JP2015096522A - Csf−1rに対する抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌及び骨分解の処理のためのコロニー刺激因子−1(CSF−)の阻害の為にチロシンキナーゼ受容体(CSF−1R)に特異的な抗体、該抗体を含んでなる組成物、及び該組成物を用いた処置方法の提供。【解決手段】CSF−1Rと特異的に結合し、特定のアミノ酸配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含んでなる、抗体、該抗体をコードする核酸配列、該核酸配列を含んでなるベクター、及び該抗体、該核酸配列又は該ベクターと薬学上許容される担体を含んでなる医薬組成物。【選択図】なし
Description
CSF−1(コロニー刺激因子−1)は、特に種々のタイプの細胞により発現されるサイトカインである。それはCSF−1の受容体(CSF−1R)を発現する単核食細胞系列細胞の分化、成長および生存因子である(SHERR. Colony-stimulating factor-1 receptor, blood. 1990, vol.75, no.1 , p.1-12)。CSF−1Rは、細胞内キナーゼドメインと、5つの免疫グロブリン様サブドメインで構成されたリガンド結合細胞外領域を含有するc−fms癌原遺伝子(protoonogene)によりコードされているチロシンキナーゼ受容体である。CSF−1Rに応答すると、生存、成長、分化および可逆的な機能変化の増大が起こる。このc−fms遺伝子はそれ自体、マクロファージ分化マーカーである。c−fmsの発現程度は、リゾチームおよびマクロファージ特異的タンパク質チロシンホスファターゼをはじめとする他のマクロファージ特異的遺伝子の発現程度よりも強い(HUME, et al. Regulation of CSF-1 receptor expression. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1 , p.46-52)。
単核食細胞系列の細胞の他、CSF−1Rは多種のヒト腫瘍によっても発現される。乳癌では、CSF−1R発現はより大きな腫瘍サイズおよび低い生存率と関連している(KLUGER, et al. Macrophage colony-stimulating factor-1 receptor expression is associated with poor outcome in breast cancer by large cohort tissue microarray analysis. Clinical cancer research. 2004, vol.10, no.1 , p.173-7; SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6)。上皮卵巣癌では、大多数の原発腫瘍および転移がCSF−1Rを強く発現し、転移が頻繁にCSF−1とCSF−1Rを同時発現する。CSF−1Rはまた腫瘍浸潤マクロファージによっても発現される(CHAMBERS, et al. Overexpression of epithelial macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) and CSF-1 receptor: a poor prognostic factor in epithelial ovarian cancer, contrasted with a protective effect of stromal CSF-1. Clinical Cancer Research. 1997, vol.3, no.6, p.999-1007)。卵巣癌および子宮内膜癌では、ノーザンブロット分析は、極めて多くの腫瘍がCSF−1とCSF−1Rを同時発現するが、CSF−1Rの発現は、正常な子宮内膜組織サンプルにおいては弱くしか検
出されないことを示す(BAIOCCHI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies. Cancer. 1991, vol.67, no.4, p.990-6)。
子宮頸癌では、CSF−1R発現は、正常な子宮内膜と比較して腫瘍間質と腫瘍上皮の双方でアップレギュレーションされている(KIRMA, et al. Elevated expression of the oncogene c-fms and its ligand, the macrophage colony-stimulating factor-1, in cervical cancer and the role of transforming growth factor-beta1 in inducing c-fms expression. Cancer res.. 2007, vol.67, no.5, p.1918-26)。腎臓癌では、高レベルのCSF−1Rを発現する腫瘍関連マクロファージの浸潤が腫瘍の進行に関連している(HEMMERLEIN, et al. Expression of acute and late-stage inflammatory antigens, c-fms, CSF-1, and human monocytic serine esterase 1, in tumor-associated macrophages of renal cell carcinomas. Cancer immunology, immunotherapy. 2000, vol.49, no.9, p.485-92)。CSF−1Rは、100%近くの前立腺上皮内新生物または癌サンプルにより発現される(IDE, et al. Expression of colony-stimulating factor 1 receptor during prostate development and prostate cancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 2002, vol.99, no.22
, p.14404-9)。また、CSF−1R発現は、急性骨髄芽球性白血病およびB細胞慢性リンパ性白血病でも検出されている(RAMBALDI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and c-fms genes in human acute myeloblasts leukemia cells. Journal of Clinical Investigation. 1988, vol.81 , no.4, p.1030-5)。
出されないことを示す(BAIOCCHI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and its receptor in gynecologic malignancies. Cancer. 1991, vol.67, no.4, p.990-6)。
子宮頸癌では、CSF−1R発現は、正常な子宮内膜と比較して腫瘍間質と腫瘍上皮の双方でアップレギュレーションされている(KIRMA, et al. Elevated expression of the oncogene c-fms and its ligand, the macrophage colony-stimulating factor-1, in cervical cancer and the role of transforming growth factor-beta1 in inducing c-fms expression. Cancer res.. 2007, vol.67, no.5, p.1918-26)。腎臓癌では、高レベルのCSF−1Rを発現する腫瘍関連マクロファージの浸潤が腫瘍の進行に関連している(HEMMERLEIN, et al. Expression of acute and late-stage inflammatory antigens, c-fms, CSF-1, and human monocytic serine esterase 1, in tumor-associated macrophages of renal cell carcinomas. Cancer immunology, immunotherapy. 2000, vol.49, no.9, p.485-92)。CSF−1Rは、100%近くの前立腺上皮内新生物または癌サンプルにより発現される(IDE, et al. Expression of colony-stimulating factor 1 receptor during prostate development and prostate cancer progression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 2002, vol.99, no.22
, p.14404-9)。また、CSF−1R発現は、急性骨髄芽球性白血病およびB細胞慢性リンパ性白血病でも検出されている(RAMBALDI, et al. Expression of the macrophage colony-stimulating factor and c-fms genes in human acute myeloblasts leukemia cells. Journal of Clinical Investigation. 1988, vol.81 , no.4, p.1030-5)。
免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションにより行われた研究では、浸潤性乳癌細胞におけるCSF−1発現の特異性が示されたが、管内性または非浸潤性腫瘍細胞では、このような産生は見られなかった(SCHOLL, et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. Journal of the National Cancer Institute. 1994, vol.86, no.2, p.120-6 ; TANG, et al. M-CSF (monocyte colony stimulating factor) and M-CSF receptor expression by breast tumour cells: M-CSF mediated recruitment of tumour infiltrating monocytes?. Journal of cellular biochemistry. 1992, vol.50, no.4, p.350-6)。浸潤性腫瘍細胞によるCSF−1の産生は患者の血漿におけるその濃度の上昇と相関があり、この場合には、正常な被験体における300pg/ml未満に対して1000pg/mlを超え得る。高い血清濃度はこの疾患の進行段階および好ましくない短い予後と相関がある(SCHOLL, et al. Circulating levels of colony-stimulating factor 1 as a prognostic indicator in 82 patients with epithelial ovarian cancer. British journal of cancer. 1994, vol.69, no.2, p.342-6; SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83)。さらに、CSF−1は腫瘍細胞の運動と浸潤を刺激することが実証されている(DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1 , p.186-90; WANG, et al. Induction of monocyte migration by recombinant macrophage colony-stimulating factor. Journal of immunology. 1988, vol.141 , no.2, p.575-9; FILDERMAN, et al. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1) enhances invasiveness in CSF-1 receptor-positive carcinoma cell lines. Cancer res. 1992, vol.52, no.13, p.3661-6)。
CSF−1はまた骨髄系列の前駆体に対して走化効果を有し、これが腫瘍において単球の浸潤を促進する。しかしながら、これらの単球の存在は、免疫系による腫瘍の破壊を観察するには十分でない(DORSCH, et al. Macrophage colony-stimulating factor gene transfer into tumor cells induces macrophage infiltration but not tumor suppression. European journal of immunology. 1993, vol.23, no.1, p.186-90)。乳房、卵巣または膵臓の腫瘍に罹患している患者に共通に見られる高い血清含量で、CSF−1はこれらの単球の、腫瘍抗原を提示し得る樹状細胞へではなく、マクロファージへの分化を方向づけ、従って、腫瘍細胞に対する有効な細胞傷害性免疫応答を誘導する(SCHOLL. Circulating levels of the macrophage colony stimulating factor CSF-1 in primary and metastatic breast cancer patients. A pilot study. Breast cancer research and treatment. 1996, vol.39, no.3, p.275-83; BARON, et al. Modulation of MHC class II transport and lysosome distribution by macrophage-colony stimulating factor in human dendritic cells derived from monocytes. Journal of cell science. 2001, vol.114, no.pt5, p.999-1010)。
CSF−1はまた、破骨細胞の増殖および分化にも必須である(CECCHINI, et al. Role of CSF-1 in bone and bone marrow development. Molecular reproduction and development. 1997, vol.46, no.1, p.75-83)。破骨細胞は、骨の発達、ホメオスタシスおよび修復の際に、石灰化した骨の分解を主として担う造血径前駆体に由来する、CSF−1Rを発現する多核細胞である。骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、関節リウマチ、腫瘍転移およびパジェット病などの種々の骨格障害では、破骨細胞による骨の吸収が骨芽細胞による骨形成を上回り、骨量の低下、骨格の脆弱性および骨折をもたらす(BRUZZANITI, et al. Molecular regulation of osteoclast activity. Reviews in endocrine. 2006, vol.7, no.1-2, p.123-39)。例えば、進行した乳癌を有する患者は骨に転移を起こすことが多い。骨転移は難治性疼痛および腫瘍による骨の欠損(骨溶解)のための骨折の高いリスクをもたらし、これは破骨細胞活性の増大によって引き起こされる(CICEK, et al. Breast cancer bone metastasis and current small therapeutics. Cancer metastasis reviews. 2006, vol.25, no.4, p.635-44)。骨溶解は高レベルの循環CSF−1と関連していることが示されている(KITAURA, et al. The journal of clinical investigation. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. 2005, vol.115, no.12, p.3418-27)。
CSF−1経路はまた、炎症性腸疾患などの疾患の腸管炎症の媒介(MARSHALL, et al. Blockade of colony stimulating factor-1 (CSF-I) leads to inhibition of DSS-induced colitis. Inflammatory bowel diseases. 2007, vol.13, no.2, p.219-24)、急性同種移植片拒絶の際のマクロファージ増殖(JOSE, et al. Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophage proliferation and accumulation in renal allograft rejection. American journal of transplantation. 2003, vol.3, no.3, p.294-300)および感染マクロファージにおけるHIV−1複製(KUTZA, et al. Macrophage colony-stimulating factor antagonists inhibit replication of HIV-1 in human macrophages. Journal of immunology. 2000, no.164, p.4955-4960)にも関与している。
これらの理由で、癌および骨分解の処置に種々の化合物によるCSF−1活性の阻害が提案されている。
背景技術
WO01/30381は、腫瘍疾患の処置用薬剤の製造におけるCSF−1活性の阻害剤の使用に関する。CSF−1活性の阻害のために提案される2つのアプローチは、CSF−1活性自体の抑制とCSF−1Rの活性の抑制である。CSF−1またはその受容体に対する中和抗体はCSF−1活性の阻害剤として好ましい。
WO01/30381は、腫瘍疾患の処置用薬剤の製造におけるCSF−1活性の阻害剤の使用に関する。CSF−1活性の阻害のために提案される2つのアプローチは、CSF−1活性自体の抑制とCSF−1Rの活性の抑制である。CSF−1またはその受容体に対する中和抗体はCSF−1活性の阻害剤として好ましい。
WO03/059395は、CSF−1活性を阻害することができる物質と細胞傷害性活性を有する物質を含んでなる、癌の処置のための組合せ物を記載している。
WO2005/068503は、対象にCSF−1に対する抗体を投与することにより、骨溶解、癌転移および癌転移に関連する骨の欠損を予防および治療するための方法を開示している。
EP1488792Aは、CSF−1Rチロシンキナーゼ活性を有効に阻害することによる分化、増殖またはメディエーターの放出の選択的阻害を示す単環式および/または二環式アリールまたはヘテロアリールキナゾリン化合物の使用に関するものである。この出願はまた、異常な細胞増殖を阻害することを目的とした薬剤の製造のためのこのような化合物の使用に関するものでもある。
US2005059113は、aCSF−1と特異的に結合する抗体およびその抗原結合部分に関するものである。この発明はまた、ヒト抗CSF−1抗体およびその抗原結合部分に関するものでもある。この出願発明はまた、ヒト抗CSF−1抗体を含んでなる重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を用いる遺伝子療法も提供する。
本発明は、CSF−1Rと特異的に結合する抗体に関する。
出願全体を通じて用いられているように、「a」および「an」は、文脈がそうではないことを明示していない限り、「少なくとも1つ」、「少なくとも第一」、「1以上」または「複数」の示された成分または工程を意味するものとして用いられる。例えば、「a cell」は、その混合物を含め、複数の細胞を示す。
「および/または」とは、本明細書で用いる場合は常に、「および」、「または」と「この用語によって結ばれた要素の総てまたは他のいずれかの組合せ」という意味を含む。
本明細書において「約」または「およそ」とは、示された値または範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。
本明細書において「含んでなる(comprising and comprise)」とは、そのパーツキット、生成物、組成物および方法が示されている成分または工程を含むが、他を排除するものではないことを意味するものとする。「から本質的になる」は、生成物、組成物および方法を定義するために用いる場合、任意の本質的に重要なもの以外の成分または工程を排除することを意味する。従って、記載の成分から本質的になる組成物は、微量夾雑物および薬学上許容される担体を排除するものではない。「からなる」は、他の成分または工程のわずかな要素も排除することを意味する。
本明細書において「と特異的に結合する」とは、タンパク質およびその他の生物産物の異種集団の存在下で、標的タンパク質の存在を決定付ける結合反応を意味する。よって、示されたアッセイ条件下で、本発明による抗体はCSF−1Rの少なくとも一部と優先的に結合し、試験サンプル中に存在する他の成分とは有意な量では結合しない。本発明による抗体とCSF−1R標的の間の特異的結合とは、その結合親和性が少なくとも103M−1、好ましくは105M−1、106M−1、107M−1、108M−1、109M−1または1010M−1であることを意味する。
本明細書において「CSF−1R」とは、ヒトCSF1受容体を意味する。ヒトCSF−1受容体はすでに配列決定されており、そのアミノ酸配列は配列番号29に示されている。
本明細書において「抗体」または「Ab」は広義で用いられる。よって、「抗体」または「Ab」は、天然物でも、または慣例のハイブリドーマ技術、組換え型技術により作製されるモノクローナル抗体(mAb)などの人工物でも、および/またはその機能的フラグメントであってもよい。本発明の抗体は、完全な免疫グロブリン分子、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、動物抗体(例えば、ラクダ抗体)、キメラ抗体、ならびにその一部、フラグメント、領域、ペプチドおよび誘導体(限定されるものではないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの任意の公知の技術によって提供される)、例えば、軽鎖を欠く免疫グロブリン(例えば、米国特許第6,005,079号参照)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体フラグメント、ダイアボディー、Fd、CDR領域、または抗原もしくはエピトープと結合し得る抗体の任意の部分またはペプチド配列の双方を含むものとする。抗体は、それが分子と特異的に反応し、それにより、その分子と抗体が結合することができる場合に、「分子と結合することができる」と言う。抗体フラグメントまたは部分は完全な抗体のFcフラグメントを欠いてもよく、循環から速やかに排除され、完全な抗体より低い非特異的組織結合を持ち得る。抗体の例は完全な抗体から、パパイン(Fabフラグメントの作製のため)またはペプシン(F(ab’)2フラグメントの作製のため)などの酵素を用いたタンパク質分解切断によって作製され得る。例えば、Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983)参照。抗体の一部は、上記方法のいずれかにより作製可能であり、あるいは組換え分子の一部を発現することにより作製可能である。例えば、組換え抗体のCDR領域を単離し、適当な発現ベクターにサブクローニングすることができる。
本明細書において「可変領域」とは、結合認識特異性の決定基を含む軽鎖(VL)または重鎖(VH)の可変領域またはドメインを意味する。可変ドメインは抗原認識に関与し、抗原結合部位を形成する。本明細書において「フレームワーク領域」とは、同種の異なる抗体間で少なくとも85%相同な(すなわち、CDR以外)軽鎖および重鎖可変領域の部分を意味する。本明細書において「相同」とは、Smith−Watermanアルゴリズム(SMITH, et al. Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology. 1981, no.147, p.195-7)を用いてアラインした際に、示されている同じアミノ酸のパーセンテージをほぼ有する、2つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味する。例えば、「85%相同」とは、最適にアラインされた際に85%のアミノ酸同一性を有する、2つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味する。重鎖および軽鎖双方の可変領域は、Kabatのデータベース(Kabat et al.,前掲)で定義される超可変配列の3つのストレッチ、すなわち、相補性決定領域(CDR)(FR1とFR2の間に位置するCDR1、FR2とFR3の間に位置するCDR2、およびFR3とFR4の間に位置するCDR3)が挿入された4つのフレームワーク部分領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)を含んでなるセグメントに分割される。特定の部分領域をFR1、FR2、FR3またはFR4として特定しない場合、他により示されるフレームワーク領域は、単一の天然免疫グロブリン鎖の可変領域内のFRの組合せを表す。本明細書において、FRはフレームワーク領域を構成する4つの部分領域の1つを表し、FR’はその4つの部分領域の2以上を表す。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の組合せであり、CDRの配置およびアラインに役立つ。CDRは、抗原のエピトープに結合特異性と親和性を付与する抗体の結合部位の形成を主として担う。抗原結合領域を提供するHまたはL鎖の可変領域内には、特異性の異なる抗体間で極めて多様なために「超可変」と呼ばれるより小さな配列がある。このような超可変領域は、「相補性決定領域」または「領域」と呼ばれる。これらのCDR領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的特異性を説明する。CDRは、可変領域内のアミノ酸の不連続なストレッチを表すが、種にかかわらず、重鎖可変領域および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置取りは、可変鎖のアミノ酸配列内でも同様の位置を持つことが分かっている。
総ての抗体の可変重鎖および軽鎖がそれぞれ3つのCDR領域を有し、個々の軽(L)鎖および重(H)鎖については、他(L1、L2、L3、H1、H2、H3と呼ばれる)とは不連続である。認知されているCDR領域は、Kabat et al, 252 J. Biol. Chem. 6609-16 (1977)により記載されており、直鎖アミノ酸配列の調査の際にこれらの規則を適用することにより、CDRループを同定することができる。とはいえ、CDR−H3ループを定義するための規則は変動がある可能性があり(Chapter 4, Antibody Engineering: Methods & Protocols, (Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2004)参照)、いくつかのCDR−H3ループの実際の境界は、円偏光二色性、核磁気共鳴またはX線結晶学などの実験技術なしでは同定不能である。総ての哺乳類種で、抗体ペプチドは定常領域(すなわち、保存性が高い)と可変領域を含み、後者の中にCDRと、重鎖または軽鎖の可変領域内、CDR外のアミノ酸配列で構成される、いわゆる「フレームワーク領域」がある。これらのCDR領域はChothia命名法(CHOTHIA and LESK. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (1987) J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)を用いて定義することもできる。よって、ある特定の実施形態では、CDRはKabatにより定義されるCDRであり、他の実施形態では、CDRはChothiaにより定義されるCDRである。抗体のCDR領域により認識される抗原決定基に関しては、これはまた「エピトープ」とも呼ばれる。言い換えれば、エピトープは、抗体により認識され、結合され得る任意の分子の一部を意味する(対応する抗体結合領域はパラトープと呼ぶことができる)。一般に、エピトープは、例えばアミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。
総ての抗体の可変重鎖および軽鎖がそれぞれ3つのCDR領域を有し、個々の軽(L)鎖および重(H)鎖については、他(L1、L2、L3、H1、H2、H3と呼ばれる)とは不連続である。認知されているCDR領域は、Kabat et al, 252 J. Biol. Chem. 6609-16 (1977)により記載されており、直鎖アミノ酸配列の調査の際にこれらの規則を適用することにより、CDRループを同定することができる。とはいえ、CDR−H3ループを定義するための規則は変動がある可能性があり(Chapter 4, Antibody Engineering: Methods & Protocols, (Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2004)参照)、いくつかのCDR−H3ループの実際の境界は、円偏光二色性、核磁気共鳴またはX線結晶学などの実験技術なしでは同定不能である。総ての哺乳類種で、抗体ペプチドは定常領域(すなわち、保存性が高い)と可変領域を含み、後者の中にCDRと、重鎖または軽鎖の可変領域内、CDR外のアミノ酸配列で構成される、いわゆる「フレームワーク領域」がある。これらのCDR領域はChothia命名法(CHOTHIA and LESK. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins (1987) J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)を用いて定義することもできる。よって、ある特定の実施形態では、CDRはKabatにより定義されるCDRであり、他の実施形態では、CDRはChothiaにより定義されるCDRである。抗体のCDR領域により認識される抗原決定基に関しては、これはまた「エピトープ」とも呼ばれる。言い換えれば、エピトープは、抗体により認識され、結合され得る任意の分子の一部を意味する(対応する抗体結合領域はパラトープと呼ぶことができる)。一般に、エピトープは、例えばアミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。
本明細書において「モノクローナル抗体」または「mAb」とは、単一のクローンに由来する抗体を意味する。モノクローナル抗体は、HARLOW. Antibodies: A Laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor: Laboratory press, 1988およびHAMMERLING, et al. Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas. New York: Elsevier, 1981. p.563-681に開示されているものなどのハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。
本明細書において「ヒト抗体」とは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するか、または密接に適合する可変領域と定常領域を有する抗体を意味する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroにおけるランダムまたは部位指定突然変異誘発により、またはin vivoにおける体細胞突然変異により導入された突然変異)を含み得る。よって、本明細書において「ヒト抗体」とは、タンパク質の実質的に総ての部分がヒト生殖細胞系抗体と実質的に同じ抗体を意味する。「実質的に同じ」とは、ヒト生殖細胞系抗体の核酸配列と少なくとも80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、いっそうより好ましくは95%相同な核酸配列を有する抗体を意味する。
本明細書において「Fab」とは、重鎖および軽鎖の可変領域を含み、結合活性を示す抗体分子の領域を意味する。「Fab」は、1つの重鎖と1つの軽鎖の凝集物(一般にFabとして知られる)を含み、その凝集物が特定の抗原または抗原ファミリーと選択的に反応することができる限り、上記はいずれも共有結合的凝集であっても非共有結合的凝集であってもよい。Fabフラグメントは、VLと、VHおよびCH1ドメインを含んでなる第二のポリペプチドとを含んでなるヘテロ二量体である。好ましい実施形態では、この抗体はFab’フラグメントである。Fab’フラグメントは、Fab’フラグメントが抗体「ヒンジ領域」に由来する1以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基を含むという点でFabフラグメントとは異なる。
「F(ab’)2」とは、抗体のペプシン処理により得られる抗体フラグメントまたは組換え技術などの他の技術により得られる等価のタンパク質を意味する。F(ab’)2フラグメントは2つの抗原結合部位を含んでなお、抗原を架橋することができる。
「Fv」とは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。
この領域は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの、強固な非共有結合的会合の二量体からなる。各可変ドメインの3つのCDRはVH VL二量体の表面の抗原結合部位を定義すべく相互作用するのはこの構成である。合わせて考えると、6つのCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、完全な結合部位よりも親和性は低いものの、抗原を認識し、抗原と結合する能力を有する。
この領域は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの、強固な非共有結合的会合の二量体からなる。各可変ドメインの3つのCDRはVH VL二量体の表面の抗原結合部位を定義すべく相互作用するのはこの構成である。合わせて考えると、6つのCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、完全な結合部位よりも親和性は低いものの、抗原を認識し、抗原と結合する能力を有する。
「単鎖Fv」または「scFv」は、抗体のVHドメインとVLドメインを含んでなり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、scFvはさらにVHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーを含んでなり、これによりscFvは抗原結合に望ましい構造を形成することができる(LENNARD. Standard protocols for the construction of scFv libraries. Methods in molecular biology. 2002, no.178, p.59-71)。
本明細書において「抗体フラグメント」とは、CSF−1Rと特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上のフラグメントを意味する。
「ダイアボディー」とは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖(VH VL)において軽鎖可変ドメイン(VL)と連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含んでなる。同じ鎖の2つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとの対合を余儀なくされ、2つの抗原結合部位を作り出す。
ダイアボディーは1つまたは1を超えるエピトープと結合し得る。ダイアボディーは、POLJAK. Production and structure of diabodies. Structure. 1994, vol.2, no.12, p.1121-3., HUDSON, et al. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of immunological methods. 1999, vol.231, no.1-2, p.177-89およびKIPRIYANOV. Generation of bispecific and tandem diabodies. Methods in molecular biology . 2002, no.178, p.317-31により詳しく記載されている。
ダイアボディーは1つまたは1を超えるエピトープと結合し得る。ダイアボディーは、POLJAK. Production and structure of diabodies. Structure. 1994, vol.2, no.12, p.1121-3., HUDSON, et al. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of immunological methods. 1999, vol.231, no.1-2, p.177-89およびKIPRIYANOV. Generation of bispecific and tandem diabodies. Methods in molecular biology . 2002, no.178, p.317-31により詳しく記載されている。
抗体フラグメントの製造のために種々の技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは完全抗体のタンパク質加水分解消化により誘導されていた。しかしながら、現在、これらのフラグメントは組換え宿主細胞により直接生産することができる。Fab、FvおよびscFv抗体フラグメントは総て、大腸菌(E. coli)で発現させ、そこから分泌させることができ、従って、これらのフラグメントを大量に生産することができる。抗体フラグメントの生産のための技術は当業者に自明である。他の実施形態では、選択される抗体は単鎖Fvフラグメント(scFv)である。
本明細書において「ドメイン抗体」(dAb)は、抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)のいずれかの可変領域に相当する、抗体の最小機能的結合単位からなる。ドメイン抗体はおよそ13kDa、または全抗体の10分の1未満の大きさの分子量を有する。
本明細書において「Fd」とは、VHドメインとCH1ドメインからなる抗体フラグメントを意味する。
「抗体」または「Ab」はまた、当業者に周知の他の抗体フラグメント、例えば、HOLLIGER, et al. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature biotechnology. 2005, vol.23, no.9, p.1126-36およびHOOGENBOOM, et al. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunology today. 2000, vol.21, no.8, p.371-8を意味する。
一実施形態によれば、本発明の抗体は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、または配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDR;または
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、または配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDR;または
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される少なくとも1つのCDRを含んでなる。
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(iii)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR、または
(iv)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR
を含んでなる。
(iii)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR、または
(iv)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、または
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR
を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR;または
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR;または
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される少なくとも1つのCDR
を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(iv)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR、または
(iv)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDRを含んでなる。
(iv)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDR、または
(iv)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるCDRの群において互いに独立に選択される2個、いっそうより好ましくは3個のCDRを含んでなる。
一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号11、12もしくは13のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR、または(ii)配列番号14、15もしくは16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
(i)配列番号11、12もしくは13のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR、または(ii)配列番号14、15もしくは16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号11、12もしくは13のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または(ii)配列番号14、15もしくは16のいずれか1つで示される少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるような2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号17、18もしくは19のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR;または(ii)配列番号20、21もしくは22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号17、18もしくは19のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または(ii)配列番号20、21もしくは22のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示される少なくとも1つのCDRセットを含んでなる。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるような2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号23、24もしくは25のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR;または(ii)配列番号26、27もしくは28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号23、24もしくは25のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または(ii)配列番号26、27もしくまたは28のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるような2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる。
好ましい実施形態では、前記可変領域は、1つ、より好ましくは2つ、いっそうより好ましくは3つ、確かに好ましくは4つのフレームワーク領域、より好ましくはヒトFRをさらに含んでなる。本明細書において「ヒトFR」は、天然ヒト抗体のフレームワーク領域と少なくとも75%相同なフレームワーク領域である。
好ましい一実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号6で示されるようなアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる。
より好ましい実施形態では、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号6で示されるような可変領域を含んでなる。
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号9で示されるようなアミノ酸配列を含んでなる可変領域を含んでなる。
別のより好ましい実施形態では、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号9で示されるような可変領域を含んでなる。
別の実施形態では、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域;
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域;
(ii)配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(iii)配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(iv)配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(v)配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(vi)配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;ならびに
(vii)配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる可変領域の群において互いに独立に選択される2つの可変領域を含んでなる。
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域;
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列
で示されるようなCDRを含んでなる可変領域;
(ii)配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(iii)配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(iv)配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(v)配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;
(vi)配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;ならびに
(vii)配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる可変領域の群において互いに独立に選択される2つの可変領域を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDR
を含んでなる第一の可変領域と
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDR
を含んでなる第二の可変領域
を含んでなる。
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDR
を含んでなる第一の可変領域と
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDR
を含んでなる第二の可変領域
を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号6で示されるような可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような可変領域
を含んでなる。
(i)配列番号6で示されるような可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような可変領域
を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる。
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。
別の実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、(i)配列番号6で示されるような重鎖可変領域、および(ii)配列番号9で示されるような軽鎖可変領域を含んでなる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる可変領域と、
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる可変領域と、
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる可変領域
を含んでなるscFvである。
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号6で示されるような可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号6で示されるような可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)
・配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)
・配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、
・配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDR、および
・配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDR
を含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号6で示されるような重鎖可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
いっそうより好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で少なくとも1つのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)scFvが提供される。確かに好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で表1および表2に示されている総てのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。
(i)配列番号6で示されるような重鎖可変領域と、
(ii)配列番号9で示されるような軽鎖可変領域
を含んでなるscFvである。
いっそうより好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で少なくとも1つのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)scFvが提供される。確かに好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で表1および表2に示されている総てのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2で示されるような重鎖を含んでなる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号4で示されるような軽鎖を含んでなる。
より好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2で示されるような重鎖と配列番号4で示されるような軽鎖を含んでなる。
いっそうより好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はCSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2で示されるような2つの重鎖と配列番号4で示されるような2つの軽鎖を含んでなる。この特定の抗体は本願を通じてCXIIG6と呼ばれる。
別の好ましい実施形態によれば、本発明は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
(i)配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるようなCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるようなCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるようなCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
(i)配列番号11、12および13で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖変領域と、
(ii)配列番号14、15および16で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
(i)配列番号17、18および19で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号20、21および22で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
(i)配列番号23、24および25で示されるような3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、
(ii)配列番号26、27および28で示されるような3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
好ましい実施形態によれば、本発明は、CSF−1Rと特異的に結合し、
(i)配列番号6で示される重鎖可変領域と、
(ii)配列番号9で示される軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
より好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で少なくとも1つのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。いっそうより好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で表1および表2に示されている総てのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。
(i)配列番号6で示される重鎖可変領域と、
(ii)配列番号9で示される軽鎖可変領域
を含んでなるヒト抗体に関する。
より好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で少なくとも1つのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。いっそうより好ましい実施形態では、配列番号6および9で示されるようなアミノ酸配列内で表1および表2に示されている総てのアミノ酸が置換されている(表1および表2に従う)ヒト抗体が提供される。
本発明による抗体、より具体的には、ヒト抗体は、IgG、IgA、IgMまたはIgEなどの種々のイソ型であり得る。好ましい実施形態では、本発明による抗体、より具体的には、ヒト抗体はIgGである。
関連の実施形態では、このヒト抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の修飾または非修飾定常領域を含んでなる。好ましい実施形態では、この定常領域は、ある特性を増強または減弱するように修飾されていてもよいヒトIgGIまたはIgG4である。
IgGIの場合、定常領域、特にヒンジ領域またはCH2領域への修飾は、ADCCおよび/またはCDC活性を含むエフェクター機能を増強または減弱し得る。他の実施形態では、IgG2定常領域は抗体−抗原凝集物の形成を低下するように修飾する。IgG4の場合、定常領域、特にヒンジ領域への修飾は、ハーフ抗体の形成を低下させ得る。
所望の結合親和性は、その抗体の1以上のアミノ酸が突然変異されても保存される。これらの変異体は抗体中の少なくとも1つのアミノ酸が異なる残基で置換されている。別の実施形態によれば、本発明は、上記のようにCSF1と特異的に結合し、CDRに含まれる少なくとも1つのアミノ酸が保存的に置換されている抗体を提供する。保存的置換を表3に示す。
本発明はまた、親和性成熟(affinity maturation)により本発明の抗体を修飾する方法に関する。
本明細書において「親和性成熟」とは、1以上のCDRに含まれる1以上のアミノ酸の置換であって、その置換が、そのような置換を持たない親抗体に比べてCSF−1Rに対する抗体の親和性の向上をもたらす場合を意味する。親和性成熟法は当技術分野で公知である。例えば、MARKS, et al. By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology. 1992, vol.10, no.7, p.779-83; BARBAS, et al. In vitro evolution of a neutralizing human antibody to human immunodeficiency virus type 1 to enhance affinity and broaden strain cross-reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, vol.91, no.9, p.3809-13; SCHIER. Identification of functional and structural amino-acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene. 1996, vol.169, no.2, p.147-55; YELTON. Affinity maturation of the BR96 anti-carcinoma antibody by codon-based mutagenesis. J. Immunol.. 1995, vol.155, no.4, p.1994-2004; JACKSON, et al. In vitro antibody maturation. Improvement of a high affinity, neutralizing antibody against IL- 1 beta. J. immunol. 1995, vol.154, no.7, p.3310-9およびHAWKINS, et a
l. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of molecular biology. 1992, vol.226, no.3, p.889-96に開示されている方法を参照。
l. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. Journal of molecular biology. 1992, vol.226, no.3, p.889-96に開示されている方法を参照。
本発明はまた、従前に記載されているような親和性成熟により得られる、CSF−1Rと特異的に結合する抗体に関する。
別の実施形態では、本発明は、従前に記載されている抗体のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、いっそうより好ましくは少なくとも98%相同なアミノ酸配列を有する、従前に記載されている抗体の変異体を提供する。
別の実施形態では、本発明による抗体は1を超えるエピトープと特異的に結合する。例えば、本発明による抗体は、CSF−1Rの2つの異なるエピトープと結合し得る。あるいは、本発明による抗体は、CSF−1Rと、かつ、別の分子と結合することができる。
本明細書において、1を超えるエピトープと特異的に結合する抗体は架橋抗体であり得る。例えば、ある抗体はアビジンと、他のものはビオチンと結合させることができる。架橋抗体は当技術分野で周知の任意の共有結合的架橋法を用いて作製し得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作出するための技術もまた記載されている(例えば、BRENNAN, et al. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science. 1985, vol.229, no.4708, p.81-3およびSHALABY, et al. Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. The Journal of experimental medicine. 1992, vol.175, no.1 , p.217-25, KOSTELNY, et al. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. Immunol.. 1992, vol.148, no.5, p.1547-33参照)。
本明細書において、1を超えるエピトープと特異的に結合する抗体は架橋抗体であり得る。例えば、ある抗体はアビジンと、他のものはビオチンと結合させることができる。架橋抗体は当技術分野で周知の任意の共有結合的架橋法を用いて作製し得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作出するための技術もまた記載されている(例えば、BRENNAN, et al. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science. 1985, vol.229, no.4708, p.81-3およびSHALABY, et al. Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. The Journal of experimental medicine. 1992, vol.175, no.1 , p.217-25, KOSTELNY, et al. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J. Immunol.. 1992, vol.148, no.5, p.1547-33参照)。
好ましい実施形態によれば、本発明による、1を超えるエピトープと特異的に結合する抗体はダイアボディーである。
別の好ましい実施形態によれば、本発明による、1を超えるエピトープと特異的に結合する抗体は、ZAPATA, et al. Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein engineering. 1995, vol.8, no.10, p.1057-62に記載されているような直鎖抗体である。
本発明による抗体は、グリコシル化型であっても非グリコシル化型であってもよい。
本明細書において「グリコシル化」とは、抗体と共有結合されている炭水化物単位の存在を意味する。
別の実施形態では、本発明による抗体は放射線増感剤、受容体および/または細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされている。
本明細書において「放射線増感剤」とは、細胞を放射線療法に対してより高い感受性とする分子を意味する。放射線増感剤としては、限定されるものではないが、メトロニダゾール、ミゾニダゾール、デスメチルミゾニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ミノラゾール、マイトマイシンC、RSU1069、SR4233、E09、RB6145、ニコチンアミド、5−ブロモデオキシウリジン(BUdR)、5−ヨードデオキシウリジン(IUdR)、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン(FUdR)、ヒドロキシ尿素およびシスプラチンが挙げられる。
本明細書において「受容体」とは、リガンドと特異的に結合することができる化合物を意味する。本発明の好ましい実施形態によれば、受容体はビオチンである。
本明細書において、細胞傷害剤とは、細胞に直接的に有毒であり、生殖または成長を妨げる化合物を意味する。好ましい実施形態によれば、本発明において用いられる細胞傷害性薬剤は、癌治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素もしくはそのフラグメント)または放射性同位元素からなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明による抗体は標識剤とコンジュゲートされる。
本明細書において「標識剤」とは、検出可能な化合物を意味する。標識剤はそれ自体検出可能であり得る(例えば、放射性同位元素標識もしくは蛍光標識)か、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物の化学修飾を触媒し得る。
本明細書において「コンジュゲートされる」とは、本発明による抗体と標識剤が共有結合または非共有結合されることを意味する。
「共有結合」とは、所望によりクロスリンカーまたは他の活性化剤を介した反応性官能基間のカップリングを意味する(例えば、HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996参照)。本発明による抗体および/またはコンジュゲート薬剤は、例えば活性化されたカルボニル基(in situで活性化されたものを含む)上もしくはイミドエステル上での置換を介して、飽和炭素原子もしくはヘテロ原子に対する還元的アミノ化、求核置換により、芳香環に対する反応により、それらのカップリングを可能となるように修飾可能である。特に、カップリングはホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋試薬を用いて行うことができる。種々の部分に存在し得るアミン基のカップリングには、グルタルアルデヒド、コハク酸、およびDMS(スベリイミド酸ジメチル)のようなビスイミドエステルを含むホモ二官能性クロスリンカーが使用可能である。多くの例がHERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.118-228に示されており、当業者によく知られている。ヘテロ二官能性クロスリンカーとしては、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基、カルボニル反応性基とスルフヒドリル反応性基、およびスルフヒドリル反応性基と光反応性リンカーの双方を有するものが挙げられる。好適なヘテロ二官能性クロスリンカーは、例えば、HERMANSON. Bioconjugate techniques. Academic press, 1996. p.229-285に記載されている。例としては、例えば、SPDP(N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート)、SMBP(スクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート)、SMPT(スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル(−2−ピリジルジチオ)トルエン)、MBS(m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、SIAB(N−スクシンイミジル(4ヨードアセチル)アミノベンゾエート)、GMBS(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル)、SIAX(スクシンイミジル−6−ヨードアセチルアミノヘキソネート、SIAC(スクシンイミジル−4−ヨードアセチルアミノメチル)、NPIA(p−ニトロフェニルヨードアセテート)がある。他の例は炭水化物含有分子(例えば、env糖タンパク質、抗体)とスルヒドリル反応性基をカップリングさせるのに有用である。例としては、MPBH(4−(4−Nマレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド)およびPDPH(4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシル−ヒドラジド(M2C2Hおよび3−2(2−ピリジルジチオ)プロピルオニルヒドラジド)がある。
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。
「核酸配列」とは、ヌクレオチドの直鎖配列を意味する。ヌクレオチドはポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドまたは両者の混合物の直鎖配列のいずれかである。本発明においてポリヌクレオチドの例は、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖RNA、および一本鎖および二本鎖DNAとRNAの双方の混合物を有するハイブリッド分子がある。さらに、本発明のポリヌクレオチドは1以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明による核酸配列はベクター内に含まれる。
このベクターはプラスミドまたはウイルス起源であってよく、適当であれば、トランスフェクション効率および/またはベクターの安定性を改良する1以上の物質と組み合わせてもよい。これらの物質は当業者に入手可能な文献に広く記載されている(例えば、FELGNER, et al. Cationic liposome mediated transfection. Proceedings of the Western Pharmacology Society. 1989, vol.32, p.115- 21; HODGSON, et al. Virosomes: cationic liposomes enhance retroviral transduction. Nature biotechnology. 1996, vol.14, no.3, p.339-42; REMY, et al. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. Bioconjugate chemistry. 1994, vol.5, no.6, p.647-54参照)。非限定例として、この物質はポリマー、脂質、特に、陽イオン脂質、リポソーム、核タンパク質または中性脂質であり得る。これらの物質は単独で用いても組み合わせて用いてもよい。考えられる組合せとしては、陽イオン脂質(DOGS、DC−CHOL、スペルミン−chol、スペルミジン−cholなど)、リソリン脂質(例えば、ヘキサデシルホスホコリン)および中性脂質(DOPE)と組み合わせた組換えプラスミドベクターがある。
好ましい実施形態によれば、本発明で使用可能な陽イオン脂質はEP901463Bに記載されている陽イオン脂質、より好ましくは、pcTG90である。
本発明の範囲内で使用可能なプラスミドの選択肢は膨大である。それらはクローニングベクターおよび/または発現ベクターであり得る。一般的な方法では、それらは当業者に既知であり、それらの多くが市販されているとともに、遺伝子操作の技術を用いてそれらを構築または修飾することもできる。挙げられる例としては、pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)またはp Poly(LATHE, et al. Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts. Gene. 1987, vol.57, no.2-3, p.193-201)に由来するプラスミドがある。好ましくは、本発明において用いられるプラスミドは、生産細胞および/または宿主細胞において複製の開始を保証する複製起点を含む(例えば、大腸菌での産生を意図するプラスミドにはColEI基点が選択され、哺乳類宿主細胞でプラスミドが自己複製することを望む場合にはoriP/EBNA1系が選択される(LUPTON, et al. Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitate extrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived plasmids in human cells. Molecular and cellular biology. 1985, vol.5, no.10, p.2533-42; YATES, et al. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 1985, vol.313, no.6005, p.812-5)。このプラスミドは加えて、トランスフェクト細胞の選択または同定を可能とする選択遺伝子を含み得る(栄養要求性突然変異の補足、抗生物質体制をコードする遺伝子など)。本来、プラスミドは所定の細胞におけるその維持および/またはその安定性を改良する付加的要素を含み得る(単量型でのプラスミドの維持を促進するcer配列(SUMMERS, et al. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 1984, vol.36, no.4, p.1097-103)、細胞ゲノムに組み込むための配列)。
ウイルスベクターに関しては、ポックスウイルス(ワクシニアウイルス、特に、MVA、カナリア痘ウイルスなど)由来、アデノウイルス由来、レトロウイルス由来、ヘルペスウイルス由来、αウイルス由来、泡沫状ウイルス由来またはアデノウイルス随伴ウイルス由来のベクターを考えることができる。複製適格または複製欠陥ウイルスベクターを使用することができる。組み込まれないベクターを用いるのが好ましい。この点において、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルス由来ベクター、より好ましくは、ワクシニアウイルスおよびMVAは、本発明の実施に特に極めて好適である。
好ましい実施形態によれば、本発明のウイルスベクターは修飾ワクシニアウイルスAnkara(MVA)に由来する。MVAベクターおよびこのようなベクターを作製する方法は欧州特許EP83286AおよびEP206920A、ならびにSUTTER, et al. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proa Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol.89, no.22, p.10847-51に詳しく記載されている。より好ましい実施形態によれば、本発明による核酸配列はMVAベクターの欠失I、II、III、IV、VおよびVIに、いっそうより好ましくは欠失IIIに挿入することができる(MEYER, et al. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. The Journal of general virology. 1991, vol.72, no.Pt5, p.1031-8; SUTTER, et al. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine. 1994, vol.12, no.11, p.1032-40)。
レトロウイルスは、分裂細胞に感染し、ほとんどの場合には組み込まれる特性を有し、この点において、癌に関する使用に特に適当である。本発明による組換えレトロウイルス遺伝子は一般にLTR配列、キャプシド形成領域、およびレトロウイルスLTRまたは下記のものなどの内在プロモーターの制御下に置かれた本発明によるヌクレオチド配列を含む。組換えレトロウイルスはいずれの起源(ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど)のレトロウイルスに由来してもよく、特には、MoMuLV(モロニーネズミ白血病ウイルス)、MVS(ネズミ肉腫ウイルス)またはFriendネズミレトロウイルス(Fb29)に由来してもよい。それは、ウイルス粒子を構築するために必要とされるウイルスポリペプチドgag、polおよび/またはenvをトランスで供給し得るキャプシド形成細胞系統で増殖される。このような細胞系統は文献に記載されている(PA317、Psi CRIP GP+Am−12など)。本発明によるレトロウイルスベクターは、特にLTR(プロモーター領域を真核細胞プロモーターで置換)またはキャプシド形成領域(異種キャプシド形成領域、例えばVL3Oタイプで置換)に修飾を含み得る(米国特許第5747323号参照)。
ベクターが宿主生物または環境内で増殖することを避けるために、E1、E2、E4およびL1−L5領域から選択される、複製に必須な少なくとも1つの領域の全部または一部を欠いたアデノウイルスベクターを用いることも好ましい。E1領域の欠失が好ましい。しかしながら、それは、欠陥のある必須機能が相補的細胞系統および/またはヘルパーウイルスの手段によりトランスで補足される程度に、特にE2、E4および/またはL1−L5領域の全部または一部に影響を及ぼす他の修飾/質質と組み合わせることもできる。この点において、当技術分野の現状の第2世代ベクターを用いることが可能である(例えば、国際出願WO94/28152およびWO97/04119参照)。例として、E1領域およびE4転写単位の主部分の主要部分の欠失が特に極めて有利である。クローニング能力を高める目的で、アデノウイルスベクターは非必須E3領域の全部または一部を付加的に欠いてもよい。別法によれば、キャプシド形成に必須な配列、すなわち5’および3’ITR(逆方向末端反復配列)とキャプシド形成領域を保持した最小アデノウイルスベクターを用いることも可能である。様々なアデノウイルスベクターおよびそれらを作製する技術が知られている(例えば、GRAHAM, et al. Methods in molecular biology. Edited by MURREY. The human press inc, 1991. p.109-128)。
さらに、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種の観点と血清型の観点の双方から多様であり得る。該ベクターはヒトまたは動物(イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サルなど)起源のアデノウイルスのゲノムに由来するか、あるいは少なくとも2種の異なる起源のアデノウイルスゲノムフラグメントを含んでなるハイブリッドに由来する。より詳しくは、イヌ起源のCAV−1またはCAV−2アデノウイルス、トリ起源のDAVアデノウイルスまたはウシ起源のBad3型アデノウイルスが挙げられる(ZAKHARCHUK, et al. Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA. Archives of virology. 1993, vol.128, no.1-2, p.171-6; SPIBEY, et al. Molecular cloning and restriction endonuclease mapping of two strains of canine adenovirus type 2. The Journal of general virology. 1989, vol.70, no.Pt 1 , p.165-72 ; JOUVENNE, et al. Cloning, physical mapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2 genomes. Gene. 1987, vol.60, no.1 , p.21-8; MITTAL, et al. Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector. The Journal of general virology. 1995, vol.76, no. Pt 1, p.93-102)。しかしながら、好ましくは、血清型Cアデノウイルス、特に2または5型血清型Cアデノウイルスに由来するヒト起源のアデノウイルスベクターが好ましい。
本明細書において「複製適格」とは、トランス補足の不在下でも宿主細胞で複製し得るウイルスベクターに関する。
好ましい実施形態によれば、複製適格ベクターは複製適格アデノウイルスベクターである。これらの複製適格アデノウイルスベクターは当業者に周知である。これらのうち、ONYX−015ウイルス(BISCHOFF, et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells. Science. 1996, vol.274, no.5286, p.373-6; He HEISE, et al. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy. Nature Medicine. 2000, vol.6, no.10, p.1134-9; WO 94/18992)のように、55kD P53インヒビターをコードするE1b領域に欠失があるアデノウイルスベクターが特に好ましい。従って、このウイルスはp53欠陥新生物細胞に選択的に感染してそれを死滅させるために使用可能である。当業者ならば、確立された技術に従い、アデノウイルス5または他のウイルスでp53阻害遺伝子を突然変異および破壊することもできる。E1A Rb結合領域に欠失があるアデノウイルスベクターも本発明で使用可能である。例えば、E1A領域に24塩基対の欠失を有する突然変異アデノウイルスであるデルタ24ウイルス(FUEYO, et al. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo. Oncogene. 2000, vol.19, no.1, p.2-12)。デルタ24はRb結合領域に欠失を有し、Rbと結合しない。従って、この突然変異ウイルスの複製は正常細胞ではRbにより阻害される。しかしながら、Rbが不活化されて、細胞が新生物化すると、デルタ24はもはや阻害されない。代わりに、突然変異ウイルスは効率的に複製し、Rb欠陥細胞を溶解させる。
本発明によるアデノウイルスベクターは、ライゲーションまたは相同組換え(例えば、国際出願WO96/17070参照)により大腸菌Escherichia coli(E.coli)においてin vitroで、または相補的細胞系統で組換えにより作製することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、ベクターは本発明による抗体の発現に必要な要素をさらに含んでなる。
発現に必要な要素は、核酸配列がRNAへと転写され、mRNAがポリペプチドへと翻訳され得る総ての要素からなる。これらの要素は、特に調節型であっても構成型であってもよいプロモーターを含んでなる。当然、プロモーターは選択されるベクターおよび宿主細胞に適したものである。挙げられる例としては、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、MT(メタロチオネイン;MCIVOR. Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase: gene transfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by using recombinant amphotropic retroviruses. Molecular and cellular biology. 1987, vol.7, no.2, p.838-46)、α−1−アンチトリプシン、CFTR、界面活性剤、免疫グロブリン、アクチン(TABIN, et al. Adaptation of a retrovirus as a eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Molecular and cellular biology. 1982, vol.2, no.4, p.426-36)およびSRα(TAKEBE, et al. SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Molecular and cellular biology. 1988, vol.8, no.1, p.466-72)遺伝子の真核細胞プロモーター、SV40ウイルス(シミアンウイルス)の初期プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)のLTR、HSV−
1 TKプロモーター、CMVウイルス(サイトメガロウイルス)の初期プロモーター、ワクシニアウイルスのp7.5K pH5R、pK1L、p28およびp11プロモーター、p11K7.5などのキメラプロモーター、およびE1AおよびMLPアデノウイルスプロモーターがある。プロモーターは腫瘍または癌細胞で発現を刺激するプロモーターでもよい。乳癌および前立腺癌で過剰発現されるMUC−1遺伝子(CHEN, et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol.96, no.6, p.2775-82)、結腸癌で過剰発現されるCEA(癌胎児性抗原を表す)遺伝子(SCHREWE, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular and cellular biology. 1990, vol.10, no.6, p.2738-48)、黒色腫で過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子(VILE, et al. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res.. 1993, vol.53, no.17, p.3860-4)、乳癌および膵臓癌で過剰発現されるERBB−2遺伝子(HARRIS, et al. Gene therapy for cancer using tumour-specific prod
rug activation. Gene therapy. 1994, vol.1 , no.3, p.170-5)および肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン遺伝子(KANAI, et al. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res.. 1997, vol.57, no.3, p.461-5)のプロモーターが特に挙げられる。サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターが特に極めて好ましい。
1 TKプロモーター、CMVウイルス(サイトメガロウイルス)の初期プロモーター、ワクシニアウイルスのp7.5K pH5R、pK1L、p28およびp11プロモーター、p11K7.5などのキメラプロモーター、およびE1AおよびMLPアデノウイルスプロモーターがある。プロモーターは腫瘍または癌細胞で発現を刺激するプロモーターでもよい。乳癌および前立腺癌で過剰発現されるMUC−1遺伝子(CHEN, et al. Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC1 promoter. The Journal of clinical investigation. 1995, vol.96, no.6, p.2775-82)、結腸癌で過剰発現されるCEA(癌胎児性抗原を表す)遺伝子(SCHREWE, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression. Molecular and cellular biology. 1990, vol.10, no.6, p.2738-48)、黒色腫で過剰発現されるチロシナーゼ遺伝子(VILE, et al. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer res.. 1993, vol.53, no.17, p.3860-4)、乳癌および膵臓癌で過剰発現されるERBB−2遺伝子(HARRIS, et al. Gene therapy for cancer using tumour-specific prod
rug activation. Gene therapy. 1994, vol.1 , no.3, p.170-5)および肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン遺伝子(KANAI, et al. In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene. Cancer res.. 1997, vol.57, no.3, p.461-5)のプロモーターが特に挙げられる。サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターが特に極めて好ましい。
しかしながら、ワクシニアウイルス由来のベクター(例えばMVAベクターについて)が用いられる場合、チミジンキナーゼ7.5K遺伝子のプロモーターおよびpH5Rプロモーターが特に好ましい。
必要な要素として、宿主細胞で本発明によるヌクレオチド配列の発現またはその維持を改善する付加的要素をさらに含んでもよい。イントロン配列、分泌シグナル配列、核局在配列、IRES型の翻訳の再開始のための内部部位、転写終結ポリA配列、三分割リーダーおよび複製起点が特に挙げられる。これらの要素は当業者に知られている。分泌シグナル配列としては、配列番号5および/または8で示されるようなポリペプチドをコードする配列が特に好ましい。
本発明による組換えベクターは対象とする1以上の付加的遺伝子も含むことができ、これらの遺伝子は同じ調節要素(ポリシストロニックカセット)または独立要素の制御下に置くことができる。特に挙げられる遺伝子は、インターロイキンIL−2、IL−4、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、IL−18、ケモカイン(例えばCCL19、CCL20、CCL21、CXCL−14)、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)、および先天性免疫および血管形成に作用する因子(例えば、PAI−1、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を表す)をコードする遺伝子である。特定の一実施形態では、本発明による組換えベクターはIL−2をコードする対象遺伝子を含んでなる。
本発明はまた、本発明による核酸配列を含んでなる細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明による細胞は真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞である。発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞およびその他多くのものなどの多くの不死化細胞系統が含まれる。好適な付加的真核細胞には、酵母およびその他の真菌が含まれる。
本発明はまた、抗体の発現を許容する条件下で本発明による細胞を培養すること、および細胞または細胞周囲の培地から抗体を精製することを含んでなる本発明による抗体を生産するための方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、本発明による抗体、核酸配列またはベクターのいずれか1つと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物は対象化合物をさらに含んでなる。
薬学上許容される担体は、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、例えばスクロース溶液のような比較的低イオン強度を有する。さらに、このような担体は溶媒または水性もしくは部分的水性の液体、例えば非発熱性無菌水を含有してもよい。加えて、医薬組成物のpHはin vivo使用の要件を満たすように調整および緩衝化される。医薬組成物は、薬学上許容される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、ならびに可溶化剤、安定剤および保存剤を含んでもよい。注射投与の場合、水性、非水性または等張性溶液中の処方物が好ましい。それは、使用時に適切な希釈剤で再構成することができる、液体または乾燥形(粉末、凍結乾燥品など)の単回用量または多回用量として提供することができる。
本発明はまた、(i)本発明による医薬組成物、抗体、核酸配列またはベクターと、(ii)対象化合物を含んでなるパーツキットに関する。
本明細書において「対象化合物」とは、治療化合物、好ましくは、癌治療薬または骨量低下の処置に有用な化合物に関する。
好ましい実施形態によれば、癌治療薬は、アドレキサン(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物)、アドリアマイシン(塩酸ソルビシン)、アドルシル(フルオロウラシル)、アルダラ(イミキモド)、アレムツズマブ、アリムタ(ペメトレキセド二ナトリウム)、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アリミデックス(アナストロゾール)、アロマシン(エキセメスタン)、アラノン(ネララビン)、三酸化ヒ素、アバスチン(ベバシズマブ)、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、キャンパス(アレムツズマブ)、カンプトサール(塩酸イリノテカン)、カペシタビン、カルボプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、クラフェン(シクロホスファミド)、クロファラビン、クロファレックス(クロファラビン)、クロラール(クロファラビン)、シクロホスファミド、シタラビン、シトサール−U(シタラビン)、サイトキサン(シクロホスファミド)、ダコゲン(デシタビン)、ダサチニブ、デシタビン、デポサイト(リポソーマルシタラビン)、デポフォーム(リポソーマルシタラビン)、塩酸デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキシル(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、塩酸ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Dox−SL(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、エフデックス(フルオロウラシル)、エレンス(塩酸エピルビシン)、エロクサチン(オキサリプラチン)、エメンド(アプレピタント)、塩酸エピルビシン、エルビタックス(セツキシマブ)、塩酸エルロチニブ、エバセット(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、アビスタ(塩酸ラロキシフェン)、エキセメスタン、ファスロデックス(フルベストラント)、フェマラ(レトロゾール)、フルオロプレックス(フルオロウラシル)、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、塩酸ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール(塩酸ゲムシタビン)、グリベック(メシル酸イマチニブ)、ヘルセプチン(トラスツズマブ)、ハイカムチン(塩酸トポテカン)、メシル酸イマチニブ、イミキモド、イレッサ(ゲフィチニブ)、塩酸イリノテカン、イキサベピロン、イグゼンプラ(イキサベピロン)、ケオキシフェン(塩酸ラロキシフェン)、ケピバンス(パリフェルミン)、二トシル酸ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、レブラン(アミノレブリン酸)、リポドックス(塩酸ドキソルビシンリポソーム)、リポソーマルシタラビン、メタゾラストン(テモゾロマイド)、メトトレキサート、マイロサール(アザシチジン)、マイロターグ(ゲムツズマブオゾガマイシン)、ナノ粒子パクリタキセル(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物)、ネララビン、ネオサール(シクロホスファミド)、ネクサバール(トシル酸ソラフェニブ)、ニロチニブ、ノルバデックス(クエン酸タモキシフェン)、オンキャスパー(ペグアスパラガーゼ)、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子処方物、パリフェルミン、パニツムマブ、パラプラット(Paraplat)(カルボプラチン)、パラプラチン(カルボプラチン)、ペグアスパラガーゼ、ペメトレキセド二ナトリウム、プラチノール−AQ(シスプラチン)、プラチノール(シスプラチン)、塩酸ラロキシフェン、レブリミド(レナリドマイド)、リツキサン(リツキシマブ)、リツキシマブ、スクレロゾール胸腔内エアゾール(タルク)、トシル酸ソラフェニブ、スプリセル(ダサチニブ)、無菌タルクパウダー(タルク)、無菌タルク(タルク)、リンゴ酸スニチニブ、スーテント(リンゴ酸スニチニブ)、シノビール(Synovir)(サリドマイド)、タルク、クエン酸タモキシフェン、タラビンPFS(シタラビン)、タルセバ(塩酸エルロチニブ)、ターグレチン(ベキサロテン)、タシグナ(ニロチニブ)、タキソール(パクリタキセル)、タキソテール(ドセタキセル)、テモダール(テモゾロマイド)、テモゾロマイド、テムシロリムス、サロミド(サリドマイド)、サリドマイド、トテクト(Totect)(塩酸デクスラゾキサン)、塩酸トポテカン、トリセル(テムシロリムス)、トラスツズマブ、トリセノックス(三酸化ヒ素)、タイカーブ(Tykerb)(二トシル酸ラパチニブ)、ベクチビックス(パニツムマブ)、ベルケード(ボルテゾミブ)、ビダザ(アザシチジン)、ボリノスタット、ゼローダ(カペシタビン)、ザインカード(塩酸デクスラゾキサン)、ゾレンドロン酸、ゾリンザ(ボリノスタット)およびゾメタ(ゾレンドロン酸)からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態によれば、骨量低下の処置に有用な化合物は、ビホスフォネート、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、副甲状腺ホルモン(PTH)(例えば、テリパラチド(フォルテオ))、ラネリック酸ストロンチウム、デノスマブまたはカルシトニン、またはその組合せである。より好ましい実施形態によれば、ビホスフォネートは、アレンドロネート(フォサマックス、フォサマックスプラスD)、エチドロネート(ダイドロネル)、イバンドロネート(ボニバ)、パミドロネート(アレディア)、リセドロネート(アクトネル、アクトネルW/カルシウム)、チルドロネート(スケリッド)およびゾレンドロン酸(レクラスト、ゾメタ)からなる群から選択される。より好ましい実施形態によれば、SERMは、ラロキシフェン(エビスタ)、バゼドキシフェン/プレマリン(アプレラル(Aprelal))およびタモキシフェンからなる群から選択される。
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞活性の上昇に関連する疾患の処置のための、本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。このような疾患としては、限定されるものではないが、内分泌障害(高コルチコイド症、性機能不全症、原発性または続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進症)、高カルシウム血症、欠乏状態(くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調)、慢性疾患(吸収不良症候群、慢性腎不全(腎性骨形成異常)、慢性肝臓疾患(肝性骨形成異常)、薬剤(グルココルチコイド(グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症)、アンドロゲン抑制療法、アロマターゼ阻害療法、ヘパリン、アルコール)、および遺伝病(骨形成不全症、ホモシスチン尿症)、骨粗鬆症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、繊維性形成異常および/またはパジェット病が挙げられる。
別の実施形態によれば、本発明は、炎症および/または自己免疫に関連する疾患の処置のための、本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。このような疾患としては、限定されるものではないが、血清反応陰性脊椎関節症(乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、炎症性腸疾患に関連する脊椎関節症)、人工関節のゆるみ、結合組織疾患(若年性関節リウマチ、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)および狼瘡腎炎、硬皮症、シェーグレン症候群、混合型結合組織疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、ホウィップル病、肉芽腫性回結腸炎に関連する関節炎、炎症性皮膚症状(自己免疫性水疱性類天疱瘡、自己免疫性尋常性天疱瘡、湿疹、皮膚炎)、炎症性肺疾患(肺胞炎、肺繊維症、類肉腫症、喘息、気管支炎、閉塞性細気管支炎)、炎症性腎疾患(糸球体腎炎(glomerulonethritis)、腎(臓)の同種移植片拒絶、尿細管炎症)、アテローム性動脈硬化症、全身性脈管炎(側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、結節性多発性動脈炎、川崎病、ウェゲナー肉芽腫、チャーグ・ストラウス症候群、顕微鏡的多発性血管炎、壊死性糸球体腎炎、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、本態性寒冷グロブリン血症性脈管炎およびその他の小血管性脈管炎、ベーチェット病)、マクロファージ活性化疾患(マクロファージ活性化症候群(MAS)、成人スティル病、血球貪食症候群)、リウマチ性多発性筋痛、原発性胆汁性硬変、硬変性胆管炎、自己免疫性肝炎、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、多発性硬化症(MS)、ギラン−バレー症候群、アジソン病および/またはレイノー現象、グッドパスチャー症候群が挙げられる。
別の実施形態によれば、本発明は、癌の処置のための、本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
本明細書において「癌」とは、限定されるものではないが、腺癌、腺房細胞腺癌、副腎皮質細胞癌、肺胞細胞癌、未分化癌、基底様癌、基底細胞癌、細気管支癌、気管支原性癌、renaladinol癌、胎児性癌、類内膜癌、線維層板肝細胞癌、濾胞性癌、巨細胞癌、肝細胞癌、表皮内癌、上皮内癌、軟髄膜癌、髄様癌、黒色性癌、髄膜癌、子宮間膜癌、燕麦細胞癌、扁平上皮細胞癌腫、汗腺癌、移行上皮癌、管状細胞癌、エナメル芽細胞肉腫、血管血友病肉腫、ブドウ状肉腫、子宮内膜間質肉腫、ユーイング肉腫、神経束肉腫、巨細胞肉腫、顆粒膜肉腫、免疫芽球肉腫、傍骨性骨肉腫、coppices肉腫、白血球性肉腫(白血病)、リンパ性肉腫(リンパ肉腫)、髄様肉腫、骨髄性肉腫(顆粒球性肉腫)、austiogenci肉腫、骨膜肉腫、細網細胞肉腫(組織球性リンパ腫)、円形細胞肉腫、紡錘細胞肉腫、滑膜肉腫、毛細管拡張性聴原性肉腫、バーキットリンパ腫、NPDL、NML、NHおよびびまん性リンパ腫を意味する。好ましい実施形態によれば、本発明による方法は骨に対する転移癌の処置に向けられ、その転移癌は乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍(白血病およびリンパ腫を含む)、頭頸部癌、胃腸管癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸管癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む)、女性生殖管の悪性腫瘍(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌および子宮頸癌を含む)、膀胱癌、脳癌(神経芽腫を含む)、肉腫、骨肉腫ならびに皮膚癌(悪性黒色腫または扁平上皮細胞癌を含む)である。
本発明はさらに、癌治療薬による化学療法処置を受けている癌患者の処置を改善するための方法であって、該患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、細胞傷害剤または放射線療法の細胞傷害有効性を改善する方法であって、そのような処置を必要とする患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、ビホスフォネート、選択性エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、副甲状腺ホルモン(PTH)(例えば、テリパラチド(Forteo))、ラネリック酸ストロンチウム、デノスマブもしくはカルシトニン、またはその組合せによる処置を受けている、破骨細胞活性の上昇に関連する疾患を有する患者の処置を改善するための方法であって、該患者を上記で開示されたような方法で同時処置することを含んでなる方法に関する。
別の実施形態では、本発明の抗体の使用は、転移癌に罹患している患者において骨に対する転移癌を予防または治療するための薬剤の製造において意図される。関連の実施形態では、転移癌は乳癌、肺癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍(白血病およびリンパ腫を含む)、頭頸部癌、胃腸管癌(食道癌、胃癌、結腸癌、腸管癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む)、女性生殖管の悪性腫瘍(卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌および子宮頸癌を含む)、膀胱癌、脳癌(神経芽腫を含む)、肉腫、骨肉腫ならびに皮膚癌(悪性黒色腫または扁平上皮細胞癌を含む)である。
別の実施形態によれば、本発明は、薬剤の製造における本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、癌を有する患者を処置するための薬剤の製造における本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、破骨細胞活性の上昇に関連する疾患を有する患者を処置するための薬剤の製造における本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、炎症性疾患、より具体的には、炎症性腸疾患を有する患者を処置するための薬剤の製造における本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
別の実施形態によれば、本発明は、関節リウマチに罹患している患者を処置するための薬剤の製造における本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの使用に関する。
本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットの投与は当業者に公知の任意の手段によって達成し得る。好ましい投与経路としては、限定されるものではないが、皮内、皮下、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内通気、吸入、眼、膣および直腸がある。好ましい実施形態によれば、本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットは全身送達される。
投与は単回用量または一定時間をおいた後に1回または数回繰り返される用量で行うことができる。望ましくは、本発明による抗体、核酸配列、ベクター、医薬組成物またはパーツキットは1週間おいて1〜10回投与される。
一般的な指針として、該抗体の好適な用量は約2mg/kg〜30mg/kg、0.1mg/kg〜30mg/kgまたは0.1mg/kg〜10mg/kg体重である。本発明によるベクターの好適な用量は、MVAベクターでは、約104〜1010pfu(プラーク形成単位)、望ましくは、約105〜108pfuで様々であり、アデノウイルス系ベクターでは、約105〜1013iu(感染単位)、望ましくは、約107〜1012iuで様々である。ベクタープラスミドに基づく組成物は10μg〜20mgの間、有利には100μg〜2mgの間の用量で投与し得る。
本発明による使用または方法が癌の処置のためである場合、本発明の方法または使用は1以上の慣例の治療法(例えば、放射線照射、化学療法および/または外科術)と組み合わせて行うことができる。複数の治療アプローチの使用は患者により広い基礎的介入を提供する。一実施形態では、本発明の方法は外科的介入の前または後に行うことができる。
別の実施形態では、それは放射線療法(例えば、γ線照射)の前または後に行うことができる。当業者ならば、使用可能な適当な放射線療法プロトコールおよびパラメーターを容易に処方することができる(例えば、PEREZ. Principles and practice of radiation oncology. 2nd edition. LIPPINCOTT, 1992参照)。
別の実施形態では、それは放射線療法(例えば、γ線照射)の前または後に行うことができる。当業者ならば、使用可能な適当な放射線療法プロトコールおよびパラメーターを容易に処方することができる(例えば、PEREZ. Principles and practice of radiation oncology. 2nd edition. LIPPINCOTT, 1992参照)。
発明を実施するための様式
CSF−1RでトランスフェクトされたNIH/3T3細胞の、mAb CXIIG6による特異的染色
B4−800−5細胞系統は、全長ヒトCSF−1Rをコードする発現プラスミドでNIH/3T3細胞を安定的にトランスフェクトすることにより作製した。B4−800−5細胞における細胞表面CSF−1R発現は、抗ヒトCSF−1R mAb 61701(マウスIgG1、R&D Systems)または2−4A5−4(ラットIgG1,k、GeneTex)で間接的に免疫染色し、イソ型対照と比較することにより確認した(図1の上および中央のパネル)。ハイブリドーマCXIIG6または陰性対照ハイブリドーマの細胞上清を、B4−800−5細胞または親NIH/3T3細胞の免疫染色に用いた(図1の下のパネル)。
CSF−1RでトランスフェクトされたNIH/3T3細胞の、mAb CXIIG6による特異的染色
B4−800−5細胞系統は、全長ヒトCSF−1Rをコードする発現プラスミドでNIH/3T3細胞を安定的にトランスフェクトすることにより作製した。B4−800−5細胞における細胞表面CSF−1R発現は、抗ヒトCSF−1R mAb 61701(マウスIgG1、R&D Systems)または2−4A5−4(ラットIgG1,k、GeneTex)で間接的に免疫染色し、イソ型対照と比較することにより確認した(図1の上および中央のパネル)。ハイブリドーマCXIIG6または陰性対照ハイブリドーマの細胞上清を、B4−800−5細胞または親NIH/3T3細胞の免疫染色に用いた(図1の下のパネル)。
フローサイトメトリー分析は、ハイブリドーマCXIIG6からの培養上清がB4−800−5細胞を選択的に染色したことを示し、細胞表面CSF−1Rに対するmAbの特異性が証明された。
細胞表面CSF−1Rに対するCSF−1の結合の阻害
3×105 THP−1細胞(ヒトCSF−1R陽性単球性白血病細胞系統)を、ハイブリドーマ培養上清、ナイーブまたは抗CSF−1R免疫マウスからの血清(1:1000希釈)、mAb抗CSF−1R 2−4A5−4(GeneTex)または対照ラットIgG1(10μg/ml)のいずれかのの存在下、または試薬無しで、4℃にて30分間インキュベートした。冷PBSで2回洗浄した後、細胞を1μg/mlのビオチン化組換えヒトCSF−1とともに30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、さらに4℃にて30分間、10μg/mlストレプトアビジン−Alexa Fluor 488(Invitrogen)とともにインキュベートした。PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞染色をフローサイトメトリーにより分析した。
3×105 THP−1細胞(ヒトCSF−1R陽性単球性白血病細胞系統)を、ハイブリドーマ培養上清、ナイーブまたは抗CSF−1R免疫マウスからの血清(1:1000希釈)、mAb抗CSF−1R 2−4A5−4(GeneTex)または対照ラットIgG1(10μg/ml)のいずれかのの存在下、または試薬無しで、4℃にて30分間インキュベートした。冷PBSで2回洗浄した後、細胞を1μg/mlのビオチン化組換えヒトCSF−1とともに30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、さらに4℃にて30分間、10μg/mlストレプトアビジン−Alexa Fluor 488(Invitrogen)とともにインキュベートした。PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後、細胞染色をフローサイトメトリーにより分析した。
対照サンプルと比較した場合の蛍光強度の低下は、細胞表面CSF−1Rに対するCSF−1の結合の阻害を反映する。CSF−1R免疫マウスからの血清はTHP−1細胞に対するCSF−1の結合を遮断する(図2)。陰性対照ハイブリドーマ上清または無関連のmAbは効果を示さず、ハイブリドーマCXIIG6からの培養上清は、mAb 2−4A5−4(左下のパネル)と同様に、THP−1細胞に対するCSF−1の結合を阻害する(図2の右下のパネル)。
mAb CXIIG6結合部位の位置決定
CSF−1R上の、mAb CXIIG6の結合部位を特定するため、5つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン(Met 1〜GLu 512、R&D Systems)かCSF−1Rの細胞外領域の、3つのみのN末端免疫グロブリン様ドメイン(Met 1〜Ser 290)のいずれか(双方ともC末端でヒトIgG1のFc領域と融合)を含んでなる可溶型のヒトCSF−1Rを用いてウエスタンブロットを行った。ヒトIgG1 Fcと融合された可溶型のEGFR(R&D Systems)を陰性対照としても用いた。
CSF−1R上の、mAb CXIIG6の結合部位を特定するため、5つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン(Met 1〜GLu 512、R&D Systems)かCSF−1Rの細胞外領域の、3つのみのN末端免疫グロブリン様ドメイン(Met 1〜Ser 290)のいずれか(双方ともC末端でヒトIgG1のFc領域と融合)を含んでなる可溶型のヒトCSF−1Rを用いてウエスタンブロットを行った。ヒトIgG1 Fcと融合された可溶型のEGFR(R&D Systems)を陰性対照としても用いた。
各可溶性受容体100ngを天然状態で電気泳動に付した後、ニトロセルロースシートに転写し、ハイブリドーマ上清、ウサギpAb c−fms/CSF−1R H300(Santa Cruz Biotechnology)、マウスmAb 61701(R&D Systems)またはナイーブまたはCSF−1R免疫マウスからの血清のいずれかでプロービングした。
可溶型のCSF−1Rは双方とも、pAb c−fms/CSF−1R H300、mAb 61701または免疫マウスからの血清でブロービングした際にブロードバンドとして検出された。ナイーブマウス血清または陰性対照ハイブリドーマ上清では検出可能なシグナルは見られなかった。CXIIG6ハイブリドーマ上清はCSF−1R1−290:FcならびにCSF−1R1−512:Fcを認識したが、EGFR:Fcは認識せず、このことはCXIIG6がヒトCSF−1Rの3つのN末端免疫グロブリン様ドメイン内(残基1〜290の間)にあるエピトープと特異的に結合することを示唆する。
mAb CXIIG6による可溶性ヒトCSF−1Rの特異的遮断
CSF−1依存性ネズミ骨髄性白血病M−NFS−60細胞系統(#CRL−1838、ATCC)を用いて、ヒトおよびネズミCSF−1Rに対するCXIIG6ハイブリドーマ上清の遮断活性を評価した。5ngの可溶性ヒトCSF−1R(CSF−1R1−512:Fc、R&D Systems製)を、白色96ウェルマイクロプレートにて、ハイブリドーマ上清、mAb 61701(R&D Systems)またはネズミイソ型対照mAbのいずれかの希釈シリーズとともにインキュベートした。次に、これらの培養ウェルに、CSF−1の不在下で一晩培養した10E4 M−NFS−60細胞を、0.1ngのヒトCSF−1とともに最終アッセイ容量100μlとして加えた。培養物を37℃で48時間インキュベートし、細胞増殖ELISA(Roche)を用い、BrdUの組み込みにより増殖を定量した。
CSF−1依存性ネズミ骨髄性白血病M−NFS−60細胞系統(#CRL−1838、ATCC)を用いて、ヒトおよびネズミCSF−1Rに対するCXIIG6ハイブリドーマ上清の遮断活性を評価した。5ngの可溶性ヒトCSF−1R(CSF−1R1−512:Fc、R&D Systems製)を、白色96ウェルマイクロプレートにて、ハイブリドーマ上清、mAb 61701(R&D Systems)またはネズミイソ型対照mAbのいずれかの希釈シリーズとともにインキュベートした。次に、これらの培養ウェルに、CSF−1の不在下で一晩培養した10E4 M−NFS−60細胞を、0.1ngのヒトCSF−1とともに最終アッセイ容量100μlとして加えた。培養物を37℃で48時間インキュベートし、細胞増殖ELISA(Roche)を用い、BrdUの組み込みにより増殖を定量した。
可溶性ヒトCSF−1Rは、陰性対照IgG1を含む、または含まない陰性ハイブリドーマ上清の存在下で示される場合と同様に、ヒトCSF−1により媒介されるM−NFS−60細胞の増殖を完全に阻害した(図3;3ウェルの平均+/−SEM)。これに対し、CXIIG6ハイブリドーマ上清および陽性対照mAb 61701は双方とも、用量依存的に細胞増殖を回復させることができ、それらが可溶性ヒトCSF−1Rを中和することができたことを示す。
このアッセイにおいて、低希釈率のCXIIG6ハイブリドーマ上清の存在下でのM−NFS−60細胞の活発な増殖は、mAb CXIIG6がM−NFS−60細胞によって発現されたネズミCSF−1Rを遮断することができなかったことを示した。さらに、可溶性CSF−1Rの不在下で行ったネズミCSF−1で補助したM−NFS−60増殖アッセイでは、mAb AFS98抗マウスCSF−1R(eBioscience)で処理すると、細胞増殖に劇的な濃度依存性の低下が起こった(データは示されていない)。CXIIG6ハイブリドーマ上清は、陰性対照抗体および陰性ハイブリドーマ上清と同様に、細胞増殖の低下を引き起こさなかった。これらの結果は、mAb CXIIG6が特異的にヒトCSF−1Rを標的とすることを証明する。
ヒト破骨細胞分化およびマトリックスメタロプロテアーゼ−9(MMP−9)分泌の阻害
破骨細胞は、健常な血液ドナーからのPBMCの傾瀉によって得られたヒト単球から作製した。要するに、単球を96ウェルプレートに2×10E4細胞/ウェルで播種し、ハイブリドーマ培養上清、mAbs抗ヒトCSF−1R 61701(R&D Systems)または2−4A5−4(GeneTex)、mAb抗ヒトCSF−1 26730(R&D Systems)、ネズミまたはラットイソ型対照、またはナイーブおよびCSF−1R免疫マウスからの血清のいずれかをハイブリドーマ培養培地で希釈したもので45分間処理した。これらの培養ウェルに完全a−MEM培地をヒトCSF−1およびRANKL(PeproTech、それぞれ25および40ng/ml)とともに、または伴わずに加えた。ハイブリドーマ上清、mAbまたは/およびサイトカインを含む、もしくは含まない培地を9日間、3日おきに補充した。9日目に馴化培養上清を採取し、ELISAアッセイ(R&D Systems)を用い、全ヒトMMP−9をアッセイした。破骨細胞の形成は、Sigma-Aldrichからの白血球酸性ホスファターゼキットを用い、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)の染色により評価した。
破骨細胞は、健常な血液ドナーからのPBMCの傾瀉によって得られたヒト単球から作製した。要するに、単球を96ウェルプレートに2×10E4細胞/ウェルで播種し、ハイブリドーマ培養上清、mAbs抗ヒトCSF−1R 61701(R&D Systems)または2−4A5−4(GeneTex)、mAb抗ヒトCSF−1 26730(R&D Systems)、ネズミまたはラットイソ型対照、またはナイーブおよびCSF−1R免疫マウスからの血清のいずれかをハイブリドーマ培養培地で希釈したもので45分間処理した。これらの培養ウェルに完全a−MEM培地をヒトCSF−1およびRANKL(PeproTech、それぞれ25および40ng/ml)とともに、または伴わずに加えた。ハイブリドーマ上清、mAbまたは/およびサイトカインを含む、もしくは含まない培地を9日間、3日おきに補充した。9日目に馴化培養上清を採取し、ELISAアッセイ(R&D Systems)を用い、全ヒトMMP−9をアッセイした。破骨細胞の形成は、Sigma-Aldrichからの白血球酸性ホスファターゼキットを用い、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)の染色により評価した。
CSF−1+RANKLは、単球の破骨細胞(大きな多核TRAP陽性細胞として定義される)への分化を誘導したが、サイトカインの不在下ではTRAP陽性破骨細胞は見られなかった。0.5μg/mlの抗CSF−1 mAb 26730を加えると、MMP−9分泌の欠如により示されるように、破骨細胞分化が完全に排除された。同濃度の抗CSF−1R mAbs 61701または2−4A5−4および免疫マウス血清(1:1000希釈)は、破骨細胞の形成を部分的にだけ阻害した(図4;サイトカイン有り(+)または無し(−);3ウェルの平均+/−SEM;*:2ウェルの平均)。1:20または1:100希釈のCXIIG6ハイブリドーマ培養上清で処理すると、2つの陰性対照ハイブリドーマ上清(A、B)に比べ、MMP−9生産のレベルが有意に減少した。これらの結果は、mAb CXIIG6が、細胞表面CSF−1Rの機能を遮断することにより、ヒト単球から破骨細胞への分化を阻害することを証明する。
CSF−1RのCSF−1依存性リン酸化の阻害
ヒトCSF−1Rを発現するプラスミドでNIH/3T3細胞を暗的的にトランスフェクトすることにより得られたB4−800−5細胞系統を用いて、CSF−1依存性CSF−1Rリン酸化に対するCXIIG6ハイブリドーマ上清の効果を検討した。細胞を2×10E5細胞/60mmペトリ皿で播種し、48〜72時間培養した。37℃で1時間血清飢餓状態にした後、細胞を37℃で1時間、CXIIG6ハイブリドーマ上清、mAb 2−4A5−4(NeoMarkers)またはイソ型対照mAb(陰性ハイブリドーマ上清で希釈)のいずれかを含有する培養培地で処理し、次に、37℃で5分間、100ng/mlのhCSF−1で刺激するか、または刺激しないままとした。次に、細胞層を溶解させ、全タンパク質を抽出した。10μgのタンパク質を、ウエスタンブロットを、ウサギpAb c−fms/CSF−1R H300またはウサギpAb p−c−fms/CSF−1R(Tyr708)−R(Santa Cruz Biotechnology)のいずれか、その後、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンHRPでプロービングすることにより分析した。
ヒトCSF−1Rを発現するプラスミドでNIH/3T3細胞を暗的的にトランスフェクトすることにより得られたB4−800−5細胞系統を用いて、CSF−1依存性CSF−1Rリン酸化に対するCXIIG6ハイブリドーマ上清の効果を検討した。細胞を2×10E5細胞/60mmペトリ皿で播種し、48〜72時間培養した。37℃で1時間血清飢餓状態にした後、細胞を37℃で1時間、CXIIG6ハイブリドーマ上清、mAb 2−4A5−4(NeoMarkers)またはイソ型対照mAb(陰性ハイブリドーマ上清で希釈)のいずれかを含有する培養培地で処理し、次に、37℃で5分間、100ng/mlのhCSF−1で刺激するか、または刺激しないままとした。次に、細胞層を溶解させ、全タンパク質を抽出した。10μgのタンパク質を、ウエスタンブロットを、ウサギpAb c−fms/CSF−1R H300またはウサギpAb p−c−fms/CSF−1R(Tyr708)−R(Santa Cruz Biotechnology)のいずれか、その後、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンHRPでプロービングすることにより分析した。
CSF−1の不在下では、CXIIG6ハイブリドーマ上清でもmAb 2−4A5−4でも、708番でリン酸化されたCSF−1Rに特異的な抗体で見られたような受容体のリン酸化は誘導されず、mAb CXIIG6単独では促進作用を示さないことが示された。CSF−1で刺激すると、イソ型対照処理細胞では非刺激細胞に比べてCSF−1Rの量が減少し、CSF−1RはTyr708でリン酸化された(データは示されていない)。CXIIG6ハイブリドーマ上清またはmAb 2−4A5−4で前処理しても、CSF−1Rの消失は高まらなかった。CSF−1Rのリン酸化は、CXIIG6ハイブリドーマ上清またはmAb 2−4A5−4で処理した後に低下した。これらの結果は、mAb CXIIG6がCSF−1RのCSF−1依存性リン酸化を遮断することができることを示す。
mAb CXIIG6の交差反応性
チロシンキナーゼ受容体のIII型サブファミリーに属し、細胞外Ig様ドメインにおいてCSF−1Rと相同性を示す一連の精製可溶性受容体:可溶性VEGFR−1、VEGFR−2、Flt−3およびPDGFRβ(Fc融合タンパク質として発現される4つ総て)に対してELISAによりmAb CXIIG6の交差反応性を試験するとともに、PDGFRαおよびSCFR(c−kit)をR&D Systemsから入手し、ELISAプレートを被覆するのに用いた。チロシンキナーゼ受容体のEGFRサブファミリーからの可溶性EGFR(R&D Systems)を陰性対照として用いた。
チロシンキナーゼ受容体のIII型サブファミリーに属し、細胞外Ig様ドメインにおいてCSF−1Rと相同性を示す一連の精製可溶性受容体:可溶性VEGFR−1、VEGFR−2、Flt−3およびPDGFRβ(Fc融合タンパク質として発現される4つ総て)に対してELISAによりmAb CXIIG6の交差反応性を試験するとともに、PDGFRαおよびSCFR(c−kit)をR&D Systemsから入手し、ELISAプレートを被覆するのに用いた。チロシンキナーゼ受容体のEGFRサブファミリーからの可溶性EGFR(R&D Systems)を陰性対照として用いた。
ハイブリドーマCXIIG6(CXIIG6 SN)または陰性対照ハイブリドーマ、または抗CSF−1RマウスIgG1 61701(R&D Systems)から培養上清を、抗体濃度500ng/mlで被覆したELISAプレート上でインキュベートした。ELISAプレートを洗浄した後、結合した抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIg(Sigma)を用いて明らかにし、OD(450-540nm)を測定した。図5に示されている結果は、mAb 61701同様、CXIIG6はCSF−1Rと強く結合したが、他のいずれのチロシンキナーゼ受容体にも特異的シグナルは検出されなかった。このことは、試験した種々のIII型チロシンキナーゼ受容体のうち、CXIIG6がCSF−1Rに特異的であることを示す。
mAb CXIIG6用の発現ベクターの構築
DG44哺乳類細胞系統においてmAb CXIIG6を生産するために、CXIIG6重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のクローニングにOptiCHO(商標)抗体発現キット(Invitrogen、カタログ番号12762−019)を用いた。OptiCHO(商標)抗体発現キットは、(1)CMVプロモーターの下流に目的遺伝子のクローニングを可能とする二シストロン性のプラスミドpOptiVEC(商標)ベクター(目的遺伝子の転写は、内部リボソームエントリー部位(IRES)によりジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)要求性選択マーカーから隔てられ、同じmRNAで目的遺伝子と選択マーカーの転写が可能となる);(2)CMVプロモーターに下流に目的遺伝子のクローニングを可能とするpcDNA(商標)3.3ベクター(このpcDNA(商標)3.3はジェネティシン(登録商標)を用いて選択が可能なネオマイシン耐性遺伝子を含む)を含む。
このpOptiVEC(商標)およびpcDNA(商標)3.3ベクターは、目的遺伝子のmRNAの3’末端の適切なプロセシングを命令するTKポリA配列を含む。
DG44哺乳類細胞系統においてmAb CXIIG6を生産するために、CXIIG6重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のクローニングにOptiCHO(商標)抗体発現キット(Invitrogen、カタログ番号12762−019)を用いた。OptiCHO(商標)抗体発現キットは、(1)CMVプロモーターの下流に目的遺伝子のクローニングを可能とする二シストロン性のプラスミドpOptiVEC(商標)ベクター(目的遺伝子の転写は、内部リボソームエントリー部位(IRES)によりジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)要求性選択マーカーから隔てられ、同じmRNAで目的遺伝子と選択マーカーの転写が可能となる);(2)CMVプロモーターに下流に目的遺伝子のクローニングを可能とするpcDNA(商標)3.3ベクター(このpcDNA(商標)3.3はジェネティシン(登録商標)を用いて選択が可能なネオマイシン耐性遺伝子を含む)を含む。
このpOptiVEC(商標)およびpcDNA(商標)3.3ベクターは、目的遺伝子のmRNAの3’末端の適切なプロセシングを命令するTKポリA配列を含む。
特異的プライマー(表4参照)を合成し、全CXIIG6重鎖および軽鎖遺伝子のPCR増幅およびクローニングに用いた(それぞれ配列番号1および配列番号3;それぞれ図6および図7参照)。逆方向プライマーは効率的な真核生物の翻訳のためのKozakコンセンサス配列を含んだ(KOZAK M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res. 1987, 15(20):8125-8148)。
CXIIG6重鎖を、プラスミドpTG17753(図8)を鋳型とし、OTG18929およびOTG18930を用いてPCR増幅し、ベクターpOptiVEC(商標)−TOPO(登録商標)(pOptiVEC(商標)−TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キット、Invitrogen、カタログ番号12744−017−01)およびpcDNA(商標)3.3−TOPO(登録商標)ベクター(pcDNA(商標)3.3−TOPO(商標)TAクローニング(登録商標)キット、Invitrogen、カタログ番号K8300−01)にクローニングし、それぞれpTG17786およびpTG17789を得た。
CXIIG6軽鎖を、プラスミドpTG17727(図9)を鋳型とし、OTG18931およびOTG18932を用いてPCR増幅し、ベクターpOptiVEC(商標)−TOPO(登録商標)(pOptiVEC(商標)−TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キット、Invitrogen、カタログ番号12744−017−01)およびpcDNA(商標)3.3−TOPO(登録商標)ベクター(pcDNA(商標)3.3−TOPO(登録商標)TAクローニング(登録商標)キット、Invitrogen、カタログ番号K8300−01)にクローニングし、それぞれpTG17788およびpTG17787を得た。
CMVプロモーターならびにpTG17786、pTG17787、pTG17788およびpTG17789のTKポリAシグナルを含む全発現カセットのヌクレオチド配列を配列決定し、それらの理論的配列との一致が見られた。
mAb CXIIG6からのキメラ抗体の作製
mAb CXIIG6の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせた。
mAb CXIIG6の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせた。
キメラ軽鎖(キメラCXIIG6 Igκ鎖と呼ぶ)を作製するため、CXIIG6 VKドメイン(配列番号3から)をコードする配列とヒトIGKC領域(GenBank受託番号:J00241)をコードする配列を連結することにより理論的配列を設計した。このXbal NotI DNAフラグメントは、5’末端にネズミ型(上記のpTG17787およびpTG17788の場合)において用いたものと同じ非翻訳配列(Kozak配列を含む)を保持していた。このキメラCXIIG6軽鎖配列を、CHOでの発現用にコドンを最適化し、合成オリゴヌクレオチドから構築し、GeneArt AGを介してpOptiVEC(商標)(図10)にサブクローニングした。得られたキメラCXIIG6軽鎖(可変領域および定常領域)の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号34に示す通りである。得られたプラスミドをpTG17895と呼んだ(図11)。
キメラ重鎖IgG1およびIgG4(それぞれキメラCXIIG6 IgG1およびキメラCXIIG6 IgG4鎖と呼ぶ)を作製するため、CXIIG6 VHドメイン(配列番号1から)をコードする配列とヒトIGHG1C領域(GenBank受託番号:J00228)またはヒトIGHG4C領域(GenBank受託番号:K01316)のいずれかをコードする配列を連結することにより理論的配列を設計した。これらのXbaI NotI DNAフラグメントは、5’末端にネズミ型(上記のpTG17787およびpTG17788の場合)において用いたものと同じ非翻訳配列(Kozak配列を含む)を保持していた。次に、キメラCXIIG6重鎖を、CHOでの発現用にコドンを最適化し、合成し、GeneArt AGによりXbaI NotIを介してpTG17812(図12)にクローニングした。得られたキメラCXIIG6 IgG1重鎖(可変領域および定常領域)の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号35に示す通りであり、得られたプラスミドをpTG17868と呼んだ(図13)。得られたキメラCXIIG6 IgG4重鎖(可変領域および定常領域)の、コドンを最適化した核酸配列は配列番号36に示す通りであり、得られたプラスミドをpTG17869と呼んだ(図14)。
mAb CXIIG6からのヒト抗体の作製
ヒト化軽鎖変異体を作製するため、配列番号9で示されるような軽鎖可変領域内で表2に従うアミノ酸置換を行った。
ヒト化軽鎖変異体を作製するため、配列番号9で示されるような軽鎖可変領域内で表2に従うアミノ酸置換を行った。
DNA配列は、CXIIG6 VKドメイン(配列番号3から)の置換を有する改変配列とヒトIGKC領域(GenBank受託番号:J00241)をコードする配列を連結することにより設計した。このXbaI NotI DNAフラグメントは、5’末端にネズミ型(上記のpTG17787およびpTG17788の場合)において用いたものと同じ非翻訳配列(Kozak配列を含む)を保持していた。次に、このヒト化CXIIG6軽鎖配列を、CHOでの発現用にコドンを最適化し、合成オリゴヌクレオチドから構築し、GeneArt AGによりXbaI NotIを介してpOptiVEC(商標)(図10)にクローニングした。得られたヒト化CXIIG6軽鎖変異体およびプラスミドを図15に一覧化する。
ヒト化重鎖変異体を作製するため、配列番号6で示されるような重鎖可変領域内で表1に従うアミノ酸置換を行った。
DNA配列は、CXIIG6 VHドメイン(配列番号1から)の置換を有する改変配列とヒトIGHG1C領域(GenBank受託番号:J00228)をコードする配列を連結することにより設計した。このXbaI ApaI DNAフラグメントは、5’末端にネズミ型(上記のpTG17787およびpTG17788の場合)において用いたものと同じ非翻訳配列(Kozak配列を含む)を保持していた。次に、このDNA配列を、CHOでの発現用にコドンを最適化し、合成し、GeneArt AGによりXbaI ApaIを介してpTG17812(図12)にクローニングした。得られたヒト化CXIIG6 IgG1重鎖変異体およびプラスミドを図16に一覧化する。
組換えネズミCXIIG6およびキメラCXIIG6 IgG1のin vitro阻害活性
精製組換えネズミCXIIG6(従前に記載の通り)およびそのキメラIgG1変異体(従前に記載されているようなキメラCXIIG6 IgG1)が可溶性ヒトCSF−1Rを遮断することができたかどうかを判定するため、M−NFS−60細胞増殖および破骨細胞分化モデル(従前に記載の通り)で用量応答試験を行った。Rockland(Rockland, 010-0141)からの精製ポリクローナルネズミIgG2aおよび本出願者が作製したキメラIgG1を対照抗体として並行して試験した。細胞を、SPRバイオセンサーアッセイにおいて抗原結合により測定される、ある濃度範囲の活性抗CSF−1R抗体に曝すことにより遮断効果を評価した。mAbs CXIIG6とそれらの個々の対照mAbとの比較は、同量の全抗体をロードすることによって行った(Fc結合によるSPRバイオセンサーアッセイ)。
精製組換えネズミCXIIG6(従前に記載の通り)およびそのキメラIgG1変異体(従前に記載されているようなキメラCXIIG6 IgG1)が可溶性ヒトCSF−1Rを遮断することができたかどうかを判定するため、M−NFS−60細胞増殖および破骨細胞分化モデル(従前に記載の通り)で用量応答試験を行った。Rockland(Rockland, 010-0141)からの精製ポリクローナルネズミIgG2aおよび本出願者が作製したキメラIgG1を対照抗体として並行して試験した。細胞を、SPRバイオセンサーアッセイにおいて抗原結合により測定される、ある濃度範囲の活性抗CSF−1R抗体に曝すことにより遮断効果を評価した。mAbs CXIIG6とそれらの個々の対照mAbとの比較は、同量の全抗体をロードすることによって行った(Fc結合によるSPRバイオセンサーアッセイ)。
M−NFS−60バイオアッセイ: M−NFS−60バイオアッセイでは、細胞を、50ng/mlのヒト可溶性CSF−1Rおよび1ng/mlのヒトCSF−1の存在下、0.23ng/ml〜0.5μg/mlの活性mAbs CXIIG6(組換えネズミCXIIG6;キメラCXIIG6 IgG1)または相当濃度の対照mAbで48時間処理した。図17に示される結果は、M−NFS−60細胞の増殖が、両mAb CXIIG6(組換えネズミCXIIG6;キメラCXIIG6 IgG1)の濃度の上昇に応答して増大したことを示し、それらが可溶性CSF−1RとCSF−1の結合(3ウェルの平均+/−SEM)に拮抗作用を示すことを証明する。キメラCXIIG6 IgG1は、細胞増殖の回復において組換えネズミCXIIG6と同等の効果があった。対照ネズミIgG2aおよびキメラIgG1は、それらそれぞれの濃度範囲で、可溶性CSF−1RによるCSF−1の中和に効果が無かった。
破骨細胞バイオアッセイ: 破骨細胞バイオアッセイでは、傾瀉ヒト単球を、25ng/mlのCSF−1(ImmunoTools)および40ng/mlのRANKLの存在下、0.85ng/ml〜0.62μg/mlの活性mAb CXIIG6(組換えネズミCXIIG6;キメラCXIIG6 IgG1)とともに8日間インキュベートした。培地および総ての添加薬剤を4日目と6日目に補充し、6〜8日間馴化した培養培地にて全MMP−9を測定した。図18に示されている結果は、対照抗体と比較して、組換えネズミCXIIG6およびそのキメラ変異体(キメラCXIIG6 IgG1)がそれぞれ、破骨細胞分化と並行するMMP−9生産を有意に低下させたことを示し、増殖の遅延が起こったことを示唆している(図18;3ウェルの平均+/−SEM)。
これらの結果を考え合わせると、精製組換えネズミCXIIG6およびキメラCXIIG6 IgG1は細胞表面ならびに可溶性のヒトCSF−1Rを阻害することが示される。
Claims (66)
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸もしくは配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDR、または、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸もしくは配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸または配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸または配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列の少なくとも5つの連続するアミノ酸を含んでなるCDRの群から選択される、少なくとも2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項1または2に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる群から選択される少なくとも1つのCDR、または、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRからなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなるCDRの群から選択される、少なくとも2、3、4または5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12もしくは13のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR;または配列番号14、15もしくは16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12もしくは13のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または配列番号14、15もしくは16のいずれか1つで示される少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号11、12、13、14、15または16のいずれか1つで示されるような少なくとも2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項11に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18もしくは19のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR;または配列番号20、21もしくは22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項14に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18もしくは19のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または配列番号20、21もしくは22のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示される少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号17、18、19、20、21または22のいずれか1つで示されるような少なくとも2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項17に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24もしくは25のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDR;または配列番号26、27もしくは28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるようなアミノ酸配列を含んでなる少なくとも2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項20に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24もしくは25のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDR;または配列番号26、27もしくまたは28のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるような少なくとも1つのCDRを含んでなる、抗体。
- 配列番号23、24、25、26、27または28のいずれか1つで示されるような少なくとも2、3、4、5個、いっそうより好ましくは6個のCDRを含んでなる、請求項23に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、可変領域を含んでなり、該可変領域が配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる、抗体。
- 可変領域が、1つ、より好ましくは2つ、いっそうより好ましくは3つ、確かに好ましくは4つのヒトFRを含んでなる、請求項25〜33のいずれか一項に記載の抗体。
- 可変領域が配列番号6で示されるようなアミノ酸配列を含んでなる、請求項25〜33のいずれか一項に記載の抗体。
- 可変領域が配列番号6で示される、請求項34に記載の抗体。
- 可変領域が配列番号9で示されるようなアミノ酸配列を含んでなる、請求項25〜33のいずれか一項に記載の抗体。
- 可変領域が配列番号9で示される、請求項36に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、2つの可変領域を含んでなり、該可変領域が、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる可変領域;配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる可変領域;配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる可変領域;ならびに配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる可変領域からなる群から選択される、抗体。
- 配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる可変領域;ならびに配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、請求項38に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる可変領域と、配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる可変領域と、配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる可変領域と、配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号6で示されるような可変領域と、配列番号9で示されるような可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2の45番で始まり54番で終わる配列で示されるCDR、配列番号2の66番で始まり87番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号2の117番で始まり126番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる重鎖可変領域;ならびに配列番号4の44番で始まり56番で終わる配列で示されるCDR、配列番号4の66番で始まり76番で終わる配列で示されるCDRおよび配列番号4の109番で始まり117番で終わる配列で示されるCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号11、12および13で示される3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、配列番号14、15および16で示される3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号17、18および19で示される3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、配列番号20、21および22で示される3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号23、24および25で示される3つのCDRを含んでなる重鎖可変領域と、配列番号26、27および28で示される3つのCDRを含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる、抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号6で示されるような重鎖可変領域と、配列番号9で示されるような軽鎖可変領域を含んでなる、抗体。
- ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体フラグメント、ダイアボディーおよびFdを含んでなる群から選択される、請求項1〜48のいずれか一項に記載の抗体。
- CSF−1Rと特異的に結合し、配列番号2で示される2つの重鎖と、配列番号4で示される2つの軽鎖を含んでなる、抗体。
- 請求項1〜50のいずれか一項に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、いっそうより好ましくは少なくとも98%相同なアミノ酸配列を有する抗体。
- 放射線増感剤、受容体および/または細胞傷害性薬剤とコンジュゲートされている、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列。
- 請求項53に記載の核酸配列を含んでなるベクター。
- 請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列または請求項54に記載のベクターと薬学上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
- 前記組成物が対象化合物をさらに含んでなる、請求項55に記載の医薬組成物。
- (i)請求項57に記載の医薬組成物、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列または請求項54に記載のベクターと、(ii)対象化合物を含んでなる、パーツキット。
- 前記対象化合物が、治療化合物、好ましくは、癌治療薬または骨量低下の処置に有用な化合物である、請求項56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキット。
- 破骨細胞活性の上昇に関連する疾患の処置のための、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 癌の処置のための、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 転移癌に罹患している患者において骨に対する転移癌を予防または治療するための、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 薬剤の製造における、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 癌を有する患者を処置するための薬剤の製造における、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 破骨細胞活性の上昇に関連する疾患を有する患者を処置するための薬剤の製造における、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 炎症性腸疾患を有する患者を処置するための薬剤の製造における、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
- 関節リウマチに罹患している患者を処置するための薬剤の製造における、請求項1〜51のいずれか一項に記載の抗体、請求項53に記載の核酸配列、請求項54に記載のベクター、請求項55もしくは56に記載の医薬組成物または請求項57に記載のパーツキットの使用。
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