6 IgG4 중쇄 (가변 및 불변 영역)의 코돈이 최적화된 핵산 서열이 서열 번호: 36에 기재되어 있고, 수득된 플라스미드를 pTG17869 (도 14)로 명명하였다.

mAb CXIIG6으로부터의 인간 항체 생성

인간화된 경쇄 변이체를 생성하기 위해, 표 2에 따른 아미노산 치환을 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 가변 영역 내에서 실시하였다.

CXIIG6 VΚ 도메인 (서열 번호: 3으로부터의 것)에 치환이 있는 변형된 서열을 인간 IGΚC 영역을 코딩하는 서열 (진뱅크 수탁 번호: J00241)에 결합시켜 DNA 서열을 디자인하였다. 이러한 XbaI NotI DNA 단편은 뮤린 버전에서 사용된 것 (상기 기술된 pTG17787 및 pTG17788에서의 것)과 동일한 비번역 서열 (Kozak 서열 포함)을 5' 말단에 유지하였다. 이어서, CHO에서 발현할 수 있도록 인간화된 CXIIG6 경쇄 서열의 코돈을 최적화시키고, 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하고, XbaI NotI을 통해 pOptiVEC™ (도 10)로 클로닝하였다 (진아트 아게에 의해 실시). 수득된 인간화된 CXIIG6 경쇄 변이체 및 플라스미드가 도 15에 열거되어 있다.

인간화된 중쇄 변이체를 생성하기 위해, 표 1에 따른 아미노산 치환을 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 가변 영역 내에서 실시하였다.

CXIIG6 VH 도메인 (서열 번호: 1로부터의 것)에 치환이 있는 변형된 서열을 인간 IGHG1C 영역을 코딩하는 서열 (진뱅크 수탁 번호: J00228)에 결합시켜 DNA 서열을 디자인하였다. 상기 XbaI ApaI DNA 단편은 뮤린 버전에서 사용된 것 (상기 기술된 pTG17786 및 pTG17789에서의 것)과 동일한 비번역 서열 (Kozak 서열 포함)을 5' 말단에 유지하였다. 이어서, DNA 서열은 CHO에서 발현할 수 있도록 서열의 코돈을 최적화시키고, 합성하고, XbaI ApaI을 통해 pTG17812 (도 12)로 클로닝하였다 (진아트 아게에 의해 실시). 수득된 인간화된 CXIIG6 IgG1 중쇄 변이체 및 플라스미드가 도 16에 열거되어 있다.

재조합 뮤린 CXIIG6 및 키메라 CXIIG6 IgG1의 시험관내 저해 활성

(상기 기술된 것과 같은) 정제된 재조합 뮤린 CXIIG6 및 그의 키메라 IgG1 변이체 (상기 기술된 것과 같은 키메라 CXIIG6 IgG1)가 가용성 인간 CSF-1R을 차단할 수 있는지를 측정하기 위해, (상기 기술된 것과 같은) M-NFS-60 세포 증식 및 파골세포 분화 모델에서 용량-반응 연구를 실시하였다. 로크랜드(Rockland) (로크랜드, 010-0141)로부터 입수한 정제된 폴리클로날 뮤린 IgG2a 및 출원인이 생산한 키메라 IgG1을 대조군 항체로서 함께 병행하여 시험하였다. SPR 바이오센서 분석법으로 항원 결합에 의해 측정되는 바와 같이, 세포를 다양한 농도의 활성 항-CSF-1R 항체에 노출시켜 차단 효과를 평가하였다. 동량의 전체 항체를 로딩하여 (Fc 결합에 의한 SPR 바이오센서 분석법), mAb CXIIG6과 그의 각 대조군 mAb 사이의 비교를 실시하였다.

M-NFS-60 바이오분석: M-NFS-60 바이오분석에서는, 48시간 동안 50 ng/ml 인간 가용성 CSF-1R 및 1 ng/ml 인간 CSF-1의 존재하에 세포를 0.23 ng/ml 내지 0.5 ㎍/ml의 활성 mAb CXIIG6 (재조합 뮤린 CXIIG6; 키메라 CXIIG6 IgG1) 또는 상응하는 농도의 대조군 mAb로 처리하였다. 도 17에 도시된 결과는 mAb CXIIG6 둘 모두 (재조합 뮤린 CXIIG6; 키메라 CXIIG6 IgG1)의 농도가 증가함에 따라 그에 대한 반응으로 M-NFS-60 세포 성장이 증가하였음을 나타내고, 이는 상기 mAb CXIIG6 둘 모두가 가용성 CSF-1R의 CSF-1에의 결합을 길항시킨다는 것을 입증한다 (웰 3개의 평균 +/- SEM). 세포 증식을 회복시키는 데 있어서 키메라 CXIIG6 IgG1은 재조합 뮤린 CXIIG6 만큼 효과적이었다. 대조군 뮤린 IgG2a 및 키메라 IgG1은 그의 각 농도 범위에 걸쳐서 가용성 CSF-1R에 의한 CSF-1 중화에는 어떤 효과도 나타내지 못했다.

파골세포 바이오분석: 파골세포 바이오분석에서는 8일 동안 25 ng/ml CSF-1 (이뮤노툴스(ImmunoTools)) 및 40 ng/ml RANKL의 존재하에 용출된 인간 단핵구를 0.85 ng/ml 내지 0.62 ㎍/ml의 활성 mAb CXIIG6 (재조합 뮤린 CXIIG6; 키메라 CXIIG6 IgG1)과 함께 인큐베이션시켰다. 배지와 모든 첨가제를 4일째 및 6일째 보충해 주고, 6일째부터 8일째까지 조절된 배양 배지 중 총 MMP-9를 측정하였다. 도 18에 도시된 결과는, 대조군 항체와 비교하여, 재조합 뮤린 CXIIG6 및 그의 키메라 변이체 (키메라 CXIIG6 IgG1)가 각각 파골세포 분화를 병행하여 이루어지는 MMP-9 생산을 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났고, 이는 성장이 지연되었음을 나타낸다 (도 18; 웰 3개의 평균 +/- SEM).

동시에, 이러한 결과는 정제된 재조합 뮤린 CXIIG6 및 키메라 CXIIG6 IgG1이 세포-표면 인간 CSF-1R 뿐만 아니라, 가용성 인간 CSF-1R도 저해시킨다는 것을 추가로 입증하는 것이다.

참고문헌

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Artificial Sequence: plasmid pTG17868“ <400> 1 atgtacctgg gcctgaacta cgtgttcatc gtgtttctgc tgaacggcgt gcagagcgag 60 gtgaagctgg aggaaagcgg cggagggctg gtgcagccag gcgggagcat gaaactgtcc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcgac gcctggatgg actgggtgcg ccagagcccc 180 gagatgggcc tggagtgggt ggccgagatc aggtccaagg ccaacaacca cgccaccttc 240 tacgccgaga gcgtgaaggg caggttcacc atcagcaggg acgacagcaa gagcagcgtg 300 tacctgcaga tgaacagcct gaggcccgag gacaccggca tctactactg caccagagtg 360 aaagtgggct tcgacaactg gggccagggc accacactga ccgtgtccag cgccagcacc 420 aagggcccca gcgtgttccc cctggccccc agctccaaga gcaccagcgg aggaacagct 480 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ttggaacagc 540 ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac 600 agcctgagca gcgtggtgac agtgcccagc agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 720 gacaagaccc acacctgtcc tccctgccca gccccagagc tgctgggcgg accctccgtg 780 ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca 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Claims

서열 번호: 11, 12 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역, 및 서열 번호: 14, 15 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는, 인간 CSF-1R에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항에 있어서, 가변 영역이 3개의 인간 FR (프레임워크 영역)을 포함하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 가변 영역이 4개의 인간 FR (프레임워크 영역)을 포함하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 서열 번호: 11, 12 및 13에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역이 서열 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제4항에 있어서, 상기 가변 영역이 서열 번호: 6에 기재되어 있는 것인 항체.
제1항에 있어서, 서열 번호: 14, 15 및 16에 기재된 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역이 서열 번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제6항에 있어서, 상기 가변 영역이 서열 번호: 9에 기재되어 있는 것인 항체.
제7항에 있어서, 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
제8항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 K3Q, E5V, M18L 및 P90A의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
제8항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 K3Q, E5V, M18L, K19R, S40A, E42G, M43K, R89K, P90T, I95V, T113L 및 L114V의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
제8항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 A9S, E17D, T18R, Q40P, S43A, Q45K, A55E, D56S, Q70D, S72T, K74T, N76S, S80P, S85T 및 G100Q의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
제8항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 A9S, V13A, E17D, T18R, Q40P, K74T, N76S 및 S80P의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
제8항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 A9S, V13A, E17D, T18R, Q40P, S43A, Q45K, V48L, D56S, Q70D, S72T, K74T, N76S, S80P, G84A, S85T 및 G100Q의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간 항체, Fab, F(ab')₂, Fv, scFv, 항체 단편, 디아바디 및 Fd를 포함하는 군으로부터 선택된 항체.
제14항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 10⁹ M^-1 이상의 결합 친화성을 갖는 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선감작제, 수용체 및 세포독성제 중 하나 이상에 접합된 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제18항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 암, 신장성 골이영양증, 간 골이영양증, 골다공증, 골경화증, 치주 질환, 섬유 형성이상 또는 파제트병을 치료하기 위한 제약 조성물.
제20항에 있어서, 관심의 대상이 되는 화합물을 추가로 포함하는 제약 조성물.
제21항에 있어서, 상기 관심의 대상이 되는 화합물이 암 치료제 또는 골량 감소 치료에 유용한 화합물인 제약 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 전이성 암 환자에서 골로 전이되는 전이성 암을 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 염증성 장 질환 환자를 치료하기 위한 제약 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 류마티스 관절염 환자를 치료하기 위한 제약 조성물.
(i) 제20항에 따른 제약 조성물, 및
(ii) 관심의 대상이 되는 화합물
을 포함하고, 암, 신장성 골이영양증, 간 골이영양증, 골다공증, 골경화증, 치주 질환, 섬유 형성이상 또는 파제트병을 치료하기 위한, 부품으로 구성된 키트(kit of part).
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