ES2640909T3 - Anticuerpos frente a CSF-1R - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que se une de forma específica a la variante de CSF-1R humano (SEQ ID NO: 15), que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos frente a CSF-1R
La presente invencion se dirige a los campos de la inmunolog^a y del tratamiento contra el cancer. En concreto, la presente invencion se dirige a anticuerpos de ser humano que se unen al Receptor del Factor Estimulador de Colonias 1 (CSF-1R) humano.
El Receptor del Factor Estimulador de Colonias 1 (CSF-1R), tambien conocido como M-CSFR o CD-115, (variante de CSF-1R humana; SEQ ID NO: 15) (CSF-1R humano; SEQ ID NO: 16; n.° de Referencia de Uniprot P07333), codificado por el gen c-fms, es un receptor tirosina quinasa que se expresa de forma selectiva en los linajes celulares de macrofagos y granulocitos en individuos normales y en celulas tumorales en el cancer. Existen dos ligandos conocidos, el Factor Estimulador de Colonias 1 (CSF-1) (CSF-1 humano; SEQ ID NO: 17) (n.° de Referencia de Uniprot P09603), tambien conocido como M-CSF, e IL-34 (IL-34 Humana; SEQ ID NO: 18) (n.° de Referencia de Uniprot Q6ZMJ4), que se une al dominio extracelular de CSF-1R. Tras la union de CSF-1 o IL-34, CSF-1R dimeriza, lo que conduce a la transfosforilacion del receptor y a la fosforilacion y activacion de moleculas de senalizacion aguas abajo tales como MAPK y Akt. La fosforilacion de CSF-1R da como resultado: (1) la proliferacion y diferenciacion de macrofagos a partir de celulas madre progenitoras hematopoyeticas y (2) la supervivencia y migracion de macrofagos a diversos organos y tejidos del cuerpo, en particular al estroma tumoral. CSF-1R tambien puede expresarse en la superficie de celulas tumorales.
Los anticuerpos contra CSF-1R murino no tienen reactividad cruzada en seres humanos y, por consiguiente, senan productos terapeuticos ineficaces para el tratamiento del cancer en seres humanos.
En la publicacion PCT WO2009/026303 (Brasel, y col.) se desvelan anticuerpos de ser humano contra CSF-1R. Tales anticuerpos no inducen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) frente a las celulas a las que se unen los anticuerpos. La ADCC se produce cuando el anticuerpo se une a una celula que expresa el antfgeno (celula diana), lo que hace que la region Fc del anticuerpo este disponible para la union al receptor de Fc en los linfocitos citolfticos naturales, monocitos, neutrofilos y celulas dendrfticas (celulas efectoras). Los anticuerpos desvelados en Brasel, no tienen la capacidad de reunir a la celula diana y a la celula efectora para iniciar la destruccion de la celula diana.
Los anticuerpos contra el ligando no tienen reactividad cruzada. Por lo tanto, los anticuerpos contra CSF-1 no inhiben la union de IL-34 a CSF-1R y los anticuerpos contra IL-34 no inhiben la union de CSF-1 a CSF-1R. La union del ligando al receptor puede tener un efecto sobre el crecimiento del cancer. De forma adicional, los anticuerpos contra el ligando no se internalizan, no inducen la degradacion de CSF-1R ni estimulan la actividad de ADCC frente a las celulas.
Existe una necesidad de anticuerpos multifuncionales que bloqueen la union de los ligandos a CSF-1R y que tambien induzcan la actividad de ADCC frente a las celulas a las que se unen los anticuerpos.
Los anticuerpos de la presente invencion son ventajosos con respecto a los anticuerpos conocidos debido a que tienen una multitud de funciones. Los anticuerpos de la invencion bloquean la union de CSF-1 e IL-34 al receptor, impidiendo de este modo la dimerizacion del receptor y la fosforilacion resultante de los restos tirosina intracelulares, funciones que son cnticas en la prevencion del crecimiento tumoral inducido por macrofagos. Los anticuerpos de la invencion se internalizan e inducen la degradacion de CSF-1R. Notablemente, ademas de bloquear la union del ligando, los anticuerpos de la invencion potencian la actividad de ADCC estimulando la destruccion de las celulas tumorales y de macrofagos y monocitos asociados al tumor. Los anticuerpos de la invencion tambien afectan de forma simultanea la actividad de los macrofagos, una actividad que desempena un papel principal en la progresion tumoral. Debido a la multitud de funciones terapeuticas que tienen, los anticuerpos de la presente invencion tienen una ventaja significativa con respecto a los anticuerpos conocidos en la tecnica.
Sumario de la invencion
Un aspecto de la presente invencion es un anticuerpo que se une de forma espedfica a la variante de CSF-1R humana (SEQ ID NO: 15), que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9. Otro aspecto de la presente invencion es un anticuerpo que se une de forma espedfica a CSF-1R humano (SEQ ID NO: 16), una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9. En aun otro aspecto de la presente invencion, un anticuerpo comprende dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9.
En el presente documento se desvelan ADN aislados y polinucleotidos/acidos polinucleicos que codifican los anticuerpos descritos anteriormente, vectores de expresion que comprenden los polinucleotidos y celulas hospedadoras que comprenden los polinucleotidos. En el presente documento se desvelan procedimientos de purificacion de los anticuerpos o fragmentos de los mismos. La invencion proporciona adicionalmente composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la presente invencion, solos o con un vehfculo, diluyente o
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excipiente farmaceuticamente aceptable. La invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la presente invencion junto con un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
De forma adicional, en el presente documento se desvelan procedimientos para la inhibicion del crecimiento de una celula cancerosa, y procedimientos para el tratamiento en mairnferos de la leucemia, carcinomas de mama y de prostata, administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo. En el presente documento se desvelan procedimientos para la inhibicion del crecimiento de una celula cancerosa, y procedimientos para el tratamiento en mamfferos de la leucemia, carcinomas de endometrio, de mama y de prostata, administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo. En el presente documento se desvelan adicionalmente procedimientos para la inhibicion del crecimiento de una celula cancerosa, y procedimientos para el tratamiento de la leucemia, carcinomas de endometrio, de mama y de prostata, asf como del cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer hepatocelular, cancer renal, mieloma multiple y linfoma de hodgkin. Los anticuerpos de la presente invencion pueden utilizarse para tratar enfermedades neoplasicas, incluyendo tumores solidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama y de prostata. En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invencion pueden utilizarse para tratar enfermedades neoplasicas, incluyendo tumores solidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama, de endometrio y de prostata. En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invencion pueden utilizarse para tratar enfermedades neoplasicas, incluyendo tumores solidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama, de endometrio, de prostata, de ovario, colorrectales, hepatocelulares y renales.
Un aspecto de la presente invencion es el anticuerpo para su uso en terapia o para su uso en el tratamiento, o para su uso como un medicamento. En aun otro aspecto, los anticuerpos anteriormente descritos son para su uso en el tratamiento del cancer. La presente invencion puede utilizarse en el tratamiento de canceres que incluyen, pero sin limitacion, la leucemia, el cancer de mama y el cancer de prostata. En un aspecto, la presente invencion puede utilizarse en el tratamiento de canceres que incluyen, pero sin limitacion, la leucemia, el cancer de mama, el cancer de endometrio y el cancer de prostata. En otro aspecto, la presente invencion puede utilizarse en el tratamiento de canceres incluyendo, pero sin limitacion, la leucemia, el cancer de mama, el cancer de endometrio, el cancer de prostata, el cancer de ovario, el cancer colorrectal, el cancer hepatocelular, el cancer renal, el mieloma multiple y el linfoma de hodgkin.
La presente invencion tambien incluye el anticuerpo de la presente invencion para su uso en el tratamiento del cancer, que incluye proporcionar o administrar una cantidad eficaz de otro tratamiento anticanceroso en el que el tratamiento anticanceroso incluye, pero sin limitacion, un agente antiangiogenesis, un agente quimioterapeutico o un agente antineoplasico. Adicionalmente, los agentes antineoplasicos incluyen, pero sin limitacion, docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorrubicina. El tratamiento anticanceroso se administra al paciente ademas del anticuerpo desvelado en el presente documento. El anticuerpo se administra antes, durante, de forma sustancialmente simultanea con, o tras el comienzo de la terapia con otro tratamiento anticanceroso u otro agente antineoplasico.
La presente invencion tambien proporciona el uso de un anticuerpo de la invencion para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. En un aspecto el cancer es leucemia, cancer de mama o cancer de prostata. En un aspecto el cancer es leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio o cancer de prostata. En otro aspecto de la presente invencion el cancer es leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer hepatocelular, cancer renal, mieloma multiple o linfoma de hodgkin. El uso del anticuerpo incluye proporcionar o administrar una cantidad eficaz de otro tratamiento anticanceroso en el que el tratamiento anticanceroso incluye, pero sin limitacion, un agente antiangiogenesis, un agente quimioterapeutico o un agente antineoplasico. Adicionalmente, los agentes antineoplasicos incluyen, pero sin limitacion, docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorrubicina. El tratamiento anticanceroso se administra al paciente ademas del anticuerpo desvelado en el presente documento. El anticuerpo del mismo se administra antes, durante, o de forma sustancialmente simultanea con, o tras el comienzo de la terapia con otro tratamiento anticanceroso u otro agente antineoplasico.
En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del cancer en un mamffero, que comprende administrar a dicho mam^era que lo necesite una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion. El cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio y cancer de prostata. El cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer hepatocelular, cancer renal, cancer de pancreas, mieloma multiple y linfoma de hodgkin. De forma adicional, el procedimiento puede comprender adicionalmente administrar otro tratamiento anticanceroso a dicho mamffero. El tratamiento anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un agente antiangiogenesis, un agente quimioterapeutico y un agente antineoplasico. El agente antineoplasico puede seleccionarse del grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorrubicina.
En el presente documento se desvelan procedimientos para el uso de anticuerpos o composiciones, para tratar a un mamffero que lo necesite, por ejemplo, para inhibir la angiogenesis o la metastasis osea, o para inhibir el crecimiento tumoral o hiperproliferativo, o para tratar enfermedades inflamatorias. La invencion proporciona adicionalmente anticuerpos, o composiciones, para su uso en el tratamiento de un mamffero que lo necesite, por ejemplo, para inhibir la angiogenesis o la metastasis osea, o para inhibir el crecimiento tumoral o hiperproliferativo, o las enfermedades inflamatorias.
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La presente invencion tambien se dirige a un producto o composicion farmaceutica que contiene el anticuerpo desvelado en el presente documento. Ademas, el producto o composicion farmaceutica puede incluir tambien un agente farmaceutico adicional, un agente antineoplasico o un agente o un tratamiento anticanceroso, incluyendo, pero sin limitacion, docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorrubicina, proporcionado en combinacion con el anticuerpo desvelado en el presente documento en unaterapia simultanea, separada o secuencial.
La invencion proporciona la utilizacion de los niveles de CSF-1 en muestras de sangre, suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion, como un indicador en pacientes de un tratamiento satisfactorio con los anticuerpos contra CSF-1R de la presente invencion, si el cancer expresa CSF-1R en la superficie de los macrofagos asociados al tumor. En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente que comprende las etapas de: (1) medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion si los niveles de CSF-1 son mayores que los niveles de CSF-1 encontrados en una poblacion de control.
La invencion proporciona la utilizacion de los niveles de IL-34 en muestras de sangre, suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion, como un indicador en pacientes de un tratamiento satisfactorio con los anticuerpos contra CSF-1R de la presente invencion. En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente, que comprende las etapas de: (1) medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion si los niveles de IL-34 son mayores que los niveles de IL-34 encontrados en una poblacion de control.
En el presente documento se desvela un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de la presente invencion que comprende: (1) la determinacion ex vivo o in vitro del nivel de CSF-1 en una muestra del sujeto, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion; y (2) en el que un aumento del nivel de CSF-1, comparado con el nivel de CSF-1 en un individuo que no padece cancer, es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
Adicionalmente, en el presente documento se desvela un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpos anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de la presente invencion, que comprende: (1) la determinacion ex vivo o in vitro del nivel de lL-34 en una muestra del sujeto, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion; y (2) en el que un aumento del nivel de IL-34, comparado con el nivel de IL-34 en un individuo que no padece cancer, es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
La invencion tambien proporciona anticuerpos que se unen de forma espedfica a CSF-1R. Los anticuerpos tienen al menos una propiedad seleccionada de (a) inhibir la union de CSF-1 o IL-34 a CSF-1R; (b) inhibir la activacion de CSF-1R; (c) reducir la fosforilacion de CSF-1R; (d) reducir la activacion de MAPK; (e) reducir la activacion de Akt; (f) reducir la cantidad de CSF-1R; y (g) inducir la ADCC. Una realizacion preferente de la presente invencion posee las propiedades (a) a (g).
Un aspecto de la presente invencion es un anticuerpo que se une de forma espedfica a la variante de CSF-1R humana (SEQ ID NO: 15) o a CSF-1R humano (SEQ ID NO: 16), e inhibe la senalizacion de CSF-1R, se internaliza e induce la degradacion de CSF-1R, y estimula la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) frente a una diversidad de celulas, incluyendo tumores, macrofagos y monocitos. SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 difieren en un aminoacido en la posicion 54, que se encuentra fuera de la region de union.
Como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo” incluye moleculas de inmunoglobulina que comprenden dos cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Las cadenas individuales pueden plegarse en dominios que tienen tamanos (110-125 aminoacidos) y estructuras similares, pero distintas funciones.
La cadena ligera puede comprender un dominio variable (en el presente documento abreviado como VL) y/o un dominio constante (abreviado en el presente documento como CL). Las cadenas ligeras de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de ser humano son ya sea cadenas ligeras kappa (K) o cadenas ligeras lambda (A). La expresion del VL, como se usa en el presente documento, pretende incluir las regiones variables de las cadenas ligera de tipo kappa (VK) y de las cadenas ligeras de tipo lambda (VA). La cadena pesada tambien comprende un dominio variable (abreviado en el presente documento como VH) y/o, dependiendo de la clase o del isotipo del anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4) (abreviado en el presente documento de forma colectiva como CH). En los seres humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, con IgA e IgG subdivididos adicionalmente en subclases y subtipos (IgA1-2 e IgG1-4). La presente invencion incluye anticuerpos de cualquiera de las clases o subclases mencionadas anteriormente. IgG1 de ser humano es el isotipo preferente para los anticuerpos de la
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presente invencion.
En cada uno de VL y VH se encuentran tres regiones, denominadas regiones determinates de complementariedad (CDR) o hipervariables, que estan sustentadas por regiones menos variables denominadas regiones marco conservadas (abreviadas en el presente documento como FR). Los aminoacidos se asignan a una region CDR particular o dominio en conformidad con la convencion de Kabat (Kabat, y col., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-93 (1971); Kabat, y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion del NIH n.° 91-3242 (1991)). Cada uno de VH y VL consta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4. La porcion de un anticuerpo que consiste en los dominios VL y VH se designa Fv (Fragmento variable) y constituye el sitio de union al antfgeno. Fv monocatenario (scFv) es un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio VL y un dominio VH en una cadena polipeptfdica, en el que el extremo N de un dominio y el extremo C del otro dominio estan unidos por un enlazador flexible.
Un “anticuerpo aislado” es un anticuerpo que (1) se ha purificado de forma parcial, sustancial o completa a partir de una mezcla de componentes; (2) se ha identificado y separado, y/o recuperado de un componente de su entorno natural; (3) es monoclonal; (4) esta libre de otras protemas de la misma especie; (5) lo expresa una celula de una especie distinta; o (6) no aparece en la naturaleza. Componentes, como se usa en el presente documento, excluye el anticuerpo de la presente invencion. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferinan con los usos diagnosticos o terapeuticos del anticuerpo, o pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. Los ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo que se ha purificado por afinidad, un anticuerpo que se ha fabricado mediante un hibridoma u otra lmea celular in vitro, y un anticuerpo humano obtenido de un raton transgenico.
La expresion “anticuerpo monoclonal”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son sustancialmente identicos excepto por las posibles mutaciones de origen natural o variaciones postraduccionales menores que pueden estar presentes. Los anticuerpos monoclonales son altamente especfficos, estando dirigidos frente a un unico sitio antigenico (tambien conocido como determinante o epftopo). Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen distintos anticuerpos dirigidos frente a distintos determinantes, cada anticuerpo monoclonal esta dirigido frente a un unico determinante en el antfgeno. El modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos y no debe interpretarse como que se requiere la produccion del anticuerpo mediante algun procedimiento particular.
La expresion “anticuerpo humano”, como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden con las secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal de ser humano (como se describe en Kabat y col., citado anteriormente). Los anticuerpos de ser humano de la invencion pueden incluir restos de anticuerpo no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal de ser humano (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis al azar o dirigida in vitro o por mutacion somatica in vivo), por ejemplo en las CDR. El anticuerpo humano puede tener al menos una posicion reemplazada con un resto de aminoacido, por ejemplo, un resto de aminoacido que potencia la actividad que no esta codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal de ser humano. Sin embargo, la expresion “anticuerpo de ser humano”, como se utiliza en el presente documento, no se pretende que incluya anticuerpos en los que las secuencias de las CDR obtenidas de la estirpe germinal de otra especie de mairnfero, tal como un raton, se hayan injertado en las secuencias de la region marco conservada de ser humano. Procedimientos de produccion de un “anticuerpo de ser humano”, como se utiliza en el presente documento, no se pretende que incluya los anticuerpos producidos en un ser humano.
La frase “anticuerpo de ser humano recombinante” incluye anticuerpos de ser humano que se preparan, expresan, crean o afslan por medios recombinantes, tal como los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresion recombinante transfectado en una celula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo de ser humano recombinante y combinatoria, anticuerpos aislados de un animal que es transgenico para los genes de inmunoglobulina de ser humano, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante otros medios que implican el corte y empalme de secuencias genicas de la inmunoglobulinas humanas con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos de ser humano recombinantes tienen regiones variables y constantes obtenidas de secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal de ser humano.
Fc (region del fragmento cristalizable) es la designacion para la porcion o fragmento de un anticuerpo que consiste en los dominios constantes de la cadena pesada emparejados. En un anticuerpo IgG, por ejemplo, la Fc consiste en los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada. El Fc de un anticuerpo IgA o uno IgM comprende adicionalmente un dominio CH4. La Fc esta asociada con la union al receptor de Fc, la activacion de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad mediada por celulas (CMC). Para anticuerpos tales como IgA e IgM, que son complejos de multiples protemas de tipo IgG, la formacion del complejo requiere los dominios constantes de la Fc.
Por lo tanto, los anticuerpos de la invencion incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos aislados, anticuerpos de ser
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humano, anticuerpos humanizados, anticuerpos de ser humano recombinantes, anticuerpos monoclonales que incluyen mimeticos de anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o la funcion de un anticuerpo. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de union a anftgeno que se unen a un antfgeno de CSF-1R. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo que tienen la capacidad de unirse a CSF-1R, o una porcion del mismo, y que estan abarcados por la presente invencion, incluyen fragmentos bivalentes tales como (Fab')2 con los enlaces disulfuro intercadena intactos, fragmentos monovalentes tales como Fab (Fragmento de union al anftgeno) que se refiere a los fragmentos de los anticuerpos que consisten en los dominios VL-CL y VH-CH1 y no conservan la region bisagra de la cadena pesada (por ejemplo, por digestion con papama), los Fab que conservan la region bisagra de la cadena pesada, Facb (por ejemplo, por digestion con plasmina), F(ab')2, Fab' que carecen de enlaces disulfuro, pFc' (por ejemplo, por digestion con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestion con pepsina, reduccion parcial o reagregacion) y Fv o scFv (por ejemplo, por tecnicas de biologfa molecular). Tambien se pretende que fragmentos de anticuerpo incluyan, por ejemplo, dominios de anticuerpos delecionados, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios, scFv, anticuerpos de dominio unico, anticuerpos monocatenarios multivalentes, anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo que incluyen diacuerpos, triacuerpos y similares, que se unen de forma espedfica a los anftgenos.
La region bisagra separa las porciones Fab y Fc del anticuerpo, proporcionando movilidad de los Fab entre sf y con respecto al Fc, asf como incluyendo multiples enlaces disulfuro para la union covalente de las dos cadenas pesadas.
Se han desarrollado formatos de anticuerpo que conservan la especificidad de union, pero tienen otras caractensticas que pueden ser convenientes incluyendo, por ejemplo, la biespecificidad, la multivalencia (mas de dos sitios de union) y el tamano compacto (por ejemplo, solo los dominios de union). Los anticuerpos de la presente invencion son espedficos para CSF-1R. Especificidad de anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo de un epftopo particular de un anftgeno. Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser, por ejemplo, monoespedficos o biespedficos. Los anticuerpos biespedficos (los BsAb) son anticuerpos que tienen dos especificidades o sitios de union a antfgeno distintos. Cuando un anticuerpo tiene mas de una especificidad, los epftopos reconocidos pueden estar asociados con un unico anftgeno o con mas de un anftgeno. Por lo tanto, la presente invencion proporciona anticuerpos biespedficos que se unen a dos anftgenos distintos, con al menos una especificidad por cSF-Ir.
La especificidad de los presentes anticuerpos por CSF-1R puede determinarse a base de la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio de disociacion de un anftgeno con un anticuerpo (Kd), mide la fuerza de union entre un determinante antigenico y un sitio de union de anticuerpo.
Los anticuerpos de la invencion se unen a un epftopo de CSF-1R emplazado en segmentos del dominio extracelular (en lo sucesivo en el presente documento denominados simplemente como “dominios” o “DEC”). El termino “epftopo”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a sitios tridimensionales discretos en un antfgeno que reconocen los anticuerpos de la invencion. Los epftopos son las regiones inmunologicamente activas en un anftgeno complejo, las regiones que en efecto se unen a un receptor de linfocitos B, y a las que en efecto se unen las moleculas de anticuerpo resultantes producidas por el linfocito B. En general, los anftgenos contienen al menos un epftopo y habitualmente mas de un epftopo. Los epftopos en los anftgenos proteicos pueden ser lineales o no lineales. Los epftopos lineales son los compuestos por restos de aminoacido contiguos en la secuencia de aminoacidos de una protema. Los epftopos lineales pueden o no requerir plegamiento conformacional para formar la estructura tridimensional nativa y provocar una respuesta inmunitaria que produzca anticuerpos con especificidad de union al anftgeno. Los epftopos no lineales estan compuestos de restos de aminoacido no contiguos. Por lo tanto, los epftopos no lineales siempre requieren algun grado de plegamiento de la protema para acercar entre sf a los restos de los aminoacidos requeridos para formar la estructura tridimensional nativa y provocar una respuesta inmunitaria que produzca anticuerpos con especificidad de union al anftgeno.
Los anticuerpos de la presente invencion tambien incluyen aquellos para los que se han mejorado las caractensticas de union mediante mutacion directa, procedimientos de maduracion de la afinidad, presentacion en fagos o combinacion de cadenas (chain shuffling). La afinidad y la especificidad pueden modificarse o mejorarse mediante mutacion de los restos de la CDR y/o de la FW, y la exploracion de los sitios de union a anftgeno que tengan las caractensticas deseadas (vease, por ejemplo, Yang y col., J. Mol. Biol., 254: 392-403 1995)). Las CDR se mutan de una diversidad de maneras. Una manera es aleatorizar restos individuales, o combinaciones de restos, de modo que en una poblacion de, por lo demas, sitios de union a anftgeno identicos, se encuentren subconjuntos de desde dos hasta veinte aminoacidos en posiciones particulares. Como alternativa, pueden inducirse mutaciones a lo largo de un intervalo de restos mediante procedimientos de PCR propensos a errores (vease, por ejemplo, Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-96 (1992)). En otro ejemplo, pueden propagarse vectores de presentacion en fago que contengan los genes de la region variable de las cadenas pesada y ligera en cepas mutadoras de E. coli (vease, por ejemplo, Low y col., J. Mol. Biol., 250: 359-68 (1996)). Estos procedimientos de mutagenesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por un experto en la materia.
Un modo conveniente para la generacion de variantes sustitucionales es la maduracion de la afinidad utilizando presentacion en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la region CDR para generar todas las posibles sustituciones de aminoacido en cada sitio. Las variantes de anticuerpo asf generadas se presentan de un modo monovalente a partir de partmulas de fago filamentoso, como fusiones con el producto del gen III de M13
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empaquetado en cada partteula. Despues se explora la actividad biologica de las variantes presentadas en fagos (por ejemplo, la afinidad de union (Kd), la especificidad, CE50) como se desvela en el presente documento. Para identificar los sitios de la region CDR candidates para la modificacion, se puede realizar mutagenesis mediante alanina para identificar restos de la region CDR que contribuyen de forma significativa a la union al antfgeno. Como alternativa, o ademas, puede realizarse mutagenesis al azar en una o mas secuencias de CDR en las posiciones de uno o mas restos, ya sea mientras la CDR este unida operativamente a la region variable o mientras la CDR es independiente de otra secuencia de la region variable y, despues, la CDR modificada se devuelve a una region variable utilizando la tecnologfa del ADN recombinante. Una vez que tales anticuerpos variantes se generan y expresan, el panel de variantes se somete a exploracion como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o mas ensayos relevantes pueden seleccionarse para el desarrollo adicional.
Ademas de los anticuerpos descritos de forma espedfica en el presente documento, pueden disenarse y fabricarse facilmente otros anticuerpos modificados “sustancialmente homologos” utilizando diversas tecnicas de ADN recombinante bien conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, las regiones marco conservadas pueden variar de las secuencias nativas a nivel de estructura primaria por varias sustituciones, adiciones y deleciones terminales e intermedias de aminoacidos, y similares. Ademas, pueden utilizarse una diversidad de regiones marco conservadas de ser humano distintas, de forma individual o en combinacion, como una base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion. En general, las modificaciones de los genes pueden realizarse facilmente mediante una diversidad de tecnicas bien conocidas, tales como mutagenesis dirigida.
En el presente documento se desvelan secuencias de acidos nucleicos que codifican una cadena pesada del anticuerpo anti CSF-1R, que comprenden una cualquiera de las regiones VH o una porcion de las mismas, o una cualquiera de las CDR de VH, incluyendo cualquiera de las variantes de las mismas, como se desvela en el presente documento. En el presente documento se desvelan moleculas de acidos nucleicos que codifican una cadena ligera del anticuerpo anti CSF-1R que comprenden una cualquiera de las regiones VL, o una porcion de las mismas, o una cualquiera de las CDR de VL, incluyendo cualquiera de las variantes de las mismas como se desvela en el presente documento. En el presente documento se desvelan secuencias de acidos nucleicos del Anticuerpo 1, las SEQ ID NO: 13 y 14, para la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden producirse mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Estos procedimientos incluyen el procedimiento inmunologico descrito por Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13 (Burdon y col. eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam) en Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell ed., 1984); asf como mediante el procedimiento de ADN recombinante descrito en Huse y col., Science 246: 1275-1281 (1989). Los anticuerpos tambien pueden obtenerse a partir de bibliotecas portadoras de combinaciones de dominios VH y VL en forma de scFv o Fab. Los dominios VH y VL pueden estar codificados por nucleotidos que son sinteticos, parcialmente sinteticos u obtenidos de forma natural. La presente invencion puede realizarse mediante bibliotecas de presentacion en fago portadoras de fragmentos de anticuerpos de ser humano. Otras fuentes de anticuerpos de ser humano son ratones transgenicos modificados por ingeniena genetica para expresar genes de inmunoglobulinas de ser humano.
Una realizacion para la preparacion de anticuerpos es la expresion del acido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invencion, en un animal transgenico que tiene insertada una porcion sustancial del genoma que produce el anticuerpo de ser humano y se hace deficiente en la produccion de anticuerpos endogenos. Los animales transgenicos incluyen, pero sin limitacion, ratones, cabras y conejos. Los anticuerpos de la presente invencion se fabricaron con ratones transgenicos. Una realizacion adicional de la invencion incluye la expresion del gen que codifica el anticuerpo en, por ejemplo, la glandula mamaria del animal para la secrecion del polipeptido durante la lactancia.
Un procedimiento comun para la produccion de anticuerpos “humanizados” es injertar secuencias de CDR de un Acm (producido inmunizando un roedor hospedador) en la estructura de una Ig de ser humano, y la transfeccion de los genes quimericos en celulas de ovario de hamster chino (CHO), lo que a su vez produce un anticuerpo funcional secretado por las celulas CHO.
Se entiende que los restos de aminoacido que son los determinantes principales para la union de los anticuerpos de dominio unico pueden estar dentro de las CDR definidas por Kabat o Chothia, pero pueden incluir otros restos tambien, tales como, por ejemplo, restos que de otra forma estanan ocultos en la interfaz VH-VL de un heterodfmero de VH-VL.
La protema utilizada para identificar los anticuerpos de union a CSF-1R de la invencion es preferentemente CSF-1R y, mas preferentemente, es el dominio extracelular de CSF-1R. El dominio extracelular de CSF-1R puede estar libre o conjugado con otra molecula. Los anticuerpos de la presente invencion pueden estar fusionados a restos de aminoacido adicionales. Tales restos de aminoacido pueden ser una etiqueta peptfdica, tal vez para facilitar el aislamiento, o una porcion FC de IgG para optimizar la dimerizacion. Tambien se contemplan otros restos de aminoacido para dirigir a los anticuerpos a organos o tejidos espedficos.
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Los fragmentos de anticuerpo pueden producirse escindiendo un anticuerpo completo o expresando el ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de los anticuerpos pueden prepararse por procedimientos descritos en Lamoyi y col., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) y Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tales fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Tales fragmentos tambien pueden contener anticuerpos monocatenario de fragmentos de las regiones variables, es decir, scFv, diacuerpos u otros fragmentos de anticuerpo. Los procedimientos de produccion de tales equivalentes funcionales se desvelan en: la solicitud de Patente Europea n.° de Publicacion EP 239.400 (Winter); Publicacion PCT WO 89/09622 (Hann, y col.); Solicitud de Patente Europea n.° de Publicacion EP 338.745 (Owens, y col.) y Solicitud de Patente Europea n.° de Publicacion EP 332.424 (Beldler, y col.)
Las celulas hospedadoras preferentes para la transformacion de vectores y la expresion de los anticuerpos de la presente invencion son celulas de marnffero, por ejemplo, las celulas NS0 (celulas de mieloma de raton no secretoras (0)), celulas 293, SP20 y CHO, y otras ffneas celulares de origen linfoide tales como de linfoma, de mieloma o de hibridoma. De forma alternativa pueden utilizarse otros hospedadores eucariotas tales como las levaduras.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden aislarse o purificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica, incluyendo la precipitacion por sulfato de amonio o sulfato de sodio, seguida de dialisis frente a solucion salina, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad o de inmunoafinidad, asf como filtracion en gel o electroforesis zonal. Un procedimiento preferente de purificacion de los anticuerpos de la actual invencion es la cromatograffa por afinidad de Protema-A.
El ADN que codifica los anticuerpos de ser humano pueden prepararse recombinando el ADN que codifica las regiones constantes y las regiones variables de ser humano, distintas de las CDR, obtenidas sustancialmente o exclusivamente de las correspondientes regiones del anticuerpo de ser humano y el ADN que codifica las CDR obtenidas de un ser humano.
Las fuentes adecuadas de ADN que codifican los fragmentos de anticuerpos incluyen cualquier celula, tal como hibridomas y celulas de bazo que expresan el anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos pueden utilizarse por sf mismos como equivalentes de anticuerpo o pueden recombinarse en equivalentes, como se describe anteriormente. La recombinacion de ADN y otras tecnicas descritas en el presente documento puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos. Otra fuente de ADN es una biblioteca de anticuerpos de presentacion en fago, como se conoce en la tecnica.
De forma adicional, en el presente documento se desvelan vectores de expresion que contienen las secuencias polinucleoffdicas descritas anteriormente, unidas operativamente a una secuencia de control tal como una secuencia de expresion, una secuencia promotora y/o una potenciadora. Se han desarrollado una diversidad de vectores de expresion para la smtesis eficaz de polipeptidos de anticuerpo en sistemas procariotas, tales como los sistemas de bacterias o eucariotas, que incluyen, pero sin limitacion, sistemas de cultivo celular de levaduras o de mairfffero. Los vectores desvelados en el presente documento pueden comprender segmentos de secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas.
Puede utilizarse cualquier vector de expresion adecuado. Por ejemplo, los vectores de clonacion procarioticos incluyen plasmidos de E. coli, tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM y RP4. Los vectores procarioticos tambien incluyen derivados de ADN de fagos tales como M13 y otros fagos filamentosos de ADN monocatenario. Un ejemplo de un vector util en levaduras es el plasmido 2 p. Los vectores adecuados para la expresion en celulas de mairfffero incluyen derivados bien conocidos de SV-40, CMV, adenovirus, secuencias de ADN obtenidas de retrovirus y vectores lanzadera obtenidos de la combinacion de vectores funcionales de marnffero, tales como los descritos anteriormente, y de plasmidos y ADN de fago funcionales. Los vectores de expresion eucarioticos adicionales son conocidos en la tecnica (por ejemplo, P. J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41 (1982); Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); Kaufmann y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21 (1982); Scahill y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 4654-59 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216-20) (1980).
Los vectores de expresion utiles, como se describen en el presente documento, contienen al menos una secuencia de control de la expresion que esta unida operativamente a la secuencia o fragmento de ADN a expresar. La secuencia de control se inserta en el vector para controlar y regular la expresion de la secuencia de ADN clonada. Los ejemplos de secuencias de control de la expresion utiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones operadoras y promotoras principales del fago lambda, la region de control de la protema de cubierta fd, los promotores glucoffticos de levadura, por ejemplo, el promotor de la 3-fosfoglicerato-quinasa, los promotores de la fosfatasa acida de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de levadura y los promotores obtenidos del virus del polioma, adenovirus, retrovirus y de simio, por ejemplo, los promotores tempranos y tardtes de SV40, y otras secuencias conocidas por controlar la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas, y sus virus, y combinaciones de los mismos.
Cuando se desea expresar una construccion genica en levaduras, un gen de seleccion adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plasmido de levadura YRp7. El gen trp1 proporciona un marcador de
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seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, n.° de ATCC 44076. La presencia de la lesion de trpl en el genoma de la celula hospedadora de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformacion por el crecimiento en ausencia de triptofano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plasmidos conocidos portadores del gen Leu2.
En el presente documento se desvelan celulas hospedadoras recombinantes que contienen los vectores recombinantes descritos anteriormente. Los anticuerpos de la presente invencion pueden expresarse en lmeas celulares que no sean de hibridomas. Los acidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipeptido de acuerdo con la invencion pueden utilizarse para la transformacion de una celula hospedadora de mairnfero adecuada.
Las lmeas celulares de particular preferencia se seleccionan a base de los niveles elevados de expresion, la expresion constitutiva de la protema de interes y la minima contaminacion con protemas del hospedador Las lmeas celulares de marnffero disponibles como hospedadoras para la expresion son bien conocidas en la tecnica e incluyen muchas lmeas celulares inmortalizadas, tales como, pero sin limitacion, las celulas COS-7, celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO), celulas de rinon de hamster lactante (BHK) y muchas otras, incluyendo lmeas celulares de origen linfoide tales como de linfoma, mieloma o celulas de hibridoma. Las celulas eucariotas adicionales adecuadas incluyen levaduras y otros hongos. Los hospedadores procariotas utiles incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coliX1776, E. coliX2282, E. coli DHI y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces.
Estas celulas hospedadoras recombinantes pueden utilizarse para producir un anticuerpo, o fragmento del mismo, cultivando las celulas en condiciones que permitan la expresion del anticuerpo o fragmento del mismo, y la purificacion del anticuerpo o fragmento del mismo a partir de la celula hospedadora o del medio que rodea a la celula hospedadora. El direccionamiento del anticuerpo o fragmento expresado, para la secrecion en las celulas hospedadoras recombinantes, puede facilitarse insertando una secuencia que codifica una senal o peptido lfder secretor en el extremo 5' del gen que codifica el anticuerpo de interes. Estos elementos peptfdicos lfderes secretores pueden obtenerse de secuencias ya sea procarioticas o eucarioticas. Por consiguiente, se utilizan peptidos lfderes secretores adecuados, siendo aminoacidos unidos al extremo N terminal de un polipeptido, para dirigir el movimiento del polipeptido fuera del citosol de la celula hospedadora y para la secrecion en el medio.
Las celulas hospedadoras transformadas se cultivan por procedimientos conocidos en la tecnica en un medio lfquido que contiene fuentes asimilables de carbono (hidratos de carbono tales como glucosa o lactosa), nitrogeno (aminoacidos, peptidos, protemas o sus productos de degradacion, tales como peptonas, sales de amonio o similares) y sales inorganicas (sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio). Adicionalmente el medio contiene, por ejemplo, sustancias promotoras del crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo hierro, cinc, manganeso y similares.
Tambien se desvela en el presente documento un procedimiento para el tratamiento del crecimiento tumoral en un marnffero administrando al mamffero una cantidad eficaz de un anticuerpo. Las condiciones adecuadas para ser tratadas de acuerdo con la presente invencion implican celulas que expresan preferentemente CSF-1R. Aunque no se pretende quedar ligado a ningun mecanismo particular, los presentes procedimientos proporcionan el tratamiento del crecimiento de celulas cancerosas que incluyen, por ejemplo, aquellas en las que el crecimiento neoplasico, la metastasis osea, el rechazo de trasplante de organos o un trastorno inmunitario, tal como una enfermedad inmunitaria, estan estimulados por CSF-1R.
“Tratamiento” o “tratar”, en el contexto de la presente invencion, se refiere al tratamiento terapeutico que incluye la inhibicion, desaceleracion, reduccion o inversion de la progresion de la afeccion subyacente o del cambio fisiologico no deseado asociado con una enfermedad o trastorno, la mejora de los smtomas clmicos de una afeccion o la prevencion de la aparicion de smtomas clmicos de la afeccion. Los resultados clmicos beneficiosos o deseados incluyen, pero si limitacion, el alivio de los smtomas, la disminucion del grado de una enfermedad o trastorno, la estabilizacion de una enfermedad o trastorno (es decir, cuando la enfermedad o trastorno no empeora), el retraso o desaceleracion de la progresion de una enfermedad o trastorno, la mejora o la paliacion de la enfermedad o trastorno, y la remision (ya sea parcial o total) de la enfermedad o trastorno, ya sea detectable o no detectable. Tratamiento tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen a los que ya tienen la enfermedad. En una realizacion, la presente invencion puede utilizarse como un medicamento.
En los procedimientos desvelados en el presente documento, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo de la invencion a un mamffero o paciente que lo necesite. De forma adicional, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti CSF-1R de la invencion. Una “cantidad terapeuticamente eficaz” o “dosis eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los penodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patologfa, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porcion de anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Otros factores incluyen la administracion, el sitio diana, el estado fisiologico del
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paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Aunque los anticuerpos humanos de la invencion son particularmente utiles para la administracion a seres humanos, pueden administrarse tambien a otros mairnferos. El termino mai^ero, como se utiliza en el presente documento, se pretende que incluya, pero sin limitacion, seres humanos, animales de laboratorio, animales domesticos y animales de granja. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una en la que cualquiera de los efectos toxicos o perjudiciales del anticuerpo o porcion de anticuerpo esta compensado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.
Las pautas posologicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica). Pueden ajustarse las dosificaciones del tratamiento utilizando procedimientos de rutina conocidos para los expertos en la tecnica, para optimizar la seguridad y la eficacia. Los programas de dosificacion normalmente vanan de una dosis en embolada unica o infusion continua a multiples administraciones por dfa (por ejemplo, cada 4-6 horas), o segun lo indicado por el medico responsable y el estado del paciente. Un intervalo ejemplar no limitante para una dosis terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de la invencion es de 0,150 mg/kg, mas preferentemente 3-35 mg/kg y mas preferentemente 5-20 mg/kg. Las cantidades y frecuencias de la dosificacion las determinara el medico que trata al paciente y pueden incluir dosis desde menos de 1 mg/kg hasta mas de 100 mg/kg proporcionadas de forma diaria, tres veces por semana, de forma semanal, una vez cada dos semanas o con menos frecuencia. Cabe senalar, sin embargo, que la presente invencion no se limita a ninguna dosis particular.
Los anticuerpos anti CSF-1R pueden administrarse en combinacion con uno o mas tratamientos anticancerosos incluyendo, pero sin limitacion, un agente antiangiogenesis, un agente quimioterapeutico y un agente antineoplasico. Puede utilizarse cualquier agente anticanceroso adecuado, tal como un agente quimioterapeutico, radiacion, anticuerpo o combinaciones de los mismos.
Los agentes anticancerosos incluyen, pero sin limitacion, agentes antineoplasicos, anticuerpos, adyuvantes y profarmacos. Los agentes antineoplasicos que se conocen actualmente en la tecnica, o que se estan evaluando, pueden agruparse en una diversidad de clases que incluyen, por ejemplo, inhibidores mitoticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos intercalantes, inhibidores de los factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes antisupervivencia, modificadores de la respuesta biologica, antihormonas y agentes antiangiogenesis. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen, pero sin limitacion, cisplatino, ciclofosfamida, melfalan y dacarbazina. Los ejemplos de antimetabolitos incluyen, pero sin limitacion, doxorrubicina, daunorrubicina, paclitaxel, gemcitabina, ALlMTA® y los inhibidores de la topoisomerasa irinotecan (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, topotecan (topoisomerasa I), etoposido (VP-16) y teniposido (VM-26) (topoisomerasa II). Cuando el agente antineoplasico es radiacion, la fuente de la radiacion puede ser externa (radioterapia externa - RE) o interna (braquirradioterapia - BT) para el paciente a tratar. La dosis administrada de agente antineoplasico depende de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y gravedad del tumor que se esta tratando, y la via de administracion del agente. Debe enfatizarse, sin embargo, que la presente invencion no se limita a ninguna dosis particular. En un aspecto, docetaxel es un agente antineoplasico preferente de la invencion. En otros aspectos de la invencion son agentes antineoplasicos preferentes paclitaxel, Herceptin® y doxorrubicina.
Los anticuerpos anti CSF-1R de la invencion pueden administrarse con anticuerpos que neutralicen otros receptores implicados en el crecimiento tumoral o la angiogenesis. Un anticuerpo anti CSF-1R se utiliza en combinacion con un antagonista de receptor que se une de forma espedfica a Her2. Otro ejemplo de tal receptor es VEGFR. Un anticuerpo anti CSF-1R puede utilizarse en combinacion con un antagonista de VEGFR. Un anticuerpo contra CSF- 1R tambien puede administrarse en combinacion con uno o mas adyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (por ejemplo IL-10, IL-4 e IL-13) u otros estimuladores inmunitarios, tales como, pero sin limitacion, quimiocinas, antfgenos asociados a tumor y peptidos.
En la presente invencion puede utilizarse cualquier procedimiento o via adecuada para administrar los anticuerpos anti CSF-1R de la invencion y, de forma opcional, coadministrar agentes antineoplasicos y/o antagonistas de otros receptores. En una terapia de combinacion de la presente invencion, el anticuerpo anti CSF-1R se puede administrar antes, durante o de forma sustancialmente simultanea con, o tras comenzar la terapia con otro agente, incluyendo, pero sin limitacion, docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorrubicina, asf como cualquier combinacion de los mismos. Los regfmenes para los agentes antineoplasicos utilizados de acuerdo con la invencion incluyen cualquier regimen que se considere optimamente adecuado para el tratamiento para la condicion neoplasica del paciente. Distintas neoplasias pueden requerir el uso de anticuerpos antitumorales espedficos y agentes antineoplasicos espedficos, lo que se determinara sobre una base de paciente a paciente. Las vfas de administracion incluyen, por ejemplo, la administracion oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutanea o intramuscular. La dosis administrada de antagonista depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y gravedad del tumor que se esta tratando, y la via de administracion de los antagonistas. Debe enfatizarse, sin embargo, que la presente invencion no se limita a ningun procedimiento o via de administracion particular.
Los anticuerpos anti CSF-1R de la invencion, cuando se utilizan en un marnffero con el fin de profilaxis o tratamiento, se formulan preferentemente como composiciones farmaceuticas. Tales composiciones farmaceuticas y los procedimientos para la preparacion de las mismas son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo,
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Remenigton: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A., y col., Eds., 19a ed., Mack Publishing Co., 1995).
En otro aspecto de la invencion, los anticuerpos de la invencion pueden administrarse junto con, o unidos de forma qmmica o biosintetica a, agentes anticancerosos, agentes antineoplasicos o antiangiogenicos, o agentes que producen una senal detectable. Los agentes antitumorales unidos a un anticuerpo incluyen cualquiera de los agentes que destruyen o danan la neovasculatura o un tumor, o los macrofagos a los que se ha unido el anticuerpo o del entorno de la celula a la que el anticuerpo se ha unido. La presente invencion puede ser un anticuerpo anti CSF-1R administrado como un conjugado, que incluye, pero sin limitacion, un inmunoconjugado, que se une de forma espedfica al receptor y suministra una toxina despues de la internalizacion del ligando-toxina. El conjugado de anticuerpo-agente puede estar unidos de forma directa entre sf o a traves de un conector, peptfdico o no peptfdico. Por ejemplo, un agente antitumoral o agente antimacrofago es un agente toxico tal como un agente antineoplasico o un radioisotopo. Los agentes antineoplasicos adecuados, incluyendo los agentes quimioterapeuticos, son conocidos por los expertos en la materia y se discuten a continuacion. La invencion contempla adicionalmente anticuerpos anti CSF-1R unidos a radicales diana o indicadores, que incluyen, solo a modo de ejemplo, agentes antineoplasicos, otros anticuerpos o indicadores, tales como isotopos radiomarcados, en un sistema de diagnostico en donde un agente que produce una senal detectable esta conjugado con el anticuerpo.
En el presente documento se desvela un procedimiento para inhibir la angiogenesis que comprende administrar una composicion que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion a un mairnfero, durante un tiempo y en una cantidad eficaz para inhibir la angiogenesis. De forma similar, los anticuerpos pueden utilizarse en procedimientos para inhibir la metastasis tumoral en un mamffero administrando a una composicion que contiene un anticuerpo de la invencion a un mamffero, durante un tiempo y en una cantidad eficaz para inhibir la metastasis de un tumor.
En el presente documento se desvela un procedimiento para alojar la infiltracion de macrofagos en el estroma tumoral y estimular el crecimiento tumoral que comprende administrar una composicion que contiene un anticuerpo de la invencion a un mamffero, durante un tiempo y en una cantidad eficaz para inhibir los efectos de los macrofagos sobre el crecimiento tumoral. De forma similar, los anticuerpos pueden utilizarse en procedimientos para aliviar en un mamffero la erosion osea alrededor de una metastasis tumoral, administrando una composicion que contiene un anticuerpo de la invencion a un mamffero durante un tiempo y en una cantidad eficaz para inhibir la erosion osea.
La invencion contempla la utilizacion del ligando de CSF-1R (CSF-1 o IL-34) como un biomarcador en la sangre, suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion, de pacientes con cancer que responden al tratamiento cuando el cancer tiene CSF-1R expresado en la superficie de los macrofagos asociados a un tumor. En el presente documento se desvela un procedimiento para predecir el tratamiento satisfactorio de un paciente con el anticuerpo o fragmento de la presente invencion, midiendo en una muestra los niveles de CSF-1 en sangre, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion. En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente, que comprende las etapas de: (1) medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo, de la presente invencion, si los niveles de CSF-1 son mayores que los niveles de CSF-1 encontrados en una poblacion de control. La invencion contempla adicionalmente el procedimiento de predecir el tratamiento satisfactorio de un paciente con el anticuerpo o fragmento de la presente invencion, midiendo en una muestra los niveles de IL-34 en sangre, en la que la muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion. En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento del cancer en un paciente, que comprende las etapas de: (1) medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo, de la presente invencion, si los niveles de IL-34 son mayores que los niveles de IL-34 encontrados en una poblacion de control.
La presente invencion tambien contempla un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de la presente invencion, que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 en una muestra del sujeto, en la que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion; y (2) en el que un aumento del nivel de CSF-1, comparado con el nivel de CSF-1 en un individuo que no padece cancer, es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
La presente invencion contempla adicionalmente un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de la presente invencion, que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de IL-34 en una muestra del sujeto, en la que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales o celulas tumorales en circulacion; y (2) en el que un aumento del nivel de IL-34, comparado con el nivel de IL-34 en un individuo que no padece cancer, es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
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La presente invencion tambien contempla un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de la presente invencion, que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 o de IL-34, o de ambos, en una muestra del sujeto, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion; y (2) en el que un aumento del nivel de CSF-1 o IL-34, o de ambos, comparado con el nivel de CSF-1 o IL-34, o de ambos, en un individuo que no padece cancer es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
Los niveles de CSF-1 o IL-34 pueden medirse en una diversidad de procedimientos, que incluyen kits disponibles en el mercado (R&D Systems para CSF-1 y USCN Life Sciences, Inc. para IL-34). En una de tales tecnicas, se anaden patrones de CSF-1 o de iL-34, o las muestras, a una placa prerrecubierta con anticuerpos contra CSF-1 o IL-34 humanos, para permitir la union de CSF-1 o IL-34 a los anticuerpos. Tras el lavado de CSF-1 o IL-34 no unidos y de otras protemas, se anade un anticuerpo secundario que reconoce respectivamente el anticuerpo anti CSF-1 o IL-34. El anticuerpo secundario se acopla a peroxidasa de rabano picante, que emite un color azulado cuando se anade sustrato a los pocillos. La intensidad del color correlaciona con la cantidad de CSF-1 o IL-34 encontrada en la placa.
Dado que CSF-1 e IL-34 son de origen natural en un cuerpo humano sano, sena necesario determinar en una poblacion de control un nivel basal de CSF-1 y uno de IL-34. La poblacion de control puede incluir un grupo de individuos que no se hayan diagnosticado como que tienen una afeccion cancerosa o signos de infeccion. Por consiguiente, la poblacion de control establecera un intervalo de niveles de CSF-1 e IL-34 que sea normal o basal para individuos sanos. Por ejemplo, los niveles de CSF-1 son el 68 % o 77 % mayores en el suero de pacientes con cancer de mama o colorrectal, respectivamente, que en el suero de los grupos de control (Lawicki y col., Clin. Chim. Acta 317: 112-116 (2006); Mroczho y col., Clin. Chim. Acta 380: 208-212 (2007)). En un aspecto de la invencion, los niveles del ligando de CSF-1R son al menos el 50% mayores en muestras de pacientes con cancer que en muestras procedentes de la poblacion de control. El intervalo de los niveles de CSF-1 y/o IL-34 en la poblacion de control se comparara con el nivel de CSF-1 y/o IL-34 identificado en la muestra o muestras del paciente, para determinar si el nivel de CSF-1 y/o IL-34 del paciente es mayor que el intervalo de niveles basales de la poblacion de control.
En un aspecto, los anticuerpos de la presente invencion son para su uso en el tratamiento de un cancer en el que las celulas cancerosas son secretoras de ligando. En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invencion son para su uso en el tratamiento de un cancer en el que las celulas cancerosas son secretoras de CSF-1. En aun otro aspecto, los anticuerpos de la presente invencion son para su uso en el tratamiento de un cancer en el que las celulas cancerosas son secretoras IL-34.
En el presente documento se desvelan kits para inhibir el crecimiento tumoral y/o la angiogenesis, que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti CSF-1R humano. Los kits pueden comprender adicionalmente el anticuerpo o fragmento del mismo y un agente adicional que induce agentes anticancerosos adicionales, agentes o tratamientos antineoplasicos, incluyendo, pero sin limitacion, docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorrubicina. Como alternativa, o ademas de, los kits pueden contener cualquier antagonista adecuado de, por ejemplo, otro receptor de factor de crecimiento implicado en la tumorigenesis o la angiogenesis, discutido a continuacion. Los kits desvelados en el presente documento pueden comprender adicionalmente un adyuvante.
Por consiguiente, los presentes anticuerpos contra receptor pueden asf utilizarse in vivo e in vitro para procedimientos de investigacion, diagnostico, profilacticos o de tratamiento, que son bien conocidos en la tecnica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion. Las descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como los empleados en la construccion de vectores y plasmidos, la insercion de genes que codifican polipeptidos en tales vectores y plasmidos, la introduccion de plasmidos en celulas hospedadoras y la expresion y determinacion de estos mismos genes y productos genicos, pueden obtenerse a partir de numerosas publicaciones, incluyendo Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Coligan, J. y col. Current Protocols in Immunology, Wiley y Sons, Incorporated (2007).
Expresion y purificacion de anticuerpos anti CSF-1R humanos
Para cada anticuerpo, se introduce por ingeniena genetica una secuencia de nucleotidos de la cadena pesada adecuada, por ejemplo SEQ ID NO: 13 para el Anticuerpo 1, en un plasmido de expresion adecuado, por ejemplo pGSHC, y se introduce por ingeniena genetica una secuencia de nucleotidos de la cadena ligera adecuada, por ejemplo SEQ ID NO: 14 para el Anticuerpo 1, en un plasmido de expresion adecuado, tal como pGSLC, mediante un procedimiento adecuado tal como clonacion por pCr. Para establecer una lmea celular estable, se cotransfectan mediante electroporacion en una lmea celular hospedadora adecuada, tal como celulas NSO o CHO, los plasmidos de la cadena pesada y ligera linealizados, y se cultiva en medios de cultivo adecuados tales como medio de Eagle modificado por Dulbecco sin glutamina con suero fetal de ternera dializado y complemento de glutamina sintasa. Se exploran los clones por la expresion de anticuerpo mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
y se selecciona el de mejor produccion para el cultivo en matraces rotativos. Se purifican los anticuerpos mediante un procedimiento adecuado, tal como cromatograffa de afinidad de protema A.
La Tabla 1 proporciona las secuencias de aminoacidos y las SEQ ID NO de las diversas CDR del Anticuerpo 1 de la presente invencion. Todas las secuencias de CDR se determinan utilizando la convencion de Kabat. La Tabla 2 5 proporciona las SEQ ID NO de las diversas secuencias relacionadas con la presente invencion. Las secuencias de acido polinucleico que codifican las secuencias de aminoacidos desveladas a continuacion tambien se incluyen en el ambito de la presente invencion.
Tabla 1: Secuencia de aminoacidos del Anticuerpo 1
CDR de la regiones variables de las cadenas pesada y ligera
Cadena pesada SEQ ID NO. Cadena ligera SEQ ID NO.
CDR1
SYGMH 1 RASQGISNALA 4
CDR2
VIWYDGSNKYYADSVKG 2 DASSLES 5
CDR3
GDYEVDYGMDV 3 QQFNSYPWT 6
10 Tabla 2: Secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO. del Anticuerpo 1
Cadena pesada Cadena ligera
Region variable Completa sin senal Completa con senal Region variable Completa sin senal Completa con senal
Anticuerpo 1
7 9 11 8 10 12
Ensayo de union por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Para el ensayo de union de CSF-1R, se recubre una placa de 96 pocillos con protema de fusion CSF-1R-Fc humana recombinante soluble (R&D Systems) (1 jg/ml x 100 jl), se sella la placa y se incuba durante una noche a 4 °C. Se 15 lavan los pocillos 3 veces con PBS (solucion salina tamponada con fosfato) que contiene TWEEN-20® al 0,2% (PBS/T), despues se bloquean los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 °C) (TA) con PBS que contiene seroalbumina bovina (BSA) al 3 %. Se aspira la mezcla BSA-PBS y se lava 3 veces la placa con PBS/T. Se hacen diluciones en serie del Anticuerpo 1 o de la IgG de control (comenzando en 3 jl/ml y se diluye con factor 3) y se anaden 100 jl a los pocillos durante 1 hora a TA. Se lavan los pocillos tres veces con PBS/T. Tras el lavado, se 20 incuba la placa con 100 de un conjugado fragmento F(ab')2 espedfico anti humano-HRP (Jackson ImmunoResearch) en PBS (dilucion 1:5000) a TA durante 1 hora. Se lava la placa 5 veces con PBS/T y despues se incuba con 100 jl de una preparacion 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solucion de peroxidasa B (KPL) durante 15 minutos a TA. Se detiene la reaccion colorimetrica con la adicion de 100 jl de H2SO4 0,1 M. Se recogen los datos utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm. Se analizan los datos de absorbancia con el programa 25 informatico GraphPad Prism para calcular la DE50. La DE50, o la mitad de la dosis eficaz maxima, es la dosis necesaria para conseguir el 50 % de la union maxima.
La DE50 del Anticuerpo 1 contra CSF-1R es de 9,7 x 10-11 M, informado como 0,09 nM. El Anticuerpo 1 presenta una fuerte union a CSF-1R
Ensayo de bloqueo por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
30 ELISA para demostrar que los anticuerpos bloquean la interaccion CSF-1/CSF-1R
Se recubren placas de microtitulacion de 96 pocillos con CSF-1 (0,5 jg/ml x 10,0 jl)) (R&D Systems) a 4 °C durante una noche. Se lavan los pocillos 3 veces con PBS/T, despues se bloquea con 100 jl de BSA/PBS al 3 % durante 1 hora a TA. Se lava otra vez 3 veces con PBS/T. Se diluye la protema de fusion rh-CSF-1R-Fc humana soluble (R&D Systems) hasta una concentracion final de 0,250 jg/ml en PBS. Al mismo tiempo se diluye el Anticuerpo 1 en PBS 35 hasta una concentracion final de 200 nM. Se diluye en serie el Anticuerpo 1 en aumentos de 1:3 desde los 200 nM iniciales hasta 3x10-12M. Se combinan 100 jl de rh-CSF-1R-Fc con 100 jl de cada dilucion del Anticuerpo 1 durante 30 minutos a TA. Se incuban 100 jl de las mezclas de Anticuerpo 1:CSF-1R-Fc durante 1 hora a TA en los pocillos cubiertos con CSF-1. Despues de 1 hora de incubacion a TA, se lava 3 veces con PBS/T y se anade a las placas una dilucion de 1:5000 del anticuerpo conjugado IgG-Fc-antihumano-HRP durante 1 hora a TA. Se lavan las placas 40 5 veces con PBS/T y despues se incuba con 100 jl de una preparacion 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y
solucion de peroxidasa B (KPL) durante 15 minutos a TA. Se detiene la reaccion colorimetrica con la adicion de 100 jl de H2SO4 0,1 M. Se recogen los datos utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm. Se analizan los datos de absorbancia con el programa informatico GraphPad Prism para calcular la CI50. La CI50, o la mitad de la concentracion inhibidora maxima, es la concentracion del anticuerpo que provoca una inhibicion del 50 % de la union 45 del ligando al receptor.
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La CI 50 de la union del Anticuerpo 1 a CSF-1R humano es de 8,1 x 10 M, informado como 0,81 nM. El Anticuerpo 1 inhibe la union de CSF-1 a CSF-1R, impidiendo de este modo la activacion de CSF-1R por parte del ligando CSF-1.
ELISA para demostrar que los anticuerpos bloquean la interaccion IL-34/CSF-1R
Se recubren placas de microtitulacion de 96 pocillos con IL-34 (0,5 pg/ml x 100 pl) (R&D Systems) a 4 °C durante una noche. Se lavan los pocillos 3 veces con PBS/T, despues se bloquea con 100 pl de BSA/PBS al 3 % durante 1 hora a TA. Se lava otra vez con 3 veces de PBS/T. Se diluye la protema de fusion rh-CSF-1R-Fc humana soluble (R&D Systems) hasta una concentracion final de 0,250 pg/ml en PBS. Al mismo tiempo, se diluye el Anticuerpo 1 en PBS hasta una concentracion final de 200 nM. Se diluye en serie el Anticuerpo 1 en aumentos de 1:3 desde los 200 nM iniciales hasta 3x10'12M. Se combinan 100 pl del rh-CSF-1R-Fc con 100 pl de cada dilucion del Anticuerpo 1 durante 30 minutos a TA. Se incuban 100 pl de las mezclas de Anticuerpo 1-CSF-1R-Fc durante 1 hora a TA en los pocillos recubiertos con IL-34. Tras 1 hora de incubacion a TA, se lava 3 veces con PBS/T y se anade una dilucion de 1:5000 del anticuerpo conjugado anti IgG-Fc de ser humano-HRP a las placas durante 1 hora a TA. Se lavan las placas 5 veces con PBS/T y despues se incuban con 100 pl de una preparacion 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y de solucion de peroxidasa B (KPL) durante 15 minutos a TA. Se detiene la reaccion colorimetrica con la adicion de 100 pl de H2SO4 0,1 M. Se recogen los datos utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm. Se analizan los datos de absorbancia con el programa informatico GraphPad Prism para calcular la CI50. La CI50, o la mitad de la concentracion inhibidora maxima, es la concentracion del anticuerpo que provoca el 50 % de inhibicion de la union del ligando al receptor.
La CI 50 de la union del Anticuerpo 1 a CSF-1R humano es de 7,0 x 10 M, notificado como 0,71 nM. El Anticuerpo 1 inhibe la union de IL-34 a CSF-1R, impidiendo de este modo la activacion de CSF-1R por parte del ligando IL-34.
Analisis de la cinetica de union mediante resonancia de plasmon superficial/analisis de Biacore®
Se mide la cinetica de union del Anticuerpo 1 a CSF-IR-Fc a 25 °C en un Biosensor Biocore® 2000 SPR (GE Healthcare). Se inmoviliza protema de fusion CSF-1R-Fc soluble (concentracion de 10 pg/ml y pH 5), variando de 395 a 1200 unidades de respuesta, en un chip CM5 utilizando el protocolo de acoplamiento de aminas convencional. Durante las mediciones de la afinidad de union se utiliza como tampon de corrida HBS-EP (HEPES 0,01 M (pH 7,4), NaCl 0,15 mM y 3 EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005 % v/v). Se realizan los analisis de interaccion a medida que se inyectan los anticuerpos en solucion, a concentraciones que vanan de 1,5-100 nM, sobre la superficie preparada del chip sensor cM5. Se inyectan para la union los anticuerpos durante 3 minutos y se permite que se disocien durante 15 minutos. Se realiza la regeneracion de la protema inmovilizada mediante una inyeccion de 10 pl/min de HCl 20 mM. Se utiliza el programa informatico BIAevaluation version 4.1 para determinar la Ka (kon) y la Kd (koff) de la formacion del complejo mediante un ajuste global simultaneo de los datos a un modelo de Langmuir 1:1. Se calcula la constante de asociacion en equilibrio (Ka) a partir del cociente 1/Kd medido en Molar (1/M). Se calcula la constante de disociacion en equilibrio (Kd) a partir del cociente de las constantes de velocidad Kd/Ka medidas en Molar (M).
En la Tabla 3 se resumen los valores promedio de Ka, Kd y Kd para multiples analisis de Biacore® para el Anticuerpo 1 con CSF-1R humano
Tabla 3: Cineticas de union del anticuerpo al CSF-1R humano recombinante
Anticuerpo
Ka (1/Ms) Kon Kd (1/s) Koff Kd(M)
Anticuerpo 1
3,7 x 105 3,3 x 10'4 8,0 x 10'10
El Anticuerpo 1 muestra una alta afinidad de union a CSF-1R.
Fosforilacion de CSF-1R detectada mediante transferencia de Western
Se siembran celulas NIH3T3 transfectadas de forma estable con celulas CSF-1R en una placa de 12 pocillos a una densidad de 5x105 celulas/pocillo, en 1 ml pocillo de medio de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero fetal bovino al 10 % (SFB) y geneticina 1 mg/ml durante 5 horas. Se lavan las monocapas dos veces en PBS y se cultiva durante una noche en 0,9 ml de DMEM /pocillo con SFB al 1 %. Se hacen diluciones en serie del Anticuerpo 1 en DMEM (comenzando en 1 pg/ml y diluyendo con factor 3) y se anaden 100 pl a los pocillos durante 2 horas a 37 °C. Se estimulan las celulas con ligando CSF-1 o IL-34 100 ng/ml durante 10 minutos y despues se pone en hielo y se lava dos veces con PBS enfriado en hielo. Se lisan las celulas en 100 pl de Hepes 50 mM (pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5 %, Na3VO41 mM, NaPPi 10 mM, NaF 50 mM) y un comprimido de inhibidores de proteasa (Roche), en hielo durante 10 minutos. Se clarifican las celulas lisadas por centrifugacion a 4 °C. Se cargan 20 pl de lisado en un gel de electroforesis desnaturalizante y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa. Se detecta CSF-1R con tirosinas fosforiladas en la transferencia utilizando un anticuerpo anti fosfoCSF-1R a 1 pg/ml (Cell Signaling). Se determina la senalizacion de CSF-1R sondando la transferencia con ya sea anti fosfo-MAPK (dilucion 1:500) o anti fosfo-Akt (1:1000) (Cell Signaling). Para asegurar una carga equivalente de los carriles, se sondan las transferencias con anticuerpos anti CSF-1R (1 pg/ml; R&D Systems) o anticuerpos anti actina (1:2000;
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Sigma). Se incuban todos los anticuerpos primarios con agitacion durante 1 hora a TA; seguido del correspondiente anticuerpo secundario conjugado con HRP, tambien con agitacion durante 1 hora a TA. Se visualizan las bandas con un reactivo de quimioluminiscencia (GE Healthcare).
Las celulas NIH-3T3 transfectadas de forma estable con CSF-1R muestran una rapida fosforilacion de CSF-1R cuando se estimulan con CSF-1 o IL-34. La presencia del Anticuerpo 1 inhibe la fosforilacion de CSF-1R, incluso cuando los niveles de anticuerpos son de 1 nM, lo que indica que la union del Anticuerpo 1 a CSF-1R impide la activacion del receptor por CSF-1R o IL-34. La inhibicion de la fosforilacion de CSF-1R tambien conduce a la disminucion de la fosforilacion de las moleculas de senalizacion utilizadas por la ruta ya sea de CSF-1 o IL-34. Tanto Akt como MAPK, que estan aguas abajo de CSF1-R, tienen niveles de fosforilacion disminuidos cuando las celulas se incuban con el Anticuerpo 1 de 100 nM a 1 nM. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 impide la activacion de CSF-1R y la activacion de la cascada de quinasas que sigue la estimulacion de CSF-1R. No hay diferencia entre los carriles en los niveles de protema de la actina y de CSF-1R, como evidencia la senal de quimioluminiscencia equivalente en cada carril observada cuando las transferencias se sondan con anticuerpos frente a estas moleculas. Por consiguiente, la inhibicion de la fosforilacion de CSF-1R no se debe a dificultades tecnicas por una carga desigual de las muestras de protema sino a una representacion real de una senalizacion disminuida.
Ensayos de internalizacion y degradacion
El Anticuerpo 1 induce la internalizacion del receptor CSF-1R
Se siembran celulas NIH-3T3-CSF-1R en portaobjetos con camaras de 8 pocillos (Nunc) y se incuba a 37 °C hasta que las celulas cubren el 50 % del area de superficie de los pocillos. Se deja que los pocillos se enfnen hasta 4 °C antes de iniciar el experimento en una mezcla en suspension de agua:hielo. Se incuban las celulas con el Anticuerpo 1 5 |jg/ml e se transfiere inmediatamente a 37 °C durante de 15 minutos a 4 horas para permitir que se produzca la internalizacion. Se continua incubando un conjunto separado de portaobjetos en la mezcla en suspension de agua:hielo durante de 15 minutos a 4 horas con Anticuerpo 1 5 jg/ml como un control. La incubacion a 4 °C impide la internalizacion del receptor de CSF-1, por lo tanto, cualquier senal observada dentro de la celula es un artefacto. Tras la incubacion, se lavan las celulas dos veces con PBS fno antes de fijarlas durante 15 minutos con paraformaldetndo al 1 % enfriado en hielo. Tras lavar tres veces con PBS fno, se permeabilizan durante 5 minutos las celulas en PBS que contiene saponina al 0,5 % y BSA al 1 %, y despues se lava otra vez en PBS que contiene BSA al 1 %. Se marca durante 1 hora con anticuerpo de cabra anti IgG de ser humano Cy3 (dilucion 1:5000) para marcar de forma fluorescente el Anticuerpo 1. Se realizan tres lavados finales con PBS antes del montaje en GelMount (Biomeda) y se cubren los portaobjetos con cubreobjetos. Para determinar la localizacion celular en las diversas condiciones descritas anteriormente el Anticuerpo 1 marcado de forma fluorescente puede visualizarse al microscopio.
En la inspeccion al microscopio, antes del inicio del experimento, a 4 °C el Anticuerpo 1 se observa en la periferia de la celula. El cambio de las celulas a 37 °C permite la rapida internalizacion del complejo Anticuerpo 1/CSF-1R, observada habitualmente al cabo de 15 minutos. Tras 1 o 2 horas de incubacion con el Anticuerpo 1, todos los complejos anticuerpo/CSF-1R se presentan de forma perinuclear con muy poca visualizacion en la membrana plasmatica, lo que indica que la union del Anticuerpo 1 a CSF-1R induce que el receptor se internalice de forma rapida y se mantenga dentro de la celula. Las celulas mantenidas a 4 °C durante hasta 2 horas muestran solo tincion periferica de la celula, sin internalizacion del Anticuerpo 1. Por lo tanto, la internalizacion del anticuerpo/CSF-1R es un proceso dependiente de ATP que se produce al cabo de los 15 minutos de la adicion del anticuerpo a las celulas.
El Anticuerpo 1 induce la degradacion del receptor CSF-1R
Se siembran celulas NIH-3T3-CSF-1R a 5x105 celulas/pocillo en una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio DMEM que contiene SFB al 10 % y geniticina 1 mg/ml. Tras la incubacion de la celulas a 37 °C durante 5 horas, se anade a las placas ya sea CSF-1 100 ng/ml o Anticuerpo 1 15 jg/ml. Se sabe que CSF-1 induce la internalizacion y degradacion de CSF-1R, actuando de este modo como un control positivo para el experimento. Se permite que CSF- 1 permanezca en las celulas durante 1 a 5 horas antes de recoger las celulas. En los otros pocillos, se incuba durante 24 y 48 horas con el Anticuerpo 1 antes de recoger las celulas. Se aspira el medio, se lisan las celulas y se corren los lisados clarificados en geles (como se describe anteriormente). Se sondan las protemas transferidas con anticuerpos anti CSF-1R para determinar la cantidad de receptor para cada condicion. Se sondan las mismas transferencias con anticuerpos anti actina para normalizar los niveles de protema. Se cuantifican los niveles de CSF- 1R y de actina utilizando el programa Multi-Gauge, para medir la densidad de las bandas de las transferencias de Western. El nivel de protema CSF-1R total relativo se representa mediante la densidad total de la banda de CSF-1R dividido por la correspondiente densidad de la banda de actina.
La incubacion de CSF-1 con las celulas NIH-3T3-CSF-1R conduce a la degradacion de CSF-1R al cabo de 1 hora de tratamiento y los niveles de CSF-1R se reducen a la mitad en 5 horas. La degradacion de CSF-1R cuando se incuba con Anticuerpo 1 no es pronunciada; el Anticuerpo 1 disminuye los niveles de CSF-1R en un cuarto. Tras 48 horas los niveles de degradacion son los mismos, lo que indica que la tasa de degradacion permanece constante. Por lo tanto, la union del Anticuerpo 1 a CSF-1R conduce a la degradacion de los receptores en las celulas.
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Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por el Anticuerpo 1
Ademas de inhibir la union de CSF-1 a CSF-1R y de inducir la internalizacion y degradacion de CSF-1R, el Anticuerpo 1 tambien inhibe a CSF-1R desencadenando una respuesta de ADCC.
Se siembran celulas de leucemia humana NKM-1 a 2x105 celulas/ml en 25 pl de medio RPMI que contiene SFB con IgG Ultrabaja al 10% e IL-2 humana 3 ng/ml en una placa de 96 pocillos. Se hacen diluciones en serie 1:3 del Anticuerpo 1 1 pg/ml en ya sea la estructura de IgG1 o de IgG2, anadiendo 25 pl/pocillo. Tras una incubacion de 15 minutos, se siembran 25 pl de 3 x 106 celulas/ml de linfocitos NK humanos (Lonza) y se incuba durante unas cuatro horas adicionales a 37 °C. Se anaden 10 pl de tampon de lisis del kit aCella-TOX (Cell Technology) y se lleva a TA durante 15 minutos. Se anaden 125 pl de SFB bajo IgG y se centrifugan las placas durante 1 minuto a 750 xg. Se anaden 50 pl de Diluyente de Ensayo Enzimatico del kit aCella-TOX a Optiplates (Perkin Elmer) y se transfieren de forma cuidadosa 50 pl del sobrenadante de las celulas a las Optiplates. Se preparan el reactivo de ensayo enzimatico y el reactivo de deteccion de acuerdo con las instrucciones del kit, anadiendo a las Optiplates 100 pl de reactivo de ensayo enzimatico seguido inmediatamente de 50 pl de reactivo de deteccion. Veinte minutos despues de anadir los reactivos se leen las placas en un luminometro.
La actividad de ADCC aumenta de una manera dependiente de la dosis del Anticuerpo 1, con el 9 % de las celulas NKM-1 destruidas cuando las concentraciones del Anticuerpo 1 alcanzan 1 pg/ml. Por el contrario, cuando el Anticuerpo 1 se clona en una estructura de IgG2 no hay cambio en la actividad de ADCC con cantidades crecientes de Anticuerpo 1. Por lo tanto, el Anticuerpo 1, una molecula de IgG1, induce la ADCC de las celulas a las que se une.
Mapeo epitopico
Publicaciones anteriores han determinado que CSF-1 se une a los tres primeros dominios de Ig de CSF-1R. Wang y col., Mol. Celda. Biol. 13: 5348 (1993). El Anticuerpo 1 se une a CSF-1R e inhibe la union de CSF-1 a CSF-1R humano, por lo tanto, debe unirse en o cerca de los primeros tres dominios de Ig de CSF-1R. Para determinar a que epttopos se une el Anticuerpo 1 en la molecula de CSF-1R, se intercambian los primeros tres dominios de Ig de raton y ser humano (vease la Tabla 4). El Anticuerpo 1 no reconoce al CSF-1R de raton, por lo tanto, si se inserta un dominio de Ig de raton en una region de union cntica del CSF-1R humano, la union de los anticuerpos podna no producirse.
Se insertan las modificaciones de los tres primeros dominios de Ig en una estructura de CSF-1R humano que contiene los dos dominios de Ig mas C-terminales restantes del dominio extracelular. Se fusionan estas construcciones con la porcion Fc de una molecula de IgG para facilitar la produccion de protema y la estabilidad de las moleculas.
Tabla 4: Dominios de Ig de CSF-1R definidos
Dominio de Ig
n.° de aminoacido
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21-107
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108-201
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202-292
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293-402
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Por lo tanto, la quimera 1 contiene el dominio de Ig de raton 1, el dominio de Ig de ser humano 2 y el dominio de Ig de ser humano 3 (r, h, h), y los dominios de Ig de ser humano 4 y 5 fusionados a una etiqueta de Fc. La quimera 2 a la quimera 7 son como siguen: r, r, h (quimera 2), r, r, r (quimera 3), h, r, h (quimera 4), h, r, r (quimera 5), h, h, r (quimera 6) y r, h, r (quimera 7), fusionados a los dos ultimos dominios de Ig del CSF-1R humano y despues a la etiqueta de Fc.
La union del Anticuerpo 1 a las protemas CSF-1R quimericas se determina mediante ELISA de union y Biacore®, como se describe anteriormente. Brevemente, se recubren placas con 100 pl de las protemas 1-7 humana, de raton o la quimera 200 ng/ml durante una noche. Tras el lavado y el bloqueo de las placas, se anade Anticuerpo 1 por duplicado a una concentracion de 100 nM. Se anaden anticuerpos secundarios Fab anti ser humano conjugados a HRP a una concentracion de 1:10.000, para detectar la union del Anticuerpo 1 a las moleculas de CSF-1R.
Como se esperaba, en los ensayos de union de ELISA el Anticuerpo 1 se une a CSF-1R humano pero no de raton. El Anticuerpo 1 se une de forma debil a las quimeras que contienen el primer o segundo dominio de Ig de ser humano, pero no a las que contienen el primer o segundo dominio de Ig de raton. El Anticuerpo 1 se une fuertemente a la quimera que contiene tanto el primer domino como el segundo dominio de Ig de ser humano de CSF-1R. Todas las otras construcciones no se unen al Anticuerpo 1. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 se une a los
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dominios de Ig uno y dos, pero requiere ambos dominios para una fuerte union del anticuerpo a CSF-1R humano cuando se evalua en un ensayo de union. Los datos de Biacore® recapitulan los datos de ELISA. Ninguna construccion quimerica que no contuviese un segundo dominio de Ig de ser humano se unio al Anticuerpo 1, incluso cuando los niveles de anticuerpo eran de 1 jM, lo que indica que se requiere el segundo dominio de Ig para la union del Anticuerpo 1. La union del Anticuerpo 1 se potencio adicionalmente cuando el primer dominio de Ig tambien era de origen humano. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 se une principalmente al segundo dominio de Ig de CSF-1R pero tiene algunos contactos beneficiosos con el primer dominio de Ig.
Ensayos de diferenciacion y proliferacion
Diferenciacion de macrofagos mediante CSF-1
Se siembran monocitos (Lonza) a una densidad de 4x105 celulas/ml en cada camara de un portaobjetos de 8 camaras, en 900 jl de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene SFB al 10% y CSF-1h 100 ng/ml. Se hacen diluciones en serie del Anticuerpo 1 en RPMI (comenzando en 1 jg/ml y diluyendo al triple) y se anaden 100 jl a los pocillos. Se incuba a 37 °C, cambiando el medio cada tres dfas hasta que se observa de forma visible que los monocitos se adhieren a la placa y se elongan, lo que es caractenstico de la diferenciacion de macrofagos.
Los monocitos tratados con el Anticuerpo 1 2 nM o concentraciones mayores, en presencia de CSF-1, fracasan en diferenciarse a macrofagos, conservando su morfologfa redondeada caractenstica de los monocitos. La induccion de CSF-1 de la diferenciacion de monocitos a macrofagos puede inhibirse con el Anticuerpo 1 con una CI50 de 0,25 nM. Ademas, muchos mueren durante el tratamiento, incapaces de sobrevivir sin la estimulacion continua con CSF-1.
Diferenciacion de macrofagos mediante IL-34
Se siembran monocitos (Lonza) a una densidad de 4x105 celulas/ml en cada camara de un portaobjetos de 8 camaras, en 900 jl de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene SFB al 10% e IL-34h 100 ng/ml. Se hacen diluciones en serie del Anticuerpo 1 en RPMI (comenzando a un 1 jg/ml y diluyendo al triple) y se anaden 100 jl a los pocillos. Se incuba a 37 °C, se cambia el medio cada tres dfas hasta que se observa de forma visible que los monocitos se adhieren a la placa y se elongan, lo que es caractenstico de la diferenciacion de macrofagos.
Los monocitos tratados con el Anticuerpo 1 2 nM o concentraciones mayores, en presencia de IL-34, fracasan en diferenciarse a macrofagos, conservando su morfologfa redondeada caractenstica de los monocitos. La induccion de IL-34 de la diferenciacion de monocitos a macrofagos puede inhibirse con el Anticuerpo 1 con una CI50 de 0,3 nM. Ademas, muchos mueren durante el tratamiento, incapaces de sobrevivir sin la estimulacion continua con CSF-1.
Proliferacion de monocitos mediante CSF-1
Se siembran monocitos (Lonza) a una densidad de 3000 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos en presencia de medio RPMI 1640 que contiene SFB al 10 % y CSF-1 100 ng/ml. Al siguiente dfa se cambia el medio y se anade el Anticuerpo 1 diluido en serie de 20 nM a 0,01 nM (diluciones con factor 3). Tres dfas mas tarde se cambia el medio por medio recien preparado que contiene SFB al 10 %, CSF-1 100 ng/ml y anticuerpo, y se dejan crecer las celulas 5 dfas adicionales. Tras la adicion de 100 jl de tampon de CellTiter Glo Luminecent y de sustrato (Promega), se agitan las celulas durante 10 minutos y se lee la luminiscencia como un indicador de viabilidad.
La CI 50 del Anticuerpo 1, que inhibe el 50 del crecimiento de los monocitos, es de 1,4 x 10 M, notificado como 0,1 nM. La CI 50 para la induccion de CSF-1 del crecimiento de los monocitos en presencia de Anticuerpo 1 indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferacion de monocitos en cultivo.
Proliferacion de monocitos mediante IL-34
Se siembran monocitos (Lonza) a una densidad de 3000 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos en presencia de medio RPMI 1640 que contiene SFB al 10 % e IL-34 100 ng/ml. Al siguiente dfa se cambia el medio y se anade el Anticuerpo 1 diluido en serie de 20 nM a 0,01 nM (diluciones con factor 3). Tres dfas mas tarde se cambia el medio por medio recien preparado que contiene SFB al 10 %, IL-34 100 ng/ml y anticuerpo, y dejan crecer las celulas 5 dfas adicionales. Tras la adicion de 100 jl de tampon CellTiter Glo Luminecent y de sustrato (Promega), se agitan las celulas durante 10 minutos y se lee la luminiscencia como un indicador de viabilidad.
La CI 50 del Anticuerpo 1, que inhibe el 50% del crecimiento de los monocitos, es de 0,5 nM. La CI50 para la induccion de IL-34 del crecimiento de los monocitos en presencia de Anticuerpo 1 indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferacion de monocitos en cultivo.
Ensayo de proliferacion con CSF-1 para lineas celulares tumorales
Se siembran celulas de leucemia NKM-1 a 1x104 celulas/ml en 100 jl de medio RPMI 1640 que contiene SFB al 1 % en una placa de 96 pocillos durante una noche. Se anade a las celulas CSF-1 20 ng/ml en medio RPMI 1640 que contiene SFB al 1 % y el Anticuerpo 1 diluido en serie 1 de 20 nM a 0,01 nM (diluciones con factor 3). Se incuba a
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37 °C durante 3 dfas adicionales. Tras la adicion de 100 pl de tampon de CellTiter Glo Luminecent y de sustrato (Promega), se agitan las celulas durante 10 minutos antes de leer la luminiscencia (como un indicador de viabilidad).
La CI 50 para el crecimiento de NKM-1 en presencia del Anticuerpo 1 es de 7,6 x 10 M, notificado como 0,07 nM. Esto indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferacion de las celulas NKM-1 en cultivo.
Modelos de tumor in vivo en los que CSF-1R se expresa en la superficie del tumor
Supervivencia prolongada de ratones portadores de leucemia humana NKM-1 tratados con el Anticuerpo 1
Se irradian ratones Nu/nu de forma subletal con 200 rads/raton 24 horas antes de una inyeccion intravenosa con 2,5 x 106 celulas de leucemia NKM-1. Unas 24 horas adicionales mas tarde, se dividen los ratones al azar en 4 grupos que reciben dos veces al dfa ya sea IgG de ser humano 60 mg/kg o Anticuerpo 1 60 mg/kg, 20 mg/kg o 5 mg/kg. Se controla la supervivencia de los ratones de forma diaria. Se determinan los valores P mediante el test de Mantel Cox del orden logantmico.
Tabla 5: Supervivencia aumentada de ratones tratados con Anticuerpo 1 portadores de celulas de leucemia NKM-1
Tratamiento
Mediana de la supervivencia (dfas) Comparacion de cohorte Valor P con respecto al control
IgG de Ser Humano
35 N/A N/A
Anticuerpo 1 (5 mg/kg)
55 Control de IgG de ser humano <0,0001
Anticuerpo 1 (20 mg/kg)
46 Control de IgG de ser humano <0,0001
Anticuerpo 1 (60 mg/kg)
46 Control de IgG de ser humano <0,0001
N/A=No Aplicable Los volumenes tumorales se calculan mediante la formula Volumen = [(Pi/6) 1xw2], en la que Pi es igual a 3,14, w representa el ancho y 1 representa el largo. El porcentaje del Control o %T/C = 100* (Volumen de Tratamiento)/(Volumen de Control). La significacion estadfstica se atribuyo si el valor p era menor a, o igual a, 0,05.
Como se observa en la Tabla 5, el Anticuerpo 1 aumenta la supervivencia de ratones portadores de celulas de leucemia NKM-1.
Modelos tumorales in vivo en los que se expresa CSF-1R en la superficie de macrofagos asociados a tumor
El Anticuerpo 1 anti CSF-1R es un anticuerpo completamente humano que reconoce la forma humana de CSF-1R pero no la forma murina del receptor. Por lo tanto, se necesita un anticuerpo anti raton para realizar estudios de prueba de hipotesis in vivo en los que se expresa CSF-1R en el macrofago. Estos estudios abordan el papel de los macrofagos de raton en el crecimiento de tumores humanos en modelos de xenoinjerto de ratones. Un anticuerpo anti raton afectana a los macrofagos de raton pero no al tumor, permitiendo la capacidad de medir el efecto de los macrofagos del estroma en el crecimiento tumoral. Los siguientes experimentos se realizan con el Anticuerpo 2, un anticuerpo de rata anti CSF-1R de raton.
Eficacia del Acm anti CSF-1R de raton en el modelo de carcinoma de endometrio humano AN3CA Xenog raft
Se inyectan por via subcutanea en el flanco izquierdo ratones Nu/nu (hembras, 7-8 semanas) con 5x106 celulas AN3CA/raton. Cuando los tumores alcanzan aproximadamente los 200 mm3, se agrupan los ratones al azar en grupos de 12 ratones/tratamiento.
Se prepara el Anticuerpo 2 y la IgG de rata en solucion salina, a una concentracion de 6 mg/ml, y se administran por via subcutanea tres veces a la semana a 40 mg/kg. En el dfa 15 se registran los volumenes tumorales y se calcula el % T/C. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas. Se calcula un T/C % del 66 % para el grupo de tratamiento con el Anticuerpo 2 frente al grupo de control de IgG de rata. Estos resultados muestran una inhibicion tumoral significativa (p = 0,045) en los animales tratados con el Anticuerpo 2.
Eficacia del Acm anti CSF-IR de raton en el modelo de carcinoma de mama humano de xenoinjerto de HCC1954
Se inyectan por via subcutanea ratones Nu/nu (hembras, 7-8 semanas; Laboratorios Charles River) con 1x107 celulas HCC1954/raton. Cuando los tumores alcanzan un tamano de 300 mm3, los ratones se escogen al azar por tamano tumoral, asignando 12 animales a cada grupo de tratamiento. Se preparan la IgG de rata y el Anticuerpo 2 en solucion salina a una concentracion de 6 mg/ml y se administra por via subcutanea, tres veces por semana. Se dosifican los animales de la IgG de rata con 40 mg/kg y se dosifican los animales del Anticuerpos 2 ya sea con 40 mg/kg o 10 mg/kg en cada inyeccion. Se registran las mediciones tumorales dos veces por semana; 37 dfas despues de la primera inyeccion se calcula el T/C %. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas.
Como se muestra en la Tabla 6, se calculo un T/C % del 77 % para el grupo de tratamiento que recibio 10 mg/kg y un T/C % del 56 % para el grupo de tratamiento que recibio 40 mg/kg el dfa 37, como el cociente de los volumenes tumorales relativos frente al grupo de control de solucion salina. Los resultados muestran una inhibicion tumoral significativa (p = 0,0014) en los animales tratados con el Anticuerpo 2 40 mg/kg.
5 Efecto antitumoral de un Acm anti CSF-1R de raton en el modelo de xenoinierto de prostata humana DU145
Se inyectan por via subcutanea en el flanco izquierdo ratones Nu/nu (machos, 7-8 semanas) con 15x106 celulas DU145/raton. Cuando los tumores alcanzan aproximadamente los 250 mm3, se agrupan los ratones al azar en grupos de 12 ratones/tratamiento.
Se preparan el Anticuerpo 2 y la IgG de rata en solucion salina a una concentracion de 6 mg/ml y se administran por 10 via subcutanea tres veces por semana a 40 y 10 mg/kg. En el dfa 21 se registran los volumenes tumorales y se
calcula el % T/C para los 10 mg/kg y 40 mg/kg. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas.
Como se muestra en la Tabla 6, se calcula un T/C % de 50 y 43 respectivamente para los grupos de tratamiento de 10 mg/kg y 40 mg/kg, frente al grupo de control de IgG de rata. Estos resultados muestran una inhibicion tumoral 15 significativa (p=<0,0001 para ambas concentraciones) en los animales tratados con el Anticuerpo 2.
Tabla 6: Inhibicion de xenoinjertos de tumor humano mediante el Anticuerpo 2
Descripcion del modelo
Tratamiento % T/C Comparacion de cohorte Valor P con respecto al control
HCC1954 (mama)
Anticuerpo 2 (10 mg/kg) 77 Control de IgG de rata 0,4543
HCC1954 (mama)
Anticuerpo 2 (40 mg/kg) 56 Control de IgG de rata 0,0014
DU145 (prostata)
Anticuerpo 2 (10 mg/kg) 50 Control de IgG de rata <0,0001
DU145 (prostata)
Anticuerpo 2 (40 mg/kg) 43 Control de IgG de rata <0,0001
Infiltracion de macrofagos disminuida en tumores de mama de HCC1954 y de prostata de DU145 tratados con un Acm anti CSF-1R de raton
20 Se extraen los tumores de los animales de los estudios de animales con HCC1954 (mama) y DU145 (prostata) descritos anteriormente. Se corta el tumor a lo largo del eje mas largo y se coloca en formalina al 10 % durante una noche a 4 °C mientras se agita. Despues de 24 horas, se lava 2 veces en PBS durante 20 minutos, despues se anaden soluciones de concentraciones progresivamente mayores de etanol, hasta que el tumor esta en etanol al 100 %. Se cambia el etanol por xileno mediante varias incubaciones en xileno al 100 % y se incluye el tumor en 25 parafina. Se cortan los bloques de parafina en cortes de 4 pm y se coloca en portaobjetos de vidrio. Se desparafiniza y se rehidrata el tejido mediante incubaciones progresivas en xileno seguidas de concentraciones crecientes de agua en etanol. Los portaobjetos de los tumores en solucion de recuperacion de la diana (Dako) se calientan en un microondas durante 3 minutos antes del bloqueo de las peroxidasas endogenas con H2O2 al 3 % durante 10 minutos a TA. Se bloquea la union de protemas no espedficas con Protein Block (Dako) durante 10 minutos antes de anadir 30 anticuerpo espedfico anti macrofago de raton en rata F4/80 (2 pg/ml; Serotec) conjugado con biotina y se incuba durante una noche a 4 °C. Se incuba en HRP-estreptavidina (dilucion 1:1000; Jackson ImmunoPesearch) durante 45 minutos a TA y se lava 3 veces. Se revela en DAB (Dako) segun las instrucciones del kit, se detiene la reaccion con dos lavados en agua. Se contratine brevemente con Hematoxilina de Mayer (10 minutos; Dako), seguido de un lavado con agua, una breve inmersion en alcohol acido, un segundo lavado con agua y el azulado utilizando agua 35 amoniacal. Se deshidrata, se retira todo y se coloca un cubreobjeto utilizando un medio de montaje permanente. Se analizan 5 imagenes de tres animales para cada grupo de tratamiento. Utilizando el programa informatico ImagePro, se determina el numero de macrofagos/area para cada grupo de tratamiento.
Tabla 7: Infiltracion de macrofagos en tumores tratados con el Anticuerpo 2 Acm anti CSF-1R de raton
Descripcion del modelo
Tratamiento Prom. del n.° de macrofagos/area Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
HCC1954 (mama)
IgG de Rata 664 N/A N/A
HCC1954 (mama)
Anticuerpo 2 (10 mg/kg) 82 Control de IgG de rata <0,0001
HCC1954 (mama)
Anticuerpo 2 (40 mg/kg) 76 Control de IgG de rata <0,0001
DU145 (prostata)
IgG de Rata 84 N/A N/A
5
10
15
20
25
30
35
40
(continuacion)
Descripcion del modelo
Tratamiento Prom. del n.° de macrofagos/area Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
DU145 (prostata)
Anticuerpo 2 (10 mg/kg) 5 Control de IgG de rata <0,0001
DU145 (prostata)
Anticuerpo 2 (40 mg/kg) 0,5 Control de IgG de rata <0,0001
N/A=No aplicable
Como se observa en la Tabla 7, la cantidad de macrofagos disminuye en ambos modelos tumorales, en especial a lo largo de la periferia. Por lo tanto, los tratamientos con el Anticuerpo 2 conducen a una disminucion de la infiltracion de macrofagos de los tumores, lo que indica que el anticuerpo anti CSF-1R de raton es responsable del empobrecimiento de la poblacion de macrofagos en estos tumores.
Importancia de los macrofagos y de los niveles CSF-1 en la progresion tumoral
Ademas de la mama y la prostata, puede efectuarse de forma beneficiosa mediante la administracion del Anticuerpo 1 la inhibicion del crecimiento tumoral, asf como el tratamiento, de muchos canceres. Algunos tipos de tumor, tales como el cancer de rinon, expresan CSF-1R en la superficie de sus celulas y podna inhibirse su crecimiento de forma directa con el tratamiento con el Anticuerpo 1 (Soares, y col., Modern Pathol. 22: 744-752 (2009)). Otros tipos de tumor, tales como el linfoma de Hodgkin y el mieloma multiple, que tienen una gran poblacion de macrofagos asociados al tumor, podnan beneficiarse del tratamiento con el Anticuerpo 1, en donde el Anticuerpo 1 podna eliminar los macrofagos que estan induciendo el crecimiento tumoral (Steidl, y col. New Engl. J. Med. 362: 875-885 (2010); Zheng, y col., Blood 114: 3625-3628 (2009)). De forma adicional los tumores que secretan CSF-1 son sensibles al tratamiento anti CSF-1 o CSF-1R, tal como el cancer colorrectal (Aharinejad, y col., Cancer Res. 62: 5317-5324 (2002)), y podnan ser apropiados para el tratamiento con el Anticuerpo 1. Ademas, el cancer de ovario, el carcinoma hepatocelular y los carcinomas de celulas renales, cuya alta expresion de CSF-1 se correlaciona con un mal pronostico, podnan ser todos candidatos para el tratamiento con el Anticuerpo 1 (Toy, y col., Gyn. Oncol. 80: 194-200 (2001); Zhang, y col., Gyn. Oncol. 107: 526-531 (2007); Zhu, y col, J. Clin. Oncol. 26: 2707-2716 (2008); Gerharz, y col., Urol. 58: 821-827 (2001)).
Los tumores que no expresan CSF-1R que poseen macrofagos asociados al tumor tienen el crecimiento inhibido por los anticuerpos anti CSF-1R solo si se secreta CSF-1
Se siembran las lmeas de celulas tumorales HCC1954 (mama), DU145 (prostata) y Pc3 (prostata) a 5x105 celulas/ml durante 48 horas en medio de cultivo que contiene SFB al 1 %. Se recoge, se clarifica y se analiza el medio utilizando un kit de ensayo de M-CSF Humano R&D Quantikine (R&D Systems). Se determinan los niveles de CSF-1 en los tiempos 0 y 48 h como pg/ml.
A las 0 horas, como se esperaba, no habfa CSF-1 discernible en el medio. Sin embargo, al cabo de 48 horas, las celulas HCC1954 secretaron 3613 pg/ml de CSF-1 mientras que las celulas DU145 produjeron 4019 pg/ml. Por el contrario, el medio de las celulas Pc3 solo contema 39 pg/ml de CSF-1.
La linea celular de prostata Pc3 se crece en ratones para verificar si la ausencia de expresion de CSF-1 esta correlacionada con la resistencia al tratamiento anti CSF-1R
Se inyectan 5x106 celulas de prostata Pc3 por via subcutanea en ratones desnudos (machos, 7-8 semanas) y se permite que los tumores alcancen los 300 mm3, antes de subdividirlos en grupos de tratamiento de 12 ratones cada uno. Los animales se dosifican con 40 mg/kg de IgG de rata, Anticuerpo 2 40 mg/kg o Anticuerpo 2 10 mg/kg, tres veces a la semana, hasta que los tumores de control alcanzan los 2000 mm3. Se miden los volumenes tumorales y se calcula el T/C % para cada grupo de tratamiento en el dfa 18 como el cociente de los volumenes tumorales relativos frente al grupo de control de IgG de Rata. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas.
Tabla 8: Correlacion de CSF-1 y la resistencia al tratamiento anti CSF-1R
Tratamiento
T/C % Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
Anticuerpo 2 (10 mg/kg)
101 Control de IgG de rata 0,95
Anticuerpo 2 (40 mg/kg)
102 Control de IgG de rata 0,53
No hay diferencia en el crecimiento entre los grupos de control tratados con IgG de rata frente a los grupos tratados con Anticuerpo 2, lo que indica que los niveles elevados de CSF-1 pueden ser un biomarcador para el tratamiento con anticuerpos anti CSF-1R.
5
10
15
20
25
30
La secrecion de CSF-1R esta correlacionada con la sensibilidad al tratamiento anti CSF-1R cuando CSF-1R esta expresado en la superficie de los macrofagos asociados al tumor
Se inyectan celulas en ratones desnudos por via subcutanea como se detalla en las Tablas 9 y 10 a continuacion, y se deja que los tumores alcancen los 300 mm3 antes de subdividir en grupos de tratamiento de 12 ratones cada uno. Los animales se dosifican tres veces por semana de acuerdo con el regimen de tratamiento detallado en las Tablas 9 y 10 a continuacion, hasta que los tumores de control alcanzan los 2000 mm3. Se miden los volumenes tumorales y se calcula el T/C % para cada grupo de tratamiento como el cociente de los volumenes tumorales relativos frente al grupo de control de IgG de rata. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas.
Tabla 9: Sensibilidad en modelos de tumor que secretan CSF-1
Descripcion del modelo
Tipo de tumor Especie Tratamiento % T/C Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
MDA-MB-231 LS-OP-PT
Mama Ser humano 40 mg/kg TVS 51 Control de IgG de rata 0,0002
HCC-1954
Mama Ser humano 40 mg/kg TVS 56 Control de IgG de rata 0,0014
DU145
Prostata Ser humano 40 mg/kg TVS 43 Control de IgG de rata <0,0001
4T1
Mama Raton 40 mg/kg TVS 54 Control de IgG de rata 0,0001
EMT6
Mama Raton 40 mg/kg TVS 42 Control de IgG de rata <b,0001
TVS=Tres veces por semana.
Tabla 10: Sensibilidad en modelos tumorales que no secretan CSF-1
Descripcion del Modelo
Tipo de Tumor Especie Tratamiento % T/C Comparacion de Cohortes Valor P con respecto al control
MCF-7
Mama Ser humano 60 mg/kg DVS 70 Control de IgG de Rata 0,0166
JimT1
Mama Ser humano 40 mg/kg TVS 93 Control de IgG de Rata 0,23
PC3
Prostata Ser humano 40 mg/kg TVS 102 Control de IgG de Rata 0,53
TVS=Tres veces por semana.
Todos los tumores que secretan CSF-1 (Tabla 9) responden al tratamiento anti CSF-1R con el Anticuerpo 2 mientras que los tumores que no secretan CSF-1 (Tabla 10) no responden, o solo lo hacen de forma pobre, al Anticuerpo 2 anti CSF-1R. La secrecion de CSF-1 esta correlacionada con la sensibilidad a los tratamientos anti CSF-1R en los modelos de tumor en los que se expresa CSF-1R en la superficie de los macrofagos asociados a tumor. Por consiguiente, los niveles elevados de CSF-1 funcionan como un posible indicador de sensibilidad o biomarcador cuando CSF-1R se expresa en la superficie de macrofagos asociados al tumor.
CSF-1R tambien puede expresarse en la superficie de celulas tumorales. La secrecion de CSF-1 no esta correlacionada con la sensibilidad a los tratamientos anti CSF-1R para la expresion de CSF-1R en la superficie de celulas tumorales.
Niveles de IL-34 en tumores y en muestras de suero de pacientes
Ademas de CSF-1, IL-34 tambien puede unirse a CSF-1R, inducir la fosforilacion del receptor y activar las moleculas de senalizacion aguas abajo, lo que conduce a la diferenciacion y supervivencia de los macrofagos. Tanto CSF-1 como IL-34 se unen a los dominios IgG en el dominio extracelular de CSF-1R (Lin, y col., Science, 320: 807-11 (2008)) y se puede inhibir la union de ambos ligandos a CSF-1R mediante el Anticuerpo 1 (CI50 = 0,81 nM y CI50 = 0,71 nM para la inhibicion de la union de CSF-1 e IL-34 por el Anticuerpo 1, respectivamente, como se discute anteriormente). El tratamiento con el Anticuerpo 1 de las celulas NIH-3T3 transfectadas de forma estable con CSF-1R inhibe la fosforilacion de CSF-1R por IL-34 (como se discute anteriormente). Adicionalmente, la induccion de IL-34 de la diferenciacion de monocito a macrofago y la proliferacion de macrofagos puede inhibirse con el Anticuerpo 1, con CI50 de 0,3 nM y 0,5 nM, respectivamente (como se discute anteriormente), lo que es comparable con los resultados observados para CSF-1. Por lo tanto, la actividad de IL-34 y su inhibicion mediante el Anticuerpo 1 son similares a las observadas para CSF-1.
Los niveles de IL-34 estan elevados en muchas celulas tumorales incluyendo las lmeas celulares de tumor de
mama, prostata y endometrio. Adicionalmente, una subpoblacion de pacientes de prostata y mama tiene altos niveles de protema IL-34 en sus sueros. Por consiguiente, dado que IL-34 funciona de forma casi identica a CSF-1 y que la secrecion de CSF-1 esta correlacionada con la sensibilidad a los tratamientos anti CSF-1R, los niveles elevados de IL-34 tambien funcionan como un indicador de sensibilidad o biomarcador.
5 Estudios de combinacion para tumor de mama
Se inyectan ratones Nu/nu (hembras, 7-8 semanas) por via subcutanea con 1x107 celulas de mama HCC-1954/raton y se deja que los tumores alcancen los 300 mm3 antes del tratamiento. Los ratones se agrupan al azar en grupos de 12 y se tratan como sigue:
Tabla 11: Estudios de combinacion de mama
Tratamiento
Dosis % T/C Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
IgG de ser Humano 40 mpk + Anticuerpo 2 40 mpk
TVS 44 Control de IgG de ser Humano 40 mpk + IgG de Rata 40 mpk 0,0002
Herceptin® 40 mpk + IgG de Rata 40 mpk
TVS 46 Control de IgG de ser Humano 40 mpk + IgG de Rata 40 mpk <0,0001
Herceptin® 40 mpk + Anticuerpo 2 40 mpk
TVS 26 Control de IgG de ser Humano 40 mpk + IgG de Rata 40 mpk <0,0001
Anticuerpo 2 40 mg/kg
TVS 42 control de solucion salina 0,006
Doxorrubicina IP 8 mg/kg
UVSx2 50 control de solucion salina 0,008
Anticuerpo 2 40 mg/kg Doxorrubicina 8 mg/kg
TVS, UVSx2 28 control de solucion salina 0,0005
Anticuerpo 2 40 mg/kg
TVS 38 control de solucion salina <0,0001
Paclitaxel IP 10 mg/kg
UVSx3 60 control de solucion salina <0,01
Anticuerpo 2 40 mg/kg Paclitaxel 10 mg/kg
TVS, UVSx3 23 control de solucion salina <0,0001
TVS=Tres veces por semana; UVSx2=una vez por semana, dos veces; UVSx3=una vez por semana, tres veces.
10
Se miden los volumenes tumorales y se calcula el T/C% para cada grupo de tratamiento como el cociente de los volumenes tumorales relativos frente al grupo de control. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas repetidas.
En todos los estudios mostrados en la Tabla 11, el Anticuerpo 2, Herceptin®, Doxorrubicina y Paclitaxel inhiben el 15 crecimiento tumoral como agentes unicos. Sin embargo, la combinacion del Anticuerpo 2 con un agente de direccionamiento tumoral tiene un efecto aditivo, lo que indica que una combinacion de un anticuerpo anti CSF-1R con un producto quimioterapeutico o con otros agentes que afectan al tumor sera mas eficaz que estos reactivos solos.
Estudios de combinacion para tumor de prostata
20 Se inyectan ratones Nu/nu (macho, 7-8 semanas) por via subcutanea con 1,5 x 107 celulas de prostata DU145/raton y deja que los tumores alcancen los 300 mm3 antes del tratamiento. Se agrupan los ratones al azar en grupos de 10 y se tratan como sigue:
Tabla 12: Estudios de combinacion para prostata
Tratamiento
Dosis % T/C Comparacion de cohortes Valor P con respecto al control
Anticuerpo 2 40 mg/kg
TVS 50 control de solucion salina 0,03
Docetaxel IP 12 mg/kg
UVSx3 59 control de solucion salina 0,15
Anticuerpo 40 mg/kg Docetaxel 12 mg/kg
TVS, UVSx3 29 control de solucion salina <0,0001
TVS=Tres veces por semana; UVSx3=una vez por semana, tres veces.
Se miden los volumenes tumorales y se calcula el T/C% para cada tratamiento como el cociente de los volumenes tumorales relativos frente al grupo de control. Se analizan los volumenes tumorales utilizando ANOVA con medidas
repetidas.
La combinacion del Anticuerpo 2 con docetaxel tiene un efecto aditivo, lo que indica que la combinacion con productos quimioterapeuticos en el cancer de prostata sera mas eficaz que los productos quimioterapeuticos solos.
Secuencias adicionales
5 SEQ ID NO: 9

Gin Asp Gin Leu Val GIu Ser GJy Gly GJy Vai Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu GIn.Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 .
Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin

.100 . 105 110 .

Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 '

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Giy Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 . 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Giy Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 . 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp . 210 215 220 .

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Aia Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 . 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Vai Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 .

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu 325 330 335

Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 .

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp . 405 410 : 415 . .

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440-445

Gly Lys ' 450
t
SEQ ID NO: 10

Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser VaJ Gly 1 5 10 15 , ;

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Ala 20 . 25 30 .

Lieu Ala Trp Tyt Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 '

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vat Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 ,
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala

ioo 105 no .

Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 ■

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 , .

Lys Val Gin Tip Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
SEQ ID NO: 11

Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu.Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Asp Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 •

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu 50 55 60 .

Glu Trp Val Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 .80 . .

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala GIu.Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp.Val

115 120 125

Tip Giy Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Tbr Lys Gly .130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu. Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 1 70 1 75 .

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 .

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val 210 215 220 •

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245. 250 255 ' '

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr . 260 265 . 270

Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 '

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 305 310 ■ 315 320 .

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 325 . 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350

Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin 370 375 380 ,

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys thr Thr 405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 . 430 ■'

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys

465 .
SEQ ID NO: 12

Met Gly Tip' Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr G3y 1.5 10 15 ■ '

Val His Ser Ala lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala . 20, 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He 35 40 45 '

Ser Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 . 55 60

Leii Leu lie Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser 85 90 95

Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Qlh Gin Phe Asn Ser 100 105 110

Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr 115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175

Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
SEQ ID NO: 13
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcacag 60 gaccagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180

ggcgaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac actgtatctg 300 caaatgaaea gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggtgactac 360 gaggtcgact acggaatgga cgtctgggge caagggacca cggtcaccgt cgcctcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctetgggggc 480 acagcggccc tgggetgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aaetcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac apcttcccgg ctgtcctaea gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagegt ggtgaccgtg ecctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgeaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactect ggggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagcc'ac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtat 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacage 960 acgtaccgtg tggtcaigcgt cctcaccgtc ctgcaccaag actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaaggge agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aagtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag egacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg ' 1260 gactccgacg gctccttctt cctctattcc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggcaaa 1407
SEQ ID NO: 14
atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagcc 60 atccagttga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 120 acttgceggg caagtcaggg eattagcaat gctttagcct ggtatcagca gaaaccaggg 180 aaagctccta agctcctgat etatgatgcc tccagtttgg aaagtggggt cccatcaagg 240 ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 300 gattttgcaa cttaltactg tcaacagttt aatagttacc cgtggacgtt cggccaaggg 360 accaaggtgg aaatcaaacg tgagttctag aggatccatc tgggataagc atgctgtttt 420 ctgtctgtcc ctaacatgcc ctgtgattat ccgcaaacaa cacacccaag ggcagaactt 480 tgttacttaa acaccatcct gtttgcttci ttcctcagga actgtggctg caccatctgt 540 cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctetg ttgtgtgcct 600 gctgaataac itctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca 660 atcgggtaac tcccaggaga gLgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct 720 cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgccfgcga 780 agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 838
SEQ ID NO: 15

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15

Gly Gin Gly He Pro Val He Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val - 35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Ala Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60

Ser Ser Ser lie Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly • 65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 . 95

He His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110

Gin Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo que se une de forma espedfica a la variante de CSF-1R humano (SEQ ID NO: 15), que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10.
  2. 2. Un anticuerpo que se une de forma espedfica a CSF-1R humano (SEQ ID NO: 16), que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10.
  3. 3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-4 o 2 que comprende dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9. y dos cadenas ligeras, comprendiendo cada una la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10.
  4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 junto con un vehnculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
  5. 5. Una composicion farmaceutica de la reivindicacion 4, que comprende adicionalmente un agente farmaceutico adicional.
  6. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso como un medicamento.
  7. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del cancer.
  8. 8. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el cancer es leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer hepatocelular, cancer renal, mieloma multiple o linfoma de Hodgkin.
  9. 9. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el cancer es leucemia, cancer de mama, cancer de endometrio o cancer de prostata.
  10. 10. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el cancer es leucemia, cancer de mama o cancer de prostata.
  11. 11. El anticuerpo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 6-10, en el que el anticuerpo se administra antes, durante, de forma sustancialmente simultanea con, o tras comenzar la terapia, con otro tratamiento anticanceroso.
  12. 12. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho tratamiento anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un agente antiangiogenesis, un agente quimioterapeutico y un agente antineoplasico.
  13. 13. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que dicho agente antineoplasico se selecciona del grupo que consiste en docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorrubicina.
  14. 14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del cancer en un
    paciente, que comprende medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se
    selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, y administrar al paciente el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 si los niveles de CSF-1 son mayores que los niveles de CSF-1 encontrados en una poblacion de control.
  15. 15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento del cancer en un
    paciente, que comprende medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente, en el que la muestra se
    selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, y administrar al paciente el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 si los niveles de IL-34 son mayores que los niveles de IL-34 encontrados en una poblacion de control.
  16. 16. Un procedimiento para determinar si un sujeto que tiene un cancer es un candidato para un regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 o IL-34, o ambos, en una muestra del sujeto, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, celulas tumorales y celulas tumorales en circulacion, en el que un aumento del nivel de CSF-1 o IL-34, o ambos, comparado con el nivel de CSF-1 o IL-34, o ambos, en un individuo que no padece cancer, es indicativo de que el sujeto es un candidato para el regimen de tratamiento para el cancer basado en un anticuerpo anti CSF-1R.
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